Nghiên cứu phân loại một số loài cá thuộc giống cá bỗng (spinibarbus) ở việt nam dựa trên gen ty thể (COI, 16s rRNA)

35 ảng 3.5: ảng thống kê khoảng biến thiên khoảng cách di truyền một số node trên cây phát sinh chủng loại Hình 3.4 cho sự phân tách rõ các loài trong c ng một giống .... 42 ảng 3.7: ả

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

UẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGH SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG ẪN KHOA HỌC

TS KI TH PHƯ NG OANH

THÁI NGUYÊN - 2015

ỜI CẢ N

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, phòng Đào tạo, ban chủ nhiệm Khoa Khoa học Sự sống - Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên đã tạo điều kiện cho tôi học tập và hoàn thành luận văn

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc của mình đến TS Kim Th Phương Oanh, trư ng phòng Hệ gen học môi trường, Viện Nghiên c u hệ Gen - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, người cô đã dành nhiều thời gian, tâm huyết, tận tình giúp đỡ và hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thiện luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn sự quan tâm, chỉ bảo và giúp đỡ nhiệt tình của tập th cán bộ Phòng Hệ gen học môi trường - Viện Nghiên c u hệ Gen - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, c ng các cán bộ của các phòng ban khác, thuộc Viện Nghiên c u hệ Gen đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Tôi c ng xin chân thành cảm ơn nhà ngư loại học TS Nguy n Văn Hảo

và TS Nguy n Th iệu Phương thuộc Viện Nghiên c u Nuôi tr ng Thủy sản I

c ng anh H nốt - người dân tộc Vân Kiều đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong việc thu thập và phân loại hình thái các mẫu cá nghiên c u

Cuối c ng, tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè và tập th lớp Cao học Công nghệ sinh học K6B đã luôn động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập

và thực hiện luận văn

Th i Ngu n ng 17 tháng 11 năm 2015

H viên

Nguy n Th Th y inh

ỜI CA ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận văn này hoàn toàn được trình bày dựa trên kết quả nghiên c u khoa học của bản thân dưới sự hướng dẫn của chuyên môn của TS Kim Th Phương Oanh, trư ng phòng Hệ gen học môi trường, Viện Nghiên c u

hệ Gen, c ng với sự hướng dẫn k thuật của các cán bộ trong phòng Hệ gen học môi trường Các số liệu hình ảnh, kết quả được trình bày trong luận văn này là trung thực, không sao chép t bất c tài liệu, công trình nghiên c u của người khác mà không chỉ rõ ngu n tham khảo Tôi xin ch u trách nhiệm về lời cam đoan của mình trước hội đ ng nhà trường

Thái Nguyên, ngày 17 tháng 11 năm 2015

H viên

Nguy n Th Th y inh

C C

ỜI CẢ N i

ỜI CA ĐOAN ii

C C iii

ANH C C C K HI U C C CH VI T TẮT v

ANH C C C ẢNG vi

ANH C C C H NH vii

Đ U 1

Chương 1: T NG QUAN T I I U 3

1.1.T ng quan về giống cá ng 3

1.1.1 V tr phân loại và phân bố 3

1.1.2 Đ c đi m sinh học 4

1.1.3 Giá tr kinh tế 5

1.2.Nghiên c u phân loại cá 5

1.2.1 Khái niệm về hệ thống phân loại cá 5

1.2.2 Đ c đi m hình thái thường d ng trong phân loại cá 6

1.2.3 Phân loại học phân t trong phân loại cá 6

1.2.4 Tình hình nghiên c u phân loại cá Việt Nam 9

1.3.Đ c đi m hệ gen ty th và vai trò của gen ty th trong phân loại phân t 11

1.3.1.Đ c đi m hệ gen ty th 11

1.3.2.S d ng gen ty th trong phân loại phân t 12

1.3.3.Hệ gen ty th của một số loài thuộc giống cá ng Spinibarbus) 12

Chương 2: VẬT I U V PHƯ NG PH P NGHI N C U 14

2.1.Vật liệu 14

2.1.1 Nguyên liệu 14

2.1.2 Hóa chất 15

2.1.3 Thiết b , d ng c nghiên c u 16

2.2.Phương pháp nghiên c u 17

2.2.1. Phương pháp nghiên c u hình thái 17

2.2.2. Phương pháp nghiên c u sinh học phân t 17

Chương 3 : K T QUẢ NGHI N C U V THẢO UẬN 27

3.1.Kết quả phân loại về m t hình thái 27

3.2.Kết quả tách chiết N t ng số 28

3.3.Kết quả khuếch đại gen 16S rRN và COI b ng k thuật PCR 29

3.4.Kết quả tinh sạch sản ph m PCR 30

3.5.Kết quả giải trình tự gen 31

3.5.1 Kết quả giải mã đoạn gen 16S rRN của ba mẫu cá nghiên c u 31

3.5.2 Kết quả giải mã đoạn gen COI của ba mẫu cá nghiên c u 34

3.6.Kết quả phân t ch phân t và phân loại 3 mẫu cá nghiên c u dựa trên đoạn gen 16S rRN và COI 38

3.6.1 Kết quả phân t ch phân t và phân loại 3 mẫu cá nghiên c u dựa trên đoạn gen 16S rRN 38

3.6.2 Kết quả phân t ch phân t và phân loại 3 mẫu cá nghiên c u dựa trên đoạn gen COI 43

3.7.Đánh giá t nh hiệu quả của N barcoding s d ng đ phân loại giống cá ng Spinibarbus) 48

K T UẬN V KI N NGH 49

T I I U THA KHẢO 50

PH C 56

ANH C C C K HI U C C CH VI T TẮT

ANH C C C ẢNG

ảng 2.1: Các hóa chất được s d ng 15

ảng 2.2: Các thiết b , d ng c được s d ng 16

ảng 2.3: Các c p m i s d ng trong nghiên c u 19

ảng 2.4: Thành phần phản ng PCR 22

ảng 3.1: ảng kết quả xác đ nh n ng độ và O 260/280 N t ng số của các mẫu cá nghiên c u 28

ảng 3.2: ảng kết quả xác đ nh n ng độ và O 260/280 sản ph m PCR của các mẫu cá nghiên c u sau khi đã được tinh sạch 30

ảng 3.3: ảng thống kê một phần kết quả L ST đối với đoạn gen 16S rRN của ba mẫu nghiên c u 32

ảng 3.4: ảng thống kê một phần kết quả L ST đối với đoạn gen COI của ba mẫu nghiên c u 35

ảng 3.5: ảng thống kê khoảng biến thiên khoảng cách di truyền một số node trên cây phát sinh chủng loại Hình 3.4 cho sự phân tách rõ các loài trong c ng một giống 41

