Đánh giá tính an toàn và tính sinh miễn dịch của vắc xin Rotavin-M1 do Việt Nam sản xuất

Trường hợp tiêu chảy có RV trong phân sau khi uống vắc xin liều 1 ở các nhóm nghiên cứu .... Hiệu giá kháng thể IgA kháng virut Rota trong huyết thanh của các đối tượng uống vắc xin nghi

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

VIỆN VỆ SINH DỊCH TỄ TRUNG ƯƠNG

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

VIỆN VỆ SINH DỊCH TỄ TRUNG ƯƠNG

Người hướng dẫn khoa học

1 PGS.TS Nguyễn Đăng Hiền

2 GS.TS Đặng Đức Anh

HÀ NỘI – 2014

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan bản luận án tiến sỹ này là công trình nghiên cứu thực

sự của cá nhân tôi Các kết quả nghiên cứu và phân tích là trung thực và chưa từng được công bố dưới bất cứ hình thức nào bởi bất cứ ai khác

Tác giả

Bùi Đức Nguyên

- GS.TS Đặng Đức Anh – Phó viện trưởng Viện Vệ Sinh Dịch Tễ Trung Ương

Các thầy đã luôn tận tâm giúp đỡ, khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án

- Tôi xin cảm ơn PGS.TS Lê Thị Luân, TS Nguyễn Vân Trang, TS Vũ Đình

Thiểm đã quan tâm giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu

Tôi xin chân thành cảm ơn:

- Viện Vệ Sinh Dịch Tễ Trung Ương và cơ sở đào tạo sau đại học của Viện đã

giúp đỡ và tạo điều kiện để tôi hoàn thành luận án này

- Trung tâm nghiên cứu sản xuất vắc xin và sinh phẩm y tế đã tạo điều kiện,

giúp đỡ tôi nghiên cứu và hoàn thành luận án

- Đảng ủy ban giám đốc bệnh viện Bạch Mai tạo điều kiện để tôi nghiên cứu

và hoàn thành luận án

- Ban lãnh đạo khoa truyền nhiễm, các anh chị em đồng nghiệp và toàn thể

nhân viên khoa truyền nhiễm bệnh viện Bạch Mai

- Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong hội đồng, các nhà khoa

học đã đóng góp nhiều ý kiến quý báu để tôi hoàn thành luận án

Cuối cùng, tôi bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình tôi và bạn bè thân thiết luôn ủng hộ và hỗ trợ về mọi mặt trong cuộc sống để tôi có thể hoàn thành luận án này

Xin trân trọng cảm ơn!

Hà Nội, tháng 7 năm 2014

Bùi Đức Nguyên

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1:TỔNG QUAN 3

1.1 Virut Rota 3

1.1.1 Hình thái 5

1.1.2 Cấu trúc 5

1.1.3 Protein 7

1.1.4 Khả năng gây bệnh 10

1.1.5 Dự phòng 10

1.1.6 Điều trị 11

1.2 Dịch tễ học 11

1.2.1 Đường lây truyền 11

1.2.2 Mùa bệnh 12

1.2.3 Lứa tuổi mắc bệnh 12

1.2.4 Chủng lưu hành 12

1.3 Tình hình nghiên cứu sản xuất vắc xin Rota trên thế giới 17

1.3.1 Vắc xin đơn giá 17

1.3.2 Vắc xin đa giá 19

1.3.3 Hướng phát triển vắc xin khác 20

1.4 Nghiên cứu sản xuất vắc xin Rota ở Việt Nam 21

1.5 Các giai đoạn thử nghiệm lâm sàng 26

1.5.1 Giai đoạn tiền lâm sàng 27

1.5.2 Giai đoạn I 30

1.5.3 Giai đoạn II 31

1.5.4 Giai đoạn III 31

1.5.5 Giai đoạn IV 32

1.6 Các vấn đề cần lưu ý trong thử nghiệm vắc xin trên người 32

1.6.1 Đề cương nghiên cứu 34

1.6.2 Lựa chọn đối tượng tình nguyện tham gia nghiên cứu 35

1.6.3 Phân nhóm 37

1.6.4 Giai đoạn giám sát 38

1.6.5 Các nghiên cứu sau khi vắc xin được cấp giấy phép 40

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 44

2.1 Đối tượng, phương pháp nghiên cứu 44

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 44

2.1.2 Tiêu chuẩn lựa chọn 44

2.1.3 Tiêu chuẩn loại trừ 45

2.2 Vật liệu nghiên cứu 46

2.2.1 Các nguyên vật liệu, dụng cụ dùng cho uống vắc xin, lấy mẫu và xét nghiệm trong phòng thí nghiệm 46

2.2.2 Vắc xin thử nghiệm 47

2.2.3 Vật liệu thu thập thông tin nghiên cứu 49

2.3 Phương pháp nghiên cứu 50

2.3.1 Phương pháp nghiên cứu giai đoạn 1 50

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu giai đoạn 2 53

2.3.3 Phương pháp nghiên cứu giai đoạn 3 60

2.4 Vấn đề y đức trong nghiên cứu……… 63

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 64

3.1 Kết quả nghiên cứu tính an toàn 64

3.1.1 Tính an toàn trên người trưởng thành 64

3.1.2 Kết quả nghiên cứu tính an toàn trên trẻ em 71

3.2 Kết quả nghiên cứu liều và lịch sử dụng 96

3.2.1 Hiệu giá kháng thể IgA ở các nhóm nghiên cứu 96

3.2.2 Sự biến đổi hiệu giá IgG trong huyết thanh trẻ trước và sau khi

uống các liều vắc xin ở các nhóm nghiên cứu 99

3.2.3 Đáp ứng kháng thể 1 năm sau khi uống vắc xin – So sánh giữa Rotavin-M1 và Rotarix 100

3.3 Kết quả nghiên cứu tính sinh miễn dịch 103

3.3.1 Hiệu giá kháng thể trước khi uống vắc xin 103

3.3.2 Kết quả chuyển đổi huyết thanh sau 1 tháng uống liều 2 105

3.3.3 Hiệu giá kháng thể trung bình nhân sau khi uống vắc xin/giả dược (M2) 107 3.3.4 Phân bố hiệu giá kháng thể IgA trong các đối tượng nghiên cứu 111

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 114

4.1 Tính an toàn của vắc xin Rotavin-M1 114

4.1.1 Tính an toàn trên người lớn 114

4.1.2 Tính an toàn trên trẻ em ở giai đoạn 2 115

4.1.3 Tính an toàn trên trẻ em ở giai đoạn 3 118

4.2 Đánh giá liều và lịch uống vắc xin trên trẻ nhỏ 118

4.3 Đánh giá tính sinh miễn dịch của vắc xin Rotavin ở trẻ em tại Thái Bình và Thanh Sơn, Phú Thọ 123

KẾT LUẬN 125

KIẾN NGHỊ 126 DANH MụC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CứU ĐÃ CÔNG Bố CÓ LIÊN QUAN ĐếN LUậN ÁN

TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC

FFU Fluorescent focus-forming unit Đơn vị huỳnh quang

GMT Geometric mean titer Hiệu giá kháng thể trung bình nhân

NIHE National Institue of Hygiene and

Epidemiology

Viện vệ sinh Dịch tễ Trung ương

POLYVAC Center for Research and

Production of Vaccines and Biologicals

Trung tâm Nghiên cứu, sản xuất Vắc xin và Sinh phẩm y tế

RT-PCR Reverse Transcription

polymerase chain reaction

Phản ứng khuếch đại chuỗi gen sao chép ngược

SGOT Serum Glutamat Oxalacetat

Transaminase

Men gan SGOT

SGPT Serum Glutanric Pyruvic

Transaminase

Men gan SGPT TCID50 Tissue culture infectous dose

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Các gen và protein của RV 9 Bảng 3.1 Tóm tắt các đặc điểm nhân khẩu học ở những người tình nguyện 64 Bảng 3.2 Kết quả xét nghiệm máu ở người tình nguyện trước khi uống, so

sánh với chỉ số bình thường 65 Bảng 3.3 Tỷ lệ người tình nguyện có biểu hiện sốt (trên 38oC) trong vòng

30 ngày sau mỗi liều 67 Bảng 3.4 Tỷ lệ có những triệu chứng đáng chú ý trong vòng 30 ngày sau

mỗi liều vắc xin 68 Bảng 3.5 So sánh các kết quả xét nghiệm huyết học và sinh hóa lần 1 và lần 2 69 Bảng 3.6 So sánh các kết quả xét nghiệm huyết học và sinh hóa lần 1 và lần 3 70 Bảng 3.7 Tuổi của trẻ tham gia nghiên cứu sau các liều vắc xin ở các

nhóm uống vắc xin khác nhau 71 Bảng 3.8 Kết quả xét nghiệm máu ở trẻ ở các nhóm trước khi uống 72 Bảng 3.9 Trường hợp tiêu chảy có RV trong phân sau khi uống vắc xin liều 1

