Nghiên cứu đặc điểm và chuyển gen GmEXP1 liên quan đến sự phát triển bộ rễ của cây đậu tương (Glycine max (L.) Merrill)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN LÒ THANH SƠN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM VÀ CHUYỂN GEN GmEXP1 LIÊN QUAN ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN BỘ RỄ CỦA CÂY ĐẬU TƯƠNG Glycine max L... Hướng tiếp cận ngh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

LÒ THANH SƠN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM VÀ CHUYỂN GEN

GmEXP1 LIÊN QUAN ĐẾN SỰ PHÁT TRIỂN BỘ RỄ

CỦA CÂY ĐẬU TƯƠNG (Glycine max (L.) Merrill)

đại, Khoa Sinh - KTNN, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên; Phòng Công nghệ DNA ứng dụng, Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen - Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam

Người hướng dẫn khoa học: 1 GS TS Chu Hoàng Mậu

2 PGS TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh

Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3:

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Đại học Họp tại trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên

Vào hồi giờ , ngày tháng năm 201

Có thể tìm hiều luận án tại Trung tâm học liệu Đại học Thái Nguyên, Thư viện Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên và Thư viện Quốc gia Việt Nam

Footer Page 2 of 148.

1 Lo Thanh Son, Le Van Son, Nguyen Vu Thanh Thanh, Chu Hoang

Mau (2014), “Cloning and Designing Vector Carrying GmEXP1

Gene Isolated from Local Soybean Cultivar Sonla, Vietnam”,

International Journal of Bioscience, Biochemistry and Bioinformatics (IJBBB), 4 (3), pp.191 - 194

2 Lò Thanh Sơn, Hồ Mạnh Tường, Lê Văn Sơn, Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Chu Hoàng Mậu (2013), “Tách dòng, thiết kế vector và

chuyển gen GmEXP1 vào cây thuốc lá Nicotinana tabacum”, Tạp chí Khoa học Tự nhiên và Công nghệ ĐHQGHN, 29(4), tr.44 - 52

3 Lò Thanh Sơn, Hồ Mạnh Tường, Lê Văn Sơn, Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Chu Hoàng Mậu (2013), “Nghiên cứu đặc điểm gen

GmEXP1 liên quan đến sự kéo dài rễ phân lập từ một số giống đậu tương địa phương Sơn La (Glycine max (L.) Merrill)”, Hội nghị Khoa học Công nghệ sinh học toàn quốc 2013, Quyển 1, tr.192 - 196

4 Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Bùi Thị Doan, Lò Thanh Sơn, Chu

Hoàng Mậu (2014), “So sánh trình tự gen GmEXP1 liên quan đến

sự kéo dài rễ phân lập từ mRNA của hai mẫu đậu tương địa

phương Bắc Kạn và Vĩnh Phúc”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ Đại học Thái Nguyên, 118(4), tr.129 - 134

Các trình tự gen đăng ký trên Ngân hàng gen quốc tế

Accession number of GmEXP1_cDNA: HG799004, HG799005,

HG799006, HG799007, HG799008, HG799009, HG799010, LN681352, LN681353

Accession number of GmEXP1_DNA: LM651915, LM651916

Footer Page 3 of 148.

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) là loại cây trồng chiến lược ở nhiều

quốc gia, giữ vị trí quan trọng thứ tư sau lúa, ngô và lúa mì Đậu tương rất có giá trị dinh dưỡng và giá trị kinh tế Hạt có hàm lượng protein cao, chứa nhiều amino acid không thay thế và các vitamin cần thiết cho cơ thể người và động vật Thân lá để lại trong đất nhiều chất dinh dưỡng, rễ có nhiều nốt sần do vi

