Nghiên cứu đa dạng di truyền tập đoàn giống lúa chịu ngập ở giai đoạn nảy mầm của việt nam bằng chỉ thị SSR

Cho đến nay, chọn giống phân tử vẫn chưa được ứng dụng có hiệu quả trong nghiên cứu các cơ chế kiểm soát sức sống cây giống ở điều kiện ngập lụt, đó là một trong những nguyên nhân chính

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NÔI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NÔI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Phúc – Bộ môn Di truyền học - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã hướng dẫn

em về tài liệu và phương pháp nghiên cứu Đồng thời đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình học tập, làm việc và hoàn thành luận văn này

Trong quá trình học tập và thực hiện luận văn này em đã nhận được rất nhiều sự dạy bảo, hướng dẫn, giúp đỡ từ phía các thày cô giáo trong khoa Sinh học, phòng Sau đại học- Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội

em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó

Nhân dịp này, em cũng xin tỏ lòng biết biết ơn tới tất cả các cô, chú, các anh, chị và các bạn đồng nghiệp trong Phòng Kỹ thuật Di truyền - Viện Di truyền Nông nghiệp đã giúp đỡ, động viên em trong suốt thời gian làm việc và thực hiện luận văn tại đây

Cuối cùng, em muốn bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè, những người thân thiết nhất đã luôn hết lòng ủng hộ, chỉ bảo, động viên em trong

suốt thời gian qua

Hà Nội, ngày 2 tháng 12 năm 2016 Học viên

Nguyễn Thị Trang

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục đích nghiên cứu 2

3.Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2

4 Đối tượng nghiên cứu và phạm vi nghiên cứu 2

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Vài nét sơ lược về cây lúa 3

1.1.1 Vai trò của cây lúa 3

1.1.2 Nguồn gốc và sự phân bố của cây lúa 6

1.2 Tính chống chịu ngập của cây lúa 6

1.2.1 Ảnh hưởng của lũ lụt đến phương pháp canh tác lúa gieo sạ thẳng 6

1.2.2 Một số đặc điểm hình thái và sinh lý chính về tính chịu ngập của cây lúa 8

1.2.3.Một số gen chính liên quan đến tính chịu ngập của cây lúa 13

1.2.4 Phân loại các giống lúa chịu ngập 14

1.3 Các phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền 16

1.3.1.Chỉ thị hình thái 16

1.3.2 Chỉ thị sinh hóa 16

1.3.3 Chỉ thị phân tử ADN 17

1.4 Chỉ thị phân tử SSR và ứng dụng trong nghiên cứu lúa chịu ngập 19

1.4.1 Chỉ thị phân tử SSR 19

1.4.2.Ứng dụng của chỉ thị phân tư SSR trong nghiên cứu đa dạng di truyền các giống lúa chịu ngập 22

1.4.3 Ứng dụng của chỉ thị phân tư SSR trong nghiên cứu xác định QTL/gene chịu ngập 24

1.5 Nghiên cứu đa dạng di truyền và tính chịu ngập cây lúa ở Việt Nam 26

1.5.1 Nghiên cứu đa dạng di truyền cây lúa ở Việt Nam 26

1.5.2 Nghiên cứu tính chịu ngập cây lúa ở Việt Nam 27

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29

2 1 Vật liệu nghiên cứu 29

2.1.1 Vật liệu thực vật 29

2.1.2 Hóa chất 29

2.2 Phương pháp nghiên cứu 32

2.2.1 Phương pháp phân tích kiểu hình 32

2.2.2 Phương pháp phân tích kiểu gen 33

2.3 Phân tích số liệu 36

2.3.1 Phân tích số liệu kiểu hình 36

2.3.1 Phân tích số liệu kiểu gen 37

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 40

3.1 Đánh giá khả năng chịu ngập của 150 giống lúa ở các địa điểm sinh thái khác nhau thuộc vùng trũng đồng bằng châu thổ Việt Nam 40

3.1.1 Đa dạng kiểu hình tính trạng sức sống cây con chịu ngập của quần thể giống lúa bản địa Việt Nam 40

3.1.2 Mối tương quan giữa khả năng chịu ngập và tỷ lệ phục hồi sau ngập của các giống lúa bản địa chịu ngập Việt Nam ở giai đoạn nảy mầm 43

3.2 Nghiên cứu đa đạng di truyền của tập đoàn lúa chịu ngập 47

3.2.1.Tách chiết ADN tổng số 47

3.2.2 Phân tích đa dạng di truyền của tập đoàn lúa có khả năng chịu ngập bằng chỉ thị phân tử SSR 48

3.3 Xác định các allele hiếm nhận dạng một số giống trong tập đoàn lúa chịu ngập nghiên cứu 62

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 66

1.Kết luận 66

2 Kiến nghị 66

Bảng 3.1: Tỷ lệ phục hồi của các giống lúa bản địa Việt Nam chịu

ngập ở giai đoạn nảy mầm

46

Bảng 3.2: Tỉ lệ khuyết số liệu và dị hợp tử của các giống lúa nghiên

cứu

50

Bảng 3.3: Hệ số PIC và tổng số alen thể hiện của 43 cặp mồi SSR với

48 giống lúa chịu ngập nghiên cứu

54 Bảng 3.4: Hệ số tương đồng di truyền của 48 giống với 43 cặp mồi 60

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.2 Các quá trình chuyển hóa liên quan đến sự tăng cường nảy mầm

và vươn dài thân lá lúa trong điều kiện thiếu oxi (Ismail 2009) 10 Hình 1.3 Con đường chuyển hóa glucose ở lúa trong điều kiện ngập nước

Hình 3.1 Thí nghiệm xử lý ngập trong ống nghiệm ở giai đoạn nảy mầm 41 Hình 3.2: Chiều dài lá của 150 giống lúa bản địa và cải tiến Việt Nam 42 Hình 3.3: Mối tương quan về khả năng chịu ngập của 48 giống nghiên cứu 44

Hình 3.5: Điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu với cặp

mồi RM341; (1-48 là các mẫu giống từ T1-T48); M: 100 bp ADN Ladder

Hình 3.6: Điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu với cặp

mồi RM85; (1-48 là các mẫu giống từ T1-T48); M: 100 bp ADN Ladder

Hình 3.7: Điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu với cặp

mồi RM10173; (1-48 là mẫu giống từ T1-T48); M: 100 bp ADN Ladder

Hình 3.8: Điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu với cặp

mồi RM16589; (1-48 là mẫu giống từ T1-T48); M: 100 bp ADN Ladder

Hình 3.9: Sơ đồ tỏa tròn về mối quan hệ di truyền của 48 giống lúa chịu

ngập ở giai đoạn nảy mầm 60 Hình 3.10: Điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu với cặp

Hình 3.11: Điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu với cặp

Hình 3.12: Điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu với cặp

Hình 3.13: Điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu với cặp

Hình 3.14: Điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu với cặp

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Trong hệ thống canh tác lúa gieo sạ thẳng, sức sống cây lúa là một trong những tính trạng giúp cho cây con trốn thoát ngập úng ở giai đoạn nảy mầm, đặc biệt sau khi gieo sạ bị ngập Trong những năm gần đây, lũ lụt trở thành vấn đề lớn đối với việc sản xuất lúa tại các vùng canh tác đất thấp, gây thiệt hại lớn về kinh tế Khả năng chịu ngập của cây lúa ở giai đoạn nảy mầm là đặc tính nông học của giống mà chính bản thân giống lúa đó thể hiện khả năng kéo dài lá mầm nhanh nhất, ngoi lên khỏi mặt nước tiếp cận oxi để trốn thoát ngập úng (submergence escape) Đặc tính này đặc biệt quan trọng để đảm bảo thời vụ, giúp quần thể lúa duy trì mật

độ tối ưu trong hệ thống canh tác gieo sạ tại các tỉnh đồng bằng châu thổ ở nước ta

Việt Nam nằm trong vùng tiểu khí hậu bị ảnh hưởng nghiêm trọng bởi yếu tố thời tiết thất thường đối với sản xuất nông nghiệp Canh tác lúa tại đồng bằng châu thổ của Việt Nam được chia thành 3 vùng chính đó là vùng đồng bằng châu thổ Sông Hồng (phía Bắc), sông Cửu Long (phía Nam) và các tỉnh đồng bằng ven biển Miền Trung Tại các vùng này, việc hình thành cơ cấu giống để canh tác lúa gieo sạ tại mô hình cánh đồng mẫu lớn đang đặt ra một vấn đề lớn trong sản xuất lúa gạo, đặc biệt đối với vùng đất thấp dễ xảy ra lũ lụt sớm

Nghiên cứu đa dạng di truyền là một điều kiện tiên quyết đối với các nhà chọn giống lúa trong việc khai thác nguồn tài nguyên gen bản địa Hơn nữa, các nhà khoa học đã ước tính chỉ có khoảng 15% nguồn gen đa dạng di truyền tiềm năng đã được sử dụng Điều đó chứng tỏ rằng phần lớn nguồn biến dị alen về các đặc điểm nông học có giá trị kinh tế vẫn chưa được sử dụng Ngoài ra, ở các vùng trồng lúa của các vùng đồng bằng châu thổ thường bị ngập nước trong suốt mùa mưa Nhiều cánh đồng gieo sạ lúa gần như bị ngập trắng hoàn toàn do nước lũ dâng Cho đến nay, chọn giống phân tử vẫn chưa được ứng dụng có hiệu quả trong nghiên cứu các

cơ chế kiểm soát sức sống cây giống ở điều kiện ngập lụt, đó là một trong những nguyên nhân chính làm giảm năng xuất lúa tại những vùng canh tác lúa đất thấp của Việt Nam Vì vậy, đánh giá di truyền và cải tạo nguồn gen lúa chịu ngập là một trong những mục tiêu cấp bách trong chương trình chọn tạo giống Xuất phát từ

những lý do trên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đa dạng di

truyền tập đoàn giống lúa chịu ngập ở giai đoạn nảy mầm của Việt Nam bằng chỉ

thị SSR" nhằm cung cấp các thông tin về các nguồn gen lúa chịu ngập, giúp khai

thác và cải tiến sức sống cây giống trong điều kiện ngập úng

2 Mục đích nghiên cứu

Đánh giá mức độ đa dạng di truyền của tập đoàn giống lúa bản địa Việt Nam chịu ngập ở giai đoạn nẩy mầm ở mức phân tử, nhằm xác định mối quan hệ di truyền giữa các nguồn gen địa phương khác nhau phục vụ cho công tác bảo tồn, khai thác và sử dụng có hiệu quả các nguồn gen lúa chịu ngập bản địa của Việt Nam