ở các nhóm nghiên cứu 84 Bảng 3.10 Trường hợp tiêu chảy có RV trong phân sau khi uống vắc xin liều 2

ở các nhóm theo liều uống 84 Bảng 3.11 Trường hợp tiêu chảy có RV trong phân sau khi uống vắc xin liều

3 ở các nhóm theo liều uống 85 Bảng 3.12 Tổng hợp trẻ tham gia nghiên cứu trong giai đoạn III 86 Bảng 3.13 Tuổi (ngày) của trẻ tham gia nghiên cứu tại các thời điểm tham

gia nghiên cứu 87 Bảng 3.14 Cân nặng (kg) của trẻ tại các thời điểm tham gia nghiên cứu 88 Bảng 3.15 Chiều cao (cm) của trẻ tham gia nghiên cứu tại các thời điểm

tham gia nghiên cứu 88

Bảng 3.16 Các triệu chứng không mong muốn ở trẻ uống vắc xin/giả dược 7

ngày sau mỗi liều tại cả 2 địa điểm nghiên cứu 89 Bảng 3.17 Các triệu chứng không mong muốn ở trẻ tham gia nghiên cứu tại

cả 2 địa điểm nghiên cứu 8-30 ngày sau khi uống liều 1 và 2 91 Bảng 3.18 Mẫu phân tiêu chảy thu thập được trong thời gian nghiên cứu và

khả năng phân lập RV trong phân 94 Bảng 3.19 Một số đặc điểm lâm sàng trẻ tiêu chảy trong phân có virut Rota 95 Bảng 3.20 Hiệu giá kháng thể IgA kháng virut Rota trong huyết thanh của

các đối tượng uống vắc xin nghiên cứu và vắc xin Rotarix 96 Bảng 3.21 Hiệu giá kháng thể RV-IgA ở nhóm R (Rotavin) và nhóm E

(Rotarix) tại các thời điểm (trước khi tham gia nghiên cứu Mo, 3

và 12 tháng sau liều 1 vắc xin (M2 và M3) 101 Bảng 3.22 Tỷ lệ đối tượng có kháng thể IgA kháng virut Rota dương tính

thời điểm 1 năm sau liều 1 102 Bảng 3.23 Tỷ lệ trẻ có kháng thể RV-IgA trước khi uống vắc xin/giả dược 103 Bảng 3.24 So sánh các mức hiệu giá kháng thể IgG ở trẻ trước khi uống vắc

xin/giả dược tại 2 địa điểm nghiên cứu 104 Bảng 3.25 Tỷ lệ chuyển đổi kháng thể IgA tại thời điểm 1 tháng sau uống

liều 2 106 Bảng 3.26 Hiệu giá trung bình nhân của kháng thể IgA trước và sau khi

uống vắc xin/giả dược tại các địa điểm nghiên cứu 107 Bảng 3.27 Hiệu giá trung bình nhân của kháng thể IgG tại các thời điểm

thăm khám 108

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Sự phân bố các chủng RV trên toàn cầu 5

Hình 1.2 Ảnh chụp RV dưới kính hiển vi điện tử 5

Hình 1.3 Sơ đồ cấu trúc hạt virut Rota và các vùng mã hóa protein 6

Hình 1.4 Hình ảnh hạt virut Rota G1P dưới kính hiển vi điện tử tại lần cấy truyền thứ 30 trên tế bào thận khỉ tiên phát chụp dưới kính hiển vi điện tử - Viện VSDTTƯ 22

Hình 1.5 Tóm tắt qui trình phát triển một loại thuốc mới 26

Hình 1.6 Tóm tắt các giai đoạn thử nghiệm vắc xin 33

Hình 2.1 Sơ đồ tuyển chon và phân nhóm đối tượng giai đoạn 1 50

Hình 2.2 Sơ đồ uống vắc xin và lấy mẫu theo dõi an toàn giai đoạn 1 51

Hình 2.3 Sơ đồ tuyển chọn và phân nhóm đối tượng giai đoạn 2 54

Hình 2.4 Sơ đồ uống vắc xin và lấy mẫu xét nghiệm giai đoạn 2 nhóm C, E và N 55

Hình 2.5 Sơ đồ uống vắc xin và lấy mẫu xét nghiệm giai đoạn 2 nhóm B và R 55 Hình 2.6 Tóm tắt tuyển chọn và thực hiện cho uống vắc xin tại Thành phố Thái Bình 60

Hình 2.7 Tóm tắt tuyển chọn và thực hiện cho uống vắc xin tại Thanh Sơn - Phú Thọ 61

Hình 2.8 Tóm tắt tuyển chọn và thực hiện cho uống vắc xin cả hai địa điểm 62

Hình 2.9 Sơ đồ uống vắc xin và lấy mẫu xét nghiệm giai đoạn 3 63

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Đồ thị 1 Chủng lưu hành gây bệnh theo týp G từ 1998 – 2009 16

Đồ thị 2 Chủng lưu hành gây bệnh theo týp P từ 2000 - 2011 17

Biểu đồ 3.1 So sánh chỉ số men gan trung bình trước khi uống và sau mỗi liều vắc xin Đường kẻ ngang thể hiện chỉ số bình thường 70

Biểu đồ 3.2 Chỉ số hồng cầu ở trẻ trước và sau khi uống vắc xin ở các nhóm khác nhau 73

Biểu đồ 3.3 Chỉ số bạch cầu ở trẻ trước và sau khi uống vắc xin 73

Biểu đồ 3.4 Chỉ số tiểu cầu ở trẻ trước và sau khi uống vắc xin 73

Biểu đồ 3.5 Nồng độ SGOT trước và sau khi uống vắc xin 74

Biểu đồ 3.6 Nồng độ SGPT ở trẻ trước và sau khi uống vắc xin 74

Biểu đồ 3.7 Nồng độ urê trong huyết thanh trẻ trước và sau khi uống vắc xin 74

Biểu đồ 3.8 Tỷ lệ trẻ có các biểu hiện không mong muốn trong vòng 7 ngày sau liều 1 ở các nhóm nghiên cứu 76

Biểu đồ 3.9 So sánh tỷ lệ trẻ ở các nhóm có phản ứng không mong muốn từ ngày thứ 8 đến ngày 30 sau liều 1 77

Biểu đồ 3.10 Tỷ lệ trẻ có triệu chứng không mong muốn trong vòng 1 - 7 ngày sau khi uống liều 2 79

Biểu đồ 3.11 Tỷ lệ trẻ có triệu chứng không mong muốn từ ngày 8-30 sau khi uống liều 2 80

Biểu đồ 3.12 Tỷ lệ trẻ có các triệu chứng không mong muốn trong vòng 7 ngày sau liều 3 81

Biểu đồ 3.13 Tỷ lệ trẻ có triệu chứng không mong muốn trong vòng 8-30 ngày sau liều 3 82

Biểu đồ 3.14 Các triệu chứng không mong muốn trong 7 ngày uống liều 1 và 2 ở trẻ tham gia nghiên cứu tại Thành phố Thái Bình và huyện Thanh Sơn, tỉnh Phú Thọ 90

Biểu đồ 3.15 Các dấu hiệu/ triệu chứng từ ngày 8 – 30 sau uống liều 1 và 2 tại Thành phố Thái Bình và huyện Thanh sơn, Phú Thọ 92