ảng 3.6: Khoảng cách di truyền K2P gi a các loài cá nghiên c u và 4 loài thuộc giống cá ng đã được đ nh danh trên Gen ank t bộ d liệu trình tự đoạn gen 16S rRNA 42

ảng 3.7: ảng thống kê khoảng biến thiên khoảng cách di truyền một số node trên cây phát sinh chủng loại Hình 3.5 cho sự phân tách rõ các loài trong c ng một giống 46

ảng 3.8: Khoảng cách di truyền K2P gi a các loài cá nghiên c u và 4 loài thuộc giống cá ng đã được đ nh danh trên Gen ank t bộ d liệu trình tự đoạn gen COI 46

ANH C C C H NH

Hình 1.1: Sự phân bố của giống cá ng Spinibarbus) [26] 4

Hình 1.2: Đ c đi m hình thái đ c trưng của giống cá ng 4

Hình 2.1: Các mẫu cá s d ng trong nghiên c u 14

Hình 2.2: Sơ đ thiết kế m i khuếch đại hai đoạn gen 16S rRN và COI 20

Hình 2.3: Sơ đ chu trình nhiệt khuếch đại đoạn gen 16S rRN b ng phản ng PCR 22

Hình 2.4: Sơ đ chu trình nhiệt khuếch đại đoạn gen COI b ng phản ng PCR 23

Hình 3.1: Kết quả điện di ki m tra sản ph m tách N t ng số trên gel agarose 0,8% 28

Hình 3.2: Kết quả điện di ki m tra sản ph m PCR trên gel agarose ,8 29

Hình 3.3: Kết quả điện di ki m tra sản ph m PCR sau khi đã tinh sạch 31

Hình 3.4: Cây phát sinh chủng loại NJ xây dựng dựa trên trình tự đoạn gen 16S rRN của 3 mẫu cá nghiên c u và 4 loài cá khác thuộc họ cá Chép 39

Hình 3.5: Cây phát sinh chủng loại NJ xây dựng dựa trên trình tự đoạn gen COI của 3 mẫu cá nghiên c u và 4 loài cá khác thuộc họ cá Chép 44

đỏ có nguy cơ tuyệt chủng của IUCN International Union for Conservation

of Nature) Trước thực tế một số loài thuộc giống cá ng có hình thái bên ngoài tương đối giống nhau, nếu chỉ dựa vào đ c đi m hình thái s g p khó khăn khi phân loại cấp độ loài ho c mẫu phân loại có k ch thước nhỏ Hơn

n a, một số loài thuộc giống cá ng mới được phát hiện, xét về m t hình thái có khả năng là loài mới cần được kh ng đ nh lại m c độ phân t Nh m cung cấp ngu n d liệu về m t di truyền, h trợ việc nhận dạng một số loài cá thuộc giống cá ng và kh ng đ nh lại một số loài được cho là loài mới thuộc giống cá ng được phát hiện Việt Nam Chúng tôi đã tiến hành thực hiện

đề tài: Nghiên u h n i t số ài thu giống ng

(Spinibarbus ở Việt Na ựa trên gen ty thể COI 16S rRNA

2 tiêu a tài

Xác đ nh chỉ th mã vạch phân t N barcoding marker) cho một số

loài thuộc giống cá ng Spinibarbus dựa trên phân t ch hai gen ty th :

cytochrome c oxidase subunit I (COI) và 16S rRN

3 Đối tư ng và h vi nghiên u

Một số loài được phân loại sơ bộ về m t hình thái thuộc giống cá ng

(Spinibarbus) ho c được đánh giá có mối quan hệ di truyền rất gần g i với giống cá

ng được thu thập tại sông Đakrông, huyện Đakrông, tỉnh Quảng Tr , bao g m:

 Cá ng nguy n Spinibarbus nguyenhuuduci sp.n)

 Cá Chầy đất Spinibarbus hollandi Oshima, 1919)

 Cá Cầy (Paraspinibarbus macracanthus)

Loài cá Cầy (Paraspinibarbus macracanthus về m t hình thái được phân loại thuộc giống cá ng Spinibarbus b i Pellegrin và Chevey vào năm 1936 với tên khoa học là Spinibarbus macracanthus Đến năm 1989, dựa trên sự khác

biệt về đ c đi m hình thái của loài cá Cầy với các loài cá thuộc giống

Spinibarbus nên loài cá Cầy đã được phân loại lại và được tách thuộc một giống

riêng với tên gọi Paraspinibarbus trong họ cá Chép Cyprinidae) [21]

4 N i ung nghiên u

 Phân lập và xác đ nh một phần trình tự của hai gen ty th COI, 16S

rRN 3 loài cá : cá ng nguy n (Spinibarbus nguyenhuuduci sp.n), cá Chầy đất Spinibarbus hollandi Oshima, 1919 , cá Cầy Parapinibarbus

macracanthus)

 Phân t ch gen ty th COI và 16S rRNA nh m xác đ nh chỉ th mã vạch

phân t N barcoding marker d ng đ phân biệt loài trong giống

Spinibarbus

phân loại sơ bộ về m t hình thái bao g m: cá ulu (Spinibarbus hoenoti sp.n),

cá ng nguy n (Spinibarbus nguyenhuuduci sp.n) và cá ng vây đen (Spinibarbus nigripinnis sp.n) [12] Đối với ba loài cá mới được phát hiện, cần

có nh ng nghiên c u về m t di truyền đ kh ng đ nh đây là cá loài mới



Nhìn chung, các loài thuộc giống cá ng sống trung và thượng lưu các sông lớn ph a nam Trung Quốc, ph a bắc Việt Nam và Lào Sự phân bố của giống cá ng được th hiện Hình 1.1

H nh 1 1: Sự phân bố của giống cá ng Spinibarbus) [26]

Việt Nam, các loài thuộc giống cá ng thường sống trung và thượng lưu các con sông lớn các tỉnh ph a bắc Việt Nam như sông H ng Yên ái tr lên , sông Lam Nghệ n hay sông Trà Khúc Quảng Ngãi ,

1.1.2 Đ iể sinh h



Xét về m t hình thái, đ c đi m chung nhất của tất cả các loài thuộc giống cá

ng được s d ng đ phân biệt giống cá ng với các giống cá khác thuộc họ

cá Chép Cyprinidae) là chúng đều có gai ngược ph a trước vây lưng và vây

hậu môn có 5 tia phân nhánh Hình 1.2

H nh 1 2: Đ c đi m hình thái đ c trưng của giống cá ng

 : Giống cá ng thường sống v ng nước chảy và trong

Đây là giống cá ưa nước sạch, do đó ngu n nước trong ao ho c b nuôi cá phải liên t c được lưu thông [14]

