Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định một số ginsenosid trong thực phẩm chức năng chứa nhân sâm ( panax ginseng)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --- NGUYỄN THỊ HẠNH NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH MỘT SỐ GINSENOSID TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG CHỨA NHÂN SÂM PANAX GI

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

NGUYỄN THỊ HẠNH

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH MỘT SỐ GINSENOSID TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG CHỨA NHÂN SÂM (PANAX GINSENG)

Chuyên ngành: Hóa phân tích

Mã số: 60440118

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

HD1: TS NGUYỄN THỊ ÁNH HƯỜNG HD2: PGS.TS PHẠM THỊ THANH HÀ

HÀ NỘI - 2016

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên cho tôi gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS NGUYỄN THỊ ÁNH HƯỜNG, PGS.TS PHẠM THỊ THANH HÀ và ThS CAO CÔNG KHÁNH đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đề tài và viết luận văn

Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS.TS LÊ HỒNG HẢO, ban lãnh đạo Viện Kiểm Nghiệm An Toàn Vệ Sinh Thực Phẩm Quốc Gia và các anh chị, các bạn công tác tại Viện Kiểm định Vệ sinh An toàn Thực phẩm Quốc gia đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi được học tập và nghiên cứu trong môi trường hiện đại

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô giáo giảng dạy tại khoa Hoá, đặc biệt là các thầy cô trong bộ môn Hoá Phân tích, đã cho tôi những kiến thức quý giá trong quá trình học tập và thực hiện đề tài này

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn các anh chị, bạn bè của tập thể lớp cao học Hoá K24, đặc biệt là những người bạn trong nhóm Hoá phân tích K24 đã giúp đỡ, chia sẻ những khó khăn trong suốt quá trình tôi học tập và thực hiện đề tài này

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn động viên, chia sẻ mọi khó khăn cùng tôi

Hà Nội, ngày 20 tháng 10 năm 2016

Học viên

Nguyễn Thị Hạnh

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AOAC

Association of Official Analytical Community

Hiệp hội cộng đồng phân tích chính thức

LOQ Limit of quantification Giới hạn định lượng

RP-HPLC Reverse phase-HPLC Sắc ký lỏng pha đảo

RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối

TLC Thin layer chromatography Lớp mỏng hiện năng cao

USP United States Pharmacopeia Dược điển Hoa Kỳ

UV-VIS Ultraviolet-Visible Tử ngoại và khả kiến

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Tác dụng đặc trưng của từng loại ginsenosid 7

Bảng 1.2 Các Saponin có aglycon là protopanaxadiol 9 Bảng 1.3 Các Saponin có aglycon là protopanaxatriol 10

Bảng 1.4 Saponin với aglycon là acid oleanolic 11 Bảng 3.1 Chương trình gradient 1, 2 26 Bảng 3.2 Chương trình gradient 3, 4 27 Bảng 3.3 Danh mục các pha động HPTLC khảo sát 29

Bảng 3.4 Kết quả định lượng ginsenosid trong mẫu TPCN dạng dung dịch với số lần chiết bằng n-butanol khác nhau 34 Bảng 3.5 Độ lặp lại thời gian lưu và diện tích pic của các chất 37

Bảng 3.6 Độ lặp lại hệ số lưu giữ Rf 38 Bảng 3.7 Kết quả đánh giá độ tuyến tính của chất chuẩn Rg1, Rg1 41 Bảng 3.8 Độ lệch của từng điểm chuẩn dùng xây dựng đường chuẩn Rg1, Rb1 43 Bảng 3.9 Kết quả đánh giá độ tuyến tính của Rg1, Rb1 trên HPTLC 43 Bảng 3.10 Độ lệch chuẩn của từng điểm chuẩn dùng xây dựng đường chuẩn Rg1 44 Bảng 3.11 Độ lệch chuẩn của từng điểm chuẩn dùng xây dựng đường chuẩn Rg1 46 Bảng 3.12 Độ lặp lại của ginsenosid Rg1, Rb1 trong viên nang cứng 47 Bảng 3.13 Độ lặp lại của ginsenosid Rg1, Rb1 trong viên nang mềm 48

Bảng 3.14 Độ lặp lại của ginsenosid Rg1, Rb1 trong mẫu nước sâm 49

Bảng 3.15 Kết quả phân tích độ lặp lại của ginsenosid Rg1, Rb1 mẫu dạng bột 50

Bảng 3.16 Kết quả phân tích độ lặp lại của ginsenosid Rg1, Rb1 trong mẫu viên nang mềm trên HPTLC 51