Biểu đồ 3.16 Các triệu chứng không mong muốn ở cả 2 địa điểm nghiên cứu

trong vòng 30 ngày sau mỗi liều vắc xin/giả dược 93 Biểu đồ 3.17 Tỷ lệ trẻ có động lực IgA 1 tháng sau liều vắc xin cuối cùng ở

các nhóm nghiên cứu 97 Biểu đồ 3.18 Đáp ứng kháng thể RV- IgA sau 2 liều và 3 liều vắc xin ở

nhóm C và N 98 Biểu đồ 3.19 Tỷ lệ trẻ có chuyển đổi kháng thể RV-IgG trong huyết thanh ở

các nhóm nghiên cứu 99 Biểu đồ 3.20 Hiệu giá kháng thể RV-IgG trước và sau khi uống vắc xin ở

các nhóm nghiên cứu 99 Biểu đồ 3.21 Hiệu giá RV-IgA ở 2 nhóm nghiên cứu tại các thời điểm 101 Biểu đồ 3.22 Sự phân bố các mức hiệu giá kháng thể IgG ở trẻ trước khi

uống vắc xin tại 2 địa điểm nghiên cứu 105 Biểu đồ 3.23 Tỷ lệ chuyển đổi kháng thể IgA tại thời điểm 1 tháng sau

uống liều 2 106 Biểu đồ 3.24 Hiệu giá trung bình nhân của kháng thể IgA trước và sau khi

uống vắc xin/giả dược tại các địa điểm nghiên cứu 107 Biểu đồ 3.25 Tỷ lệ giữa hiệu giá kháng thể IgG trong mẫu M2 và mẫu Mo ở

trẻ tham gia nghiên cứu 109 Biểu đồ 3.26 Hiệu giá trung bình nhân của kháng thể IgG tại các thời điểm

thăm khám 110 Biểu đồ 3.27 Tổng hợp phân bố hiệu giá IgA sau liều 2 tại Thành phố

Thái Bình 111 Biểu đồ 3.28 Tổng hợp phân bố hiệu giá IgA sau liều 2 tại Thanh Sơn –

Phú Thọ 112 Biểu đồ 3.29 Tổng hợp phân bố hiệu giá IgA sau liều 2 tại 2 địa điểm

nghiên cứu 112

20 – 40% Hàng năm, trên thế giới có khoảng trên 600 nghìn trẻ chết vì tiêu chảy do virut Rota, chiếm 5% số ca chết vì mọi nguyên nhân ở trẻ em dưới

5 tuổi [6],[13],[49],[116]

Tại Việt Nam, hàng năm tỷ lệ mắc tiêu chảy do virut Rota chiếm trên 50% trong tổng số trẻ em dưới 5 tuổi bị tiêu chảy vào điều trị tại một số Bệnh viện Nhi lớn của Việt Nam [6], [99], [114]

Như vậy, tiêu chảy do virut Rota ở trẻ em là một gánh nặng đối với tất cả các nước trên thế giới Việc cải thiện điều kiện vệ sinh cũng không làm giảm tỷ

lệ mắc tiêu chảy do virut Rota, do vậy biện pháp phòng bệnh hiệu quả nhất hiện nay là sử dụng vắc xin Hiện nay, nhiều nước trên thế giới đã và đang đặc biệt quan tâm đến vấn đề sản xuất vắc xin phòng bệnh do virut Rota [11], [14], [46] Tại Việt Nam, từ năm 2008, vắc xin Rotarix của Hãng Glaxo Smith Kline đã được đưa vào sử dụng trên thị trường Tuy nhiên, giá thành của vắc xin này rất cao >700.000 đồng/liều Do vậy không nhiều người dân có đủ điều kiện để sử dụng vắc xin này cho con em họ

Từ thực tế đó, POLYVAC được Bộ Y tế giao nhiệm vụ nghiên cứu sản xuất vắc xin Rota nhằm chủ động nguồn vắc xin cho nhu cầu trong nước thông qua đề tài nghiên cứu qui trình công nghệ sản xuất vắc xin Rota tại Việt Nam Đề tài đã được nghiệm thu đạt kết quả xuất sắc Để triển khai bước tiếp

theo nhằm tiến tới xin cấp đăng ký sử dụng vắc xin Rota tại Việt Nam, chúng tôi đã sử dụng sản phẩm của đề tài cấp nhà nước nói trên là các loạt vắc xin Rotavin-M1 đã được đánh giá trong phòng thí nghiệm và tiền lâm sàng và được Viện Kiểm định Quốc gia Vắc xin và Sinh phẩm Y tế cấp giấy chứng

nhận chất lượng để tiến hành đề tài: “Đánh giá tính an toàn và tính sinh

miễn dịch của vắc xin Rotavin-M1 do Việt Nam sản xuất”

Mục tiêu của luận án:

1 Đánh giá tính an toàn của vắc xin Rotavin-M1 do Việt Nam sản xuất

2 Đánh giá tính sinh miễn dịch của vắc xin Rotavin-M1 do Việt Nam sản xuất

3 Xác định liều dùng và lịch sử dụng thích hợp

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Virut Rota

Virut Rota (RV) là virut không màng, có vật liệu di truyền ARN kép,

thuộc họ Reoviridae [17],[18],[78] Họ này gồm có các nhóm: Reovirut, Coltivirut, Cypovirut, Fijivirut, Orbivirut, Phytoreovirut, Oryzavirut, Reovirut RV gây bệnh ở động vật có vú, chim, bò sát Virut có hình khối

tròn, đường kính trung bình từ 65-70 nm, giống như một cái bánh xe có các gai ngắn và một cái vành rất nhẵn do vậy có tên là RV [48]

RV được chia thành 7 nhóm; A, B, C, D, E, F và G, trong đó chỉ có nhóm A, B, C gây bệnh cho cả người và động vật [83] Nhóm D, E, F, G chỉ thấy ở động vật Nhóm A hay gặp nhất, gây ra hầu hết các vụ dịch tiêu chảy nặng ở trẻ em Nhóm B thường gây ra những vụ dịch tiêu chảy nặng trên người lớn ở Trung Quốc, còn nhóm C gây ra các trường hợp lẻ tẻ trong các vụ dịch tiêu chảy ở trẻ VP6 là kháng nguyên quyết định nhóm và phân nhóm, I hoặc II [28],[29],[30]

Các týp huyết thanh và genotype

Týp huyết thanh của RV được đặc trưng bởi hai protein capsid lớp ngoài là VP4 và VP7, xác định bởi kỹ thuật trung hoà, sử dụng kháng huyết thanh tạo ra ở động vật [124] Giống như virut cúm, phân loại RV dựa trên cùng một lúc VP4 (týp huyết thanh P) và VP7 (týp huyết thanh G) Ví dụ chủng Wa (G1P1A) phân lập từ người thuộc nhóm A, phân nhóm II, týp huyết thanh G1 và P1A, còn chủng DS-1 (G2P1B) thuộc nhóm A, phân nhóm I, týp huyết thanh G2 và P1B Gần đây RV còn được phân loại dựa theo genotype Đối VP7, týp huyết thanh G (phân loại bằng kỹ thuật trung hoà) và genotype G (xác định bằng RT-PCR) có mối liên quan chặt chẽ với

nhau, do vậy có thể sử dụng 2 thuật ngữ này tương đương [123],[138] Có 14 týp huyết thanh G đã phân lập được Tuy nhiên, đối với VP4, tồn tại song song 2 hệ phân loại theo týp huyết thanh (13 týp) và genotype (21 genotypes)

Do 2 hệ phân loại này không trùng lặp, cả 2 thuật ngữ đều được sử dụng để miêu tả chủng RV; ví dụ chủng Wa được ký hiệu là P1A [8] trong đó P1A là týp huyết thanh 1A và [8] là genotype (số trong ngoặc đơn vuông) Tuy nhiên, việc tạo kháng thể chỉ kháng VP4 rất khó khăn (do tỷ lệ VP4 trong hạt virut nhỏ, 1.5% so với tỷ lệ VP7 30%), xu hướng phân loại RV hiện nay dựa trên genotype (xác định bằng RT-PCR) [1],[30]

14 genotype G đã được nhận dạng ở RV nhóm A Các týp 1, 2, 3 và 4

là các genotype chiếm đa số còn lại các týp 5,6, 7, 8, 9, 10, 12 chiếm thiểu số trong các týp gây bệnh ở người Có ít nhất 21 genotype P đã được phát hiện tại thời điểm của bài viết này (tương đương với 12 týp huyết thanh), 8 trong

số đó phát hiện ở người là P1A [8], P1B [4], P2A [6], P3 [9], P4 [10], P5A [3], P8 [11], P11 [14] Các chủng có sự kết hợp giữa G và P genotype bắt đầu xuất hiện với chiều hướng tăng

Về mặt lý thuyết sẽ có rất nhiều chủng RV của người khác nhau bởi khả năng kết hợp của các genotype G (14 chủng) và P (21 chủng) Các kết hợp G và P thường gặp là G1P[8], G3P[8], G4P[8], G2P[4] Đây là một thuận lợi cho mục đích phát triển vắc xin Tuy nhiên, sự lưu hành của các chủng RV

có khác nhau đáng kể ở các vùng khí hậu khác nhau, một số chủng không thông thường lại phân bố ở một vài quốc gia đang phát triển, týp huyết thanh G9[6] chiếm 9,5% tổng số các chủng RV ở Ấn Độ [15]

