Xác định đồng thời một số độc tố gây liệt cơ trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ bằng sắc ký lỏng khối phổ LC-MS MS

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ======= NGUYỄN THỊ NHUNG XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI MỘT SỐ ĐỘC TỐ GÂY LIỆT CƠ TRONG NHUYỄN THỂ HAI MẢNH VỎ BẰNG... Các phương pháp xá

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

=======

NGUYỄN THỊ NHUNG

XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI MỘT SỐ ĐỘC TỐ GÂY LIỆT CƠ

TRONG NHUYỄN THỂ HAI MẢNH VỎ BẰNG

Nguyễn Thị Nhung Trường ĐHKH Tự Nhiên

LỜI CẢM ƠN

Bản khóa luận này được thực hiện và hoàn thành tại Viện Kiểm nghiệm

An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc Gia với sự hướng dẫn của PGS.TS Lê Thị

Hồng Hảo

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn PGS

TS Lê Thị Hồng Hảo đã định hướng nghiên cứu, hướng dẫn và góp ý giúp

em hoàn thành khóa luận này Tôi xin gửi lời cảm ơn tới ThS Nguyễn Thị

Hà Bình đã hướng dẫn và giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận này

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới Ban lãnh đạo Viện Kiểm nghiệm An

toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia, TS Trần Cao Sơn và các cán bộ khoa Độc

học dị nguyên, Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia đã tạo điều kiện giúp tôi hoàn thành đề tài

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô giáo giảng dạy tại khoa Hoá, đặc biệt là các thầy cô trong bộ môn Hoá Phân tích, đã cho tôi những kiến thức quý giá trong quá trình học tập và thực hiện đề tài này

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn các anh chị, bạn bè của tập thể lớp cao học hoá K24, đặc biệt là những người bạn trong nhóm hoá phân tích K24 đã giúp đỡ, chia sẻ những khó khăn trong suốt quá trình tôi học tập và thực hiện đề tài này Cuối cùng, tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè đã luôn bên tôi, chia sẻ khó khăn, động viên và giúp đỡ tôi trong học tập và trong cuộc sống

Do thời gian thực hiện đề tài có hạn nên không tránh những thiếu sót Tôi rất mong nhận được ý kiến đóng góp của thầy cô và các bạn sinh viên

Hà Nội, ngày 07 tháng 11 năm 2016

Nguyễn Thị Nhung

Nguyễn Thị Nhung Trường ĐHKH Tự Nhiên

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 2

1.1 Giới thiệu về độc tố nhuyễn thể gây liệt cơ 2

1.1.1 Giới thiệu về STX 4

1.1.2 Giới thiệu về NEO 4

1.1.3 Giới thiệu về GTX-1 5

1.1.4 Giới hạn tối đa cho phép (ML) 6

1.1.5 Những tác hại của độc tố nhuyễn thể gây liệt cơ 7

1.2 Các phương pháp xác định độc tố gây liệt cơ trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ 9

1.2.1 Các phương pháp thử sinh học 9

1.2.2 Phương pháp xét nghiệm miễn dịch ELISA 10

1.2.3 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 11

1.2.4 Kỹ thuật điện di 13

1.2.5 Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS), (LC-MS/MS) 13

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Đối tượng và nội dung nghiên cứu 16

