Xác định đồng thời thành phần caffeine, theobromine và theophylline trong một số loại chè phân bố ở miền bắc Việt Nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --- ĐOÀN THỊ BÍCH NGỌC XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI THÀNH PHẦN CAFFEINE, THEOBROMINE VÀ THEOPHYLLINE TRONG MỘT SỐ LOẠI CHÈ PHÂN BỐ Ở MI

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

ĐOÀN THỊ BÍCH NGỌC

XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI THÀNH PHẦN CAFFEINE, THEOBROMINE

VÀ THEOPHYLLINE TRONG MỘT SỐ LOẠI CHÈ PHÂN BỐ Ở MIỀN

BẮC VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội –2016

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

ĐOÀN THỊ BÍCH NGỌC

XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI THÀNH PHẦN CAFFEINE, THEOBROMINE

VÀ THEOPHYLLINE TRONG MỘT SỐ LOẠI CHÈ PHÂN BỐ Ở MIỀN

i

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên tôi xin chân thành cảm ơn tới PGS.TS Nguyễn Văn Ri, Bộ môn Phân tích – Khoa Hóa học – Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội đã giao đề tài này cho tôi và tận tình hướng dẫn, truyền đạt những kinh nghiệm quý báu cho tôi trong suốt quá trình làm luận văn tốt nghiệp

Tôi xin chân thành cảm ơn TS Chu Đình Bính đã định hướng nghiên cứu cho luận văn này, tận tình hướng dẫn và giúp đỡ để tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Chu Ngọc Châu đã tận tình hướng dẫn

và giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này

Để hoàn thành được luận văn này, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ của các thầy cô tại Bộ môn Hóa Phân tích – Khoa Hóa học – Đại học Khoa học Tự Nhiên

Xin chân thành cám ơn Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu Công nghiệp rừng,

Bộ môn Bảo quản Lâm sản đã tạo điều kiện thuận lợi để luận văn của tôi được hoàn thành

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè, những người đã quan tâm giúp

đỡ và động viên, khuyến khích tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn

Hà Nội, Ngày 08 tháng 12 năm 2016 Học viên cao học

Đoàn Thị Bích Ngọc

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 10

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 12

1.1 Tổng quan Chè (Camellia sinensis (L.) Kuntze) 12

1.1.1.Nguồn gốc và phân loại các loài Chè 12

1.1.2 Thành phần hoá học của chè 13

1.2 Hoạt tính của nhóm ankaloid 15

1.2.1 Hoạt tính sinh học của caffeine 15

1.2.2 Hoạt tính sinh học của theophyline 17

1.2.3 Hoạt tính sinh học của theobromine 18

1.3.Các phương pháp phân tích thành phần ankaloid 18

1.3.1 Phương pháp điện di mao quản 18

1.3.2 Phương pháp phổ hồng ngoại gần 19

1.3.3 Phương pháp phổ Raman 21

1.3.4 Phương pháp sắc lỏng 22

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁPNGHIÊN CỨU Error! Bookmark not defined.

2.1 Đối tượng, mục tiêu và nội dung nghiên cứu Error! Bookmark not defined 2.1.1 Đối tượng và mục tiêu nghiên cứu Error! Bookmark not defined 2.1.2 Nội dung nghiên cứu Error! Bookmark not defined 2.2 Phương pháp nghiên cứu Error! Bookmark not defined 2.2.1 Nguyên tắc chung và trang bị của phương pháp HPLC Error! Bookmark not defined.

2.2.2 Sắc ký hấp phụ pha ngược RP-HPLC Error! Bookmark not defined.

iii

2.2.3 Detector UV-Vis Error! Bookmark not defined 2.2.4 Phân tích định lượng bằng HPLC Error! Bookmark not defined 2.3 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị nghiên cứu Error! Bookmark not defined 2.3.1 Dụng cụ Error! Bookmark not defined 2.3.2 Thiết bị Error! Bookmark not defined 2.3.3 Hóa chất Error! Bookmark not defined Chương 3 KẾT QUẢ VẢ THẢO LUẬN Error! Bookmark not defined.