khuẩn Rhizobium cộng sinh có khả năng cố định đạm giúp cải tạo độ phì và sử

dụng bền vững nguồn tài nguyên đất

Tình trạng biến đổi khí hậu toàn cầu gây khó khăn lớn cho sản xuất nông nghiệp ở nhiều nước châu Á, châu Phi, Nam Mỹ và thu hẹp diện tích sản suất nông nghiệp Việt Nam có khoảng 75% diện tích là đồi núi, đất dốc nên thường xuyên khan hiếm về nguồn nước gây khó khăn cho canh tác đối với nhiều loại cây trồng, trong đó có đậu tương Cây đậu tương có thời gian sinh trưởng ngắn, khả năng thích ứng rộng, có thể bố trí phù hợp với nhiều cơ cấu cây trồng trong sản xuất, nhưng lại thuộc nhóm cây trồng chịu hạn kém Khô hạn có ảnh hưởng trực tiếp đến sinh trưởng phát triển ở tất cả các giai đoạn của cây đậu tương Thiếu nước ở giai đoạn trước khi hoa nở làm giảm tới 40% năng suất hạt đậu tương so với ảnh hưởng của hạn ở giai đoạn sau khi nở hoa Chính vì vậy chọn tạo giống đậu tương có khả năng chịu hạn tốt là vấn đề cấp thiết và mang tính thời sự trên thế giới cũng như ở Việt Nam

Trong điều kiện khô hạn, sự điều chỉnh áp suất thẩm thấu trong tế bào và

sự phát triển mạnh của bộ rễ sẽ giúp cây thu được nhiều nước từ các lớp đất sâu, đảm bảo quá trình sinh trưởng và phát triển bình thường của thực vật Thực vật có bộ rễ phát triển kéo dài, khả năng đâm xuyên tốt, có thể vươn tới những lớp đất sâu sẽ có cơ hội thu nhận được nhiều nước hơn trong điều kiện khô hạn Đồng thời, sự điều chỉnh thẩm thấu trong tế bào chóp rễ bằng những

cơ chế tích luỹ chất khô, tăng cường các kênh vận chuyển tích cực, tăng cường hô hấp và trao đổi ion cũng giúp thực vật dễ dàng lấy được lượng nước ít ỏi trong đất Mặt khác, trong điều kiện hạn, thực vật còn có một loạt các phản ứng kết hợp để tăng cường khả năng chống chịu với điều kiện hạn như điều chỉnh đóng mở khí khổng, giảm thoát sự thoát hơi nước, tăng cường tích nước tế bào… Trong một loạt những phản ứng nói trên ở thực vật dưới

Footer Page 4 of 148.

điều kiện khô hạn của môi trường thì việc nghiên cứu tác động vào sự phát triển kéo dài rễ, thay đổi cấu trúc và số lượng rễ bên được xem là biện pháp hữu hiệu trong việc cải thiện khả năng chịu hạn của cây đậu tương

Cải thiện đặc tính di truyền thích nghi với khô hạn của cây trồng được xem

là giải pháp quan trọng trong tình trạng biến đổi khí hậu toàn cầu hiện nay Hướng tiếp cận nghiên cứu cải thiện sự phát triển bộ rễ của cây đậu tương đã được quan tâm với việc sử dụng kỹ thuật chọn lọc quần thể, lai giống hữu tính, đột biến thực nghiệm và ứng dụng công nghệ sinh học hiện đại, trong đó công nghệ gen được coi là biện pháp có hiệu quả trong nghiên cứu chọn tạo giống đậu tương có khả năng chịu hạn cao

Từ những lý do trên chúng tôi thực hiện đề tài luận án: “Nghiên cứu đặc

điểm và chuyển gen GmEXP1 liên quan đến sự phát triển bộ rễ của cây đậu tương (Glycine max (L.) Merrill)”

2 Mục tiêu nghiên cứu

2.1 Mục tiêu tổng quát

Tạo được dòng cây chịu hạn mang cấu trúc gen chuyển liên quan đến sự kéo dài rễ phân lập từ cây đậu tương bằng kỹ thuật chuyển gen

2.2 Mục tiêu cụ thể

(i) Xác định được sự khác biệt về sự phát triển của bộ rễ và sự sai khác về

trình tự nucleotide của gen GmEXP1 liên quan đến sự kéo dài rễ của một số

giống đậu tương địa phương

(ii) Phát triển được vector chuyển gen thực vật mang gen GmEXP1 liên

quan đến sự kéo dài rễ ở cây đậu tương

(iii) Tạo được dòng cây thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc gen GmEXP1

biểu hiện sự kéo dài rễ cao hơn so với cây đối chứng không chuyển gen

(iv) Tạo được dòng cây đậu tương chuyển gen mang gen GmEXP1 liên

quan đến sự phát triển kéo dài rễ

3 Nội dung nghiên cứu

(1) Nghiên cứu so sánh sự phát triển bộ rễ của một số giống đậu tương thông qua các chỉ tiêu như: chiều dài, kích thước, khối lượng khô của rễ và phân nhóm các giống đậu tương nghiên cứu theo mức độ phát triển bộ rễ

(2) Nghiên cứu thông tin về gen GmEXP1 liên quan đến sự kéo dài rễ, thiết kế

cặp mồi, khuếch đại, tách dòng và xác định trình tự gen từ cây đậu tương

Footer Page 5 of 148.