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 16

2.1.2 Nội dung nghiên cứu 16

2.2 Phương pháp nghiên cứu 16

2.2.1 Phương pháp chuẩn bị mẫu 16

2.2.2 Phương phápsắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS) 17

2.2.3 Thẩm định phương pháp 23

Nguyễn Thị Nhung Trường ĐHKH Tự Nhiên

2.2.4 Phương pháp xử lý số liệu 26

2.3 Phương tiện nghiên cứu 26

2.3.1 Thiết bị, dụng cụ 26

2.3.2 Dung môi, hóa chất 27

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Error! Bookmark not defined 3.1 Tối ưu hóa các điều kiện chạy thiết bị LC-MS/MS Error! Bookmark not defined 3.1.1 Tối ưu hóa các điều kiện chạy của thiết bị khối phổ MS/MS Error! Bookmark not defined 3.1.2 Tối ưu hóa các điều kiện chạy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Error! Bookmark not defined 3.2 Khảo sát quy trình xử lý mẫu Error! Bookmark not defined 3.2.1 Chọn qui trình xử lí mẫu Error! Bookmark not defined 3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên quá trình chiết mẫu Error! Bookmark not defined 3.2.3 Khảo sát quá trình pha loãng dịch chiết Error! Bookmark not defined 3.2.4 Khảo sát thể tích dung môi chiết Error! Bookmark not defined 3.3 Thẩm định phương pháp phân tích Error! Bookmark not defined 3.3.1 Tính đặc hiệu / chọn lọc Error! Bookmark not defined 3.3.2 Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) Error! Bookmark not defined 3.3.3 Xác định khoảng tuyến tính Error! Bookmark not defined. 3.3.4 Độ chính xác (accuracy) của phương pháp phân tích (độ đúng và độ chụm) Error! Bookmark not defined 3.4 Áp dụng phân tích mẫu thực tế Error! Bookmark not defined KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Error! Bookmark not defined TÀI LIỆU THAM KHẢO Error! Bookmark not defined PHỤ LỤC

Nguyễn Thị Nhung Trường ĐHKH Tự Nhiên

DANH SÁCH BẢNG BIỂU

Bảng 1.1: Cấu trúc hóa học và độc tính của một vài độc tố PSP 3

Bảng 1.2: Một số nước đã đưa ra qui định giới hạn tối đa cho phép (ML) của các PSP 6

Bảng 1.3: Một số nghiên cứu sử dụng phương pháp HPLC-FLD để xác định PSP 11

Bảng 2.1: Bảng pha dung dịch chuẩn la ̀m viê ̣c Error! Bookmark not defined

Bảng 3.1: Ion mẹ của từng chất Error! Bookmark not defined.

Bảng 3.2: Điều kiện tối ưu cho ESI-MS/MS Error! Bookmark not defined.

Bảng 3.3: Các thông số tối ưu MS/MS Error! Bookmark not defined.

Bảng 3.4: Chương trình gradient Error! Bookmark not defined

Bảng 3.5: Lựa chọn quy trình chiết mẫu Error! Bookmark not defined

Bảng 3.6: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên quá trình chiết mẫu

Error! Bookmark not defined

Bảng 3.7: Khảo sát quá trình pha loãng dịch chiết Error! Bookmark not defined

Bảng 3.8: Khảo sát thể tích dung môi chiết Error! Bookmark not defined

Bảng 3.9: Ion mẹ và ion con của STX, GTX-1, NEO Error! Bookmark not defined

Bảng 3.10: LOD và LOQ của STX, GTX-1, NEO Error! Bookmark not defined

Nguyễn Thị Nhung Trường ĐHKH Tự Nhiên

Bảng 3.11: Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ của các PSP

Error! Bookmark not defined

Bảng 3.12: Độ lặp lại và độ thu hồi của STX, GTX-1, NEO trên nền mẫu Ngao Error! Bookmark not defined.

Bảng 3.13: Độ lặp lại và độ thu hồi của STX, GTX-1, NEO trên nền mẫu Hàu Error! Bookmark not defined.

Bảng 3.14: Kết quả phân tích mẫu thực tế trên địa bàn Hà Nội Error!