 ă : Th c ăn chủ yếu của các loài thuộc giống cá ng là các loài động

vật không xương sống, ấu tr ng, côn tr ng trư ng thành, giun t tơ, giáp xác,

tôm, ốc, hến,

 : Nhìn chung, các loài thuộc giống cá ng thành th c muộn, nuôi

khoảng 1 năm mới bắt đầu sinh đ và t lệ sống thấp v d như cá ng khoảng 3 -4 Đây là khó khăn lớn nhất trong việc phát tri n nuôi các loài

cá thuộc giống cá ng [9]

1.1.3 Gi tr inh t

Nhìn chung, các loài thuộc giống cá ng giàu giá tr dinh dưỡng, chất lượng th t thơm ngon, do vậy giá tr về m t kinh tế của giống cá ng là rất cao Hiện nay, các loài cá thuộc giống cá ng nước ta đang được m rộng nghiên

c u và chuy n giao công nghệ nhân giống và nuôi cá đ tr thành các loài cá thương ph m Đi n hình là mô hình nuôi cá ng được phát tri n trong nh ng năm gần đây một số tỉnh miền núi như: Hà Giang, Yên ái, Hòa ình, Thanh Hóa Theo c c Thủy sản Hòa ình, cá ng hiện nay là một trong nh ng đối tượng nuôi l ng ch nh của tỉnh, m i năm có th cung cấp ra th trường 5-6 tấn cá thương ph m [9]

1.2 Nghiên u h n i

1.2.1 Kh i niệ v hệ thống h n i

Hệ thống phân loại cá là một hệ thống g m các cấp phân loại t thấp đến cao theo th tự sau: loài, giống, họ, bộ, lớp, ngành, giới Theo đó, loài được xem

là cấp phân loại cơ bản nhất

các hệ thống phân loại cá hiện nay, ngoài các cấp phân loại ch nh k trên, chúng ta có th g p các cấp phân loại ph như: ngành ph , lớp ph , bộ ph , họ

ph , loài ph T một loài có th chia ra làm hai hay nhiều loài ph Loài ph là tập hợp của nhiều cá th có nhiều đ c đi m phân loại giống nhau và c ng phân

bố một v ng đ a l nhất đ nh Gi a các loài ph trong c ng một loài s có một vài sai khác phân loại [7]

Trên thế giới có hai hệ thống phân loại cá được s d ng ph biến là: hệ thống phân loại cá của Lindberg 1971 và hệ thống của schmeyer 1998 Tuy nhiên hệ thống phân loại cá của Eschmeyer (1998) được s d ng ph biến, vì các tác giả này đã dựa trên nh ng nghiên c u mới nhất về giải phẫu, sinh l , sinh hóa, di truyền, đ sắp xếp các loài cá vào hệ thống phân loại Ch nh vì thế, hệ thống phân loại cá này v a mang t nh hiện đại, v a có độ tin cậy cao hơn

1.2.2 Đ iể h nh th i thư ng ng tr ng h n i



 Đếm tia vi của các vi như: vi lưng, vi hậu môn, vi ngực, vi b ng

 Đếm v y:

 V y đường bên: Đếm tất cả nh ng v y có ống cảm giác t sau l mang đến

gốc của các tia vi đuôi

 V y trên đường bên: Đếm nh ng v y thuộc hàng v y n m bên trên của

đường bên

 V y quanh cuống đuôi: Đếm nh ng v y quanh phần cuống đuôi



 Đo các chỉ tiêu thuộc về chiều dài như: Chiều dài toàn thân cá, chiều dài cá

bỏ đuôi, chiều dài đầu, chiều dài mõm, chiều dài cuống đuôi, chiều dài tia dài nhất của vây đuôi, chiều dài tia gi a vây đuôi

 Đo các chỉ tiêu thuộc về chiều cao và khoảng cách như: Chiều cao thân, chiều cao đầu qua gi a mắt, chiều cao đầu qua bờ trước và bờ sau của mắt, chiều cao cuống đuôi, đường k nh mắt, khoảng cách gi a hai mắt



 Quan sát hình dạng toàn thân và hình dạng của các cơ quan trên cơ th cá

 Quan sát màu sắc toàn thân và màu sắc của các cơ quan trên cơ th cá [7]

1.2.3 Ph n i h h n t tr ng h n i

Phân loại học phân t molecular taxonomy là phương pháp phân loại các loài sinh vật dựa trên các d liệu m c độ phân t N , protein [37]

ựa trên các kết quả phân t ch, so sánh trình tự N ho c protein của sinh vật, hệ thống phân loại của nhiều họ sinh vật đã được sắp xếp lại Năm 2 8,

Cooper và cộng sự đã công bố nghiên c u sự phát sinh loài của họ cá

Pomacentridae thuộc bộ cá Perciformes) N t ng số của tất cả 1 4 loài

thuộc tất cả các giống n m trong họ cá Pomacentridae và 1 loài ngoài nhóm t các họ cá khác thuộc bộ cá Perciformes bao g m họ cá Cichlidae,

Embiotocidae và Labridae) đã được tách chiết Sau đó ba đoạn gen nhân g m:

rag1 9 3 bp , rag2 8 2 bp , bmp4 553 bp và ba đoạn gen ty th g m: 12S rRN 1 27 bp , 16S rRN 598 bp , N 3 4 8 bp được khuếch đại và giải trình tự D liệu trình tự các gen thu được được d ng đ xây dựng cây phát sinh chủng loại theo phương pháp Maximum Likelihood ML và Maximum Parsimony (MP) b ng cách s d ng phần mềm Mr ayes v3.1.2, Garli v 951 và PAUP* v4.0b10 Kết quả cây phân loại cho thấy có 5 nhánh ch nh trong họ cá

Pomacentridae được tạo ra trên cây phân loại với 5 họ ph , bao g m: Stegastinae, Lepidozyginae, Chrominae, Abuderdufinae và Pomacentrinae Kết

quả phân t ch số liệu ML và ayesian cho thấy các loài trong nhánh lớn chủ yếu

là các loài cá lớn, các loài cá ăn sinh vật đáy thuộc 9 giống [22] Năm 2 12, Costa và cộng sự đã s d ng DNA barcoding đ xây dựng một hệ thống cấp bậc cho các loài cá bi n Portugal, thông qua việc phân t ch v ng trình tự gen COI-5P của 1 2 loài cá được nhận dạng về m t hình thái Các mẫu cá thu thập được tách N t ng số t mô th t Sau đó, khuếch đại b ng phản ng PCR v ng gen COI 652 bp Tất cả sản ph m PCR được tinh sạch và được đọc trình tự t cả