Ở Việt Nam theo nghiên cứu dịch tễ học phân tử RV trên trẻ em dưới 5 tuổi nhập viện do tiêu chảy từ năm 2000 - 2003 cho thấy chủng G1P [8] chiếm đa số Ngoài ra có một tỷ lệ nhỏ các chủng G1P [4], G2P [4], G4P [8], G4P [6],… Tuy nhiên, từ năm 2006 đến nay, tỷ lệ lưu hành của chủng G1P[8]

đã giảm dần, thay vào đó là sự lưu hành rộng rãi của chủng G3P [6] hoặc G3P[8] [6, 7, 8, 9, 10, 114]

G1P8 G2P4 G3P8 G4P8 Hỗn hợp

C ác l oại k hác 53%

Hình 1.2 Ảnh chụp RV dưới kính hiển vi điện tử [42]

1.1.2 Cấu trúc

Dưới kính hiển vi điện tử, virut Rota có dạng khối cầu 20 mặt, đường kính khoảng 75nm [14,101,120] Chuỗi nucleocapsid của virut được tạo thành bởi ba vòng xoắn đồng tâm gồm 11 đoạn RNA kép Hạt Rota virut có hai lớp

áo protein bao ngoài Mỗi đoạn dsRNA mã hóa cho một protein cần thiết cho

sự tồn tại và nhân lên của virut [121]

Capsid của RV có dạng đối xứng 20 mặt, 132 capsomer sắp xếp đối xứng xoắn [77,120]

- Lớp ngoài chứa protein cấu trúc VP4 và VP7

- Lớp trong chứa protein cấu trúc VP6

- Lớp lõi chứa protein cấu trúc VP1, VP2 và VP3 Trong đó VP2 là protein bao quanh RNA

Các nghiên cứu bằng kĩ thuật điện di miễn dịch và kính hiển vi điện tử đã khẳng định: Capsid trong mang kháng nguyên đặc hiệu nhóm Capsid ngoài mang kháng nguyên đặc hiệu týp [6, 14, 88, 100]

Hình 1.3: Sơ đồ cấu trúc hạt virut Rota và các vùng mã hóa protein

Genome của Rota virut là RNA sợi đôi có 11 đoạn kí hiệu từ 1->11 Có

độ lớn khoảng 18.555 cặp base Mỗi gen có trọng lượng phân tử từ 2x105 -> 2,2x106 (Dalton), mã hóa cho một protein cấu trúc hoặc không cấu trúc Trừ gen 9 và gen 11, mỗi chuỗi mã hóa hóa cho hai phân tử protein Trọng lượng

11 đoạn ước tính khoảng 10x106 đến 14x106 (Dalton) [41, 42]

Điện di trên gel acrylamit thấy 11 đoạn gen của Rota virut được chia ra làm 4 khu vực Những gen này được đánh số theo thứ tự phân bố của chúng trên bản gel, chẳng hạn gen nào di chuyển chậm nhất được đánh số 1 [52] Đối với Rota virut nhóm A:

Hạt virut chứa ít nhất 6 protein cấu trúc:

- Các đoạn 1, 2, 3 và 6 mã hóa cho các protein VP1, VP2, VP3 và VP6

- VP1 là enzym ARN polymerase nằm trong lõi hạt virut, tham gia vào quá trình phiên mã tạo ra các phân tử mARN và tạo ra các bản sao genom ARN cho các hạt virion mới

- VP2 là lớp lõi của hạt virion và liên kết với genom ARN

- VP3 là một phần của màng lõi trong của hạt virion và là enzyme Guanylyl transferase, có vai trò gắn mũ vào đầu 5’ trong quá trình cải biến sau phiên mã phân tử mARN, bảo vệ mARN khỏi sự phân huỷ của các nuclease [110,118]

- Ba protein mang tính đặc hiệu kháng nguyên của virut là VP4,VP6

và VP7

- Đoạn gen 4 mã hóa cho protein capsit lớp ngoài VP4, là protein bề mặt hạt virut nhô ra như những cái gai, liên kết với các phân tử receptor bề mặt tế bào chủ để đưa toàn bộ genom virut vào tế bào VP4 là một protein nhạy cảm với protease và định ra týp P của virut, là kháng nguyên trung hòa có tính ngưng kết hồng cầu VP4 bị enzyme protease trong ruột phân hủy tách ra một cách đặc hiệu tạo thành VP5* và VP8* làm tăng hoạt tính gây nhiễm của virut vào tế bào chủ [42,88]

- Đoạn gen 9 mã hóa cho protein VP7 VP7 có bản chất là glycoprotein là kháng nguyên trung hòa đặc hiệu cho týp huyết thanh và VP7 đinh ra týp G của virut [42, 47]

- VP6 là kháng nguyên chung cho dưới nhóm của RV

- Các gai VP4 nhô ra từ lớp vỏ VP6 Phần VP4 trải dài hướng vào trong và tương tác với VP7 và protein capsit trong VP6 Sự tương tác VP4-VP7, VP4-VP6 bao hàm rằng VP4 có thể tham gia duy trì chính xác hình dạng giữa hai lớp trong và ngoài vỏ capsit cũng như phạm vi ảnh hưởng chức năng VP7 là glycoprotein tạo ra lớp vỏ ngoài của virut bao gồm 780 phân tử, VP7 tương tác với phần chóp của VP6 [14]

1.1.3.2 Protein không cấu trúc

- Các đoạn gen còn lại (5, 7, 8 hoặc 9 tùy chủng, 10 và 11) mã hóa cho các protein không cấu trúc lần lượt là: NSP1 (NS53), NP2 (NS35), NSP3 (NS34), NSP4 (NS28), NSP5 (NS26)

- NSP1 tạo ra từ gen 5 là một protein không cấu trúc liên kết ARN

- NSP2 là một protein liên kết ARN tích lũy trong thể vùi tế bào chất (viroplasms) cần thiết cho quá trình sao chép genom của virut [110,115,131]

Bảng 1.1 Các gen và protein của RV [14]

Đoạn gen Protein

Trọng lượng phân tử (Daltol)

Protein không cấu trúc

Không có vai trò cho sinh

Protein không cấu trúc

Làm tăng hoạt tính mARN virut và ngừng tổng hợp protein tế bào

8 NSP2 (NS35) 36.700

Protein không cấu trúc protein cấu trúc

NTPase liên quan trong việc nhân lên của ARN

37.368 Vỏ capsit ngoài Cấu trúc và kháng nguyên

trung hòa

10 NSP4 (NS28) 20.290

Protein không

11 NSP5 (NS26) 21.725

Protein không

1.1.4 Khả năng gây bệnh

RV là nguyên nhân hàng đầu gây viêm dạ dày ruột cấp dẫn đến tiêu chảy

ở trẻ em dưới 5 tuổi, đặc biệt là trẻ từ 6 đến 24 tháng tuổi [4,8,9] Trẻ sơ sinh hiếm khi bị bệnh, chủ yếu là nhiễm trùng không triệu chứng hoặc biểu hiện rất nhẹ Một nghiên cứu cho thấy chỉ 10 – 20% trẻ sơ sinh bị nhiễm RV có biểu hiện lâm sàng Nhiễm trùng không triệu chứng ở trẻ sơ sinh có thể liên quan đến kháng thể từ mẹ truyền qua nhau thai cho con hoặc kháng thể và các yếu tố ức chế trysin trong sữa mẹ, enzym pancreatic, cytokine… Như vậy sữa

mẹ không những chỉ phòng được nhiễm RV mà còn có thể phòng được bệnh tiêu chảy nặng [23,27]

Ngoài gây viêm dạ dày ruột cấp, RV còn có thể gây viêm ruột hoại tử, lồng ruột, tắc mật, xuất huyết đường niệu, nhiễm trùng huyết… Tuy nhiên, hiện nay chưa có bằng chứng điển hình có tính thuyết phục về vấn đề này [137]

Nhiễm trùng do RV cũng khá phổ biến ở người lớn Theo một nghiên cứu khoảng 55% người lớn khi tiếp xúc với trẻ em bị viêm dạ dày ruột do RV

có hiệu giá kháng thể tăng trong thời gian con cái họ mắc bệnh [73] Một nghiên cứu khác cho thấy 11-70% người lớn bị nhiễm trùng đã biểu hiện thành bệnh tiêu chảy Bệnh thường do virut nhóm B, người mắc bệnh có thể không có triệu chứng hoặc bị tiêu chảy mãn tính [91, 92, 93]