Bookmark not defined

Nguyễn Thị Nhung Trường ĐHKH Tự Nhiên

DANH SÁCH HÌNH Hình 1.1: Công thức cấu tạo tổng quát của các độc tố PSP 3

Hình 1.2: Công thức cấu tạo của STX 4

Hình 1.3: Công thức cấu tạo của Neo 5

Hình 1.4: Công thức cấu tạo của GTX-1 5

Hình 2.1: Sơ đồ đơn giản của hệ thống sắc ký lỏng 18

Hình 2.2: Bộ kết nối phun điện tử 20

Hình 2.3: Bộ phân tích tứ cực 22

Hình 2.4: Bộ phân tích khối ba tứ cực 22

Hình 3.1: Sắc kí đồ mix PSP chuẩn 100 ng/mL chạy chương trình gradient 4

Error! Bookmark not defined

Hình 3.2: Sơ đồ quy trình xử lý mẫu 1Tiến hành xử lý mẫu theo quy trình 2 theo tác giả Van De Riet Error! Bookmark not defined.

Hình 3.3: Sơ đồ quy trình xử lý mẫu 2 Error! Bookmark not defined.

Hình 3.4: Sơ đồ quy trình xử lý mẫu 3 Error! Bookmark not defined.

Hình 3.5:Sắc kí đồ các PSP 100 ng/mL trong quy trình 3 Error! Bookmark

not defined

Hình 3.6: Sắc kí đồ quy trình không gia nhiệt khi thêm chuẩn mix PSP 100 ng/mL Error! Bookmark not defined

Hình 3.7: Sắc kí đồ quy trình gia nhiệt khi thêm chuẩn mix PSP 100 ng/mL

Error! Bookmark not defined

Hình 3.8: Đồ thị khảo sát sự ảnh hưởng của quá trình pha loãng đến hiệu suất

Nguyễn Thị Nhung Trường ĐHKH Tự Nhiên

thu hồi Error! Bookmark not defined

Hình 3.9: Đồ thị khảo sát sự ảnh hưởng của thể tích chiết đến hiệu suất thu

Hình 3.10: Quy trình xử lí mẫu tối ưu Error! Bookmark not defined.

Hình 3.11: Phổ khối của các PSP Error! Bookmark not defined

Hình 3.12: Sắc đồ mẫu trắng không có tín hiê ̣u chất phân tích Error!

Bookmark not defined

Hình 3.13: Sắc đồ mẫu chuẩn ở mức 200 ng/mL Error! Bookmark not defined

Hình 3.14: Sắc đồ mẫu trắng thêm chuẩn ở mức 200 ng/mL Error!

Bookmark not defined

Hình 3.15: Sắc kí đồ STX tại LOD 10 ng/mL (tương đương 100 µg/kg trên mẫu) Error! Bookmark not defined.

Hình 3.16: Sắc kí đồ NEO tại LOD 15 ng/mL (tương đương 150 µg/kg trên mẫu) Error! Bookmark not defined.

Hình 3.17: Sắc kí đồ GTX-1 tại LOD 15 ng/mL (tương đương 150 µg/kg trên mẫu) Error! Bookmark not defined.

Hình 3.18: Đường chuẩn STX theo diê ̣n tích pic Error! Bookmark not defined

Hình 3.19: Đường chuẩn GTX-1 theo diê ̣n tích pic Error! Bookmark not

defined

Nguyễn Thị Nhung Trường ĐHKH Tự Nhiên

Hình 3.20: Đường chuẩn NEO theo diê ̣n tích pic Error! Bookmark not defined

Nguyễn Thị Nhung Trường ĐHKH Tự Nhiên

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

nhớ

Nguyễn Thị Nhung Trường ĐHKH Tự Nhiên

Nguyễn Thị Nhung 1 Trường ĐHKH Tự Nhiên

ĐẶT VẤN ĐỀ Trong những năm gần đây việc nuôi trồng thủy sản nói chung và việc nuôi các loài hai mảnh vỏ nói riêng đã và đang phát triển rầm rộ ở nhiều địa phương ven biển nước ta Điều này đã góp phần vào việc phát triển ngành kinh tế biển, phục vụ cho nhu cầu thị trường tiêu thụ trong và ngoài nước, tăng thêm thu nhập, cải thiện đời sống cho nhiều hộ dân cư ven biển