m i xuôi và m i ngược Kết quả xác đ nh trình tự được dóng hàng s d ng MEGA v4.1 và đưa lên GenBank và OL (Barcode of Life Data Systems) Cây phát sinh chủng loại xây dựng dựa trên phương pháp Neighbour Joining (NJ) với giá tr bootstrap 1 lần và khoảng cách di truyền được t nh toán theo thuật toán Kimura 2-Parameter K2P được s d ng đ phân t ch sự phát sinh loài Kết quả phân t ch cây phát sinh chủng loại cho thấy 1 2 loài cá nghiên c u thuộc 79 giống, 54 họ và 22 bộ; khoảng cách di truyền trung bình trong c ng loài và khoảng cách di truyền trung bình khác loài được t nh theo thuật toán K2P tương ng là ,32 và 8,84% Tất cả các mẫu đã được sắp xếp thành 5 cấp độ khác nhau -E), theo độ tin cậy và sự ph hợp gi a nhận dạng hình thái loài

c ng chu n đoán tương ng dựa trên N barcoding của chúng, cấp độ chiếm 73,5 bao g m các loài được nhận dạng rõ ràng về m t hình thái, cấp độ

chiếm 7,8% g m các thành phần trong nhóm ph hợp với sự phân loại dựa trên N barcoding nhưng còn cần sự kh ng đ nh lại của nh ng nghiên c u tiếp theo, còn lại là các loài nhận dạng với các cấp độ thấp của độ tin cậy cấp độ C đến chiếm 18,7% [23]

Với nh ng đ c t nh hình thái th hiện một cách không rõ ràng trong mô tả cấp độ loài sinh vật, thông tin trình tự N có nh ng đóng góp quan trọng trong việc chu n đoán đ c t nh của loài một số t các loài chưa được phân loại rõ, thông tin t N có th coi như căn c đ mô tả trong phân loại o đó, phương pháp phân loại phân t kết hợp với phương pháp phân loại truyền thống trong việc xác đ nh và mô tả một loài sinh vật, đ c biệt là các loài mới được xem

là rất cần thiết [27]

Năm 2 3, Paul Hebert, nhà nghiên c u tại Đại học Guelph Ontario, Canada đã đề xuất khái niệm N barcoding mã vạch N như là một cách đ xác đ nh loài thông qua việc so sánh các trình tự một đoạn N ngắn (DNA barcoding t một mẫu chưa biết với một thư viện các trình tự DNA của các loài đã biết Điều này cho phép đ nh danh một sinh vật tại bất kỳ giai đoạn phát tri n nào t một mẫu mô rất nhỏ, dạng tươi ho c dạng bảo t n trong nhiều năm trước [1] T khái niệm này có th thấy N barcoding đóng vai trò như một công c mang t nh ng d ng cao h trợ hiệu quả cho công tác phân loại sinh vật

Cá, d liệu di truyền s d ng k thuật N barcoding đã và đang được

b sung và s d ng một cách có hiệu quả trong việc nhận dạng và xác đ nh loài mới Năm 2 11, Zhang đã s d ng một đoạn gen COI có k ch thước 652 bp làm

N barcoding đ nhận dạng các loài cá bi n Trung Quốc Đầu tiên, 329 mẫu thuộc 1 loài, bảo quản trong c n 7 được tách chiết N t ng số Sau đó một đoạn v ng 5 trên gen ty th COI được khuếch đại b ng phản ng PCR, sản ph m PCR sau đó được s d ng đ xác đ nh trình tự Trình tự giải mã được dóng hàng s d ng phần mềm S QSC P v2.5, sự sai khác của trình tự được

t nh theo thuật toán Kimura 2-Parameter (K2P) Cây NJ được tạo ra dựa trên khoảng cách K2P s d ng phần mềm M G Việc lựa chọn các nhóm phân loại, phân t ch sự phát sinh loài được tiến hành b ng P UP* v4.0b10 s d ng phương pháp MP với bootstrap 1 lần, kết quả đã phân loại 121 loài cá, các loài khác nhau c ng được nhận dạng cấp độ giống [47] C ng trong thời gian

này Gao và cộng sự đã s d ng một đoạn gen COI 6 9 bp đ h trợ cho phân

loại hình thái một loài cá mới thuộc bộ cá Perciformes Trung Quốc Năm

2 13, Zhu và cộng sự c ng đã s d ng một đoạn gen COI có k ch thước khoảng

650 bp làm N barcoding đ nhận dạng các loài thuộc giống cá Chana [48]

1.2.4 T nh h nh nghiên u h n i ở Việt Na

Thành phần khu hệ cá Việt Nam rất đa dạng và phong phú o đó, nhiều nghiên c u liên quan đến phân loại cá, đánh giá sự đa dạng của thành phần các loài cá trong theo khu vực đ a l nước ta đã được thực hiện trong suốt thời gian qua:

Năm 2 8, Mai Viết Văn và cộng sự đã nghiên c u thành phần loài cá phân

bố Sóc Trăng- ạc Liêu Kết quả đã phát hiện 239 loài cá thuộc 146 giống, 68

họ, 18 bộ ộ cá Vược Perciformes chiếm số lượng loài lớn nhất với 126 loài chiếm 52,72 , trong đó họ cá Khế Carangidae là họ có số lượng thành phần

loài phong phú nhất [16]

Năm 2 11-2012, Hoàng nh Tuấn và Nguy n Xuân Huấn đã công bố danh

m c thành phần loài cá của 2 xã a Nam và a Xa, huyện a Tơ, tỉnh Quảng Ngãi, là đ a phận có nhiều sông lớn chảy qua Kết quả phân t ch số liệu đã xác

đ nh bộ cá Chép Cypriniformes là bộ đa dạng nhất với 4 họ chiếm 23,5 và

27 loài chiếm 62,8 [15]

Năm 2 11, ương Văn Long đã xác đ nh thành phần loài cá của lưu vực sông H ng, thuộc đ a phận thành phố Hưng Yên, huyện Kim Động, tỉnh Hưng Yên Kết quả bước đầu xác đ nh được 51 loài cá, thuộc 47 giống, 24 họ và 1

bộ Trong đó, bộ cá Chép có số lượng loài lớn nhất chiếm 29, 2 [8]

Năm 2 13, Nguy n Th iệu Phương và cộng sự nghiên c u khu hệ cá sông Đakrông, huyện Đakrông, tỉnh Quảng Tr trong khuôn kh dự án ảo t n

và Phát tri n ngu n lợi thủy sản v ng cao, cho thấy có 84 loài cá, thuộc 52 giống, 17 họ và 7 bộ khu vực này Trong đó, cấu trúc taxon bậc họ thì bộ cá

Vược Perciformes) nhiều nhất với 7 họ chiếm 36,85 , cấu trúc taxon bậc giống và bậc loài thì nhiều nhất là bộ cá Chép Cypriniformes với 39 giống

chiếm 65 và 78 loài chiếm 73,15 [12]