1.1.5 Dự phòng

Gần như hầu hết trẻ bị nhiễm RV trong vòng 2-3 năm đầu do nhiễm

từ nhà, nhiễm tại nhà trẻ, bệnh viện Do vậy cần cảnh báo cho các bậc phụ huynh cần rửa tay kỹ bằng xà phòng để phá vỡ chuỗi lây nhiễm [64,103] Các dung dịch diệt khuẩn khác như 0.1% o-phenylphenol và 79% ethanol như Lysol có thể được sử dụng Hơn nữa cần có kiến thức về các triệu chứng mất nước, cũng như điều trị trẻ khi tiêu chảy Phương pháp dự phòng hữu hiệu nhất vẫn là sử dụng vắc xin phòng bệnh

1.1.6 Điều trị

Hiện nay, biện pháp hữu hiệu để phòng bệnh này là sử dụng vắc xin Việc cung cấp nước sạch và cải thiện điều kiện vệ sinh cũng không làm giảm tiêu chảy do virut Rota ở nhiều quốc gia Những nghiên cứu đã đưa ra rằng nhiễm virut Rota lần đầu có khả năng bảo vệ cho những lần nhiễm sau (giảm triệu chứng lâm sàng, lượng virut thải trong phân) Do vậy, mặc dù có rất nhiều genotype và týp huyết thanh của RV lưu hành, vắc xin phòng virut Rota

có thể được phát triển chỉ từ một chủng Hiện nay, 2 chiều hướng song song tồn tại trong phát triển vắc xin phòng RV: vắc xin đơn giá (nguồn gốc từ người hoặc động vật) và vắc xin đa giá Cả hai hướng phát triển này đều cho hiệu lực cao, như sẽ trình bày dưới đây Điều cần quan tâm nhất là tính giảm động lực và gây đáp ứng miễn dịch chéo của vắc xin

Việc bù nước và điện giải là quan trọng nhất trong điều trị tiêu chảy

do Rota virut và được thực hiện càng sớm càng tốt Có thể bù nước bằng đường uống hoặc đường tĩnh mạch Kháng sinh không có tác dụng trong điều trị Nếu lạm dụng có thể dẫn tới loạn khuẩn đường ruột Chính vì vậy việc chuẩn đoán nhanh nguyên nhân gây bệnh sẽ giúp cho có hướng điều trị đúng và hiệu quả

1.2 Dịch tễ học

1.2.1 Đường lây truyền

RV chủ yếu lây truyền theo đường phân miệng ngoài ra còn có thể lây theo đường hô hấp Bệnh hiếm khi truyền từ động vật sang người Trẻ em có thể nhiễm cả trước và sau khi ốm kèm tiêu chảy Đôi khi chúng có thể đưa virut tới những thành viên khác trong gia đình và những người có tiếp xúc gần gũi RV có thể gây tiêu chảy ở cả người lớn chăm sóc trẻ bị bệnh [14,68,73]

1.2.2 Mùa bệnh

Ở các nước khí hậu ôn đới, tiêu chảy do RV thường xuất hiện vào mùa đông Ở các nước nhiệt đới và các nước đang phát triển, yếu tố mùa ít rõ rệt hơn, bệnh có thể gặp quanh năm [56,104]

Ở Mỹ, RV gây bệnh theo mùa, đạt cao điểm từ tháng 11 đến tháng 5, với mức độ lưu hành bắt đầu từ phía Tây Nam lan sang vùng Đông Bắc [57]

Ở Việt Nam theo Đoàn Thị Ngọc Anh (1987) các tháng 11 12 và một tỷ

lệ phát hiện virut là 25-39,5% so với các tháng 4, 5, 6 là 5% - 10% [1]

Theo chương trình giám sát đã công bố năm 2001, sự phân bố bệnh tiêu chảy theo lứa tuổi ở tất cả các lứa tuổi đều không giống nhau Tại Việt Nam trẻ dưới 3 tháng tuổi ít mắc bệnh do sữa mẹ có tỷ lệ IgA khá cao Kháng thể này

có thể kéo dài tới khi trẻ 2 tuổi, do vậy trẻ bú sữa mẹ được miễn dịch tự nhiên nên ít mắc bệnh hơn

1.2.4 Chủng lưu hành

1.2.4.1 Trên thế giới

* Sự phân bố khác nhau của chủng RV ở các vùng khí hậu khác nhau [126]

- Sự phân bố của các kiểu gen G + Theo thống kê tại Nam Mỹ trong 2095 chủng RV được phân tích có 57,5% là G1; 18,3% là G2; 4,4% là G3; 8,8% là G4; 2,3% là G5; và 8,6% là G9

+ Tại châu Phi trong 2133 chủng RV được phân tích có G1, G2, G3, G4, G8 và G9 tương ứng là 35,75%; 20,3%; 13,3%; 14,2%; 12,8 % và 3,7% + Tại các nước châu Á trong số 13126 chủng phân tích có tỷ lệ G1, G2, G3, G4, G10 và G12 tương ứng là 60,3%; 16,7%; 6,5%; 14,3%; 1,7%; 0,3%; và 0,2%

+ Tại Bắc Mỹ trong 2892 chủng RV được phân tích có tỷ lệ chủng G1, G2, G3, G4 và G9 tương ứng là 73,7%; 11%; 10,6%; 2,7%; 8,6% [57]

+ Tại Châu Âu trong 14475 chủng RV tỷ lệ G1, G2, G3, G4, G6 và G9 tương ứng là 69.4%; 10,2%; 3,5%; 15,5%; 0,1% và 1,3%

+ Tại châu Úc trong 6995 chủng RV được phân tích tỷ lệ chủng G1, G2, G3, G4 và G9 tương ứng là: 74%; 10,8%; 1%; 4,6% và 9,6%

- Sự phân bố của các kiểu gen P Kiểu gen P8 và P4 chiếm hơn 90% tiêu chảy do RV Ngoại trừ ở châu Phi thì kiểu gen P6 có tỷ lệ cao (22,4%) đứng thứ 2 sau P8 (51%)

- Sự phân bố của các chủng hỗn hợp P-G Bốn chủng Rota phổ biến trên toàn cầu G1P8 (64,7%); G2P4 (12%); G3P8 (3,3%); G4P8 (8,5%) là nguyên nhân tiêu chảy ở trẻ em do RV trên thế giới [84]

Sự phân bố chủng P-G biến đổi nhanh chóng từ châu lục này tới châu lục khác Bốn chủng nói trên chiếm tới 90% các trường hợp ở Bắc Mỹ, châu Âu, châu Úc, ở Nam Mỹ và châu Á có mặt khoảng 68% ca nhiễm, ở châu Phi là 50% Chủng P8G1 gây ra hơn 70% ca nhiễm ở Bắc Mỹ và châu Âu trong khi

đó chỉ xuất hiện trong 30% ca nhiễm ở Nam Mỹ và châu Á, chỉ khoảng 23%

ở châu Phi Trong đó cần phải kể đến là sự phát hiện một số chủng P-G bất thường như P4G1, P8G2, P4G3, P4G4 với tần suất tương đối cao (trong các khu vực khác nhau trên thế giới có thể gợi ý tính di truyền bền vững và khả năng tiềm tàng lây lan của chúng trong cộng đồng)

Sự xuất hiện các chủng bất thường có thể được giải thích bằng các nguyên nhân sau đây [13,126]: Genome RV khi sao chép đã xảy ra đột biến điểm Khi 2 týp huyết thanh cùng gây nhiễm vào một tế bào sẽ xảy ra hoán vị kháng nguyên RV gây bệnh mãn tính ở người suy giảm miễn dịch có thể sắp xếp lại genome và tạo ra các đoạn ARN bất thường Các yếu tố kể trên có thể cùng một lúc xảy ra Ví dụ vừa sắp xếp lại genome, vừa xảy ra đột biến

Tần số các mẫu không thể định týp khi sử dụng phương pháp EIA nằm trong khoảng 8-46,2%, có thể các chủng đột biến đã tránh được sự nhận biết của các kháng thể đơn dòng hoặc do sự có mặt của các týp huyết thanh bất thường không phát hiện được bởi các kháng thể đơn dòng vẫn thường được sử dụng để xác định RV ở người bằng phương pháp EIA

Ứng dụng RT-PCR xác định genome RV đã làm giảm số lượng các chủng không thể định týp Tuy nhiên, những kĩ thuật này còn gặp phải những hạn chế vốn có Các chủng chứa các đột biến lớn ở các vùng bám primer vẫn không thể xác định được Vẫn còn một số nghiên cứu kết hợp EIA và RT-PCR và lai các đầu dò, tuy vậy khoảng 7,8% - 26,6% các chủng không thể định týp [94,130]