(3) Nghiên cứu phát triển vector chuyển gen thực vật chứa cấu trúc gen

GmEXP1 liên quan đến sự kéo dài rễ

(4) Nghiên cứu chuyển cấu trúc vector chứa gen GmEXP1 liên quan đến sự kéo dài rễ vào cây thuốc lá thông qua A.tumefaciens Phân tích sự biểu hiện

của gen chuyển trên cây thuốc lá chuyển gen ở thế hệ T0 và T1. Phân tích, so sánh sự phát triển bộ rễ của các dòng cây chuyển gen và cây đối chứng ở thế

hệ T1 trên phương diện chiều dài rễ chính, khối lượng khô và thể tích rễ

(5) Nghiên cứu thử nghiệm chuyển cấu trúc mang gen GmEXP1 liên quan

đến sự kéo dài rễ vào cây đậu tương

4 Những đóng góp mới của luận án

Luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu có hệ thống từ phân lập, tách dòng phân tử đến phát triển vector chuyển gen và biểu hiện gen

GmEXP1 liên quan đến sự phát triển bộ rễ ở cây thuốc lá và cây đậu tương

Việt Nam

Ứng dụng kỹ thuật Real time RT-PCR và Western blot đã đánh giá được mức độ biểu hiện của gen chuyển trong cây chuyển gen và bước đầu tạo được

dòng đậu tương chuyển gen mang gen GmEXP1

Kết quả đạt được của luận án có giá trị khoa học và thực tiễn cao trong tiếp cận nghiên cứu tạo dòng cây chịu hạn theo hướng cải thiện sự phát triển

bộ rễ bằng kỹ thuật chuyển gen ở thực vật

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài luận án

Về mặt khoa học

Kết quả nghiên cứu góp phần làm sáng tỏ đặc điểm cấu trúc của gen

GmEXP1 phân lập từ các cây đậu tương SL1, DT84 Cơ sở khoa học và hiệu

quả của kỹ thuật chuyển gen trong việc cải thiện đặc tính chịu hạn của cây trồng đã được khẳng định thông qua việc phát triển thành công vector chuyển

gen thực vật mang cấu trúc gen GmEXP1 và tạo được dòng cây thuốc lá chuyển

gen có bộ rễ phát triển tốt hơn so với cây đối chứng

Kết quả bước đầu tạo cây đậu tương chuyển gen đã mở ra hướng nghiên cứu kỹ thuật chuyển gen trong cải thiện khả năng chịu hạn của cây đậu tương

ở Việt Nam

Các bài báo đăng tải trên các tạp chí khoa học công nghệ quốc tế và trong nước cùng với 9 trình tự gen công bố trên Ngân hàng Gen quốc tế là những tư liệu có giá trị tham khảo trong nghiên cứu và giảng dạy

Footer Page 6 of 148.

6 Cấu trúc luận án: Luận án có 127 trang (kể cả tài liệu tham khảo) được

chia thành các chương, phần: Mở đầu (04 trang), Chương 1: Tổng quan tài liệu (33 trang), Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu (16 trang); Chương 3: Kết quả nghiên cứu (46 trang); Chương 4: Thảo luận chung kết quả nghiên cứu (09 trang); Kết luận và đề nghị (01 trang); Các công trình công bố liên quan đến luận án (02 trang); Tài liệu tham khảo (16 trang); Phụ lục (8 trang) Luận án có 25 bảng, 31 hình và tham khảo 150 tài liệu