Bảng 3.17 Độ thu hồi ginsenosid Rg1, Rb1 trong viên nang cứng 52

Bảng 3.18 Độ thu hồi ginsenosid Rg1, Rb1 trong viên nang mềm 53

Bảng 3.19 Độ thu hồi ginsenosid Rg1, Rb1 trong mẫu dung dịch 54

Bảng 3.20 Độ thu hồi ginsenosid Rg1, Rb1 trong viên nang cứng trên HPTLC 55

Bảng 3.21 Độ thu hồi ginsenosid Rg1, Rb1 trong viên nang mềm trên HPTLC 56

Bảng 3.32 Kết quả phân tích ginsenosid Rb1, Rb1 trong các TPCN 57

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Mức di động của các ginsenosid 'Rx' trên tấm sắc ký lớp mỏng 8

Hình 1.2 Cấu trúc các Saponin có aglycon là protopanaxadiol 9

Hình 1.3 Cấu trúc Saponin có aglycon là protopanaxatriol 10

Hình 1.4 Cấu trúc Saponin với aglycon là acid oleanolic 10

Hình 1.5 Công thức cấu tạo của ginsenosid Rb1 11

Hình 1.6 Công thức cấu tạo của ginsenosid Rg1 11

Hình 3.1 Sắc đồ dung dịch chuẩn ginsenosid Rg1, Rb1 với gradient 1 27 Hình 3.2 Sắc đồ dung dịch chuẩn ginsenosid Rg1, Rb1 với gradient 2 27 Hình 3.3 Sắc đồ dung dịch chuẩn ginsenosid Rg1, Rb1 với gradient 3 28 Hình 3.4 Sắc đồ dung dịch chuẩn ginsenosde Rg1, Rb1 với gradient 4 28 Hình 3.5 Hình ảnh HPTLC với hệ pha động 1 29 Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn hiệu quả chiết mẫu sử dụng MeOH ở nồng độ khác nhau 31

Hình 3.7 Sắc đồ sử dụng với dung môi chiết MeOH 70% 31 Hình 3.8 Đồ thị biểu diễn hiệu quả chiết mẫu sử dụng EtOH ở nồng độ khác nhau 32 Hình 3.9 Đồ thị biểu thị hiệu quả chiết mẫu với các dung môi hữu cơ loại lipid 33

Hình 3.10 Sơ đồ quy trình xử lý mẫu 37

Hình 3.11 Sắc đồ của mẫu trắng 39

Hình 3.12 Sắc đồ dung dịch mẫu trắng TPCN có thêm ginsenosid Rg1, Rb1 Hình 3.13 Sắc đồ dung dịch chuẩn ginsenosid Rg1,Rb1 39

Hình 3.14 Phổ hấp thụ UV của ginsenosid Rg1 40

Hình 3.15 Phổ hấp thụ UV của ginsenosid Rb1 40

Hình 3.16 Sắc đồ dung dịch thử thêm chuẩn ginsenosid 41

Hình 3.17 Đồ thị đường chuẩn Rg1, Rb1 phân tích trên HPLC 42

Hình 3.18 Sắc đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp 500pm 42

Hình 3.19 Đồ thị đường chuẩn Rg1, Rb1 trên HPTLC 44

Hình 3.20 Sắc đồ của ginsenosid Rg1 và Rb1 phân tích trên HPTLC 45

Hình 3.21 Sắc đồ ginsenosid 3,0 ppm pha trong dung dịch mẫu trắng 45

Hình 3.22 Sắc đồ phân tích độ lặp lại lần 5 của viên nang cứng 47

Hình 3.23 Sắc đồ phân tích độ lặp lại viên nang mềm lần 1 48

Hình 3.24 Sắc đồ phân tích độ lặp lại mẫu nước sâm lần 1 49

Hình 3.25 So sánh độ lặp lại của sắc đồ 10 mẫu thực phẩm chức năng chứa nhân sâm dạng bột 50

Hình 3.26 Sắc đồ phân tích độ lặp lại của ginsenosid Rg1, RB1 trong mẫu viên nang mềm trên HPTLC 51