* Sự phân bố của các týp P và G dao động theo thời gian

Sự phân bố G và P có sự thay đổi theo thời gian Trong nghiên cứu 10 năm liên tiếp (1987-1997) ở Bangladesh cho thấy sự dao động hàng năm là một ví

dụ tiêu biểu sự phân bố của các týp huyết thanh G1, G2, G3, G4 và G9

- Trong suốt 3 năm đầu tiên G2 là týp huyết thanh phổ biến nhất, tiếp theo là các týp G1 và G4

- Năm thứ 4 các týp G4 là phổ biến nhất và chiếm ưu thế đến năm 1995 Năm 1995 các týp G9 nổi lên và chiếm ưu thế, các týp G4 hiếm gặp hơn Năm 1996 và 1997 týp G9 phổ biến nhất được xác định trong nước này với tần suất tương ứng là 34,4% và 53%

Như vậy ta thấy các týp P và G của RV trong cùng một khu vực cũng không ổn định theo các năm, do đó việc nghiên cứu giám sát tiêu chảy do

RV tại các nước là cần thiết để có hướng nghiên cứu biện pháp phòng bệnh hợp lý [128]

1.2.4.2 Tại Việt Nam

Hiện nay ở Việt Nam đã có một vài nghiên cứu về bệnh tiêu chảy cấp

do virut Rota Tỷ lệ phát hiện virut Rota bằng kỹ thuật ELISA đối với bệnh nhân tiêu chảy cấp là tương đối cao Virut Rota lưu hành quanh năm, nhưng giảm vào các tháng nóng ẩm Lứa tuổi mắc bệnh nhiều nhất là dưới 2 tuổi Miền Bắc Việt Nam nằm trong vùng khí hậu cận nhiệt đới chia làm bốn mùa

rõ rệt nên tỷ lệ mắc bệnh tiêu chảy do virut Rota cũng thay đổi theo mùa Đỉnh điểm của mùa bệnh là từ tháng 11 đến tháng 5 (mùa đông - xuân) còn các mùa khác tỉ lệ mắc bệnh tiêu chảy do virut Rota ở trẻ em giảm đi rõ rệt [24,76,99] Theo Đoàn Thị Ngọc Anh, từ 1981 đến 1985, tỷ lệ tiêu chảy cấp

do virut Rota ở trẻ em từ 0 đến 5 tuổi tại Viện Nhi Thụy Điển chiếm 26,5%, tại bệnh viện Nhi Đồng 2 thành phố Hồ Chí Minh chiếm 28,1%, bệnh viện Xanh Pôn là 21,5% với tỷ lệ nam (59,5%) cao hơn nữ (40,5%) Bệnh tập trung cao nhất vào các tháng từ 11 đến tháng 1 (27,2% - 39,3%) Cũng theo tác giả này, lứa tuổi hay bị tiêu chảy cấp do virut Rota là từ 0 đến 2 tuổi, đặc biệt là nhóm tuổi 7 đến 12 tháng (26,8%) Theo tài liệu giám sát bệnh tiêu chảy do virut Rota ở trẻ em dưới 5 tuổi tại một số bệnh viện lớn của Việt Nam

từ năm 1998 đến năm 2003, tỷ lệ phát hiện ra virut Rota ở bệnh nhi tiêu chảy cấp tại Viện Nhi Thụy Điển chiếm 55,64%, tại Bệnh viện Xanh Pôn chiếm 49,84%, Viện Nhi Hải Phòng là 59,28%, Bệnh viện Đa khoa Khánh Hoà là 58,32%, Viện Nhi Đồng 1 là 58,82%, Bệnh viện Nhi Đồng 2 là 58,65% Trung bình tỷ lệ trẻ mắc tiêu chảy cấp do virut Rota trên cả nước là 57,39%,

rõ ràng là một tỷ lệ rất cao [8,45,114]

Theo kết quả giám sát bệnh tiêu chảy do virut Rota tại các bệnh viện chính của Việt Nam từ 1998 đến 2011 cho thấy rằng: Chủng virut Rota lưu hành tại nước ta như sau [8]

Đồ thị 1 Chủng lưu hành gây bệnh theo týp G từ 1998 – 2009

Tổng quát trong 11 năm giám sát chủng G1, G2, G3 chiếm đa số với tỷ

lệ tương ứng 38,8%: 11,7%: 19,9% Chủng G4, G9 chiếm tỷ lệ thấp tương ứng 4,7% và 6,1% Chưa xác định được týp G chiếm 14,9%

Tuy nhiên xét theo từng năm kết quả cho thấy rằng chủng G2 lưu hành chính năm 1998-2000 với tỷ lệ 53,6% sau đó giảm xuống dưới 20% từ năm 2000-2003, tỷ lệ tăng lên gần 30% năm 2002-2003 và giảm xuống dưới 10%

từ năm 2004 đến nay Trong khi đó chủng G1 năm 1998-2000 chỉ chiếm 13,1% nhưng đã tăng lên 76,5% năm 2000-2001, năm 2001-2002 chủng G1

hạ xuống 12% sau đó tăng lên trong những năm sau nhưng ở dưới mức 50%, cao nhất năm 2010-2011 với tỷ lệ 79,6% Chủng G3 chiếm tỷ lệ rất thấp và hầu như không có trong những năm 1998-2004, nhưng tỷ lệ G3 tăng dần trong những năm sau và tăng cao trong năm 2008-2009 với tỷ lệ lên tới

44,7% Chủng G9 chiếm tỷ lệ thấp ở hầu hết các năm nghiên cứu, tuy nhiên năm 2001-2002 đột nhiên tăng cao là chủng lưu hành chính với tỷ lệ 58,4%

Đồ thị 2 Chủng lưu hành gây bệnh theo týp P từ 2000 - 2011

Đồ thị 2 cho kết quả phân tích chủng lưu hành theo týp P Không giống như phân tích chủng lưu hành theo týp G, týp P8 lưu hành chủ yếu với tính ổn định qua suốt thời kỳ từ 1998-2009 với tỷ lệ có năm lên gần 90% Tỷ lệ trung bình qua 12 năm là 76,1% Chủng G4 nổi lên vào năm 2002-2003 nhưng cũng chỉ chiếm 33,3% còn những năm khác xuất hiện với tỷ lệ thấp Chủng P6 chiếm tỷ lệ thấp ở hầu hết các năm giám sát, cao nhất vào năm 2001-2002 với

tỷ lệ 16,2% [8,114]

1.3 Tình hình nghiên cứu sản xuất vắc xin Rota trên thế giới

1.3.1 Vắc xin đơn giá

Ứng cử viên vắc xin RV đầu tiên là các vắc xin đơn giá "Monovalent

vaccines" sử dụng chủng RV WC3 và RIT4237 được phân lập từ bò hoặc

chủng RRV được phân lập từ khỉ Rhesus Tuy nhiên, những vắc xin này không còn được sử dụng do có sự khác nhau lớn về hiệu lực vắc xin giữa các nước có thử nghiệm vắc xin [53,61,62]

Tại Viện Sinh phẩm Lan Châu Trung Quốc, bác sĩ Bai đã sản xuất vắc

xin từ chủng virut Rota gây tiêu chảy cho cừu (LLR) LLR là vắc xin sống,

uống, đơn týp, virut Rota nhóm A, phân týp I, G10P[12] Chúng được cấy truyền 37 đời Hiện nay vắc xin này đang được sử dụng rộng rãi trên toàn nước Trung Quốc để phòng bệnh tiêu chảy cho trẻ em [80,82]

Vắc xin dòng sơ sinh, bác sĩ Ruth Bishop đã phát triển chủng này trong

phòng thí nghiệm của bà Chủng này là chủng virut Rota người (G3P[6]) được phân lập từ một trẻ sơ sinh và làm giảm độc lực qua nhiều lần cấy truyền Trong nghiên cứu dịch tễ học, trẻ sơ sinh bị nhiễm tự nhiên với chủng này và được phòng chống bệnh trong suốt hai năm đầu của trẻ Trẻ được dùng vắc xin ở 3, 5, 7 tháng tuổi với liều gây nhiễm 6x105FFU/ liều [35,86]

Vắc xin của hãng Glaxo Smith Kline (Rotarix), bác sĩ Georges Thiry

đưa ra những kế hoạch về phát triển vắc xin Rota chủng 89-12, chủng này được phân lập từ một trẻ 15 tháng tuổi bị hội chứng viêm dạ dày ruột tháng