3.1 Khảo sát các điều kiện xác định đồng thời caffeine, theobromine và

theophylline bằng phương pháp HPLC Error! Bookmark not defined 3.1.1 Khảo sát điều kiện chạy sắc ký Error! Bookmark not defined 3.1.2 Khảo sát điều kiện chiết mẫu Error! Bookmark not defined 3.2 Đánh giá phương pháp phân tích Error! Bookmark not defined.

3.2.1 Khảo sát khoảng tuyến tính và xây dựng đường chuẩn xác định đồng

thời caffeine, theophylline và theobromine Error! Bookmark not defined 3.2.2 Xác định giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ Error! Bookmark not defined.

3.2.3 Độ chụm (độ lặp lại) Error! Bookmark not defined 3.2.4 Độ đúng (độ thu hồi) Error! Bookmark not defined.

3.2.5 Đánh giá, so sánh kết quả phân tích caffeine trong mẫu chè bằng phương

pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao trong luận văn.Error! Bookmark not defined 3.3 Phân tích mẫu thực Error! Bookmark not defined 3.3.1 Phân tích mẫu lá chè Error! Bookmark not defined 3.3.2 Phân tích mẫu búp chè Error! Bookmark not defined 3.3.3 Đánh giá kết quả phân tích Error! Bookmark not defined KẾT LUẬN Error! Bookmark not defined.

TÀI LIỆU THAM KHẢO 23

PHỤ LỤC Error! Bookmark not defined.DANH MỤC BẢNG:

Bảng 1.1: Thành phần hóa học của chè 13Bảng 1.2: Tổng quan các phương pháp RP-HPLC gần đây cho việc xác định các

methylxanthine Error! Bookmark not defined Bảng 2.1: Bảng địa điểm lấy mẫu búp chè và lá chè.Error! Bookmark not defined Bảng 3.1: Mối quan hệ giữa bước sóng và diện tích picError! Bookmark not defined.

Bảng 3.2: Khảo sát dung môi pha động Error! Bookmark not defined Bảng 3.3: Khảo sát pH pha động Error! Bookmark not defined Bảng 3.4: Khảo sát thành phần pha động Error! Bookmark not defined Bảng 3.5: Khảo sát sự thay đổi tốc độ pha động Error! Bookmark not defined Bảng 3.6: Khảo sát dung môi chiết mẫu chè Error! Bookmark not defined Bảng 3.7: Khảo sát khả năng chiết mẫu chè tại năm cấp nhiệt độ khác nhau Error! Bookmark not defined.

Bảng 3.8: Khảo sát các thời gian chiết mẫu chè khác nhauError! Bookmark not defined.

Bảng 3.9 Khảo sát ảnh hưởng của lượng dung dịch NH3 1%/ etanol 60% được sử

dụng trong quá trình chiết Error! Bookmark not defined Bảng 3.10: Điều kiện tối ưu xác định đồng thời TB, TP và CF trong chè Error! Bookmark not defined.

Bảng 3.11: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính Error! Bookmark not defined Bảng 3.12: Bảng giá trị đánh giá sai số hệ thống của các đường chuẩn Error! Bookmark not defined.

Bảng 3.15: Độ lặp lại tối đa chấp nhận tại các nồng độ khác nhau (theo AOAC)

Error! Bookmark not defined Bảng 3.16: Bảng tính toán kết quả độ lặp của phép đoError! Bookmark not defined.

Bảng 3.17: Độ lặp của phương pháp trên mẫu chè Error! Bookmark not defined Bảng 3.18: Độ thu hồi chấp nhận ở các nồng độ khác nhau (theo AOAC) Error! Bookmark not defined.

Bảng 3.19: Độ thu hồi của phương pháp phân tích Error! Bookmark not defined.