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

3.1 Ý nghĩa khoa học

Hiểu biết về đa dạng di truyền của các nguồn gen lúa chịu ngập tạo cơ sở lý luận cho việc chọn lọc, phục tráng để nâng cao tiềm năng di truyền của các giống lúa chịu ngập trong sản xuất

Phát hiện sai khác di truyền của các giống lúa chịu ngập có ý nghĩa quan trọng trong việc xác định các allele hiếm, allele đặc trưng để nhận dạng chính xác các nguồn gen ưu tú giúp định hướng cho công tác thu thập bảo tồn đa dạng nguồn gen lúa chịu ngập ở mức phân tử Phục vụ công tác lai tạo và nghiên cứu lập bản đồ

di truyền, nhằm định vị QTL/gen liên kết với tính trạng chịu ngập

3.2 Ý nghĩa thực tiễn

Nghiên cứu đa dạng di truyền thông qua các chỉ thị phân tử (SSR) góp phần nâng cao hiệu quả công tác bảo tồn và chọn tạo giống lúa có phẩm chất gạo tốt, năng suất cao, có khả năng chịu ngập ở giai đoạn nảy mầm, phù hợp với điều kiện canh tác lúa gieo sạ tại mô hình cánh đồng mẫu lớn của Việt Nam

4 Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu

4.1 Đối tượng:

Đối tượng nghiên cứu là cứu là tập đoàn các giống lúa chịu ngập ở giai đoạn nảy mầm được thu thập ở nhiều địa phương khác nhau, các giống này đang được lưu giữ và bảo tồn tại ngân hàng gen Cây trồng Quốc gia (Trung tâm Tài nguyên Thực vật)

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Vài nét sơ lược về cây lúa

1.1.1 Vai trò của cây lúa

Lúa (Oryza sativa L.) là cây lương thực quan trọng được trồng chủ yếu ở

Châu Á, đặc biệt là khu vực Đông Nam Á trong đó có Việt Nam Lúa gạo là nguồn lương thực chủ yếu nuôi sống hàng tỷ người trên thế giới [40] Sản lượng lúa gia tăng trong thời gian qua đã mang lại sự an sinh cho con nguời, đặc biệt đối với dân nghèo: gạo là nguồn cung cấp thức ăn chủ yếu Các nước nghèo thường dùng gạo là nguồn lương thực chính, khi thu nhập tăng lên mức tiêu thụ gạo có xu hướng giảm xuống, thay thế bằng các loại thức ăn cung cấp nhiều protein và vitamin hơn là năng lượng Bangladesh và Thái Lan có mức tiêu thụ gạo cao nhất vào những năm 1960 (tương đương 180 kg/người/năm), đến năm 1988 giảm xuống còn khoảng 150 kg Ở Việt Nam hiện nay mức tiêu thụ gạo bình quân vẫn còn ở mức cao, khoảng 120 kg/người/năm Tuy nhiên có thể nói, trên khắp thế giới, ở đâu cũng có dùng đến lúa gạo hoặc các sản phẩm từ lúa gạo Khoảng 40% dân số trên thế giới lấy lúa gạo làm nguồn lương thực chính Trên thế giới có hơn 110 quốc gia có sản xuất và tiêu thụ gạo với các mức độ khác nhau Lượng lúa được sản xuất ra và mức tiêu thụ gạo cao tập trung ở khu vực Châu Á Năm 1980, chỉ riêng ở Châu Á đã có hơn 1,5 tỷ dân sống nhờ lúa gạo, chiếm trên 2/3 dân số Châu Á Con số này theo ước đoán đã tăng lên gần gấp đôi [6]

Lúa là cây trồng thân thiết, lâu đời nhất của nhân dân ta và nhiều dân tộc khác trên thế giới, đặt biệt là các dân tộc ở Châu Á Mặc dù năng suất lúa ở các nước Châu Á còn thấp nhưng do diện tích sản xuất lớn nên Châu Á vẫn là nguồn đóng góp rất quan trọng cho sản lượng lúa trên thế giới (trên 90%) Các quốc gia dẫn đầu về sản lượng lúa theo thứ tự là Trung Quốc, Ấn Độ, Indoniesia, Bangladesh, Việt Nam, Thái Lan và Myanmar, tất cả đều nằm ở Châu Á Như vậy,

có thể nói Châu Á là vựa lúa quan trọng nhất thế giới Gạo là thức ăn giàu dinh dưỡng So với lúa mì, gạo có thành phần tinh bột và protein hơi thấp hơn, nhưng

năng lượng tạo ra cao hơn do chứa nhiều chất béo hơn Ngoài ra, nếu tính trên đơn

vị 1 hecta, gạo cung cấp nhiều calo hơn lúa mì do năng suất lúa cao hơn nhiều so với lúa mì Giả sử một người trung bình cần 3200 calo mỗi ngày thì một hecta lúa

có thể nuôi 2055 người/ngày hoặc 5,63 người/năm, trong khi lúa mì chỉ nuôi được 3,67 người /năm, bắp 5,3 người/năm Hơn nữa, trong gạo lại có chứa nhiều acid amin, thiết yếu như: Lysine, Threonine, Methionine, Tryptophan… hơn hẳn lúa mì Đối với một số quốc gia như Việt Nam, Thái Lan, Miến Điện (Myanmar), Ai Cập lúa gạo chiếm một vị trí quan trọng trong nền kinh tế quốc dân, không phải chỉ là nguồn lương thực mà còn là nguồn thu ngoại tệ để đổi lấy thiết bị, vật tư cần thiết cho sự phát triển của đất nước [6] Điều này chỉ rõ vị trí của lúa gạo trong cơ cấu lương thực thế giới và trong đời sống kinh tế quốc tế

Việt Nam là một trong những nước có nghề truyền thống trồng lúa nước cổ xưa nhất thế giới Nông nghiệp trồng lúa vừa đảm bảo an ninh lương thực quốc gia, vừa là cơ sở kinh tế sống còn của đất nước Dân số nước ta đến nay hơn 90 triệu người, trong đó dân số ở nông thôn chiếm gần 80% và lực lượng lao động trong nghề trồng lúa chiếm khoảng 70% lực lượng lao động cả nước Điều đó cho thấy lĩnh vực nông nghiệp trồng lúa thu hút đại bộ phận lực lượng lao động cả nước, đóng vai trò rất lớn trong nền kinh tế quốc dân Bên cạnh đó, ưu thế lớn của nghề trồng lúa còn thể hiện rõ ở diện tích canh tác trong tổng diện tích đất nông nghiệp cũng như tổng diện tích trồng cây lương thực Ngành trồng trọt chiếm 4/5 diện tích đất canh tác trong khi đó lúa giữ vị trí độc tôn, gần 85% diện tích lương thực Theo báo cáo của Bộ Nông nghiệp và phát triển Nông thôn, diện tích trồng lúa khoảng 7,8 triệu ha tập trung ở 2 vùng trồng lúa chính là đồng bằng sông Cửu Long (5,29 triệu ha) và đồng bằng sông Hồng (2,51 triệu ha) với sản lượng lúa cả năm 2014 ước tính đạt 44,84 triệu tấn, năng suất bình quân đạt 57,4 tạ/ha [4]

Như vậy bên cạnh sự thu hút về nguồn lực con người thì sự thu hút nguồn lực đất đai cũng lại khẳng định rõ vị trí của lúa gạo trong nền kinh tế quốc dân Trong những năm gần đây, Việt Nam có tổng sản lượng lúa hàng năm đứng thứ 5 trên thế giới, nhưng lại là nước xuất khẩu gạo đứng hàng thứ 2 thế giới hiện nay với

sản lượng gạo xuất khẩu bình quân trên dưới 4 triệu tấn/năm Thái Lan luôn là nước xuất khẩu gạo dẫn đầu thế giới, hơn hẳn Việt Nam (thứ 2) cả về số lượng và giá trị,

do có thị trường truyền thống rộng hơn và chất lượng gạo cao hơn Mỹ, Ấn Độ, Pakistan cũng là những nước xuất khẩu gạo quan trọng, sau Việt Nam Hiện nay, Việt Nam đứng hàng thứ 6 thế giới về diện tích gieo trồng lúa Hạt gạo Việt Nam chẳng những đủ bảo đảm yêu cầu về an ninh lương thực trong nước mà còn góp phần rất quan trọng trong thị trường lúa gạo thế giới [6]

1.1.2 Nguồn gốc và sự phân bố của cây lúa

Từ trung tâm phát sinh, cây lúa theo thời gian đã được di thực đi nhiều vùng sinh thái mới Qua quá trình chọn lọc tự nhiên và nhân tạo, cây lúa có khả năng thích nghi ngày càng rộng Hiện nay, cây lúa được trồng trong những điều kiện sinh thái và khí hậu rất khác nhau Lúa được trồng ở Tây Bắc Trung Quốc (50o vĩ Bắc), ở miền Trung Xumatra trên đường xích đạo và ở cả New South Wales, châu Úc (35o vĩ Nam) Lúa cũng được trồng từ những vùng thấp hơn mực nước biển, ở Kerala (Ấn Độ) đến những vùng có độ cao 2000 mét ở Kasmia (Ấn Độ) và có thể trồng trên cạn hoặc điều kiện nước sâu tới 1,5 - 5 mét [10]

Tổ tiên cây lúa đã tồn tại từ đầu kỷ Phấn trắng Vào giữa kỷ này, xuất

hiện một trong những loại nguyên thuỷ nhất thuộc tộc Oryzae, đó là loại

Streptochasta Schrad Đến cuối kỷ Phấn trắng xuất hiện loại tre (Bambusa) và

loại lúa (Oryza) Một số loại khác xuất hiện muộn hơn vào kỷ thứ ba, thời kỳ phát triển mạnh nhất của họ Hoà thảo (Gramineae) Các loài lúa Oryza spp có

cùng tổ tiên chung vào thời địa cầu Gondwanaland, sau khi trái đất tách rời thành năm lục địa cách đây khoảng 85-90 triệu năm [5]

Tác giả Cheng khi nghiên cứu di truyền tiến hoá của 101 giống lúa, bao gồm cả

lúa trồng và lúa dại cho thấy loài lúa trồng Oryza sativa chia thành hai nhóm tương ứng với hai loài phụ là Indica và Japonica Trong khi đó Oryza rufipogon chia thành bốn nhóm, một nhóm là Oryza rufipogon hàng niên và ba nhóm Oryza rufipogon đa niên Kết quả cho thấy các giống lúa Japonica có quan hệ gần gũi với một nhóm Oryza

rufipogon đa niên, còn các giống lúa Indica có quan hệ gần với nhóm lúa Oryza rufipogon hàng niên [30]