12 năm 1988 và là chủng G1P[8] 215 trẻ được chọn ngẫu nhiên để nhận 2 liều vắc xin (105FFU/liều) hoặc placebo tại tháng thứ 2 và tháng thứ 4 100% trẻ này không phải tới bác sĩ, 20 trẻ bị tiêu chảy do virut Rota trong đó 18 trường hợp xuất hiện ở nhóm sử dụng Placebo và 2 trường hợp sử dụng vắc xin [71,75,81] Vắc xin Rota của Glaxo Smith Kline đã được Viện Avant cấp phép, và kết quả nghiên cứu được công bố, ứng cử viên vắc xin này là chủng virut Rota người, sống, giảm độc lực, đơn týp (G1P[8]) Vắc xin này được sản xuất để sử dụng trên toàn thế giới và được thêm chất làm giảm độ axit Vắc xin này ổn định tại nhiệt độ phòng thí nghiệm và sẽ sử dụng cho trẻ ở 2 và 4 tháng tuổi với liều 105 đơn vị tạo đám hoại tử [25,98,119]

- Rotarix là vắc xin sống giảm độc lực được sử dụng 2 liều, có nguồn

gốc từ 1 chủng virut Rota người G1P[8] Vắc xin này được thực nghiệm lâm

sàng giai đoạn I, II ở Mỹ, Châu Mỹ Latinh và châu Âu trên 9.400 trẻ cùng với lịch tiêm chủng mở rộng Kết quả thử nghiệm cho thấy khoảng 73% phòng được viêm dạ dày ruột do bất kỳ týp RV nào và > 90% chống lại nhiễm cấp tính do RV, đặc biệt vắc xin này có hiệu lực phòng bệnh >83% do RV không thuộc týp G1 [112] Thử nghiệm lâm sàng giai đoạn III đã thực hiện trên 70.000 trẻ ở Châu Mỹ Latinh và vắc xin này đang hoàn thành thẩm định an toàn và hiệu lực, không có dấu hiệu chỉ ra rằng lồng ruột ở trẻ em liên quan đến việc sử dụng vắc xin này Địa điểm nghiên cứu lâm sàng cỡ nhỏ hơn đang được tiến hành ở châu Á và châu Mỹ [32,39,54,65,71]

1.3.2 Vắc xin đa giá

Các vắc xin đa giá "Multivalent vaccines" được sản xuất năm 1985 bằng cách sử dụng kỹ thuật sắp xếp gen (gene assortant) [90] Gen VP7 trong hệ gen của chủng RV động vật được thay thế bởi gen của RV người, gen này mã hoá cho protein VP7 thuộc các týp huyết thanh khác nhau, thông thường là các chủng phổ biến tại địa phương định sử dụng vắc xin

Rota Shield là vắc xin tứ liên "Tetravalent vaccines", là vắc xin sống

giảm độc lực uống được sản xuất từ chủng virut Rota ở khỉ Rherus (RRV - TV) có tên là MMU18006 Chủng này có cùng đặc tính trung hoà với các chủng virut Rota G3 của người, MMU18006 phù hợp cho việc phát triển vắc xin bởi vì nó phát triển tốt trong nuôi cấy tế bào So với các vắc xin dùng các chủng virut Rota bò, MMU 18006 an toàn và tạo miễn dịch tốt Các thử nghiệm lâm sàng ở trẻ em tại Bắc Mỹ, Nam Mỹ và Châu Âu cho thấy RotaShield là vắc xin an toàn và rất hiệu quả, và vắc xin này đã được cấp phép tháng 10 năm 1998 tại Mỹ, khi 600.000 trẻ được sử dụng vắc xin tương đương với 1,2 triệu liều, vắc xin này bị đình chỉ sử dụng vì có liên quan đến tăng nguy cơ lồng ruột sau 3 tuần sử dụng liều đầu tiên với tỷ lệ ước tính 1/10.000 trẻ [70,107,117]

Vắc xin RotaTeq được tạo ra trong phòng thí nghiệm nghiên cứu của

Merck Vắc xin phối hợp dựa trên chủng của người và bò (WC3) tạo ra

khả năng phòng chống bệnh rất tốt (70%) và phòng bệnh tiêu chảy cấp nặng (95-100%) Nói chung vắc xin này tương đối tốt, nó không gây sốt cao và có

tỷ lệ đào thải thấp Vì không có phản ứng phụ, nên khả năng gây lồng ruột ở trẻ em thấp Vắc xin này là vắc xin 5 týp phối hợp chủng của người (G1,G2,G3,G4 và P[8]) và chủng của bò (WC3) [21,44] Địa điểm nghiên cứu lâm sàng đã đánh giá an toàn và hiệu lực của vắc xin này khi cho trẻ sử dụng theo 2 lịch uống sau: 2,4,6 tháng tuổi và 2, 3, 4 tháng tuổi Hiệu lực của liều 8x106FFU chống lại 100% khả năng viêm nhiễm đường ruột cấp tính và khoảng 68,7-76,6% phòng được sự viêm nhiễm đường ruột do bất kỳ chủng

virut Rota nào [20,34,55,58] Rota Teq là vắc xin sống uống giảm độc lực sử

dụng 3 liều được bắt đầu nghiên cứu từ 1991 Địa điểm nghiên cứu lâm sàng chỉ ra rằng vắc xin này rất an toàn và hiệu lực, nó phòng được >70% sự xâm nhập của bất kỳ týp Rota virut nào và 100% chống lại viêm nhiễm đường tiêu hoá cấp tính do Rota virut sau liều đầu tiên ở nghiên cứu giai đoạn II [31] Thử nghiệm lâm sàng chỉ ra rằng, Rota Teq không làm tăng nguy cơ lồng ruột

so với placebo sau 42 ngày ở bất kỳ liều sử dụng nào [60,63,72]

1.3.3 Hướng phát triển vắc xin khác

Do tính chất gây nhiễm qua đường ruột, và chủ yếu các tổn thương xảy

ra tại đường ruột, các vắc xin hiện tại phát triển đều là vắc xin sống, giảm động lực để cho uống nhằm gây miễn dịch bảo vệ ngay tại đường ruột Tuy nhiên, đã có những nghiên cứu về vắc xin đưa qua các đường khác ví dụ vắc xin bất hoạt dùng để tiêm, vắc xin đưa theo đường mũi [95,96] Mục đích của các vắc xin thể loại này là nhằm giảm tối đa nguy cơ gây lồng ruột Đồng thời vắc xin tiêm có khả năng kết hợp với các vắc xin khác trong chương trình tiêm chủng mở rộng Bản thân vắc xin phòng bại liệt cũng đã được chuyển hướng sang vắc xin bất hoạt dùng để tiêm Điều bất cập của vắc xin bất hoạt là trong khi khả năng gây miễn dịch toàn thân cao, khả năng

tạo miễn dịch bảo vệ tại đường ruột còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố như chất lượng vắc xin, độ tinh khiết, tá dược Trong khi vắc xin bất hoạt tỏ ra có khả năng bảo vệ cao ở chuột và khỉ thí nghiệm, vắc xin bất hoạt không bảo vệ lợn thí nghiệm khỏi tiêu chảy, mặc dù tạo ra hiệu giá kháng thể cao trong máu Tuy nhiên, trong hoàn cảnh các vắc xin sống uống có khả năng có hiệu lực kém hơn ở các nước đang phát triển ở Châu Phi, Châu Á, so với các nước phát triển ở Châu Âu, Châu Mỹ, đây là một hướng đi mới cần tiếp tục được mở rộng [38,79,96]

Phương pháp sản xuất vắc xin Rota bao gồm vắc xin sống giảm độc lực, vắc xin tái tổ hợp, vắc xin bất hoạt, Mỗi loại vắc xin có ưu điểm và nhược điểm riêng [59,125,127] Tuy nhiên, vắc xin sống theo đường uống

có nhiều ưu điểm hơn cả: Thứ nhất dễ sử dụng, thứ hai tạo đáp ứng miễn dịch tại đường tiêu hoá cao, do vậy, hiệu quả cao trong phòng bệnh ngay khi virut hoang dại xâm nhập vào cơ thể theo đường phân miệng, thứ ba quá trình tạo miễn dịch theo đường uống giống như tạo miễn dịch tự nhiên rất hiệu quả Hạn chế của vắc xin sống này cũng như các vắc xin sống khác

là virut quay lại độc lực mặc dù rất hiếm, để khắc phục nhược điểm này cần tuân thủ nghiêm ngặt qui trình cấy truyền chủng cũng như qui trình sản xuất vắc xin sau này