Đô thị hóa, ô nhiễm môi trường làm môi trường biển ngày càng bị suy thoái tạo điều kiện cho sự xuất hiện và bùng nổ của các loài vi tảo biển độc hại Các loài thân mềm hai mảnh vỏ là đối tượng trung gian chính để gây ra hiện tượng ngộ độc ở người và các sinh vật bậc cao như chim biển, thú biển Đặc biệt

sự có mặt các nhóm độc tố độc tố gây liệt cơ PSP (Paralytic Shellfish Poisoning) Chính vì vậy, nghien cứu phát hiện các độc tố cần được quan tâm để giảm nguy

cơ ảnh hưởng đến sức khỏe cũng như tính mạng của con người

Trong đề tài này tập trung nghiên cứu nhóm độc tố nhuyễn thể gây liệt cơ PSP (Paralytic Shellfish Poisoning) Độc tố này gây nguy hiểm đến sức khoẻ và tính mạng con người là do động vật nhyễn thể bị nhiễm và tích lũy độc tố PSP do

ăn phải tảo độc nhóm Dinoflagellates bao gồm loài Dinophysis spp, Aurocentum, prorocentrumlima.Việc xác định một số độc tố nhuyễn thể gây liêt cơ là rất cần

thiết, là công cụ rất tốt phục vụ cho công tác thanh tra, kiểm tra an toàn thực phẩm

Do đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu phát triển phương pháp “Xác định đồng thời một số độc tố gây liệt cơ trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ bằng sắc ký lỏng khối phổ LC-MS/MS” Phương pháp hiện đại, có độ tin cậy và chính xác cao

Mục tiêu của thực hiện đề tài luận văn là:

- Xây dựng phương pháp xác định đồng thời một số độc tố gây liệt cơ trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LC - MS/MS

- Sơ bộ đánh giá một số độc tố gây liệt cơ trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ tiêu thụ tại Hà Nội

Nguyễn Thị Nhung 2 Trường ĐHKH Tự Nhiên

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu về độc tố nhuyễn thể gây liệt cơ

Độc tố nhuyễn thể gây liệt cơ (PSP) là một nhóm các alkaloid gây độc trên thần kinh STX là độc tố PSP được phát hiện sớm nhất vào năm 1957, và kể

từ đó đến nay đã có 57 dẫn xuất được mô tả [28]

Độc tố PSP là những độc tố thân nước và chịu được nhiệt độ cao nên khó

có thể bị phá hủy khi nấu ăn hay đun nóng [15], [18] Chúng có thể được chia thành 4 phân nhóm chính [8], [22], [28]:

Độc tố nhóm carbamate gồm: saxitoxin (STX), neosaxitoxin (NEO), gonyautoxins (GTX1-4) có độc tính mạnh nhất

Độc tố nhóm decarbamoyl gồm: decarbamoyl saxitoxin (dcSTX), decarbamoyl gonyautoxins (dcGTX1-4) có độc tính trung bình, được báo cáo xuất hiện trong một vài động vật hai mảnh vỏ, nhưng ít được tìm thấy trong các loài tảo độc

Nguyễn Thị Nhung 3 Trường ĐHKH Tự Nhiên

Hình 1.1: Công thức cấu tạo tổng quát của các độc tố PSP Bảng 1.1: Cấu trúc hóa học và độc tính của một vài độc tố PSP

O NH2O

californianeus Độc tố có thể sản sinh riêng biệt bởi S giganteus hay M californianeus