Bảng 3.20: Kết quả xác định phần trăm caffeine trong các mẫu chè tại hai phòng thí

nghiệm Error! Bookmark not defined Bảng 3.21: Bảng chi tiết các địa chỉ lấy mẫu lá chè Error! Bookmark not defined.

Bảng 3.22: Kết quả phân tích đồng thời theobromine, theophylline và caffeine trong

mẫu lá chè Error! Bookmark not defined.

Bảng 3.23: Đánh giá các kết quả phần trăm ankaloid trong các mẫu lá chè ở các tỉnh

khác nhau theo phương pháp song sánh các giá trị trung bìnhError! Bookmark not defined.

Bảng 3.24 Bảng chi tiết các địa chỉ lấy mẫu búp chè.Error! Bookmark not defined.

Bảng 3.25: Kết quả phân tích đồng thời theobromine, theophylline và caffeine trong

mẫu búp chè Error! Bookmark not defined.

Bảng 3.26: Độ lệch chuẩn tương đối của các mẫu búp chè đã đo được ở các tỉnh

khác nhau Error! Bookmark not defined.

Bảng 3.27: Đánh giá các kết quả phần trăm ankaloid trong các mẫu búp chè ở các

tỉnh khác nhau theo phương pháp song sánh các giá trị trung bìnhError! Bookmark not defined.

Bảng 3.28: Tỉ lệ phần trăm khối lượng các ankaloid trong mẫu lá và mẫu búp chè

Error! Bookmark not defined.

DANH MỤC HÌNH VẼ:

Hình 1.1: Cấu trúc của caffeine, theophyline và theobromine 15

Hình 2.1: Sơ đồ hệ thống HPLC Error! Bookmark not defined.

Hình 2.2: Hệ thống thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao LC-ATVP của Shimazu Nhật

Bản Error! Bookmark not defined Hình 3.1: Phổ hấp thụ cực đại của theobromine, theophylline và caffeine Error! Bookmark not defined.

Hình 3.2: Mối quan hệ giữa bước sóng và diện tích pic.Error! Bookmark not defined.

Hình 3.3: Sắc đồ khảo sát hai loại cột Error! Bookmark not defined Hình 3.4: Khảo sát dung môi pha động Error! Bookmark not defined.

vii

Hình 3.5: Sắc đồ khảo sát pH pha động Error! Bookmark not defined Hình 3.6: Ảnh hường của %ACN đến diện tích pic và thời gian lưu Error! Bookmark not defined.

Hình 3.7: Sắc đồ khảo sát thành phần pha động Error! Bookmark not defined Hình 3.8: Ảnh hưởng của tốc độ pha động đến diện tích pic.Error! Bookmark not defined.

Hình 3.9: Sắc đồ khảo sát tốc độ pha động Error! Bookmark not defined Hình 3.10 Quy trình phân tích ankaloid trong chè Error! Bookmark not defined Hình 3.11: Ảnh hưởng của dung môi chiết đến diện tích pic.Error! Bookmark not defined.

Hình 3.12: Sắc đồ khảo sát dung môi chiết mẫu chè.Error! Bookmark not defined.

Hình 3.13: Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến diện tích pic.Error! Bookmark not defined.

Hình 3.14: Sắc đồ các điểm nhiệt độ chiết mẫu khác nhauError! Bookmark not defined.

Hình 3.15: Ảnh hưởng của thời gian chiết đến diện tích pic.Error! Bookmark not defined.

Hình 3.16: Sắc đồ tại các thời gian chiết mẫu khác nhauError! Bookmark not defined.

Hình 3.17: Ảnh hưởng của lượng dung dịch NH3 1%/ etanol 60% với diện tích pic

Error! Bookmark not defined Hình 3.18: Sản phẩm phản ứng của EGCG với amoniac.Error! Bookmark not defined.