Hiện nay, nhiều chuyên gia lúa gạo đồng ý rằng lúa glaberrima và lúa

sativa có cùng chung nguồn thủy tổ vào thời kỳ lục địa nguyên thuỷ

Gondwanaland, nhưng sau khi các lục địa tách rời nhau, lúa sativa và glaberrima

tự tiến hoá từ các loài lúa dại bản địa ở hai châu lục là châu Á và châu Phi (Khush, 1997) [55]

Hình 1.1 Sơ đồ tiến hoá của hai loài lúa trồng (Khush, 1997) [55]

Việc thuần hoá cây lúa diễn ra ở bán đảo Trung Ấn và được bắt đầu khoảng 10.000 - 15.000 năm trước, còn cây lúa trồng đã xuất hiện ở châu Á cách đây khoảng 8.000 năm [29]

1.2 Tính chống chịu ngập của cây lúa

1.2.1 Ảnh hưởng của lũ lụt đến phương pháp canh tác lúa gieo sạ thẳng

Việt Nam nằm trong vùng khí hậu chịu tác động tiêu cực của biến đổi khí hậu đến sản xuất nông nghiệp Đất trồng lúa trải khắp với các tiểu vùng khí hậu nông nghiệp khác nhau: đất được chủ động tưới tiêu, đất ướt vùng thấp, đất vùng cao và đất dễ bị ngập lụt Nguyên nhân chủ yếu làm giảm nghiêm trọng sản lượng

lúa ảnh hưởng đến nền kinh tế Việt Nam là vấn đề côn trùng gây hại, dịch bệnh, hạn hán, lạnh, mặn và ngập lụt…Lúa là loại cây trồng cần nhiều nước nên thường được trồng ở những khu vực đất thấp thường xuyên đe dọa bởi lũ lụt Lúa có thể được canh tác bằng phương pháp cấy hoặc gieo sạ từ 2 - 3 vụ tùy thuộc vào điều kiện khí hậu nông nghiệp Trong thế kỷ hai mươi, với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật nông nghiệp và công nghệ cũng như xu hướng kinh tế mới, hầu hết các nước trồng lúa đã khuyến khích nông dân chuyển đổi từ phương pháp cấy lúa truyền thống sang gieo lúa sạ thẳng

Ở Việt Nam, gieo sạ lúa đã trở nên quen thuộc đối với nông dân trồng lúa ở các tỉnh phía Nam, giúp giảm công lao động mà năng suất lại cao hơn so với tập quán nhổ mạ và cấy Ở các tỉnh phía Bắc, từ năm 2005, Bộ Nông nghiệp và PTNT

có chủ trương phát triển lúa gieo thẳng có sự hỗ trợ của công cụ sạ hàng và diện tích lúa gieo thẳng ngày càng được mở rộng trong sản xuất, mỗi năm đều tăng từ 1,2 - 1,5 lần đem lại hiệu quả kinh tế cao cho người nông dân [8] Gieo sạ cùng thời gian trong cùng một cánh đồng ở mô hình cánh đồng mẫu lớn ngày càng được nhân rộng

ở các tỉnh trồng lúa và mang lại thu nhập cao, tạo tiền đề cho ngành sản xuất lúa gạo phát triển bền vững Vấn đề khuyết mật độ cây trồng là một trở ngại khi áp dụng biện pháp canh tác này trên diện tích lớn, đặc biệt ở khu vực dễ bị lũ lụt vào đầu vụ

Thêm vào đó, một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) có nhiều vùng đất khác nhau và trong mỗi tiểu vùng, nông dân phải đối mặt với nhiều khó khăn trong sản xuất lúa Mùa mưa, những vùng trũng lúa bị ngập úng, nhiều trà lúa gieo sạ bị chết do nước chụp Đồng bằng Bắc Bộ và các tỉnh miền Trung, hàng năm

từ tháng 7 đến tháng 10 ở vụ mùa, giai đoạn sau gieo sạ hay gặp mưa lớn kéo dài trên diện rộng, khi ngập nước trở nên nghiêm trọng với mực nước từ 30 đến 90 cm trong vòng 5 đến 15 ngày, nước tiêu không kịp và dâng cao tràn vào các ruộng lúa gây ngập úng toàn diện hoặc cục bộ làm mất trắng từ hàng chục đến hàng trăm hecta lúa sạ Theo Cục Trồng trọt, kể từ 2008, gieo thẳng được phát động như một tình thế khắc phục thiếu mạ do chết rét, với tổng diện tích gieo thẳng toàn miền Bắc

là trên 168 ngàn ha, chiếm 14,6% diện tích lúa toàn miền, thì đến vụ xuân 2011, diện tích lúa gieo thẳng toàn miền đã đạt trên 229 ngàn ha chiếm 20% diện tích lúa, tăng gần 14% [8] Gieo sạ thẳng đã góp phần tiết kiệm chi phí, hạ giá thành, tạo tiền

đề và động lực cho dồn đổi đất đai, cơ giới hóa sản xuất để hình thành vùng sản xuất hàng hóa tập trung Các tính toán qua 2 - 3 vụ cho thấy cứ mỗi ha gieo thẳng tiết kiệm chi phí và làm lợi cho nông dân 3 - 4 triệu đồng Nếu nhân con số này với trên 200.000 ha thì số tiền mang lại là cả ngàn tỷ đồng mỗi năm Gieo thẳng cũng còn một loạt các vấn đề kỹ thuật cần giải quyết như giống lúa thích hợp ngập úng, chịu thâm canh và chống đổ tốt hơn

Hơn nữa, trong những năm gần đây với sự biến đổi thất thường của khí hậu

đã làm cho ngập lũ trở thành một trong những thảm họa thiên nhiên nghiêm trọng nhất [42] Lúa là cây trồng quan trọng bậc nhất ở Việt Nam và những nghiên cứu về tính chống chịu sinh học và phi sinh học như chịu ngập là chủ đề có tầm chiến lược trong chương trình chọn tạo giống lúa Do vậy nghiên cứu cơ bản tạo tiền đề cho ứng dụng chọn tạo giống lúa thích ứng với khả năng gieo sạ thẳng, đặc biệt là ở những vùng đất lúa thường xuyên bị ngập lụt trong các hệ thống canh tác lúa sạ ở nước ta trở nên rất quan trọng

1.2.2 Một số đặc điểm hình thái và sinh lý về tính chịu ngập của cây lúa

Lúa là cây trồng danh tiếng có thể sinh trưởng tốt trong điều kiện ngập úng

và thể hiện phổ biến dị di truyền rộng về tính chịu ngập Trong điều kiện bị ngập, hàm lượng oxy khuếch tán vào nước giảm 10.000 lần so với trong không khí [24] Khi bị ngập hàm lượng oxy trong nước giảm xuống dưới mức thích hợp cho cây trồng sinh trưởng thì được gọi là điều kiện yếm khí một phần (hypoxia) Hiện tượng này xảy ra khi bộ rễ của cây trồng bị ngập trong một thời gian ngắn nhưng thân của chúng vẫn còn ở trên mặt nước Sau khi đất bị ngập nước thì hàm lượng oxy giảm nhanh tới mức chỉ trong vòng một ngày là có thể không phát hiện được oxy nữa, khi oxy không còn hiện diện ở trong nước thì được gọi là yếm khí toàn phần (anoxia) [78]

Lúa thể hiện hai xu hướng khác nhau về chiến lược chịu ngập hoặc là mọc vươn dài ra để thoát khỏi tình trạng ngập, hoặc không vươn dài để bảo tồn nguồn năng lượng Các chiến lược chịu ngập này phụ thuộc vào từng giai đoạn sinh trưởng phát triển, cũng như những vùng đất chịu tác động khác nhau khi ngập úng Nhìn chung, đặc tính chịu ngập của lúa ở giai đoạn nẩy mầm thể hiện bằng cơ chế sức sống của cây con nẩy mầm nhanh và sinh trưởng sớm để cây lúa vươn lên khỏi mặt nước và tiếp cận với oxy [47] Theo đó, sức sống cây con đóng một vai trò quan trọng trong việc “trốn thoát” khỏi tình trạng ngập, đó cũng là yếu tố quan trọng trong hệ thống canh tác gieo sạ bằng máy [32] Lúa chịu ngập ở giai đoạn nảy mầm hay sức sống cây con (seedling vigor) đề cập đến tất cả các yếu tố làm cây giống tăng trưởng sớm, bao gồm các quá trình sinh lý ở các giai đoạn dị dưỡng, chuyển đổi và tự dưỡng [33] Hầu hết các giống lúa ở thời kỳ mạ đều vươn dài thân lá một cách tối đa khi bị ngập nước hoàn toàn, mức độ vươn dài đó phụ thuộc vào đặc tính

di truyền của giống và bị ảnh hưởng bởi môi trường ngập hoặc tình trạng cây con trước khi bị ngập [53]

Sự tăng quá trình sử dụng cacbohydrate giúp phân chia tế bào và kéo dài tế bào giúp cây lúa vươn nhanh thân lá để trốn thoát ngập [81; 89] Lũ lụt dẫn đến quá trình chuyển đổi từ môi trường bình thường sang tình trạng thiếu oxy, lúa thể hiện

sự biến dị về khả năng vươn dài thân lá khi bị ngập nước [31] Trong điều kiện thiếu oxi, các giống chịu ngập sẽ vươn dài cây nhanh hơn để giúp cây con thoát ngập Cây sẽ sử dụng các năng lượng dự trữ thông qua sự hoạt động của enzym thủy phân tinh bột và hô hấp yếm khí [48] Một số quá trình chuyển hóa nhằm cung cấp năng lượng cần thiết và giúp cây vươn lóng trong điều kiện thiếu oxi (Hình 1.2) Sự tăng cường quá trình chuyển hóa tinh bột dự trữ nhờ sự hoạt động của enzym amylaza phân huỷ tinh bột là bước quan trọng nhất giúp cây sống sót và phát triển trong tình trạng ngập Hô hấp hiếm khí giúp đường hòa tan tham gia vào quá trình

dị hóa (glycolysis) để giải phóng năng lượng Quá trình này nhờ sự kích hoạt của

hai enzym PDC (Pyruvate dehydrogenase) và ADH (Alcohol dehydrogenases) là

những enzym quan trọng của quá trình lên men rượu Khi nảy mầm, ethylene được

sản sinh bằng cách phát triển phôi để kéo dài tế bào Ethylene cũng có thể làm tăng thêm quá trình thủy phân tinh bột bằng cách giảm tổng hợp ABA (Axít abscisic) trong khi đó lại tăng cường sự tổng hợp GA (Axít gibberellic) Cả hai quá trình này đều tăng cường sự hoạt động của các enzyme thủy phân tinh bột mà đặc biệt là amylase