- Lý hóa tính: Các độc tố PSP không bị phân hủy bởi nhiệt ở môi trườngacid

nhưng không bền vững và dễ bị oxy hóa trong môi trường kiềm

- Tác hại: Các triệu chứng nhiễm độc PSP có thể xuất hiện sau khi ăn vài phút cho đến 10 giờ Triệu chứng bao gồm cảm giác tê ở môi, cổ, mặt, cùng cảm thấy như có kiến bò trong các ngón tay và ngón chân, nhức đầu, chóng mặt và buồn nôn, nói năng không còn mạch lạc, mạch đập nhanh, thở khó Trường hợp nặng

có thể dẫn đến tử vong do suy hô hấp

- Hệ số độc: Trong nhóm các độc tố nhuyễn thể gây liệt cơ thì STX là độc tố

Nguyễn Thị Nhung 4 Trường ĐHKH Tự Nhiên

mạnh nhất và ta quy ước nó có hệ số cao nhất là 1 Độc tố có độ mạnh thứ hai là GTX-1 và đến NEO Độc tố ít gây độc nhất là độc tố GTX-2

- Xâm nhập: qua đường ăn uống, hít thở

bào thần kinh do đó chúng gây ảnh hưởng đến hoạt cả hoạt động thần kinh và các phản ứng của hệ cơ

1.1.1 Giới thiệu về STX

- Danh pháp thường: Saxitoxin

- Danh pháp quốc tế:

3a,4,8,9-tetrahydro-1H,10H-pyrrolo(1,2-c)purine-10,10-diol

(3aS-(3a-α,4-α,10aR*))-2,6-diamino-4-(((amino-carbonyl)oxy)methyl) Công thức cấu tạo:

Hình 1.2: Công thức cấu tạo của STX

1.1.2 Giới thiệu về NEO

- Danh pháp thường: Neosaxitoxin

- Danh pháp quốc tế:

Nguyễn Thị Nhung 5 Trường ĐHKH Tự Nhiên

[(3aS,4R,10aS)-5,10,10-Trihydroxy-2,6-diiminooctahydro-1H,8H-pyrrolo[1,2-c]purin-4-yl]methyl carbamate

- Công thức cấu tạo:

Hình 1.3: Công thức cấu tạo của Neo

{4-[(carbamoyloxy)methyl]-5,10,10-trihydroxy-2,6 Công thức cấu tạo:

Hình 1.4: Công thức cấu tạo của GTX-1

Nguyễn Thị Nhung 6 Trường ĐHKH Tự Nhiên

1.1.4 Giới hạn tối đa cho phép (ML)

- Mức tối đa cho phép (ML) là giới hạn của độc tố PSP , được phép tồn tại về mặt pháp lí hoặc xem như có thể chấp nhận được ở trong nhuyễn thể hai mảnh

vỏ, mà không gây hại cho người sử dụng

Bảng 1.2: Một số nước đã đưa ra qui định giới hạn tối đa cho

phép (ML) của các PSP như sau [13]:

Đất nước/

Nguyễn Thị Nhung 7 Trường ĐHKH Tự Nhiên

Nhận xét: Hiện nay Việt Nam chưa đưa ra qui định giới hạn tối đa cho phép (ML) của các PSP Vậy chúng tôi chấp nhận giá trị ML bằng 80 µg/100g là giá trị

Ở Việt Nam, hiện tượng thủy triều đỏ xuất hiện chủ yếu ở khu vực vùng biển Nam Trung Bộ Trong đó Bình Thuận là nơi hiện tượng này xảy ra thường xuyên, hàng năm từ tháng 3 đến tháng 9 Gần đây, trong khoảng tháng 3-6/2012 ở Cát

Bà Hải Phòng cũng đã xuất “thủy triều đỏ”, tuy nhiên loại tảo này có tên Noctiluca scintillans không sinh độc tố, nên không có nguy cơ gây độc cho người [11]

 Ảnh hưởng của tảo độc trong ao tôm

Trên các ao nuôi tôm sú Penaeus monodon và P orientalis ở Đài Loan, Trung Quốc và Malaysia có nhiều giống tảo nở hoa do môi trường giàu ding dưỡng bao gồm: Euglena spp, Noctiluca scintillan, Alexdrium tamarense, Chattonella spp, chúng gây ra tình trạng thiếu oxy máu, tiết ra độc tố PSP, ASP làm giảm sinh trưởng ở tôm, gây bệnh, hoặc trực tiếp gây chết tôm