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Luận án đã tham khảo 18 tài liệu tiếng Việt; 130 tài liệu tiếng Anh và 2 tài liệu từ internet để tổng kết các nội dung có liên quan, bao gồm: (1) Vai trò của

bộ rễ thực vật và của cây đậu tương đối với tác động của hạn; (2) Một số gen liên quan đến sự phát triển bộ rễ của thực vật và của cây đậu tương; (3) Chuyển

gen liên quan đến hoạt động của bộ rễ cây đậu tương nhờ A tumefaciens

Bộ rễ thực vật giữ vai trò quan trọng, là cơ quan hấp thu nước chủ yếu cung cấp cho các hoạt động sống của tế bào và cơ thể Những cây có bộ rễ phát triển kéo dài, đâm xuyên sâu và lan toả rộng sẽ có nhiều cơ hội thu nhận được nước và dinh dưỡng do vậy có thể dễ dàng vượt qua điều kiện khô hạn (Huck và cs, 1983) Sự phát triển bộ rễ của thực vật và của cây đậu tương được quy định bởi nhiều gen liên quan đến các đặc điểm hình thái, sinh trưởng phát triển, trao đổi chất (Taylor và cs, 1978; Uga và cs, 2013) Cho đến nay, gen chìa khoá xác định sự phát triển kéo dài rễ chưa được tìm ra Ở cây

Footer Page 7 of 148.

đậu tương, gen EXP1 xác định protein expansin hoạt động chủ yếu ở vùng sinh

trưởng của cả rễ chính và rễ bên được cho là có liên quan đến hoạt động phát triển kéo dài rễ (McQueen-Mason và cs, 1994; Choi và cs, 2003; Lee và cs, 2003) Protein expansin là một liên họ bao gồm 4 phân họ là α-expansin (EXPA), β-expansin (EXPB), expansin-like A (EXLA) và expansin-like B (EXLB) có tác động kéo giãn, nới lỏng thành tế bào thực vật Protein expansin được mã hoá bởi đa họ gen (multi-gene family) được phát hiện ở nhiều thực vật như lúa, yến mạch, đậu tương, ngô, khoai tây Riêng ở cây đậu tương có tới 75

gen EXP khác nhau nằm trên 18 cặp NST tương đồng, trong đó gen GmEXP1

thuộc NST số 17 có kích thước 1491 bp gồm 3 exon và 2 intron xen kẽ Trình

tự mã hoá của gen GmEXP1 dài 768 bp xác định protein α-expansin gồm 255

amino acid (Kende và cs, 2004; Zhu và cs, 2014) Protein tương ứng gồm 3 vùng: vùng tín hiệu dẫn đầu; vùng chức năng DPBB xúc tác dạng enzyme endoglucanase và vùng Pollen allerg bám dính cơ chất (Wu và cs, 2001) Khi thành tế bào đạt "pH sinh trưởng" = 4,5 - 6,0 và tỷ lệ khối lượng expansin với thành tế bào đạt 1 : 10.000 thì expansin gây biến đổi cấu trúc mạng lưới thành tế bào bằng cách len lỏi, bẻ gãy các liên kết phi hoá trị giữa các thành phần polysaccharide với nhau (gồm pectin và hemicellulose) và làm lỏng lẻo mạng lưới polymer Áp lực sức trương của tế bào làm khoảng cách giữa các vi sợi mở rộng theo cả chiều ngang và chiều dọc (Cosgrove và cs 2000, 2005)

Hình 1.4 Cơ chế gây giãn thành tế bào thực vật của expansin (theo Cosgrove - 2000) A: Expansin b ẻ gãy các liên kết phi hoá trị giữa glycan với vi sợi cellulose; B: Expansin bẻ

gãy các liên kết hoá trị giữa các polysaccharide với nhau; C: Các vi sợi cellulose dễ dàng

trượt và đẩy giãn khoảng cách dưới áp lực sức trương của tế bào

Ngoài ra tác động trực tiếp giãn thành tế bào, expansin còn gây hiệu quả gián tiếp tạo khoảng trống cho cellulolase tiếp xúc với cơ chất, đẩy nhanh hiệu quả tăng kích thước tế bào Một số thực nghiệm chứng minh hoạt động và phân bố của expansin trong tế bào mô thuộc vùng sinh trưởng của rễ đậu tương cho thấy

Footer Page 8 of 148.

vai trò quan trọng của expansin trong việc kéo dài rễ, tạo điều kiện cho thực vật hấp thu được nhiều nước và dinh dưỡng từ các lớp đất sâu (Cosgrove và cs 1998)