Hình 1.2 Các quá trình chuyển hóa liên quan đến sự tăng cường nảy mầm và

vươn dài thân lá lúa trong điều kiện thiếu oxi [48]

Cho đến nay, chưa có nhiều nghiên cứu về sinh lý, hóa sinh và phân tử của lúa chịu ngập yếm khí ở giai đoạn nảy mầm Hô hấp yếm khí là một quá trình bắt buộc trong điều kiện thiếu oxi Nhưng nếu duy trì lâu thì cây sẽ chết vì năng lượng rất ít và sản sinh một số sản phẩm như rượu, axit mà nếu tích lũy nhiều sẽ gây độc cho cây Hô hấp yếm khí cũng là một phản ứng thích nghi giúp cây tồn tại tạm thời trong điều kiện thiếu oxi Một số thực vật có khả năng sống trong môi trường thường xuyên thiếu oxi vì chúng có các cơ chế thích nghi và chống chịu với yếm khí [88] Nhìn chung, quá trình thủy phân đường (glycolysis) và lên men ethanol là những con đường chính để cung cấp năng lượng trong sự nảy mầm và phát triển cây con giai đoạn mạ trong điều kiện bị ngập nước [61; 71] Con đường lên men rượu đóng một vai trò chủ đạo trong điều kiện yếm khí, trong đó ATP hình thành thông

qua sự phosphoryl hóa oxy hóa trong ty lạp thể Quá trình trao đổi chất và chức năng của tế bào bị giảm do giảm hiệu quả của hô hấp kỵ khí Đây là nguyên nhân gây ra sự khủng hoảng năng lượng, vì trong quá trình glycolysis (thủy phân đường) chỉ tạo được 3 phân tử ATP từ một phân tử đường hexose (đường chứa 6 phân tử cacbon) Trong khi đó ở điều kiện hiếu khí, một phân tử đường có thể tạo ra 39 phân tử ATP trong tế bào [48]

Bên cạnh đó, quá trình lên men alcohol (AF) là một trong những quá trình thích ứng chuyển hóa chính để cây trồng đối mặt với tình trạng thiếu oxi khi cây lúa

bị ngập nước Ethylene gián tiếp điều khiển sự phát triển của lóng thân khi ngập nước [36] ACC synthase (ACS) and ACC oxidase (ACO) là enzyme quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp ethylene, hoạt tính của những enzyme này biểu hiện khi cây lúa bị ngập nước [76] Năng lượng ATP được hình thành trong điều kiện thiếu oxi là rất quan trọng giúp cây lúa thoát ngập Vì vậy, giống lúa có khả năng dự trữ hàm lượng carbohydrate cao trước khi ngập, kết hợp với khả năng duy trì sản xuất năng lượng ATP trong điều kiện hiếm khí là yếu tố cơ bản giúp cây lúa nảy mầm yếm khí [72]

Cũng theo nghiên cứu của Tsuji H và cs., 2003b [86] cho rằng: Đường phân

và lên men ethanol là các quá trình quan trọng nhằm sản sinh năng lượng cung cấp cho tế bào Quá trình lên men ethanol được thực hiện bởi hai bước: Đầu tiên,

pyruvate (PDC) được tạo ra từ quá trình thủy phân đường glucose Tiếp theo, dưới xúc tác của enzym pyruvate decarboxylase, một phân tử PDC sẽ chuyển hóa thành

phân tử acetaldehyde (ALDH) Nối tiếp của quá trình đường phân là một phân tử

ALDH được chuyển hóa thành ethanol nhờ xúc tác của enzym alcohol

dehydrogenase (ADH) Mặt khác, một phân tử pyruvate được tạo ra từ quá trình

đường phân và 1 phân tử ALDH được hình thành từ quá trình lên men ethanol Hai phân tử này đồng thời tham gia vào quá trình oxi hóa trong ty thể Kết quả của quá trình oxi hóa nhằm chuyển NADH thành NAD+ ,cho phép các tế bào thực vật tiếp tục quá trình đường phân và duy trì năng lượng ATP trong điều kiện ngập (Hình 1.3)

Hình 1.3 Con đường chuyển hóa glucose ở lúa trong điều kiện ngập nước [86]

Về hình thái học, cây lúa tự biến đổi hình thái ở rễ nhằm thích nghi với ngập úng như: gia tăng số lượng rễ phụ và rễ khí sinh có độ rỗng cao hơn những rễ thông thường nhằm tăng cường khả năng vận chuyển oxy xuống những phần bị ngập nước; tăng cường khả năng thành lập mô dẫn khí (aerenchyma) Mô dẫn khí là một dạng tế bào đặc biệt của rễ thường hiện diện ở những loài thực vật sống ở vùng đất ngập nước và một số ít loài trên cạn khi bị ngập nước [68] Hình thái điển hình của cây lúa chịu ngập ở giai đoạn nảy mầm là vươn lóng nhanh nhất để giúp cây tiếp cận với oxi ở trên mặt nước [47]

Ngược lại, khả năng chịu ngập (submergence tolerance) là tính trạng liên quan đến cây lúa ở giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng có khả năng phục hồi khi sau khi ngập hoàn toàn từ 10 - 14 ngày [49] Cơ chế hình thái và sinh lý của lúa ở giai đoạn này là hạn chế sinh trưởng, ức chế hình thành diệp lục và tăng cường dự trữ hàm lượng carbohydrat Nhờ vào chiến lược ngừng hoạt động (quiescense strategy)

sẽ giúp cây lúa chịu đựng môi trường ngập, chờ đến khi nước rút để mọc ra các lá mới [49; 82]

1.2.3 Một số gen chính liên quan đến tính chịu ngập của cây lúa

Khả năng chịu ngập là một tính trạng giúp cây lúa phục hồi sau khi bị ngập

hoàn toàn trong nước (10-14 ngày) Đặc tính này do sự kiểm soát của gen Sub1 nằm trên nhiễm sắc thể số 9, được phân lập từ giống lúa indica FR13A có nguồn gốc từ

Ấn Độ Nhờ sự hoạt động của gen Sub1 trong môi trường ngập sẽ kìm hãm sự phát

triển thân lá để dự trữ hàm lượng cacbohydrat và cung cấp năng lượng cho cây lúa sau khi nước rút, giúp cây lúa phục hồi nhanh chóng sau ngập úng [36]

Trong khi đó, sự sinh trưởng sớm của cây con và tỷ lệ nẩy mầm là hai yếu tố

cơ bản để đánh giá mức độ chịu úng khi nẩy mầm ở lúa [27] Sự vươn dài lá mầm của lúa trong điều kiện ngập úng được thể hiện rất rõ, tuy nhiên cơ chế và gen liên quan đến quá trình này mới được khám phá trong nghiên cứu gần đây (Xu và cs., 2006) [96] Khả năng chịu ngập của cây lúa ở giai đoạn nảy mầm hay thoát ngập (submergence escape) là một tính trạng khá phức tạp, do ảnh hưởng của nhiều gen

và các yếu tố môi trường Expansins đóng vai trò quan trọng trong vươn dài lá mầm yếm khí nhờ vào việc phát triển chiều rộng của tế bào [21] EXPA7, EXPB12,

EXPA2 và EXPA4 được xác định là các gen ứng cử viên liên quan đến sự vươn dài

lá mầm yếm khí [45]

Nhiều thay đổi chuyển hóa xảy ra trong quá trình nảy mầm và sinh trưởng sớm trong điều kiện yếm khí, chức năng quan trọng của quá trình lên men ethanol trong điều kiện ngập nước được coi là nhân tố để tái sinh NAD+ nhằm sản sinh ra năng lượng trong môi trường yếm khí thông qua đường phân, hay hô hấp yếm khí

[35] Các quá trình này thường liên quan đến hoạt động của một số gen như ADH (alcohol dehydrogenase), ALDH2a (acetoaldehyde dehydrogenase) và PDC

(pyruvate decarboxylase) Sự biểu hiện của các gen ADH1, ADH2 và ALDH2a đều

tăng trong điều kiện ngập ở cả hai loài phụ lúa indica và japonica, trong khi đó gen

ALDH2b không biểu hiện Kết quả cho thấy biểu hiện của các gen ADH1, ADH2 và ALDH2a liên quan đến tính chịu ngập ở giai đoạn cây con, tuy nhiên sự biểu hiện

này không phải là gen chính quyết định mức độ khác nhau về tính trạng sức sống

cây con chịu ngập của một giống/ một kiểu gen cụ thể [92] Theo nghiên cứu của

Kato-Noguchi và cs., 2001 [54], sự vươn thân lá liên quan chặt chẽ đến tăng sự hoạt

động gen ADH lúa ở giai đoạn cây con thể hiện ở cả 2 loài phụ indica và japonica Đồng phân ty thể của gen ALDH2 được mã hóa bởi ít nhất hai gen trong nhân hệ

gen lúa

Locus Sub1 đóng vai trò quan trọng trong cơ chế chịu ngập của lúa ở giai

đoạn trưởng thành thông qua sự hạn chế tối thiểu vươn dài thân lá và ức chế diệp

lục Nhưng gen Sub1A không có tác dụng kìm hãm sự kéo dài thân lá của lúa ở giai

đoạn mạ khi ngập Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy cây lúa thể hiện cơ chế chịu ngập khác nhau tại các thời điểm sinh trưởng khác nhau trong phản ứng với môi trường ngập [92] Ethylene có tác dụng kích thích sự kéo dài lóng thân và thành lập

mô dẫn khí ở rễ lúa [51; 67] Gần đây, các phát hiện về mới về khả năng chịu ngập trên cây lúa phần lớn đều liên quan đến các gene sản sinh ethylene trong quá trình

ngập nước như Sub1, SK1 và SK2 [96; 37; 38; 41; 66] Khi lúa bị ngập làm kích thích sự hoạt động của hai gene (SK1 và SK2) dẫn đến ethylene được tích tụ,

giberelin được tăng cường sự tổng hợp làm cho cây lúa vươn dài lóng Các chuyên gia cho rằng nếu tình trạng ngập xảy ra nhanh (10 - 14 ngày) thì gen Submergence