Hình 3.19: Sắc đồ khảo sát ảnh hưởng của lượng dung dịch NH3 1%/ Etanol 60%

được sử dụng trong quá trình chiết Error! Bookmark not defined.

Hình 3.20: Khảo sát khoảng tuyến tính của (a) theobromine, (b) theophylline và (c)

caffeine Error! Bookmark not defined.

Hình 3.21: Đường chuẩn của (a) theobromine, (b) theophylline và (c) caffeine

Error! Bookmark not defined.

Hình 3.22: Độ lệch chuẩn tương đối của các ankaloid ở các nồng độ khác nhau

Error! Bookmark not defined Hình 3.23: Độ thu hồi của các ankaloid ở các nồng độ khác nhau.Error! Bookmark not defined.

Hình 3.24: Phần trăm khối lượng các ankaloid trong các mẫu lá chè Error! Bookmark not defined.

Hình 3.25: Phần trăm khối lượng các ankaloid trong các mẫu búp chè Error! Bookmark not defined.

Hình 3.26: Tỉ lệ ba thành phần ankaloid trong mẫu búp với mẫu lá chè Error! Bookmark not defined.

HPLC : Sắc ký lỏng hiệu năng cao

(High Performance Liquid Chromatography) NIR : Phổ hồng ngoại gần

(Near-infrared spectroscopy) FTIR : Quang phổ hồng ngoại chuyển đổi Fourier

Fourier transform infrared spectroscopy) LOD : Giới hạn phát hiện

(Limit of detection) LOQ : Giới hạn định lượng

(Limit of quantitation)

(Standard deviation) RSD : Độ lệch chuẩn tương đối

(Relative standard deviation)

11

MỞ ĐẦU

Chè xanh có tên khoa học Camellia sinensis(L.) Kuntze Nó là một loại thức uống rất

phổ biến trên thế giới, ở các nước châu Á đặc biệt là vùng Đông Á Chè là một phần không thể thiếu trong nền văn hóa cũng như ẩm thực Việt Nam cũng đã trồng và sử dụng chè từ hàng nghìn năm nay Chè được phân loại theo từng vùng xuất xứvà có hương vị đặc trưng riêng Ở Việt Nam có một số vùng trồng chè có hương vị chè vượt trội hơn các vùng khác như là Thái Nguyên, Lào Cai, Yên Bái, Phú Thọ…Khi uống chè ta thấy hệ thần kinh trung ương và dạ dày được kích thích, đồng thời cảm thấy có vị đắng và tê tê ở đầu lưỡi Thành phần chính dẫn đến các cảm giác đó là do nhóm ankaloid có trong chè bao gồm caffeine (1,3,7-trimethylxanthine), theobromine (3,7-dimethylxanthine), và theophylline (1,3-dimethylxanthine) Caffeine trong chè chiếm khoảng 2-5% khối lượng khô Theobromine và theophylline với hàm lượng khô nhỏ hơn nhiều so với hàm lượng của caffeine, chiếm khoảng 0,33% khối lượng chất khô [7], nhưng chúng có vai trò về dược tính quan trọng hơn so với caffeine

Hiện nay, việc phát triển các phương pháp phân tích để xác định đồng thời caffeine, theobromine, và theophylline trong các sản phẩm thực phẩm, dịch sinh học và đồ uống hoặc sô cô la, cũng như trong quá trình sản xuất dược phẩm đang rất được quan tâm Một

số phương pháp phân tích khác nhau đã được đề xuất để xác định những methylxanthine này Tuy nhiên, chỉ có một vài phương pháp trong đó có phương pháp sắc ký có khả năng tách biệt hoàn toàn ba hợp chất theobromine, theophylline và caffeine trong mẫu phân tích mà bước xử lý mẫu trước khi đo đơn giản và cho giới hạn phát hiện thấp Trong nghiên cứu này, một phương pháp phân tích đã được phát triển để xác định đồng thời caffeine, theobromine và theophylline trong chè bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (HPLC) với bộ phát hiện UV, cho phép bơm trực tiếp mẫu mà không cần xử

lý trước, ngoại trừ một bước lọc Phương pháp này có thời gian lưu ít hơn 12 phút và cho giới hạn phát hiện thấp