Những tiến bộ kỹ thuật trong chuyển gen thực vật nhờ A tumefaciens mở

ra khả năng tạo cây đậu tương chuyển gen GmEXP1 cải tiến sự phát triển kéo

dài rễ nhằm cải thiện khả năng chịu hạn Sự tiến bộ thể hiện ở các khâu: hoàn thiện quy trình tái sinh; chọn lọc hiệu quả bằng các gen chỉ thị, gen sàng lọc; ứng dụng thành công và có hiệu quả các kỹ thuật phân tử trong phân tích thể chuyển gen như PCR, Real-time RT-PCR, Western blot; đánh giá chính xác

sự biểu hiện chức năng sinh học của gen chuyển Nhờ đó, Việt Nam và Thế giới đã đạt được những thành tựu chuyển gen ở cây đậu tương rất đáng khích

lệ (Zhang 2010; Li 2013; de Paiva Rolla 2014; Trần Thị Cúc Hoà 2007; Nguyễn Thị Thuý Hường 2011; Nguyễn Thu Hiền 2014; Lò Thị Mai Thu 2014 ).

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

Sáu giống đậu tương địa phương Sơn La được Trung tâm Nghiên cứu & Phát triển Đậu đỗ - Viện Cây lương thực & Cây thực phẩm - Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam và giống đậu tương DT84 do Viện Di truyền Nông nghiệp Việt Nam cung cấp được dùng làm vật liệu đánh giá bộ rễ và nghiên cứu đặc điểm gen Hai giống đậu tương địa phương Bắc Kạn và Vĩnh Phúc được sử dụng làm vật liệu bổ sung trong tách dòng, xác định trình tự nucleotide và phân

tích đa dạng trình tự gen GmEXP1 Giống thuốc lá Nicotinana tabacum K326

do Viện Kinh tế Kỹ thuật thuốc lá Việt Nam cung cấp

Các chủng vi khuẩn và các loại vector sử dụng trong đề tài luận án được cung cấp bởi Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn Lâm Khoa học & Công

nghệ Việt Nam gồm: Escherichia coli DH5α, Agrobacterium tumefaciens

CV58; vector pBT tách dòng gen, vector pRTRA7/3, vector pCB301

2.2 Hoá chất, thiết bị và địa điểm nghiên cứu

Hoá chất, các bộ KIT được mua tại các hãng nổi tiếng Thế giới như Neer, Fermentas, Invitrogen ; Các thí nghiệm được thực hiện từ tháng 02 năm 2012, thí nghiệm sinh lý đánh giá sự phát triển bộ rễ và kiểm tra chức năng sinh học của gen chuyển được tiến hành tại phòng thí nghiệm khoa Sinh Hoá - trường Đại học Tây Bắc Các thí nghiệm phân lập gen, thiết kế vector,

Bio-Footer Page 9 of 148.

chuyển gen và phân tích cây chuyển gen được tiến hành tại phòng Công nghệ ADN ứng dụng, Phòng Công nghệ Tế bào thực vật và Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen thuộc Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Công trình được hoàn thành tại Bộ môn

Di truyền và Sinh học hiện đại, Khoa Sinh - Kỹ thuật Nông nghiệp, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên

2.3 Phương pháp nghiên cứu

Các thí nghiệm được tiến hành theo sơ đồ tổng quát mô tả ở hình 2.1

Hình 2.1 Sơ đồ thí nghiệm tổng quát

Luận án sử dụng các phương pháp nghiên cứu chia thành 6 nhóm chính: (1) nhóm phương pháp sinh lý đánh giá sự phát triển của bộ rễ, (2) nhóm phương pháp phân lập, tách dòng và xác định trình tự gen, (3) nhóm phương pháp phát

triển vector chuyển gen GmEXP1, (4) nhóm phương pháp tạo cây chuyển gen,

(5) nhóm phương pháp phân tích cây chuyển gen và (6) phân tích, xử lý số liệu

2.3.1 Nhóm phương pháp sinh lý đánh giá sự phát triển của bộ rễ

Các giống đậu tương, các dòng thuốc lá nghiên cứu được gây hạn trên hệ thống thí nghiệm gây hạn nhân tạo (thực hiện theo Lê Trần Bình và cộng sự - 1998) sau khi nảy mầm và đạt 3 lá thật Mỗi giống/dòng đều được bố trí song song 3 lô thí nghiệm (lặp lại 3 lần) và một lô đối chứng, mỗi lô 10 cây/1 giai

Footer Page 10 of 148.