(Sub1) giúp lúa chống chịu ngập, nhưng nếu tình trạng ngập kéo dài thì cặp gene Snorkel 1 (SK1) và Snorkel 2 (SK2) sẽ thể hiện ưu thế giúp cây lúa thoát ngập Như

vậy, cả gen Submergence và Snorkel đều có vai trò quan trọng và khả năng ứng

dụng rất lớn trong chọn tạo giống lúa chịu ngập Ethylene liên quan đến cả hai phương thức chống chịu của cây như duy trì khả năng hô hấp yếm khí và kích thích vươn lóng khi bị ngập

1.2.4 Phân loại các giống lúa chịu ngập

Theo nghiên cứu của Tạ Hồng Lĩnh và cs., 2015 [9] việc điều tra và phân loại vùng trồng lúa gặp nhiều khó khăn vì tiêu chuẩn định danh chưa thống nhất Thuật ngữ về vùng sinh thái trồng lúa đã được thay đổi nhiều lần Vì vậy, từ năm

1979 đến năm 1984, các nhà khoa học của Viện Nghiên cứu lúa Quốc tế (IRRI) đã

thành lập một Ủy ban Quốc tế để phân loại và định danh vùng sinh thái lúa ngập, nhằm thống nhất cách gọi tên để giúp ích cho việc xác định mục tiêu nghiên cứu rõ ràng hơn Căn cứ vào mức độ và thời gian bị ngập lụt các nhà khoa học đã đưa ra các tên gọi khác nhau:

- Ngập lụt có thể xảy ra bất kỳ giai đoạn nào trong thời vụ trồng lúa Thời gian ngập lụt từ 1 đến 2 tuần và sự ngập lụt có thể xảy ra sớm ngay từ khi hạt nảy mầm trong điều kiện ruộng lúa gieo thẳng

- Ngập úng thường xuyên: Là hiện tượng ngập dài hạn khi lớp nước sâu tới

60 cm trong suốt thời gian sinh trưởng của lúa Loại ngập úng này làm giảm năng suất nghiêm trọng của những giống lúa do giảm tỷ lệ đẻ nhánh, giảm kích thước bông và độ đậu hạt và gây chết đối với cây lúa

- Ngập sâu xảy ra khi mực nước sâu lớn hơn chiều cao cây lúa và kéo dài nhiều tháng, ruộng lúa của giống thích ứng ngập sâu do di truyền hoặc giống có chiều cao lớn

Gần đây, các nhà khoa học của Viện Nghiên cứu lúa Quốc tế (IRRI) đã dựa vào những thời gian cây lúa bị ngập tại các vùng bị ảnh hưởng bởi lũ lụt “flood prone rice” và thống nhất chia thành 4 nhóm giống như sau:

1/ Nhóm lúa chống chịu ngập hoàn toàn trong vòng 10 ngày, sau đó có thể phục hồi khi nước rút Đó là những vùng bị lũ quét, hay vùng bị ngập bị động và bất ngờ “flash flood”, tính chống chịu trong điều kiện như vậy được gọi là

“complete submergence”

2/ Nhóm lúa có khả năng vượt nước 5 - 10 cm/ngày hoặc nhiều hơn trong vùng lũ lụt kéo dài 3 - 4 tháng/năm Đó là vùng lúa nổi (floating rice) ở Đồng bằng sông Cửu Long trước đây Loại hình lũ lụt như vậy được gọi với thuật ngữ quốc tế

là “stagnant flood”, nước dâng chậm, kéo dài nhiều tháng Tính chống chịu trong điều kiện như vậy được gọi là “khả năng vươn lóng” (elongation ability)

3/ Nhóm lúa có khả năng thích nghi vùng đầm lầy ven biển, nơi đó thủy triều lên xuống trong ngày làm cây lúa bị ngập lúc triều cường Đó là vùng bị ngập

xen kẽ (mixed flood)

4/ Nhóm lúa không có khả năng vượt nước, nhưng thích nghi tốt trong vùng nước ngập sâu, lũ lụt kéo dài 2 - 3 tháng, thuật ngữ chung gọi là “deep water rice”

(lúa nước sâu), lúa có tính cảm quang, thời gian trỗ thường xảy ra khi nước rút

1.3 Các phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền

Đa dạng di truyền là kết quả của quá trình biến đổi trong vật chất di truyền sinh vật (trình tự ADN, số lượng cấu trúc nhiễm sắc thể) theo các con đường tự nhiên (lai- phân ly, tái tổ hợp, đột biến tự nhiên…) hay bởi con người (lai-chọn tạo giống, gây đột biến ) Đa dạng di truyền có vai trò quan trọng trong công nghệ sinh học nông nghiệp Trên nhiều đối tượng thực vật, nghiên cứu đa dạng di truyền đã được thực hiện từ khá lâu với nhiều phương pháp tiếp cận khác nhau, mỗi phương pháp cung cấp cho người sử dụng các loại thông tin khác nhau Việc lựa chọn phương pháp đánh giá phụ thuộc vào mục đích của người nghiên cứu

1.3.1 Chỉ thị hình thái

Nghiên cứu đa dạng di truyền dựa trên chỉ thị hình thái là phương pháp đánh giá thông qua các đặc điểm hình thái (hình dạng, kích thước, đặc điểm các bộ phận) Với ưu điểm là dễ dàng tiếp cận, không đòi hỏi các thiết bị đắt tiền cũng như quy trình phức tạp Tuy nhiên, việc sử dụng chỉ thị hình thái trong phân tích đa dạng di truyền có những hạn chế: (1) Số lượng các chỉ tiêu hình thái có hạn, chỉ thị hình thái chịu tác động của môi trường và phụ thuộc vào giai đoạn nhất định của quá trình phát triển; (2) Việc đánh giá mang tính chất thông kê nên cần thực hiện với số lượng lớn để đảm bảo tính chính xác; (3) Có nhiều tính trạng do đa gen quy định mà không phải toàn bộ gen đều biểu hiện ra kiểu hình mà có thể đánh giá được Vì thế cho đến nay, các nhà chọn giống thường kết hợp sử dụng các chỉ tiêu hình thái với việc xác định bằng chỉ thị sinh hoá và chỉ thị phân tử ADN để đạt được kết quả

chính xác nhất [12; 101]

1.3.2 Chỉ thị sinh hóa

Chỉ thị sinh hoá là loại chỉ thị có bản chất là đa hình protein, bao gồm chỉ thị isozyme và các loại protein dự trữ Các protein khác nhau có khối lượng phân tử và điểm đẳng điện khác nhau, vì vậy chúng có thể di chuyển với tốc độ khác nhau trong quá trình điện di tạo thành những đặc điểm đặc trưng trên gel điện di và có thể

hiện thị bằng phương pháp nhuộm Cơ chế này được điều khiển bởi vật chất di truyền là ADN, thông qua dòng thông tin di truyền từ ADN -ARN-protein [15] Chỉ thị protein và chỉ thị enzyme thuộc loại đồng trội có độ tin cậy cao đồng thời có thể phát hiện ra các biến dạng khác nhau của protein Tuy nhiên, do số lượng không nhiều và sự biểu hiện chúng phụ thuộc vào giai đoạn sinh trưởng và phát triển của

cá thể, nên các chỉ thị protein và isozyme được ứng dụng tương đối hạn chế [3]

1.3.3 Chỉ thị phân tử ADN

Các chỉ thị phân tử ADN dựa trên bản chất đa hình ADN Chỉ thị phân tử ADN có thể là một gen hoặc những đoạn ADN đặc hiệu Chỉ thị di truyền phân tử

có tính ổn định cao và có thể xác định trong tất cả các loại mô với độ chính xác cao

mà không bị ảnh hưởng bởi yếu tố môi trường Chỉ thị phân tử được chia làm hai nhóm chính:

- Chỉ thị dựa trên cơ sở nguyên lý lai ADN: chỉ thị RFLP

- Chỉ thị dựa trên cơ sở nhân bản ADN bằng kỹ thuật PCR: RAPD, AFLP, SSR

1.3.3.1 RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism - Đa hình chiều dài mảnh phân cắt giới hạn)

RFLP là một kỹ thuật nhận dạng ADN bằng cách lai axit nucleic Nguyên lý của phương pháp: ADN của bộ gen sau khi cắt bằng enzyme giới hạn sẽ thành những đoạn có kích thước khác nhau Khi điện di những đoạn này sẽ phân bố ở những vị trí khác nhau trên gel, qua biến tính các đoạn này trở thành sợi đơn và được chuyển lên màng lai celulose hoặc nylon Kết quả của phản ứng lai là chúng ta

có thể xác định được sự đa hình giữa các mẫu ADN khác nhau Chỉ thị RFLP là chỉ thị đồng trội được sử dụng phổ biến trong tạo giống cây trồng với nhiều mục đích khác nhau: lập bản đồ di truyền, chọn lọc sớm tính trạng đơn gen, phân tích đa hình

di truyền Tuy nhiên hạn chế của phương pháp này là tốn nhiều thời gian, công sức,

kỹ thuật phức tạp, độc hại do sử dụng chất phóng xạ và đòi hỏi ADN chất lượng cao [15; 62]

1.3.3.2 Chỉ thị AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism - Đa hình chiều dài các đoạn được nhân bản chọn lọc)

Các chỉ thị AFLP được dùng như một công cụ đặc trưng để xác định mức độ quan hệ giữa các giống, loài và là nguồn chỉ thị di truyền dùng cho lập bản đồ liên

kết di truyền, nhận biết sự liên kết giữa các chỉ thị phân tử với các đặc điểm hình thái, năng suất và chất lượng hoặc các locus gen khác [90] AFLP là một kỹ thuật có

độ nhạy cao dễ phát hiện đa hình trong toàn bộ hệ gen AFLP cho phép phân tích nhanh, ổn định, đáng tin cậy, có khả năng ứng dụng trong lập bản đồ hệ gen và chọn giống [90]

AFLP cho đa hình cao, vì vậy kỹ thuật AFLP hứa hẹn cho phép xem xét kỹ

sự đa hình ở một số lượng lớn locus trong một thời gian rất ngắn và đòi hỏi một lượng rất nhỏ ADN Điều này tạo cho AFLP trở thành một hệ thống chỉ thị lý tưởng cho hàng loạt nghiên cứu di truyền [90] Nhưng AFLP là chỉ thị di truyền trội do đó không có khả năng phân biệt được cá thể đồng hợp tử và cá thể dị hợp tử Phương pháp phức tạp, đòi hỏi phải có các phương pháp xử lý số liệu tự động trong quá trình phân tích, giá thành cho nghiên cứu là tương đối cao [90; 52]