Hình 3.27 Sắc đồ phân tích độ thu hồi của ginsenosid trong viên nang cứng lần 1

52

Hình 3.28 Sắc đồ phân tích độ thu hồi của ginsenosid trong viên nang mềm lần 1

53

Hình 3.29 Sắc đồ phân tích độ thu hồi của ginsenosid trong dung dịch lần 1 54

Hình 3.30 Sắc đồ phân tích mẫu nang cứng mã NC3 57

Hình 3.31 Sắc đồ phân tích mẫu nang mềm mã NM4 57

MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC, CHỮ VIẾT TẮT TRONG KHÓA LUẬN

DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG KHÓA LUẬN

DANH MỤC HÌNH VẼ TRONG KHÓA LUẬN

CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN 13

1.1 Tổng quan về nhân sâm và hoạt chất trong nhân sâm 13

1.1.1 Giới thiệu chung về nhân sâm 13

1.1.2 Tác dụng đặc trưng của nhân sâm 14

1.1.3 Vài nét về nhóm hoạt chất ginsenosid 15

1.1.4 Công thức cấu tạo và tính chất vật lý của ginsenosid Rg1 và Rb1 19 1.2 Tổng quan về các phương pháp phân tích ginsenosid 20

1.3 Các phương pháp xử lý mẫu Error! Bookmark not defined

1.4 Tổng quan về kỹ thuật HPTLC Error! Bookmark not defined

1.4.1 Sắc ký lớp mỏng Error! Bookmark not defined

1.4.2 Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao Error! Bookmark not defined

2.1 Mục tiêu nghiên cứu Error! Bookmark not defined

2.2 Nội dung nghiên cứu Error! Bookmark not defined

2.3 Đối tượng nghiên cứu Error! Bookmark not defined

2.4 Phương pháp nghiên cứu Error! Bookmark not defined

2.4.1 Khảo sát các điều kiện HPLC Error! Bookmark not defined

2.4.2 Khảo sát các điều kiện phân tích ginsenosid bằng HPTLC Error! Bookmark not defined

2.4.3 Xây dựng quy trình xử lý mẫu Error! Bookmark not defined

2.4.4 Thẩm định quy trình Error! Bookmark not defined

2.5 Phương pháp xử lý số liệu Error! Bookmark not defined

2.6 Nguyên vật liệu, thiết bị Error! Bookmark not defined

2.6.1 Thiết bị và dụng cụ Error! Bookmark not defined

2.6.2 Hóa chất, thuốc thử Error! Bookmark not defined

2.6.3 Dung dịch chuẩn Error! Bookmark not defined

CHƯƠNG 3 – THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ Error! Bookmark not defined

3.1 Lựa chọn điều kiện sắc ký để phân tích ginsenosid bằng HPLC Error!

Bookmark not defined

3.2 Thiết lập điều kiện sắc ký để phân tích ginsenosid bằng HPTLC Error!

Bookmark not defined

3.3 Xây dựng quy trình xử lý mẫu Error! Bookmark not defined

3.4 Thẩm định phương pháp Error! Bookmark not defined

3.4.1 Tính thích hợp hệ thống Error! Bookmark not defined

3.4.2 Tính chọn lọc, tính đặc hiệu Error! Bookmark not defined

3.4.3 Khoảng tuyến tính Error! Bookmark not defined

3.4.4 Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng Error! Bookmark not defined

3.4.5 Độ lặp lại của phương pháp Error! Bookmark not defined

3.4.6 Độ thu hồi của phương pháp Error! Bookmark not defined

3.4.7 Kết quả áp dụng phương pháp xác định ginsenosid Rg1, Rb1 trong một số

sản phẩm Error! Bookmark not defined

KẾT LUẬN Error! Bookmark not defined

TÀI LIỆU THAM KHẢO 21

PHỤ LỤC Error! Bookmark not defined

Phụ lục 1: Sắc đồ đường chuẩn Error! Bookmark not defined

Phụ lục 2: Sắc đồ khảo sát độ lặp lại Error! Bookmark not defined Phụ lục 3: Sắc đồ khảo sát độ thu hồi Error! Bookmark not defined

MỞ ĐẦU

Từ xa xưa, nhân sâm (tên khoa học là Panax Ginseng) đã được xem là thảo dược quý hiếm Hoạt chất chính tạo nên tác dụng kỳ diệu của nhân sâm là thành phần ginsenosid Hợp chất này được phân thành hai nhóm chính là nhóm Rb1 và nhóm Rg1 Vài năm gần đây nhiều nhà khoa học hướng tới sự quan tâm đặc biệt tới nhân sâm với rất nhiều nghiên cứu được công bố Ở Việt Nam cũng như trên thế giới, nhân sâm được biết đến không chỉ

là nguồn dinh dưỡng quý báu mà còn là một vị thuốc vô cùng quan trọng Theo nghiên cứu khoa học và sách đông y thì nhân sâm có nhiều tác dụng tốt cho sức khỏe con người