đoạn gây hạn Khi các cây có 3 - 4 lá thật thì bắt đầu ngừng cung cấp nước để gây hạn nhân tạo Xác định các chỉ số liên quan đến sự phát triển bộ rễ qua từng giai đoạn 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày và 9 ngày gây hạn ở cả các lô thí nghiệm và cả lô đối chứng làm căn cứ so sánh và đánh giá sự phát triển bộ rễ

2.3.2 Phương pháp phân lập, tách dòng và giải trình tự gen

Phân lập gen GmEXP1 bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu đã thiết

kế SoyExp1F_NcoI/Soy Exp1R_NotI và khuôn mẫu từ DNA tổng số tách

chiết ở lá; từ RNA tổng số tách chiết ở rễ mầm qua tổng hợp cDNA

Tách dòng và giải trình tự gen qua các bước: i) Tinh sạch sản phẩm PCR, ii) Ghép nối đoạn gen vào vector tách dòng pBT; iii) Biến nạp plasmid tái tổ

hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α; iv) Chọn dòng khuẩn lạc bằng colony PCR; v) Tách chiết plasmid và cắt kiểm tra bằng BamHI; vi) Xác định và

phân tích trình tự nucleotide

2.3.3 Nhóm phương pháp phát triển vector chuyển gen GmEXP1

Vector chuyển gen GmEXP1 được phát triển theo hai bước cơ bản: (1) Thiết kế cấu trúc độc lập mang gen chuyển GmEXP1; (2) Gắn cấu trúc gen

GmEXP1 vào vector chuyển gen thực vật pCB301 Các kỹ thuật sử dụng để

phát triển vector bao gồm: cắt DNA bằng enzyme giới hạn theo chỉ dẫn về thành phần, điều kiện phản ứng của bên cung cấp; tinh sạch sản phẩm cắt theo

chỉ dẫn của KIT; kỹ thuật biến nạp vector vào E.coli DH5α bằng sốc nhiệt,

colony PCR, tách plasmid và một số kỹ thuật phân tử khác thực hiện theo Sambrook và cộng sự đề xuất năm 2001

2.3.4 Phương pháp tạo cây chuyển gen nhờ A tumefaciens

Biến nạp pCB301_GmEXP1 vào tế bào A tumefaciens CV58 bằng xung

điện, chọn lọc bằng colony PCR và nhân dòng vector chuyển gen để tạo chủng

vi khuẩn mang vector chứa cấu trúc gen chuyển GmEXP1 phục vụ biến nạp Chuyển vector chứa cấu trúc gen chuyển GmEXP1 vào cây thuốc lá N

tabacum K326 thông qua vi khuẩn A tumefaciens và tạo cây thuốc lá chuyển

gen qua hệ thống tái sinh phù hợp theo mô tả của Topping - 1998

Chuyển vector chứa cấu trúc gen chuyển GmEXP1 vào cây đậu tương DT84 qua nách lá mầm hạt chín nhờ vi khuẩn A tumefaciens Quy trình tạo

cây đậu tương chuyển gen được thực hiện dựa trên nghiên cứu của Olhoft và

Footer Page 11 of 148.

cộng sự - 2006 và tham khảo quy trình tái sinh tạo cây đậu tương chuyển gen của Nguyễn Thị Thuý Hường - 2011 và Nguyễn Thị Thu Hiền 2014

2.3.5 Nhóm các phương pháp phân tích cây chuyển gen

Kiểm tra sự có mặt của gen chuyển bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc

hiệu SoyExp1F_NcoI/Soy Exp1R_NotI Kiểm tra sự có mặt của sản phẩm phiên mã gen GmEXP1 bằng RT-PCR Đánh giá mức độ biểu hiện phiên mã

của gen chuyển bằng Real-time RT-PCR theo phương pháp R=2-∆∆Ct của Livak - 2001 Kiểm tra sự có mặt của protein expansin ngoại lai bằng Western blot Đánh giá sự biểu hiện chức năng sinh học của gen chuyển bằng cách đặt cây chuyển gen trong môi trường gây hạn nhân tạo và đánh giá qua so sánh các chỉ tiêu phát triển bộ rễ (chiều dài rễ chính, thể tích, khối lượng khô bộ rễ)

2.3.6 Các phương pháp phân tích, xử lý số liệu

Hiệu suất chuyển gen (%) = Số cây mang gen chuyểnTổng số mẫu biến nạp × 100

Kết quả nghiên cứu về các trình tự gen, amino acid được xử lý bằng phần mềm BioEdit, DNA Star; Số liệu thí nghiệm được xử lý bằng phần mềm Excel và NTSYS PC2.1 (Chu Hoàng Mậu 2008)