Các nghiên c u đánh giá sự đa dạng của thành phần các loài cá, không chỉ

d ng lại việc phân loại, thống kê thành phần các loài cá đã được mô tả, so sánh

và đánh giá sự đa dạng của các họ cá, bộ cá đ a đi m nghiên c u Các nghiên c u còn phát hiện ra các loài cá mới, b sung ngu n d liệu quan trọng làm phong phú thêm cho sự đa dạng thành phần các loài cá của khu hệ cá Việt Nam:

Năm 2 7, Nguy n H u ực và cộng sự đã công bố phát hiện một loài cá

mới thuộc phân giống Spinibarbichthys Oshima, 1926 thuộc giống

Spinibarbus và được đ t tên khoa học là Spinibarbus maensis [11]

Năm 2 12 Nguy n Văn Hảo và V Th H ng Nguyên đã mô tả một loài

mới thuộc giống cá ng Spinibarbus Oshima được phát hiện tỉnh Tuyên

Quang [4]

Năm 2 13, Nguy n H u ực và cộng sự đã phát hiện loài cá mới

Acheilognathus nguyenvanhaoi sp.n, thuộc giống Acheilognathus Bleeker, 1859

n m trong họ cá Chép [2] C ng trong thời gian này, Nguy n Văn Hảo và cộng

sự đã mô tả 3 loài cá mới thuộc giống cá ng Spinibarbus) được phát hiện tỉnh Quảng Tr bao g m: cá ulu (S.hoenoti sp.n), cá ng nguy n (S.nguyenhuuduci sp.n) và cá ng vây đen (S.nigripinnis sp.n) dựa trên các đ c

đi m về m t hình thái [5]

Năm 2 15, Nguy n Văn Hảo và cộng sự đã dựa vào các đ c đi m hình thái

phát hiện 3 loài cá mới trong giống Silurus bao g m: S.caobangensis sp.n,

S.langsonensis sp.n, S.dakrongensis sp.n Kết quả thu được đã nâng số loài trong

giống Silurus nước ta lên 5 loài [3]

ên cạnh đó, các nghiên c u phân t ch các đ c đi m hình thái và đ c đi m

di truyền đ c trưng cho t ng loài cá, nh m h trợ cho việc nhận dạng, đ nh danh các loài cá nước ta c ng được tập trung nghiên c u:

Năm 2 13, Hà Phước H ng và H Kim Lợi đã nghiên c u hình thái đá tai

cơ quan tiếp nhận âm thanh và cân b ng của cá của 26 loài họ cá Chép

(Cyprinidae cho thấy có th dựa vào các đ c đi m riêng biệt của t ng loại đá tai

đ h trợ cho đ nh danh loài [6]

Năm 2 14, Đ ng V Hà Quyên và cộng sự đã phân loại một số loài cá nước ngọt đ ng b ng sông C u Long dựa vào đ c đi m hình thái và s d ng trình tự gen 16S rRNA (khoảng 6 bp của hệ gen ty th nh m xây dựng mối quan hệ phát sinh chủng loại của các loài cá nghiên c u đ ki m ch ng kết quả

phân loại dựa vào hình thái Cây phân loại cho thấy sự đ ng dạng của các giống

cá nghiên c u, tuy nhiên, có sự khác biệt trình tự gen 16S rRN gi a các loài trong nghiên c u và loài tương ng trên GenBank [13]

1.3 Đ iể hệ gen ty thể và vai tr a gen ty thể tr ng h n i h n t 1.3.1 Đ iể hệ gen ty thể

Hệ gen ty th mt N bao g m các N mã hóa cho các protein riêng chỉ có trong ty th , và chúng c ng được nhân lên trong ch nh ty th Hệ gen ty

th ch a các nhóm gen mang t nh n đ nh cao, có hệ số đột biến thấp, sản ph m của chúng có t nh bảo t n ch c năng nghiêm ng t và bảo thủ qua các thế hệ như các gen sao mã các rRN riboxom

N ty th mã hóa cho 2 rRN chỉ có duy nhất trong ribosome của ty

th , 2 đến 35 tRN cần cho quá trình vận chuy n trong ty th , và 13 protein

ti u đơn v của ph c hợp trong ty th có liên quan đến chu i hô hấp và sự t ng hợp TP

Hệ gen ty th có k ch thước đa dạng, v d : nấm men Saccharomyces

cerevisiae là 78 kb, nấm mốc Neurospora crassa là 6 kb, cá ng Spinibarbus denticulatus là 16,5 kb,

tất cả các tế bào động vật đều có ch a N ty th , N ty th có tốc độ thay đ i nhanh, chúng cung cấp nh ng sai khác quan trọng trong trình tự

mt N gi a các loài Tốc độ tiến hóa của mt N là nhanh hơn t 5 đến 1 lần genome nhân b i vì ty th không có enzyme s a ch a các sai sót trong quá trình tái bản, hay nh ng sai hỏng đối với phân t N ng cách đó, mt N có cấp độ thay đ i trình tự nucleotide và cấp độ thay đ i axit amin trong protein mã hóa s cao động vật có vú, mt N tiến hóa rất nhanh chóng trong giới hạn các nucleotide thay đ i, nhưng sự sắp xếp không gian của các gen và k ch thước của genome là khá n đ nh gi a các loài [28] Một số gen ty th được ng d ng nhiều

có th k đến như: gen cytochrome c oxidase subunit I COI và gen 16S rRNA COI (hay COX1) là một v ng gen mã hóa cho protein có m t với nhiều bản sao trong m i tế bào Hiệu quả s d ng gen COI đ phân biệt nhiều mẫu động vật có c ng t tiên được ghi nhận tốt, thậm ch hiệu suất s d ng cao ngay cả với các mẫu đã được lưu gi qua thời gian dài Nhiều nghiên c u cho thấy COI giúp phân biệt được khoảng 98 các loài với nhau [10]

16S rRNA là một gen ty th mã hóa cho ti u đơn v nhỏ của riboxom Gen 16S rRN chiếm 1 1 toàn bộ hệ gen ty th , và được s d ng rộng rãi trong nghiên c u sự phát sinh loài vì tốc độ biến đ i tương đối nhanh của nó trong quá trình tiến hóa và có t nh bảo t n cao Gen 16S rRNA trong ty th đã được s

d ng đ khám phá mối quan hệ phát sinh loài cá với các cấp độ phân loại khác nhau V d cấp bộ [34]; cấp họ [45 ; cấp phân họ [24] [35]; cấp độ giống [33 ; và cấp loài [19 [24]