Ở Việt Nam hiện nay, nhu cầu sử dụng nhân sâm tăng cao Nguồn nguyên liệu này chủ yếu được nhập từ Trung Quốc, Hàn Quốc… nên rất dễ bị giả mạo, sản phẩm nhập về chất lượng không đáp ứng được chất lượng Vì vậy việc kiểm soát tính đúng và chất lượng nguyên liệu đầu vào là rất quan trọng Tuy nhiên, việc kiểm nghiệm chất lượng nguyên liệu nhân sâm và thực phẩm chức năng chứa nhân sâm ở nước ta vẫn còn nhiều hạn chế dẫn tới tình trạng người dân sử dụng nhầm dược liệu hoặc mua phải dược liệu đã bị chiết hết hoạt chất, kém chất lượng Điều này không những gây ảnh hưởng đến sức khỏe của người bệnh, quyền lợi người tiêu dùng mà còn gây mất lòng tin của mọi người khi sử dụng thuốc từ dược liệu nói chung, gây tổn hại cho ngành Y tế và Kinh tế của đất nước Thông thường các phương pháp được sử dụng để phân tích hàm ginsenosid Rg1 và Rb1 bao gồm: các phương pháp sắc ký khí khối phổ (GC-MS), điện di mao quản (CE), sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS), sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPTLC), sắc ký bản mỏng hiệu năng cao (HPTLC) ở Việt Nam phương pháp được sử dụng chủ yếu là phương pháp HPLC Phương pháp HPLC được áp dụng tại viện Kiểm Nghiệm An Toàn Vệ Sinh Thức Phẩm Quốc Gia để định tính và định lượng ginsenosid trong thực phẩm chức năng có chứa nhân sâm Tuy nhiên chưa có tiêu chuẩn về việc định lượng ban hành ở Việt Nam Do vậy việc áp dụng phụ thuộc vào điều kiện phòng thí nghiệm cụ thể Ngoài ra, phương pháp HPTLC cho thấy tiềm năng áp dụng để kiểm tra nhanh chất lượng của nhân sâm và các sản phẩm từ sâm Do vậy chúng tôi lựa chọn đề tài nghiên cứu với hi vọng xây dựng một phương pháp nhằm so sánh, kiểm chứng phương pháp phân tích Xuất phát từ những

yêu cầu trên, chúng tôi tiến hành đề tài : “Nghiên cứu phương pháp xác định một số

ginsenosid trong thực phẩm chức năng chứa nhân sâm (Panax Ginseng)”

Mục tiêu nghiên cứu:

 Xây dựng phương pháp xác định đồng thời hai ginsenosid (Rg1 và Rb1) bằng

kỹ thuật HPTLC và HPLC

 Thẩm định phương pháp đã đã xây dựng theo các tiêu chí của thế giới

 Áp dụng triển khai phân tích một số mẫu thực phẩm chức năng chứa nhân sâm trên thị trường Hà Nội

CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về nhân sâm và hoạt chất trong nhân sâm

1.1.1 Giới thiệu chung về nhân sâm

Bộ phận thường sử dụng là rễ củ đã được phơi hay sấy khô của Nhân sâm (Panax ginseng C.A Meyer) thuộc họ Nhân sâm (Araliaceae) Họ Nhân sâm (Araliaceae Juss.)

còn có tên gọi khác là họ Ngũ gia bì Hầu như tất cả các loài trong họ nhân sâm (Araliaceae) đều được sử dụng làm thuốc trong Y học cổ truyền ở nhiều nước Á-Âu; đặc biệt là ở các nước Đông-Bắc Á Sâm trồng gọi là viên sâm, sâm mọc hoang gọi là sơn sâm