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 ĐÁNH GIÁ SỰ PHÁT TRIỂN BỘ RỄ CỦA CÁC GIỐNG ĐẬU TƯƠNG NGHIÊN CỨU

Đánh giá sự phát triển bộ rễ qua các giai đoạn gây hạn nhân tạo để phân nhóm các giống đậu tương nghiên cứu theo mức độ phát triển của bộ rễ đồng thời xây dựng căn cứ lựa chọn giống đậu tương ưu tú về đặc điểm này phục

vụ phân lập gen nhằm cung cấp nguyên liệu cho việc phát triển vector chuyển gen Các chỉ tiêu được đánh giá bao gồm: chiều dài rễ chính, thể tích và khối lượng khô của bộ rễ ở các ngưỡng gây hạn khác nhau của giai đoạn cây đậu tương non Các tham số thống kê về các chỉ tiêu như sai số trung bình, phép kiểm định giả thuyết về so sánh giá trị trung bình mẫu đều được tính toán với mức ý nghĩa α = 0,05 Số liệu phân tích trình bày ở các bảng 3.1, 3.2, 3.3 của luận án đều cho thấy các chỉ tiêu phát triển bộ rễ ở các giống địa phương Sơn La đều cao hơn giống đối chứng DT84; trong đó SL1 có các giá trị đánh giá cao hơn các giống còn lại và thấp nhất là DT84

Footer Page 12 of 148.

Hình 3.1 Mối quan hệ giữa các giống đậu tương nghiên cứu dựa trên dữ liệu về sự

phát triển bộ rễ trong điều kiện gây hạn nhân tạo

Dựa trên sự biểu hiện của các tính trạng về bộ rễ đã đánh giá và bằng chương trình NTSYSpc 2.1, sơ đồ hình cây về mối quan hệ giữa các giống đậu tương nghiên cứu được thiết lập (hình 3.1) Bảy giống đậu tương nghiên cứu được phân thành ba nhóm: nhánh I chỉ có giống SL1, có bộ rễ phát triển mạnh nhất; nhóm II gồm có giống SL6, SL4 có bộ rễ phát triển khá; nhóm III gồm các giống SL2, SL3, SL5 và DT84 là nhóm có bộ rễ phát triển kém nhất, trong đó giống DT84 có khoảng cách di truyền xa nhất so với giống SL1 (10,47%) SL1 (giống địa phương Phù Yên - Sơn La) là giống có bộ rễ phát triển tốt nhất trên các phương diện đánh giá dùng làm vật liệu cung cấp gen

GmEXP1; giống DT84 có bộ rễ phát triển kém nhất làm đối tượng tiếp nhận

gen chuyển

3.2 ĐẶC ĐIỂM GEN GmEXP1 PHÂN LẬP TỪ MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU TƯƠNG

3.2.1 Đặc điểm gen GmEXP1 phân lập từ cDNA của một số giống đậu tương 3.2.1.1 Tách dòng cDNA và xác định trình tự gen GmEXP1

Cặp mồi SoyExp1F_NcoI/SoyExp1R_NotI được thiết kế dựa trên trình tự gen GmEXP1 của đậu tương AF516879 đã công bố tại Ngân hàng gen quốc tế

để nhân bản và phân lập gen GmEXP1 từ các mẫu nghiên cứu; đồng thời mang trình tự chứa điểm cắt giới hạn của enzyme NcoI/NotI phục vụ phát triển vector Sản phẩm PCR khuếch đại gen GmEXP1 từ cDNA được kiểm tra

trên gel agarose nhận được một băng DNA kích thước khoảng 0,79kb phù hợp

với kích thước dự đoán khi thiết kế cặp mồi PCR (Hình 3.2-A) Gen GmEXP1 được tách dòng với các bước: gắn vào vector pBT; biến nạp vào E.coli DH5α

bằng sốc nhiệt; colony PCR chọn dòng mang gen đích tái tổ hợp bằng cặp mồi pUC18_F/pUC18_R (Hình 3.2-B) Trước khi đọc trình tự, plasmid tái tổ hợp

gen GmEXP1 được cắt kiểm tra bằng BamHI cho kết quả dương tính 7/7 mẫu

thử Việc giải trình tự trên máy tự động được thực hiện lặp lại 3 lần/mẫu

Footer Page 13 of 148.