1.3.2 S ng gen ty thể tr ng h n i h n t

Với nh ng đ c đi m của các gen trong hệ gen ty th , đ c biệt là t nh n

đ nh cao, hệ số đột biến thấp, sản ph m của các gen có t nh bảo t n ch c năng nghiêm ng t và bảo thủ qua các thế hệ, nhiều gen trong hệ gen của ty th đã được nghiên c u và ng d ng trong phân loại phân t , đ c biệt là trong việc xây dựng bộ d liệu N barcoding trong nhận dạng cấp độ loài

Năm 2 13, Wang và cộng sự đã phân loại hình thái và kết hợp với phân loại di truyền phân t cho thấy mối quan hệ gần g i của tất cả các loài, loài ph

của giống cá Percocypris dựa trên phân t ch 3 gen ty th 16S rRN , COI và

CYTB và một gen nhân rag2) [43]

Năm 2 1 , Tang và cộng sự đã ki m tra mối quan hệ phát sinh chủng loại

của họ ph Danioninae , thuộc bộ cá Chép (Cypriniformes s d ng d liệu trình

tự của 2 gen ty th : COI, CYTB và 2 gen nhân: rag1 và RH [40]

1.3.3 Hệ gen ty thể a t số ài thu giống ng Spinibarbus)

Năm 2 13, genome ty th của S denticulatus có k ch thước 16549 bp đã

được giải mã, bao g m: 13 gen mã hóa protein, 22 gen tRN và 2 gen rRN

[42] Genome ty th của S denticulatus được công bố trên GenBank mang mã

số KC852197.1

Sau đó, Ai và cộng sự đã tiếp t c giải mã được toàn bộ genome ty th của

S caldwelli với k ch thước là 16545 bp, được công bố trên GenBank mang mã

số K 134718.1

Năm 2 14, Ma và cộng sự đã giải mã toàn bộ genome ty th của S sinensis

với k ch thước 16591 bp và được công bố trên GenBank mang mã số

KC579368.1 Genome ty th của S sinensis bao g m 13 gen mã hóa protein, 22

gen tRNA, 2 gen rRNA và một v ng điều khi n Kết quả cho thấy có 8 gen tRN , gen N 6 và tất cả các gen ty th khác được mã hóa trên chu i n ng Có

1 v ng gen ch ng chéo lên nhau với k ch thước 3 bp và có 13 v ng đệm gi a các gen với t ng k ch thước là 69 bp [31]

C ng trong năm 2 14, Chen và cộng sự đã giải mã toàn bộ hệ gen ty th

của S.hollandi Oshima với k ch thước 16521 bp và mã số trên GenBank là KM401858.1 Hệ gen ty th của S.hollandi g m 13 gen mã hóa protein, 22 gen

tRNA, 2 gen rRNA, và một v ng điều khi n không mã hóa CR CR có k ch thước 867 bp n m v tr gi a tRN Pro và tRN Phe Thành phần trung bình của

các bazơ của S.hollandi là: 31,87 ; 26,56 C; 25,89 T và 15,68 G [20]

Các d liệu về hệ gen ty th của các loài thuộc giống cá ng được công bố trên GenBank đã được đề cập trên cung cấp ngu n tài liệu tham chiếu quan trọng trong nghiên c u này

Chương 2 VẬT I U V PHƯ NG PH P NGHI N C U 2.1 Vật iệu

2 1 1 Nguyên iệu

Các mẫu cá được nhận dạng sơ bộ về m t hình thái thuộc ho c có quan hệ gần g i với giống cá ng s d ng đ nghiên c u được thu thập trực tiếp trên sông Đakrông, xã Đakrông, huyện Đakrông, tỉnh Quảng Tr , được th hiện Hình 2.1

H nh 2 1: Các mẫu cá s d ng trong nghiên c u

ảo quản mẫu : Mẫu cá ngay sau khi thu thập được ngâm và bảo quản trực tiếp trong dung d ch ethanol 1 , điều kiện nhiệt độ phòng khoảng 25o

C)

Ethidium bromide 0,1µg/ml

Taq DNA polymerase

Buffer 10X

4 Tinh sạch N GeneJET PCR Purification Kit (Lithuania-EU)

5 Sequencing BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit

Ethanol EDTA; Hi-Di Formamide

2 Máy n nhiệt ThermoMixer C, M ình tam giác các cỡ

3 ộ ngu n điện di và b điện di ngang

5 Lò vi sóng Sarp, Nhật ản Lọ thủy tinh Pyrex các cỡ

6 Máy đo pH Mettler, Th y S Kh u trang

7 Máy ly tâm Eppendorf 5415C

(Biofuge, Sorvall)

Găng tay cao su

8 Máy lắc (Eppendorf) Micropipet 1 l Gilson,

Pháp

9 Máy PCR Veriti 96 well Thermal

Cycler I, M ,

Micropipet 2 l Gilson, Pháp

10 Máy speed Vac (Eppendorf) Micropipet 1 l Gilson,

Pháp

11 Máy giải trình tự gen I PRISM®

3100 Avant Genetic Analyzer)

Micropipet 2 l Gilson, Pháp

12 Máy khuấy trộn Vortex OSI Rotolab Micropipet 1 l Gilson,

Pháp

13 Tủ lạnh nhiệt độ 40

C, - 200C Sanyo, Nhật ản

Đầu côn các cỡ, ph hợp với

t ng loại micropipet

14 Máy đo O ioSpectrometer, M ng eppendorf các cỡ ,2ml;

0,5ml; 1ml; 2ml

2.2 Phương h nghiên u

2.2.1 Phương h nghiên u h nh th i

Quan sát sơ bộ bên ngoài cơ th cá, đo các chỉ tiêu hình thái cm cơ th cá, phân loại sơ bộ các mẫu cá nghiên c u dựa trên khóa phân loại hình thái các loài thuộc giống cá ng mới nhất được công bố (Ph l c 1) được cung cấp b i Viện Nghiên c u Nuôi tr ng Thủy sản I Đình ảng, T Sơn, ắc Ninh Theo đó,

đ c đi m hình thái của các loài cá trong giống Spinibarbus được trình bày dựa

trên nguyên tắc đối nhau theo t ng c p [5]

2.2.2 Phương h nghiên u sinh h h n t

c : Lấy khoảng 1 mg m i mẫu cá r a qua b ng nước 1X kh tr ng

sau đó thấm trên giấy thấm cho khô S d ng kéo cắt các mẫu thành các miếng nhỏ khoảng 2 mm3