Viên sâm: Sâm trồng, phơi hoặc sấy khô, rễ cái có hình thoi hoặc hình trụ tròn, dài

khoảng 3 - 15 cm, đường kính 1 - 2 cm, mặt ngoài màu vàng hơi xám, phần trên hoặc toàn bộ rễ có nếp nhăn dọc rõ, có khía vân ngang, thô, không liên tục, rải rác và nông phần dưới có 2 - 3 rễ nhánh và nhiều rễ con nhỏ, dài, thường có mấu dạng củ nhỏ không

rõ Thân rễ (Lô đầu) sát ở đầu rễ, dài 1 - 4 cm, đường kính 0,3 - 1,5 cm, thường cong và

co lại, có rễ phụ (gọi là Đinh) và có vết sẹo thân, tròn, lõm, thưa (gọi là Lô uyển) Chất tương đối cứng, mặt bẻ màu trắng hơi vàng, có tinh bột rõ, tầng phát sinh vòng tròn, màu vàng hơi nâu, vỏ có ống tiết nhựa, dạng điểm, màu vàng nâu và những kẽ nứt dạng xuyên tâm Mùi thơm đặc trưng, vị hơi đắng và ngọt

Hồng sâm: Hấp, sấy và phơi khô rễ viên sâm thu được Hồng sâm; Hồng sâm có dạng rễ

cái hình thon hoặc hình trụ, dài khoảng 3 - 15 cm, đường kính 1 - 2 cm, mặt ngoài trong

mờ, màu nâu hơi đỏ, đôi khi có một vài vết đốm màu nâu hơi vàng thẫm, có rãnh dọc, vân nhăn và các vết sẹo rễ con; phần đầu rễ cái có các vòng tròn gián đoạn, không rõ nét, phần đuôi rễ cái mang 2-3 rễ nhánh vặn xoắn, chéo nhau và nhiều rễ con cong queo, hoặc chỉ mang những vết sẹo thân, tròn, lõm (Lô uyển); một số thân rễ mang 1 - 2 rễ phụ, còn nguyên dạng hoặc đã gẫy (gọi là đinh) Chất cứng và giòn, mặt bẻ gẫy nhẵn, tựa như sừng Mùi thơm đặc trưng, vị ngọt và hơi đắng

Sơn sâm: Nhân sâm mọc hoang, phơi hay sấy khô Dược liệu là rễ cái, dài bằng hoặc

ngắn hơn thân rễ, có hình chữ V, hình thoi hoặc hình trụ, dài 2 - 10 cm, mặt ngoài màu vàng hơi xám, có vân nhăn dọc, đầu trên có các vòng vân ngang, trũng sâu, dày đặc, thường có 2 rễ nhánh, các rễ con trông rõ ràng, mảnh dẻ, nhỏ sắp xếp có thứ tự; có mấu nổi lên rõ gọi là “mấu hạt trân châu” Thân rễ mảnh dẻ, nhỏ, dài, bộ phận trên có các vết sẹo thân, dày đặc, các rễ phụ tương đối dày đặc, trông tựa như hình hạt táo

Nhân sâm mọc hoang và được trồng ở đông bắc Trung quốc, Triều Tiên, Liên xô cũ Việc trồng trọt nhân sâm rất công phu, sau 5-6 năm mới thu hoạch Đất phải tốt Cây ưa bóng râm Thu hoạch vào mùa xuân và mùa thu, rễ củ được rửa sạch, phơi nắng nhẹ, hoặc sấy nhẹ đến khô Người ta cho rằng loại mọc hoang có giá trị hơn loại trồng Hiện nay nước

ta chưa trồng được, còn phải nhập nhân sâm của nước ngoài

Hiện nay các nhà khoa học đã tìm ra trong nhân sâm có chứa nhiều thành phần khác nhau, tuy nhiên ginsenosid, chính là thành phần quyết định tác dụng của nhân sâm Đây chính là chất có khả năng tạo ra những ảnh hưởng tích cực đối với sức khỏe

1.1.2 Tác dụng đặc trưng của nhân sâm

Theo y học cổ truyền nhân sâm có công dụng: Đại bổ nguyên khí, ích huyết, kiện tỳ ích phế, sinh tân, an thần ích trí Chủ trị: Khí hư muốn thoát, chân tay lạnh, mạch vi, tỳ hư, kém

ăn, phế hư ho suyễn; tân dịch thương tổn, miệng khát nước, nội nhiệt tiêu khát, đái tháo, bệnh lâu ngày gầy yếu, tâm hồi hộp, suy tim kiệt sức, hay choáng ngất Thành phần hoạt chất của ginsenosid trong nhân sâm có tác dụng đặc trưng khác nhau được tóm tắt trong bảng 1.1

Bảng 1.1 Tác dụng đặc trưng của từng loại ginsenosid

Ro Phân giải rượu, chống viêm gan và phục hồi hư tổn gan

Rb1 Là Saponin có thể kiểm chế hệ thống thần kinh trung ương làm