1.3.3.3 Chỉ thị RAPD (Ramdom Amplified Polymorphic DNA - ADN đa hình được nhân bội ngẫu nhiên)

Kỹ thuật RAPD cho phép phát hiện đa hình các đoạn ADN được nhân bản ngẫu nhiên bằng việc sử dùng một mồi đơn chứa trật tự nucleotide ngẫu nhiên Điểm khác của RAPD so với các chỉ thị khác là nó chỉ sử dụng một mồi ngẫu nhiên Đoạn mồi này có thể bám vào bất kỳ vị trí nào trong hệ gen khi tìm được vị trí bổ sung Với đặc điểm đoạn được nhân bản là ngắn (khoảng từ 200 - 2000 nucleotide) nên khả năng đoạn mồi tìm ra được điểm gắn trên ADN khuôn là không quá khó khăn Các chỉ thị RAPD thường được sử dụng để phân tích và xác định mối quan hệ thân thuộc giữa các quần thể, loài sinh vật, giống cây trồng hay các cá thể để phục

vụ cho công tác lai tạo giống hoặc phân loại Đồng thời, chúng cũng được sử dụng như chỉ thị phân tử để xác định kiểu gen kiểm soát hoặc có liên quan đến một tính trạng nào đó ở sinh vật Ưu điểm của RAPD là nhanh, giá thành cho mỗi mẫu phân tích là thấp, không cần biết những thông tin về trình tự, dễ dàng phân tích cho số lượng mẫu lớn Nhưng nhược điểm của RAPD là một kỹ thuật nhạy cảm, phụ thuộc vào điều kiện thí nghiệm, các thiết bị nghiên cứu và giai đoạn nghiên cứu Mặt khác, RAPD là chỉ thị trội nên không thể nhận biết được cá thể dị hợp tử Khó nhận

biết những đoạn cùng kích thước từ 2 mẫu ADN khác nhau thực sự có được tạo ra

từ cùng 1 vị trí trên hệ gen [26]

Để khắc phục những hạn chế này người ta nhân những băng RAPD đặc hiệu, xác định trình tự của chúng rồi thiết kế mồi những đoạn dài khoảng 20 bp từ cả hai đầu gọi là chỉ thị SCARs (Sequence Characterized Amplified Regions)

1.3.3.4 Một số loại chỉ thị ADN khác

Phân tử ADN không chỉ khác nhau về trình tự mà còn khác nhau về hình dạng không gian khi ADN ở trạng thái sợi xoắn kép Hai trình tự ADN chỉ cần có một vị trí nucleotide khác nhau cũng có thể mang hình dạng khác nhau Bằng phương pháp điện di có thể phát hiện được sự đa hình (về hình dạng) giữa các đoạn ADN này (chỉ thị CSGE - Conformation Sensitive Gel Electrophoresis) [34; 74]

Cùng với những thành tựu của công nghệ sinh học, nhiều loại chỉ thị mới đã được phát triển và ứng dụng, làm phong phú thêm công cụ sử dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền Với mục tiêu làm sáng tỏ hơn bản chất phân tử trong các nghiên cứu, các chỉ thị mới đi sâu vào phân tích trình tự ADN của các gen cụ thể (chỉ thị STS, EST và ADN microarray…), giúp nghiên cứu đa dạng di truyền chính xác và chi tiết hơn Tuy nhiên, những chỉ thị này yêu cầu kỹ thuật và chi phí cao hơn so với các loại chỉ thị ADN “thế hệ cũ” (RAPD, SSR,…) Đây chính là điểm cơ bản hạn chế sự phổ biến của những chỉ thị này trong nghiên cứu đa dạng di truyền

1.4 Chỉ thị phân tử SSR (Simple Sequence Repeat – Trình tự lặp đơn giản) và ứng dụng trong nghiên cứu lúa chịu ngập

1.4.1 Chỉ thị phân tử SSR

Trong cơ thể thực vật, hiện tượng lặp lại của một trật nucleotide đơn giản là khá phổ biến Tuy nhiên, tuỳ từng loài mà số lượng nucleotide trong mỗi đơn vị lặp lại có thể ít hay nhiều và số lần lặp có thể biến động từ 2 đến hàng trăm ngàn lần Phương thức lặp lại rất phong phú, được chia ra làm 3 kiểu lặp lại sau [11; 28]:

• Lặp lại hoàn toàn (các đơn vị lặp lại sắp xếp nối tiếp nhau)

• Lặp lại không hoàn toàn (xen kẽ vào các đơn vị lặp lại là một hoặc một số nucleotide khác)

• Lặp lại phức tạp (có sự xen kẽ giữa những đơn vị lặp lại khác nhau)

Chỉ thị SSR có các ưu điểm so với các chỉ thị ADN khác: Tính đặc hiệu cao: các đoạn mồi SSR được thiết kế dựa trên vùng trình tự sườn có tính bảo thủ cao của các đoạn lặp SSR, do đó sản phẩm nhân gen của phản ứng SSR-PCR đặc hiệu và ổn định hơn các chỉ thị ADN ngẫu nhiên Di truyền đồng trội và mức độ đa hình cao: Trải qua tiến hóa và các biến đổi di truyền, số lần lặp lại các motip SSR thay đổi rất nhiều và làm cho các đoạn SSR có chiều dài khác nhau Do đó phản ứng SSR-PCR

có thể phát hiện các alen khác nhau trong cùng một locus SSR, qua đó phát hiện được các cá thể đồng hợp tử/dị hợp tử của locus đó Khác với chỉ thị ngẫu nhiên (RAPD) hay chỉ thị dựa trên các vị trí giới hạn (RFLP, AFLP), chỉ thị SSR được phát triển dựa trên trình tự ADN đã biết trước đối tượng nghiên cứu

Kỹ thuật SSR cho phép ta phát hiện được tính đa hình về chiều dài các trình

tự nucleotide đơn giản SSR dùng để chọn lọc tính trạng kháng bệnh khảm do virut

ở cây đậu tương, chọn lọc năng suất lúa, xác lập mối quan hệ thân thuộc giữa các giống cây trồng (cà chua, lúa, đậu tương ) xây dựng bản đồ liên kết Mặt khác, chỉ thị SSR còn được sử dụng trong công việc xác định giới tính ở động vật và thực vật [28] Nhưng hạn chế cơ bản của việc sử dụng chỉ thị SSR là tốn công sức, giá thành cao trong việc xây dựng các cặp mồi đặc hiệu cho mỗi locus đa hình bao gồm việc tách dòng và đọc trình tự một số lượng lớn các đoạn ADN trong hệ gen chứa SSR, mỗi loại mồi chỉ đặc trưng cho một loài [26]

1.4.1.1 Các loại chỉ thị SSR

Căn cứ vào cấu tạo đơn vị lặp lại (2 - 6 lần) chúng ta có 4 loại chỉ thị SSR [7]:

- Mononucleotit SSR (AAAAAAAAAAA): là các đoạn trình tự lặp lại 1 lần

mà có thể cấu tạo tới vài phần trăm của hệ gen Mononucleotit SSR thường tập trung ở vùng tâm động của nhiễm sắc thể do đó nó ít khi được sử dụng trong phân biệt kiểu gen của các cá thể mà được sử dụng nhiều trong quá trình lập bản đồ gen ở gần vùng tâm động

- Dinucleotit SSR (GT)6: có mặt tại hàng trăm hoặc hàng nghìn vị trí khác nhau trên gennome mà ở đó một đơn vị lặp lại từ 10bp cho tới 0,5 - 30 kb

- Trinucleotit SSR (CTG)4: là dạng có 3 loại base trong trình tự lặp lai VD:

Hình 1.4: Cơ chế bắt chéo lỗi trong giảm phân [7]

Hình 1.5: Cơ chế trượt lỗi trong quá trình sao mã [7]

1.4.1.3 Vai trò của chỉ thị SSR

Chỉ thị SSR là một loại chỉ thị chính xác và hữu hiệu trong nghiên cứu đa dạng di truyền, phân loại các giống vật nuôi, cây trồng khác nhau trong cùng một loài Thuận lợi to lớn của chỉ thị SSR là phương pháp này biểu hiện một số lượng lớn đa hình Sử dụng chỉ thị SSR để phân tích hệ gen, xây dựng bản đồ liên kết gen

và chọn lọc các tính trạng mong muốn Ngoài ra nó còn có thể phân định sự sai khác giữa các giống trong cùng một loài phụ do khả năng cho phép đánh giá mức độ alen của cùng một locut [2] Rất nhiều chỉ thị SSR đã được tìm thấy ở vùng phía trên của các vùng khởi đầu sao chép của vùng mang mã Chức năng của những vùng như vậy vẫn còn chưa rõ ràng, mặc dù người ta tìm thấy chúng tồn tại giữa các vùng exon và có liên quan tới các bệnh di truyền [7] Có rất nhiều chứng cứ cho rằng trình tự SSR cũng đóng vai trò là yếu tố mang mã hoặc nhân tố điều hòa bởi chúng được tìm thấy khắp nơi ở phần trước vùng khởi đầu sao mã của vùng mang mã, và một số đã được tìm thấy có quan hệ với vùng mã hoá Số lượng khác nhau các đoạn lặp lại này ở vùng mã hoá có quan hệ với sự biểu hiện của gen và chức năng của gen [7] Ở một số trường hợp, sự thay đổi (mất hoặc thêm) các đơn vị lặp lại của SSR cũng làm thay đổi chức năng hoạt động của promotor Vị trí của SSR gần hay

xa promotor cũng làm hoạt động của promotor thay đổi Vùng điều khiển có chứa SSR hoạt động như một nhân tố thúc đẩy quá trình phiên mã và những đột biến mất đoạn SSR có thể làm giảm chức năng của gen [7]

1.4.2 Ứng dụng của chị thị phân tử SSR trong nghiên cứu đa dạng di truyền các giống lúa chịu ngập

Đa dạng di truyền có vai trò quan trọng trong công nghệ sinh học nông nghiệp Từ những kết quả đánh giá đa dạng di truyền, các nhà khoa học có thể quy hoạch và bảo tồn các nguồn gen quý nhằm duy trì đa dạng sinh học hoặc hỗ trợ xác định gen mục tiêu hoặc quá trình lai, chọn tạo giống thông qua lựa chọn các cặp bố

mẹ trong phép lai Trên nhiều đối tượng thực vật, nghiên cứu đa dạng di truyền đã được thực hiện từ khá lâu với nhiều phương pháp tiếp cận khác nhau, mỗi phương pháp cung cấp cho người sử dụng các loại thông tin khác nhau Việc lựa chọn phương pháp đánh giá phụ thuộc vào mục đích của người nghiên cứu Về cơ bản

các loại chỉ thị trên đều có thể được ứng dụng để lập bản đồ di truyền, nghiên cứu

sự đa dạng di truyền, phân lập gen, hoặc xác định gen

Nghiên cứu của Sadia Matin và cs.,(2012) về đánh giá đa dạng di truyền của

12 giống lúa nước sâu (deep water rice) với 8 chỉ thị phân tử SSR, nằm rải rác trên