Dựa trên những lý do đó, tôi đã lựa chọn tên luận văn: “Xác định đồng thời thành

phần caffeine, theobromine, và theophylline trong một số loại chè phân bố ở Miền Bắc Việt Nam”

13

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan Chè (Camellia sinensis(L.) Kuntze)

Tên Khoa học: Camellia sinensis (L.) Kuntze

Tên tiếng Việt: Chè, Trà

1.1.1 Nguồn gốc và phân loại các loài Chè

Nguồn gốc

Theo truyền thuyết, cây chè lần đầu tiên được phát hiện bởi người Trung Quốc Ngày nay, cây chè được trồng ở nhiều nơi trên thế giới trong vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Đến nay có 56 nước trồng chè, sản xuất và chế biến chè ở các quy mô khác nhau, phân bố

ở khắp 5 châu

Các vùng trồng chè ở Việt Nam

Cây chè được trồng nhiều ở Việt Nam, nó được phân bố rộng rãi ở các vùng như:

- Tây Bắc: Sơn La, Lai Châu, Điện Biên, Yên Bái

- Đông Bắc: Quảng Ninh, Lạng Sơn, Bắc Giang, Cao Bằng

- Trung du và miền núi phía Bắc: Thái Nguyên, Phú Thọ, Hòa Bình, Hà Nội, Vĩnh Phúc

- Phía bắc miền Trung: Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh, Tây Nguyên, Lâm Đồng, Gia Lai, Kon Tum

Phân loại

Dựa theo đặc điểm thực vật học, đặc điểm sinh hoá, nguồn gốc phát sinh cây chè, chè được chia làm 4 loại:

a Chè Trung Quốc lá to (Camellia sinensis var Macrophylla)

b Chè Trung Quốc lá nhỏ (Camellia sinensis var Bohea)

c Chè Shan (Camellia sinensis var Shan)

d Chè Ấn Độ (Camellia sinensis var Assamica)

Cả 4 loại trà trên đều có trồng ở Việt Nam nhưng phổ biến nhất là 2 loại trà: trà

Camellia sinesisvar.Macrophy và trà Camellia sinesisvar.Shan

- Camellia sinensisvar Macrophylla được trồng nhiều nhất ở các tỉnh trung du với

các tên gọi của địa phương (theo màu sắc lá) như: Trung du lá xanh, Trung du lá vàng, v.v

- Camellisa sinensisvar Shan được trồng ở miền núi các tỉnh miền bắc và ở phía nam

Tây Nguyên (Lâm Đồng) Ở mỗi địa phương có các giống khác nhau như: Shan Mộc Châu, Shan Tham Vè, Shan Trấn Ninh [3]

1.1.2 Thành phần hoá học của chè

Thành phần hóa học của chè biến đổi rất phức tạp, nó phụ thuộc vào giống, điều kiện đất đai, địa hình, kĩ thuật canh tác.Để khảo sát đặc tính lý, hóa của chè, ta sẽ tìm hiểu thành phần các chất có trong lá chè, từ đó tìm hiểu vai trò và ý nghĩa của nó

Hiện nay thành phần lá trà được mô tảkhá đầy đủthành phần lá trà được mô tả trong bảng 1.1 sau [1]:

Bảng 1.1: Thành phần hóa học của chè

Flavanol:

(-) Epigallocatechin gallate (EGCG)

(-) Epicatechin gallate (ECG)

(-) Epigallo catechin (EGC)

(-) Epicatechin (EC)

(+) Catechin (C)

(+) Gallcatechin (GC)

8-12 3-6 3-6 1-3 1-2 3-4

Đường (glucose, fructose, saccharose, raffinose, stachyose) 4-5