) cho vào ống eppendorf 1,5 ml

c 2: sung 72 l Solution 1 vào m i ống eppendorf Vontex cho đều

c : sung 5 l Protease K 2 mg ml vào m i ống eppendorf Lắc

đều và đ trong máy n nhiệt 6 oC trong 3 giờ Trong quá trình ủ lắc 2-3 lần

c : sung 2,5 l Protease K 2 mg ml vào m i ống eppendorf, vontex

c : sung Solution 1 cho đầy ống epp 1,5 ml Vontex và đ trong

máy n nhiệt 6 oC, qua đêm

c : Hút 12 l mẫu sang 1 ống eppendorf 2 ml mới đ cân b ng

lượng dung d ch trong các ống trước khi ly tâm), bỏ phần d ch c n ph a dưới chưa tan

c : sung 24 l Solution 2, sau đó đ lạnh 4oC trong 3 phút

c : Ly tâm 12000 vòng phút, 4o

C, trong 15 phút Lấy phần pha d ch

ph a trên, khoảng 7 l với 1 ống epp, chuy n sang 1 ống epp mới (ống epp có nhiều d ch pha trên được thu sang 2 ống epp mới Loại c n protein

c : Thêm 72 l thanol 1 vào m i ống dung d ch v a lấy Đ ủ

-20oC qua đêm

c 0: Ly tâm 12000 vòng phút, 4oC, 15 phút Thu tủa N

c : sung 5 l thanol 7 vào m i ống eppendorf Ly tâm

12000 vòng phút, 4oC, trong 1 phút Thu tủa

c 2: Làm khô b ng máy cô mẫu chân không trong 1 phút

c : sung H2O vào m i ống eppendorf, vontex cho tan tủa

c : Đ ống eppendorf trong b n nhiệt 55oC cho N tan hết trong 5 phút, spin đ phần bốc hơi trong ống eppendorf xuống hết

c : Đo O các sản ph m N t ng số thu được, bảo quản -20o

 C c b c tiến h nh

 Chuẩn bị gel agarose 0 %: Cho ,8 g agarose vào 1 ml đệm T

1X, đem đun trong lò vi sóng cho đến khi agarose tan hoàn toàn Đ nguội đến khoảng 6 oC thì đ dung d ch agarose vào khuôn điện di đã cài lược sẵn ề dày gel khoảng 5 mm là th ch hợp Sau 3 -4 phút khi agarose đã được polyme hóa hoàn toàn là có th điện di được

 Tra mẫu DNA v o giếng điện di: N được trộn với đệm tra mẫu, sau

đó tra vào các giếng trên bản gel Mẫu N được chạy điện di c ng với marker

N đ xác đ nh k ch thước phân t của N

 Chạ điện di: Chạy điện di với hiệu điện thế U = 5 -1 V và cường

độ dòng điện I = 8 -100 mA)

 Nhuộm DNA:Sau khi kết thúc điện di, bản gel được lấy ra và nhuộm

trong dung d ch t r n ng độ ,5 g ml khoảng 1 -15 phút Sau đó lấy bản gel

ra và r a b ng cách ngâm trong nước sạch 2 lần, m i lần 5-10 phút

 Quan s t v chụp ảnh: ản gel được quan sát dưới ánh sáng t ngoại

UV254nm, và được ch p ảnh b ng hệ thống ch p ảnh gel tự động

2.2.2.3 Phương h thi t i

Hai c p m i suy biến được thiết kế dựa trên sự tham khảo một số trình tự

hệ gen ty th đã được công bố của các loài thuộc giống Spinibarbus trên

GenBank và một số nghiên c u khác được trình bày trong ảng 2.3:

Sơ đ thiết kế m i khuếch đại hai đoạn gen 16S rRN và COI được th hiện như Hình 2.2 sau:

Hình 2.2: Sơ đ thiết kế m i khuếch đại hai đoạn gen 16S rRN và COI 2.2.2.4 Phương h PCR



PCR Polymerase chain reaction là phương pháp t ng hợp lượng lớn

DNA invitro trên cơ s mẫu khuôn Quá trình t ng hợp N kéo dài t m i dựa

trên nguyên tắc bắt c p đ c hiệu của các đoạn N có trình tự b sung và khả

năng kéo dài chu i của enzyme bền nhiệt ph biến là Taq polymerase - phân lập

t vi khu n ch u nhiệt Thermus aquaticus PCR g m một chu i nhiều chu kỳ,

m i chu kỳ có ba bước: biến t nh, gắn m i và t ng hợp Kết quả sau khoảng 2-3 giờ, lượng N s được khuếch đại lên hàng triệu lần

 kỹ ậ

 Một chu kỳ phản ng PCR g m 3 giai đoạn sau:

 Giai đoạn biến t nh: N mạch kép ban đầu tách thành hai mạch đơn

nhờ nhiệt độ cao 94°

C-95°C trong thời gian ngắn

 Giai đoạn g n mồi: nhiệt độ th ch hợp khoảng 5 °C-6 °C , hai m i

là các oligonucleotide dài t 15-30 nucleotide, m i m i s bám vào một đầu của một đoạn N sợi đơn đã được tách ra t sợi N mạch kép theo nguyên tắc

b sung

 Giai đoạn t ng h p: Nhiệt độ của h n hợp phản ng được tăng lên

khoảng 7 °

C-80°C là nhiệt độ th ch hợp đ Taq N polymerase kéo dài chu i,

tránh hiện tượng tiếp hợp không đ c hiệu



Đ phản ng PCR di n ra đạt hiệu quả tốt nhất, chúng tôi đã tiến hành tối

ưu hóa các thành phần trong phản ng PCR c ng như xây dựng chu trình nhiệt

đ khuếch đại hai đoạn gen COI và 16S rRN dựa trên nhiệt độ gắn m i của các trình tự m i xuôi và m i ngược đã được thiết kế

Phản ng PCR được tiến hành trong môi trường đệm th ch hợp cho sự hoạt động của enzyme như: lực ion, pH Trong th nghiệm này chúng tôi đã s d ng

dung d ch đệm ream Taq uffer, có ch a ion Mg2+ có vai trò tạo ph c với dNTP và gắn vào enzyme, hoạt hoá enzyme, tăng sự kết hợp gi a m i và đoạn khuôn, c ng như tăng nhiệt độ nóng chảy của sợi N mạch kép đ s d ng cho phản ng PCR

Các dNTP d TP, dGTP, dTTP, dCTP là nguyên liệu cho quá trình t ng hợp các đoạn N mới t khuôn nên không th thiếu trong thành phần của PCR N ng độ m i loại dNTP phải b ng nhau Trong th nghiệm nghiên c u chúng tôi đã s d ng n ng độ dNTPs là 10 mM

Một trong nh ng yếu tố quan trọng khác của phản ng PCR là nhiệt độ và

n ng độ các đoạn m i s d ng Việc điều chỉnh nhiệt độ gắn m i và n ng độ

m i th ch hợp trong k thuật PCR quyết đ nh lượng sản ph m thu được Trong

th nghiệm này, chúng tôi s d ng n ng độ 1 pM đối với m i loại m i Nhiệt

độ gắn m i của hai đoạn gen COI và 16S rRN đã được chúng tôi khảo sát các nhiệt độ: 54o