12 nhiễm sắc thể của lúa Kết quả thu được 79 alen với trung bình 4,38 alen trên mỗi locus Hệ số (PIC) dao động 0,477 - 0,782 với trung bình 0,634 Kết quả tìm được RM13 là chỉ thị tốt nhất để nhận dạng các kiểu gen thông qua giá trị PIC Sơ

đồ phả hệ mối quan hệ di truyền được chia thành 2 nhóm chính và 4 nhóm phụ và

hệ số tương đồng di truyền biến động từ 0,14 - 0,89, thể hiện mức độ đa dạng di truyền cao trong các giống Các kết quả về đa dạng di truyền sẽ là thông tin bổ ích cho việc lựa chọn các cặp lai trong chương trình chọn tạo giống lúa chịu ngập[79]

Zhang Li-na và cs., (2013) nghiên cứu sự đa dạng di truyền của tập đoàn các giống lúa bản địa vùng trũng và vùng cao của Trung Quốc với 66 chỉ thị SSR Tổng

số 555 alen phát hiện được từ 324 giống lúa nghiên cứu, với trung bình là 8,409

alen/locus Kết quả cho thấy sự đa dạng di truyền các giống indica cao hơn so với các giống japonica và các giống vùng cao thể hiện mức độ đa dạng kiểu gen hơn

các giống lúa vùng đất thấp Các chỉ thị SSR: RM72, RM232, RM219, RM241, RM224 và RM3 cho tỷ lệ đa hình cao nhất và các chỉ thị SSR này phù hợp để đánh giá sự đa dạng di truyền tập đoàn giống lúa nghiên cứu Sự phân bố các giống bản

địa vùng cao và trũng trong nhóm japonica và indica có sự khác biệt rõ ràng, hiển

nhiên có sự khác biệt giữa các giống vùng cao và vùng thấp trong nhóm giống

japonica, nhưng không có sự khác biệt rõ ràng như vậy trong nhóm giống indica

[100]

Một nghiên cứu khác về đa dạng di truyền của 21 giống lúa vùng đồng bằng

và 3 giống lúa vùng bằng sử dụng 45 chỉ thị SSR thu được tổng số 146 alen [73] Kết quả phân tích điện di khẳng định 131 băng đa hình (89.72%) Hệ số PIC dao động từ 0,041 - 0,728 với trung bình 0,640 Hệ số tương đồng di truyền thay đổi từ 0,23 đến 0,72 Tại hệ số tương đồng 0,67 các giống được chia thành 5 nhóm chính

Các kết quả nghiên cứu cũng chỉ rõ các chỉ thị SSR là thông tin hữu ích để đánh giá

đa dạng di truyền, có tiềm năng sử dụng trong chọn tạo giống lúa chịu ngập

1.4.3 Ứng dụng của chỉ thị phân tử SSR trong nghiên cứu xác định QTL/gen chịu ngập

Bản đồ QTL (Quantitative Trait loci) được áp dụng trong trường hợp những tính trạng mục tiêu do đa gen điều khiển (tính chống chịu ngập, hạn, mặn, ) Di truyền số lượng truyền thống không thể phát hiện QTL trên những loci riêng biệt gắn với tính trạng số lượng đang nghiên cứu, vị trí của nó trên nhiễm sắc thể và liên kết của nó với những gen khác Trên thực tế, việc chọn giống chống chịu ngập dựa trên kiểu hình rất khó do có sự tương tác giữa các gen Nhờ chỉ thị phân tử mà công việc xác định QTL/gen chịu ngập, ứng dụng trong chọn tạo giống chống chịu trở lên

dễ dàng, chủ động và chính xác hơn Độ chính xác của phương pháp này có thể lớn hơn 99,75% khi gen chịu ngập kẹp giữa hai chỉ thị liên kết với gen đó và khoảng cách di truyền từ chỉ thị phân tử đến gen kiểm soát tính chịu ngập nhỏ hơn 5cM Gần đây, sự phát triển của chỉ thị phân tử và bản đồ gen cây lúa đã được ứng dụng vào mục đích xác định các QTL điều khiển tính chống chịu ngập của cây lúa, hiện diện trên các nhiễm sắc thể khác nhau

Trong những năm qua, nhiều kết quả nghiên cứu về lập bản đồ QTL/gen kiểm soát tính trạng chịu ngập của lúa ở giai đoạn nảy mầm trên thế giới đã được công bố Huang và cs., (2004) nghiên cứu lập bản đồ QTL sức sống cây con trên

quần thể gồm 264 dòng tái tổ hợp F12 của tổ hợp lai giữa Lemont (japonica) và Teqing (indica), đánh giá kiểu hình của 3 tính trạng liên quan đến sức sống cây con:

bao gồm tỷ lệ hạt nẩy mầm, vươn dài thân lá cây con và trọng lượng khô Kết quả phát hiện được tổng số 13 vùng QTL chính liên quan đến tính trạng sức sống cây con chịu ngập [46] Khi nghiên cứu lập bản đồ quần thể lai trở lại (BC2F2) giữa Khaiyan/IR64 với 155 chỉ thị SSR đa hình trên chiều dài bản đồ 1483,5 cM, Angaji

và cs., 2008 đã xác định được 4 vùng QTL chính liên kết gần với tính trạng chịu

ngập lúa ở giai đoạn nảy mầm, nằm trên các nhiễm sắc thể 1 (qAG-1), 2 (qAG-2-1), 11(qAG-11) và 12 (qAG-12) [23] Một nghiên cứu khác của Anganji và cs., (2010)

đã tiến hành trên quần thể lai trở lại (BC2F2) giữa KhaoHlan On/IR64 Bản đồ liên

kết với tính chịu ngập của lúa ở giai đoạn nảy mầm được thiết lập dựa trên 135 chỉ thị SSR đa hình, với chiều dài bản đồ là 1475,7 cM Kết quả đã tìm ra 5 vùng QTL chính liên quan đến khả năng chịu ngập khi nẩy mầm, nằm trên các nhiễm sắc thể 1

(qAG-1-2), 3 (qAG-3-1), 7 (qAG-7-2), 9 (qAG-9-1,20) [22]

Abe và cs (2012) nghiên cứu lập bản đồ QTL sức sống cây con trên quần thể

gồm 250 dòng lai tái tổ hợp từ tổ hợp lai giữa lúa japonica Kakehashi và Dunghan Shali đã phát hiện được 4 QTL liên quan đến chiều dài cây con Trong đó qPHS3-2

là vùng QTL chính nằm trên vai dài của nhiễm sắc thể số 3 [21]

Mặt khác, QTL Sub1 là một trong những gen chính quy định tới 70% tính

chống chịu ngập ở giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng Cho đến nay các nhà khoa học

ở Viện Nghiên cứu Lúa Quốc tế (IRRI) đã xác định được một số các chỉ thị phân tử SSR liên kết chặt với gen có thể ứng dụng trong chọn giống Vị trí định vị của một

số chỉ thị liên kết gần gen Sub1 trên nhiễm sắc thể số 9 được thể hiện ở hình 1.7

Hình 1.6: Bản đồ QTL Sub1 với một số các chỉ thị SSR trên NST số 9 [96]

Để khắc phục một phần nhược điểm của phương pháp lai tạo truyền thống, ngày nay các nhà chọn giống kết hợp với phương pháp ứng dụng của chỉ thị phân tử (Marker Assisted Selection) Vì vậy, tất cả các chỉ thị SSR đã được phát hiện trong các nghiên cứu đã được công bô ở trên đều có thể được ứng dụng trong chọn tạo giống chịu ngập Các chỉ thị SSR đó dùng để xác định kiểu gen của dòng con lai ưu

tú có mang đoạn QTL/gen chịu ngập ở giai đoạn nảy mầm (mang QTL AG), hoặc giai đoạn sinh trưởng sinh dưỡng (mang QTL Sub1) trong chương trình chọn tạo

giống lúa chịu ngập

1.5 Nghiên cứu đa dạng di truyền và tính chịu ngập cây lúa ở Việt Nam

1.5.1 Nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền cây lúa trong nước

Việt Nam được coi là trung tâm khởi nguyên của cây lúa, tài nguyên di truyền lúa của nước ta phong phú cả về số lượng và chất lượng Nghiên cứu đa dạng

di truyền và phân loại một cách hệ thống lúa trồng ở Việt Nam còn hạn chế Tuy nhiên trong những năm gần đây, các nhà khoa học đã quan tâm ứng dụng chỉ thị phân tử để đánh giá đa dạng tài nguyên lúa nước ta

Phạm Thị Bé Tư và cs (2008) đã đánh giá đa dạng của 90 giống lúa mùa địa phương bằng chỉ thị SSR Hệ số đa dạng từ 0,68 - 9,95, trung bình là 0,88 Kết quả

90 giống lúa mùa địa phương thành 6 nhóm giống lúa khác nhau [18] Trần Danh Sửu và cs (2010) đã đánh giá đa dạng di truyền của 45 giống lúa nếp ở miền Bắc sử dụng 50 chỉ thị SSR Hệ số đa hình di truyền (PIC) của các chỉ thị SSR biến động từ 0,12 đến 0,83, đạt trung bình 0,43 cho thấy mức độ đa dạng gen tồn tại trong 45 mẫu lúa nghiên cứu ở mức khá đa dạng Dựa trên ADN lục lạp thì 90% giống lúa

nếp nghiên cứu thuộc Japonica [14]