1.4 Nghiên cứu sản xuất vắc xin Rota ở Việt Nam

POLYVAC là cơ sở đầu tiên, duy nhất tiến hành nghiên cứu và sản xuất

VX Rota ở Việt Nam Đây là VX được sản xuất từ chủng G1P[8] do Polyvac phân lập, tạo chủng gốc và chủng sản xuất vắc xin từ mẫu phân ký hiệu KH0118 của trẻ nữ bị tiêu chảy cấp do virut Rota phải nhập viện Đa khoa Khánh Hòa năm 2003 [11,109]

Dựa vào những đặc tính nổi trội của chủng G1P[8], Trung tâm Nghiên cứu Sản xuất Vắc xin và Sinh phẩm Y tế sử dụng chủng này sản xuất vắc xin Rotavin-M1 để phòng bệnh tiêu chảy do virut Rota tại nước ta

Tế bào sử dụng cho sản xuất vắc xin Rotavin-M1 là tế bào Vero Đây là loại tế bào mà virut Rota có thể nhân lên tốt và được WHO cho phép dùng sản xuất vắc xin cho người [22] Các nguyên liệu, hóa chất và môi trường sử dụng

là của các hãng nổi tiếng và có uy tín như Gibco, Merck, Sigma

Trung tâm Nghiên cứu Sản xuất Vắc xin và Sinh phẩm Y tế đã xét nghiệm mẫu phân bằng phương pháp EIA cho kết quả dương tính với virut Rota, và xác định týp gây bệnh là týp G1P[8] bằng phương pháp RT-PCR Sau đó mẫu phân được xử lý theo qui trình của phòng thí nghiệm virut đường ruột của Trung tâm Kiểm soát và Phòng ngừa bệnh tật CDC-Atlantta- Hoa Kỳ

để sử dụng cho tạo chủng virut Rota gốc týp G1P[8]

Hình 1.4 Hình ảnh hạt virut Rota G1P [8] dưới kính hiển vi điện tử tại lần cấy truyền thứ 30 trên tế bào thận khỉ tiên phát chụp dưới kính hiển vi điện tử - Viện VSDTTƯ

Qui trình tạo chủng virut Rota gốc G1P[8] (KH0118); qui trình sản xuất vắc xin rotavin M1 và các thử nghiệm kiểm tra chất lượng [19,67,109]

Qui trình tạo chủng virut Rota gốc

Mẫu phân KH0118 Định týp bằng phương pháp RT-PCR

Phân lập trên MA104 (3 lần liên tiếp)

Xác định sự nhân lên của virut (chỉ số OD) bằng bộ sinh phẩm chẩn đoán Rotaclone (EIA)

Xác định sự nhân lên của virut (chỉ số OD) bằng bộ sinh phẩm chẩn đoán Rotaclone (EIA)

Cấy truyền dòng trên tế bào thận khỉ tiên

phát (6 lần liên tiếp)

Qui trình tạo chủng virut Rota gốc

Thích nghi dòng trên tế bào vero một

lớp (3 lần liên tiếp)

-Xác định sự nhân lên của virut (chỉ

số OD) bằng bộ sinh phẩm chẩn đoán Rotaclone (EIA)

-Chuẩn độ hiệu giá virut Rota bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang

Cấy truyền dòng trên tế bào vero 1 lớp

(13 lần liên tiếp)

Cấy truyền dòng trên tế bào thận khỉ

tiên phát (3 lần liên tiếp)

-Xác định sự nhân lên của virut (chỉ

số OD) bằng bộ sinh phẩm chẩn đoán Rotaclone (EIA)

-Chuẩn độ hiệu giá virut Rota bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang Cấy truyền dòng trên tế bào vero một

lớp (8 lần liên tiếp)

-Xác định sự nhân lên của virut (chỉ

số OD) bằng bộ sinh phẩm chẩn đoán Rotaclone (EIA)

-Chuẩn độ hiệu giá virut Rota bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang -Thử nghiệm nhận dạng bằng RT-PCR

- Xác định trình tự gen Tinh sạch dòng, chọn lọc dòng trên tế

bào vero (2 lần liên tiếp)

Chủng virut Rota gốc G1P[8](KH0118)

Xác định sự nhân lên của virut (chỉ số OD) bằng bộ sinh phẩm chẩn đoán Rotaclone (EIA)

Qui trình tạo chủng virut Rota gốc

Tạo chủng giống gốc (Virus Master Seed) G1P[8] MS

Kiểm định chất lượng theo hướng dẫn của Tổ chức Y tế thế giới TRS 941

2007

Tạo chủng sản xuất (Virus Working

Seed) G1P[8] WS

Kiểm định chất lượng theo hướng dẫn của Tổ chức Y tế thế giới TRS 941

2007

Nuôi cấy tế bào Vero Kiểm tra chất lượng tế bào

Gây nhiễm virut Kiểm định chất lượng theo hướng dẫn

1.5 Các giai đoạn thử nghiệm lâm sàng [3]

Để phát triển một loại thuốc hay một loại vắc xin, bắt buộc phải trải qua các giai đoạn thử nghiệm kéo dài trong nhiều năm trong đó mỗi giai đoạn

là một thử nghiệm lâm sàng hoàn toàn độc lập Nếu loại thuốc/vắc xin được thử nghiệm thành công qua các giai đoạn 1, 2 và 3 thì sẽ được phê duyệt để sử dụng trong cộng đồng Giai đoạn 4 là những nghiên cứu tiếp theo sau khi vắc xin đã được phê duyệt Tuy nhiên, để được phép thử nghiệm lâm sàng một loại thuốc hoặc vắc xin qua 4 giai đoạn trên, các sản phẩm này phải được được trải nghiệm qua các nghiên cứu tiền lâm sàng và giai đoạn 0

Nghiên cứu tiền lâm sàng

Chế tạo công thức

Giai đoạn 1 Giai đoạn 2

Giai đoạn 3

Giai đoạn 4

Hình 1.5 Tóm tắt qui trình phát triển một loại thuốc mới

1.5.1 Giai đoạn tiền lâm sàng

Các nghiên cứu tiền lâm sàng là những thực nghiệm trong phòng thí

nghiệm (in vitro) và trên cơ thể động vật (in vivo) sử dụng các liều khác nhau

để thu thập các thông tin ban đầu về hiệu lực, độc tính và các tác động hoá dược đối với cơ thể sống Khi có một hợp chất được định hướng là ứng cử viên hàng đầu, cần tiến hành các nghiên cứu tiền lâm sàng thu thập đầy đủ các thông tin cần thiết để có thể tiến hành nghiên cứu trên người Nghiên cứu tiền lâm sàng là phần nghiên cứu bắt buộc trước khi tiến hành các thử nghiệm lâm sàng Các thành tố của nghiên cứu tiền lâm sàng bao gồm (i) phần nghiên cứu

in vitro nuôi cấy tế bào và các mô phân lập để xác định phân tử đích và cơ chế hoạt động, và (ii) phần nghiên cứu in vivo để xác định hiệu lực và độc tính

của dược phẩm Ngoài việc phải đảm bảo tuân thủ Thực hành Phòng thí nghiệm Tốt (GLP) các nghiên cứu tiền lâm sàng cần cân nhắc một số yếu tố như (1) các tác động về sinh học và dược động học, (2) lựa chọn các loài động vật thích hợp, (3) số lượng và giới tính động vật thí nghiệm, (3) chọn liều và đường dùng, (4) tính sinh miễn dịch

Các tác động về sinh học/ dược động học

Các tác động về sinh học/ dược động học có thể được lượng giá sử dụng các phân tích trong phòng thí nghiệm Sử dụng các dòng tế bào hoặc nuôi cấy tế bào nguyên thuỷ để khảo sát hiệu lực trực tiếp lên kiểu hình và sự nhân lên của tế bào Do đặc tính với từng loài của từng loại dược phẩm có nguồn gốc từ công nghệ sinh học, điều quan trọng là phải lựa chọn 4 loài động vật thích hợp để thử nghiệm độc tính Những dòng tế bào sử dụng trong

thử nghiệm in vitro có nguồn gốc từ tế bào của động vật có vú có thể được sử dụng để tiên lượng cơ chế hoạt động trong thử nghiệm in vivo và đánh giá độ

nhạy của các loài khác nhau kể cả cơ thể người đối với sinh phẩm Những nghiên cứu này còn có thể xác định quá trình chiếm hữu cơ quan cảm thụ, ái tính với cơ quan cảm thụ, tác dụng dược lý và hỗ trợ cho quá trình lựa chọn các loài động vật thích hợp cho các thử nghiệm về dược lý học và độc tính

trên động vật (in vivo) Kết quả tổng hợp giữa nghiên cứu trong ống

nghiệm và trên động vật sẽ giúp cho việc định hướng các kết quả trên