Ở Việt Nam, tảo độc Noctiluca scintillans nở hoa ở khu vực Vân Phong thuộc vùng biển Khánh Hòa đã làm chết khoảng 20 tấn tôm hùm với thiệt hại ước tính

Nguyễn Thị Nhung 8 Trường ĐHKH Tự Nhiên

khoảng 6 tỷ đồng

 Ảnh hưởng xấu đến sức khỏe con người

Ở người, nhiễm độc tố nhuyễn thể gây liệt cơ (PSP) là do ăn phải nhuyễn thể chứa độc tố này Nhuyễn thể bị nhiễm và tích lũy các loại độc tố này là do ăn tảo độc

Dấu hiệu đầu tiên của sự nhiễm độc trên người xuất hiện khoảng 5-30 phút sau khi ăn nhuyễn thể bị nhiễm với các triệu chứng: cảm giác kim châm hoặc tê nhẹ đến liệt cơ hô hấp hoàn toàn Trong trường hợp nặng có thể tử vong do liệt cơ hô hấp, xảy ra trong vòng từ 2-12h sau khi ăn thực phẩm nhiễm độc PSP

Mỗi năm, các trường hợp ngộ độc do PSP vẫn được ghi nhân trên toàn thế giới

Từ năm 1970 có khoảng 1.600 trường hợp ngộ độc do PSP đã được báo cáo, dặc biệt là ở Bắc Mỹ và Châu Âu Bên cạnh đó, có thêm khoảng 900 trường hợp ngộ độc PSP được ghi nhận ở các vùng trên thế giới mà trước đó PSP chưa được biết đến

Ở Nhật, trường hợp ngộ độc đầu tiên được ghi nhận vào cuối những năm 1960 Ở Malaysia, Philippin và Indonesia, các ca ngộ độc đầu tiên được báo cáo vào những năm 1970 và đầu những năm 1980 Trong suốt 20 năm qua, dường như có

sự gia tăng các vụ ngộ độc PSP do việc nuôi và tiêu thụ nhuyễn thể được mở rộng

 Nhóm nhuyễn thể được xác định trong những vụ ngộ độc PSP gồm chủ yếu động vật thân mềm hai mảnh vỏ gồm vẹm, ngao, hàu, điệp và sò Cần chú ý:

do PSP tích lũy trong nhuyễn thể nên chúng có thể gây ngộ độc cho người cả khi không có hiện tượng thủy triều đỏ Tác dụng độc lên động vật

PSP có thể gây độc lên nhiều động vật khác như cá, chim, ếch, gà, chuột, thỏ, chó mèo Trong các thí nghiệm trên động vật, PSP làm chết thú thử nghiệm do gây liệt hệ thống hô hấp Ngoài ra, PSP thể hiện tác dụng độc lên hệ thần kinh cơ, hệ thần kinh trung ương, hệ thống tim mạch và ở liều 1 µg/kg trọng lượng cơ thể đã

Nguyễn Thị Nhung 9 Trường ĐHKH Tự Nhiên

gây tăng huyết áp

 Hấp thụ và thải các độc tố PSP trong cơ thể thủy sản

Trong quá trình lọc thức ăn, các tế bào và bào tử của tảo giáp đã chuyển vào thực quản dạ dày của nhuyễn thể hai mảnh vỏ Nội tạng của nhuyễn thể chỉ chiếm 30% tổng khối lượng của mô mềm nhưng lại chứa đến 96% tổng độc tố Trong

cơ thể động vật nhuyễn thể, các độc tố tập trung nhanh chóng trong nội tạng và sau giảm dần Thành phần các độc tố không giống nhau mà biến đổi theo thời gian và vị trí trong động vật Cơ khép vỏ không tích lũy độc tố mà thực tế cho thấy đã làm bất hoạt độc tố Ống tiêu hóa, màng, tuyến sinh dục và mô mang giữ lại độc tố với trọng lượng khác nhau giữa các mô và giữ các loài Sau khi hấp thụ