Nguyễn Đức Thành và cs (2012) [16] sử dụng 40 chỉ thị SSR để nghiên cứu

đa dạng di truyền của 60 giống lúa đặc sản và chất lượng được trồng phổ biến ở Việt Nam Hệ số PIC của 33 cặp mồi nằm trong khoảng 0,06 đến 0,83 Hệ số tương đồng di truyền của 60 giống lúa nghiên cứu dao động từ 0,056 đến 0,77 Ngô Thị Hồng Tươi và cs (2014) [19] đã đánh giá đa dạng di truyền của 46 dòng/giống lúa cẩm gồm cả lúa nếp và tẻ được thu thập từ các địa phương sử dụng 35 chỉ thị phân

tử SSR, trong đó có 9 chỉ thị đơn hình và 26 chỉ thị đa hình với tổng số 68 allen đa hình chiếm tỷ lệ trung bình 2,62 allen trên một locus Hệ số đa dạng di truyền (PIC) dao động từ 0,08 đến 0,74 với giá trị trung bình là 0,46 Kết quả phân tích đã chia nguồn vật liệu nghiên cứu thành 2 nhóm chính Lã Tuấn Nghĩa và cs (2015) [11] đã đánh giá đa dạng đi truyền của 55 giống lúa địa phương có tiềm năng chất lượng với

32 chỉ thị SSR cho thấy sự đa dạng di truyền cao Hệ số đa hình di truyền (PIC) dao động từ 0,28 (RM60) đến 0,85 (RM215) với giá trị trung bình là 0,67 Hệ số tương đồng di truyền giữa các giống dao động trong khoảng từ 0,45 - 0,94 Thuy và cs (2012) đánh giá sự đa dạng di truyền của 41 giống luá trong vùng cao phía Bắc của Việt Nam được khảo sát với 30 đơn giản trình tự lặp lại (SSR) Cho kết quả chỉ số

đa dạng PIC thay đổi từ 0,447 - 0,888 [63]

Chỉ thị ADN được ứng dụng hiệu quả trong nghiên cứu di truyền thực vật và phân tích đa dạng di truyền, xác định các locus kiểm soát các tính trạng, hay chọn giống phân tử là các lĩnh vực được triển khai hiệu quả Nhưng hiện nay, trong khai thác nguồn gen giống lúa bản địa Việt Nam chưa có nghiên cứu nào về đa dạng di truyền liên quan đến các đặc tính chịu ngập của cây lúa

1.5.2 Nghiên cứu về tính chịu ngập cây lúa trong nước

Mặc dù trên thế giới có nhiều nghiên cứu cơ bản về tính trạng sức sống cây con chịu ngập đáp ứng cho hệ thống canh tác lúa gieo sạ, nhưng hầu như vấn đề này chưa được tiến hành nghiên cứu ở Việt Nam Hơn nữa, Việt Nam có nguồn gen lúa

đa dạng ở các vùng canh tác khác nhau thích ứng với lũ lụt Do đó thực hiện những nghiên cứu cơ bản làm tiền đề cho nghiên cứu ứng dụng trong lĩnh vực này là chiến lược quan trọng trong chương trình chọn tạo giống lúa

Từ nhiều năm nay Viện Cây lương thực & CTP (thuộc Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam) đã có chương trình lai tạo các giống lúa cao cây, chịu nước sâu, ngập úng và cho năng suất cao trong vụ mùa Các loại giống úng (U) như: U6, U14, U16, U17 và các giống lúa khác chính vụ như: C10, C15 đã được đưa ra khảo nghiệm từ 1982 ở phía Bắc và năm 1983 ở phía Nam Nhiều giống đã được công nhận khu vực hoá và công nhận là giống quốc gia Theo Lê Minh Phụng (1991) [13].Các thí nghiệm và thực tiễn sản xuất nhiều năm tại Viện Cây lương thực và CTP chứng minh các giống U14, U17, C10 có khả năng chịu ngập tràn qua ngọn (ở điều kiện nước trong) từ 7-10 ngày, cây lúa vẫn duy trì sự sống Sau đó, khi nước rút dần các giống có khả năng hồi phục nhanh chóng, nếu tiếp tục chăm bón vẫn có thể cho năng suất ở mức chấp nhận

Liên quan đến nghiên cứu giống lúa chịu ngập, nhóm tác giả Bùi Chí Bửu và

cs (2003) [1] đã tiến hành thu thập và nghiên cứu nhóm lúa nổi ở một số tỉnh Đồng bằng Sông Cửu Long (18 giống), thí nghiệm được tiến hành tại IRRI cho thấy: Trong thí nghiệm thanh lọc giống chịu ngập tại hồ nước sâu của IRRI năm 1985 với mức độ nước dâng 5 cm/ngày sử dụng giống có tuổi mạ 30 ngày, tác giả nhận thấy: các giống lúa nổi Ba sào, Nàng chệt cụt, Nàng đùm nhỏ, Nàng đùm to, Nàng đùm

trắng, Nàng phước, Nàng rừng, Nàng son, Nàng tây, Nàng tây C, Nàng Tây đùm, Nàng tri, Nếp cô Ba, đều vượt nước ở điểm 1; các giống lúa nước sâu như Trắng chùm, Trắng lựa, Tàu nút, Lúa Thước vẫn phát triển bình thường ở độ sâu 70 cm, nhưng ở độ sâu 120cm, tất cả đều bị thiệt hại Hơn nữa, sự khác biệt về tuổi mạ và tốc độ mực nước dâng cao mỗi ngày cho thấy có sự khác nhau giữa 2 thí nghiệm ở IRRI và Viện Lúa Đồng bằng sông Cửu Long Các giống Nàng đùm to, Nàng tây C thể hiện mức độ vượt nước trung bình hoặc yếu trong điều kiện thí nghiệm tại Viện Lúa Đồng bằng sông Cửu Long nhưng tỏ ra vượt nước tốt trong điều kiện ở IRRI

Năm 2008, Viện Cây lương thực & CTP phối hợp với IRRI thử nghiệm và

điều tra sở thích của nông dân cho thấy: giống Samba Mahsusi - Sub1 được nông

dân lựa chọn do có thời gian sinh trưởng ngắn, thân cứng, đẻ nhánh khoẻ và chống

chịu sâu bệnh tốt, giống tiếp theo được nông dân lựa chọn là giống Swarna – Sub1

Nguyễn Thị Lang và cs, (2011) nhờ sử dụng chỉ thị phân tử và phương pháp lai trở lại (MABC) đã tạo ra được các dòng triển vọng từ quần thể phân ly của tổ hợp lai

OM1490/IR64-Sub1 (nhờ chỉ thị phân tử RM23850 liên kết chặt với gen Sub1 định

vị trên nhiễm sắc thể số 9) Kết quả thu được 10 dòng mang gen Sub1có khả năng

phục hồi và cho tỷ lệ sống sót cao (90 - 99%) sau 2 tuần ngập [65]

Tất cả những nghiên cứu ở Việt Nam mới chỉ tập trung vào nghiên cứu thử nghiệm, chọn tạo và đánh giá tính chịu ngập của cây lúa ở giai đoạn sinh trưởng

sinh dưỡng liên quan đến gen Sub1 Nhưng hiện nay chưa có nghiên cứu nào về đa

dạng di truyền cũng như chọn tạo giống lúa chịu ngập ở giai đoạn nảy mầm/giai đoạn mạ Trong khi đó, cải tiến tính chịu ngập yếm khí của lúa ở giai đoạn nẩy mầm

là một trong đặc tính nông học rất quan trọng, bởi vì đây là thời kỳ cơ bản quyết định đến mật độ và thời vụ gieo trồng của lúa, đặc biệt trong hệ thống canh tác lúa gieo sạ thẳng ở những vùng bị lũ lụt

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Vật liệu thực vật

Vật liệu là 150 giống lúa bản địa và cải tiến Việt Nam dùng để sàng lọc kiểu hình đánh giá khả năng chịu ngập ở giai đoạn nẩy mầm (Phụ lục 1) Nguồn vật liệu này được thu thập đại diện cho các tỉnh thành ở ba vùng đồng bằng châu thổ Việt Nam (Bắc, Trung và Nam), được lưu giữ tại Trung tâm tài nguyên thực vật Quốc

gia Trong tất cả các thí nghiệm của chúng tôi đều sử 2 giống lúa Japonica Nipponbare (chịu ngập) và giống Indica Kasalath (mẫn cảm ngập) làm đối chứng

[92]

2.1.2 Hóa chất

* Hoá chất tách chiết ADN:

- Hoá chất tách chiết ADN bao gồm các loại như: Tris HCl; EDTA; SDS; NaCl, CTAB; Chloroform; isopropanol; isoamyl alcohol; Ethanol của các hãng Sigma, Merck, Prolabo, ICN và Labscan

- Đệm tách chiết ADN tổng số (đệm CTAB): CTAB 1%; Tris-HCl 0,1M; EDTA 0,5M, pH 8,0; NaCl 5M; mercapthoethanol 14M

- TBE 5X (Tris-borat buffer): Tris base; Boric acid; EDTA 0,5M, pH 8,0

- TE buffer pH = 8,0: Tris 1M, pH = 8,0; NaCl 5M; EDTA 0,5M, pH 8,0

* Hoá chất dùng để chạy phản ứng PCR:

- Đệm PCR 1X (10 mM Tris-HCl pH8, 1,5 mM MgCl2 , 5 mM KCl) của hãng Quiagen và Invitrogen

- MgCl2 của hãng Fermentas và Invitrogen

- dNTPs (dATP, dGTP, dCT, dTTP) của hãng Fermentas và Invitrogen

- Mồi và Ladder 100bp, 25bp của hãng Fermentas và Invitrogen

- Taq polymerase của hãng Fermentas và Invitrogen

* Hoá chất chạy điện di:

Điện di gel polyacrylamide gồm các hóa chất: acrylamide, APS, TEMED nhuộm Bromophenol blue, Ethidium bromide

* Các mồi SSR:

Các cặp mồi SSR được sử dụng để phân tích đa dạng di truyền do hãng Invitrogen cung cấp Các thông tin về trình tự, kích thước, số allele chuẩn trên mỗi locus, vị trí phân bố của các locus ở trên 12 NST khác nhau đã được McCouch (2002) và cộng sự công bố (bảng 2.1) [60]

Bảng 2.1 Thông tin về các cặp mồi nghiên cứu

T

Nhiễm sắc thể

Kích thước (bp)

Trình từ mồi

Nhiệt

độ gắn

2 2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.2 Phương pháp phân tích kiểu hình

Sử dụng phương pháp thử ngập bằng ống nghiệm để sàng và đánh giá kiểu hình tính trạng sức sống cây con chịu ngập [57] Theo phương pháp thử ngập bằng ống nghiệm những giống có khả năng vươn dài thân lá nhanh trong điều kiện ngập nhân tạo sẽ thể hiện sức sống cây con tốt khi ngập úng Hạt giống được chọn tiến hành khử trùng nấm và các vi sinh vật khác bằng dung dịch NaClO 0,5% trong 30 phút, rửa sạch 3 lần bằng nước cất Ngâm ủ hạt giống và để nẩy mầm trong tủ ôn