và phân bố, các độc tố có thể bị biến đổi Các loài hai mảnh vỏ có cách xử lý và phản ứng với PSP khác nhau và sự nhạy cảm của chúng với độc chất này cũng khác nhau, ví dụ: vẹm tích lũy các độc tố PSP nhiều hơn hàu trong cùng hoàn cảnh Các nghiên cứu nuôi trong phòng thí nghiệm cho thấy vẹm hấp thụ dễ dàng các độc tố của tảo giáp nhưng với lượng độc tố tương đương như thế thì hàu ngừng lọc

1.2 Các phương pháp xác định độc tố gây liệt cơ trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ

Có hai nhóm phương pháp chính để xác định các độc tố sinh học biển trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ bao gồm nhóm phương pháp sinh học và nhóm phương pháp hoá học:

1.2.1 Các phương pháp thử sinh học

Thử nghiệm sinh học trên chuột (MBA) vẫn là phương pháp thử nghiệm chính trong hầu hết các chương trình giám sát ngộ độc thủy sản MBA được sử dụng phổ biến trên thế giới trong hơn 50 năm qua và là phương pháp chính thức của AOAC

Nguyễn Thị Nhung 10 Trường ĐHKH Tự Nhiên

PSP trong mẫu được chiết tách bằng dung dịch HCl 0,1N, dịch chiết được tiêm vào chuột theo tỷ lệ 1 mL dịch/20 g chuột, quan sát biểu hiện của chuột trong vòng 60 phút và xác định thời gian chết của chuột Dựa vào thời gian chết của chuột tra bảng Sommer sẽ xác định được giá trị đơn vị chuột (MU), từ đó tính được nồng độ độc tố PSP trong mẫu [23], [30]

Tác giả Đào Việt Hà – Viện Hải Dương Học Nha Trang [1] đã tiến hành thử nghiệm sinh học trên chuột (MBA.AOAC 1990) để xác định hàm lượng độc

tố PSP trong nghêu Meretrix lyrata tại một số vùng nuôi trọng điểm khu vực Cần Giờ Tác giả đã tiến hành tiêm phúc mạc chuột nhắt trắng (Swiss wiss) (có trọng

lượng 20g ± 2g) 1 mL dịch chiết thô, sau đó theo dõi triệu chứng và thời gian chết của chuột (nếu xảy ra) Tính toán độc lực tổng dựa theo phương pháp AOAC, 1990 Kết quả cho thấy, hàm lượng độc tố PSP ở tất cả các mẫu đều dưới mức độ phát hiện của phương pháp MBA (36 µg/100g, với hệ số CF = 0.18)

- Ưu điểm: thời gian thực hiện nhanh, có khả năng đánh giá được tổng các độc tố và không đòi hỏi trang thiết bị phức tạp

- Nhược điểm là độ nhạy thấp, không thể tự động hóa, không định danh chính xác loại chất độc, bị ảnh hưởng bởi các đặc tính động vật và đặc biệt là vấn

đề đạo đức [22], [23] Do đó, nhóm phương pháp này hiện nay không còn đáp ứng được nhu cầu và dần được thay thế bằng các phương pháp hoá học

1.2.2 Phương pháp xét nghiệm miễn dịch ELISA

ELISA (Enzym-linked immunosorbent assay) là một kĩ thuật sinh hóa để phát hiện kháng nguyên hay kháng thể trong mẫu xét nghiệm, và thường được quan sát bởi sự thay đổi màu sắc Usleber và cộng sự bằng cách sử dụng các kháng thể đa dòng đã phát triển thành công kit thử nghiệm cho STX Giới hạn phát hiện là 4 ng/g mô nhuyễn thể [26]

- Ưu điểm: Dễ thực hiện và thời gian phân tích ngắn