C, 56oC và 58oC Kết quả khảo sát cho thấy, nhiệt độ gắn m i

th ch hợp cho đoạn gen COI là 54oC và nhiệt độ gắn m i th ch hợp cho đoạn gen 16S rRNA là 58oC

 à ầ

Một mẫu phản ng PCR được tiến hành trong t ng th t ch 25 l bao g m các thành phần sau :

 Chu trình nhiệt khuếch đại đoạn gen 16S rRNA (k ch thước khoảng

1200 bp , s d ng c p m i 16Sp1 và 16Sp1R được di n ra như Hình 2.3 sau:

H nh 2 3: Sơ đ chu trình nhiệt khuếch đại đoạn gen 16S rRNA

b ng phản ng PCR

 Chu trình nhiệt khuếch đại đoạn gen COI ~13 bp , s d ng c p m i COI-F1 và COI-R1 được bi u di n Hình 2.4 sau:

H nh 2 4: Sơ đ chu trình nhiệt khuếch đại đoạn gen COI b ng phản ng PCR 2.2.2.5 Phương h tinh s h sản h PCR

Sản ph m PCR được tinh sạch s d ng bộ Kit tinh sạch: GeneJET PCR Purification của Lithuania-EU Các bước tinh sạch sản ph m PCR được thực hiện theo th tự sau:

 c : Thêm 50 µl Binding Buffer vào h n hợp sản ph m PCR hoàn

chỉnh với tỉ lệ về th t ch là 1:1 v d : với 1 l h n hợp phản ng, thêm 1

µl Binding Buffer Trộn đều Ki m tra màu của dung d ch Màu vàng bi u th

pH tối ưu cho N liên kết (pH=5,2 Nếu màu của dung d ch là màu cam ho c tím, thêm 10 µl CH3COONa 3M, pH=5,2 vào dung d ch và trộn, màu sau khi trộn s có màu vàng Sau đó, spin h n hợp

 c 2: Chuy n 1 l dung d ch t bước 1 vào cột tinh sạch GeneJ T

đã được lắp ráp với ống Collection Ly tâm cột tinh sạch trong 1 phút, 14 vòng phút, nhiệt độ phòng Loại bỏ phần d ch ống Collection

 c : Thêm 700 µl Wash Buffer đã được pha loãng với thanol) vào

cột tinh sạch GeneJ T Ly tâm 30-60 giây, 14000 vòng/phút, nhiệt độ phòng Loại bỏ thành phần d ch chảy qua màng trong ống Collection

 c : Ly tâm cột tinh sạch GeneJ T thêm khoảng 1 phút, 14000

vòng phút, nhiệt độ phòng, đ loại bỏ hết lượng Wash uffer vẫn còn trong cột đây là bước cần thiết vì sự có m t của thanol còn lại trong mẫu N có

th c chế nh ng phản ng tiếp theo)

 c : Chuy n cột tinh sạch GeneJ T sang một ống epp 1,5 ml sạch

Thêm 4 l đệm hòa tan vào ch nh gi a cột tinh sạch GeneJ T, đ nhiệt độ phòng 5-10 phút, sau đó ly tâm trong 1 phút, 14 vòng phút, nhiệt độ phòng

 c : Loại bỏ cột tinh sạch GeneJ T, đo O sản ph m sau tinh sạch

 Nguyên tắ hung

Trình tự nucleotide quan tâm được xác đ nh trên nguyên tắc của phương pháp Sanger: tạo ra các đoạn N một sợi hơn kém nhau một nucleotide, kết thúc b i các ddNTP đã được đánh dấu huỳnh quang Đ tạo ra các đoạn kết thúc

b ng các ddNTP khác nhau, tiến hành PCR s d ng ig yeTerminator v3.1 Cycle Sequencing Kit đã có sẵn các hóa chất cần thiết của phản ng nhân gen đ xác đ nh trình tự như dNTPs, ddNTPs, DNA polymerase o đó, chỉ cần b sung thêm N khuôn sản ph m PCR ho c N plasmid tinh sạch và m i

ph hợp Phản ng được thực hiện trong một ống vì 4 loại ddNTP đã được đánh dấu b ng các màu khác nhau Thành phần của phản ng khuếch đại gen đ đọc trình tự bao g m: M i 3,2 pM, sản ph m PCR, ig ye và đệm tương ng với

t ng th t ch 15 l

 Chu tr nh nhiệt

Chu trình nhiệt cho phản ng PCR trong máy Gen mp®

PCR System 97 như sau: 96°C - 1 phút; (96°C - 10 giây; 50°C - 5 giây; 60°C - 4 phút) x 25 chu kỳ Sau đó gi sản ph m 4°

C

 Tinh s h sản h PCR ằng hương h tOH/ TA

 sung vào sản ph m PCR 5 l T 125 mM, 6 l tOH 1 và

đ h n hợp nhiệt độ phòng trong 15 phút Sau đó, ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút đ tủa N có trong đó

 Loại bỏ tOH, r a tủa b ng 6 l tOH 7 Ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút

 Làm khô tủa và b sung 1 l Hi-DiTM

ormamide đ biến t nh 95°C trong 5 phút

 Sau bước này, nguyên liệu được đưa vào máy đọc trình tự tự động I PRISMTM 3100 Genetic Analyzer

 Các ống được điện di trong ống vi mao quản 8 cm x 5 l

 Kết quả được thu nhận và x l b ng phần mềm I PRISMTM

Avant Data Collection v2.0 và DNA Sequencing Analysis v5.2

ước 2: Phân t ch trình tự được đọc t m i xuôi và trình tự được đọc t

m i ngược của một sản ph m PCR Kết hợp thông tin của cả hai trình tự này đ

có d liệu trình tự hoàn chỉnh của một sản ph m PCR ước phân t ch này c ng được thực hiện b ng cách s d ng phần mềm io dit v7.2

ước 3: Các trình tự gen được so sánh với d liệu trên Gen ank qua công

c L ST [18 trên website: http: blast.ncbi.nlm.nih.gov nh m chú giải gen, xác đ nh xem đoạn gen đã đươc giải mã có đúng như dự đoán l thuyết hay không

ước 4: Thu thập d liệu trình tự gen 16S rRN và COI của 4 loài cá khác, thuộc 15 giống trong họ cá Chép, t ngân hàng Gen ank nh m xây dựng cây phát sinh chủng loại

ước 5: Kết hợp d liệu trình tự gen 16S rRN và COI thu thập t Gen ank và d liệu trình tự mới giải mã t 3 mẫu cá nghiên c u, xây dựng cây phát sinh chủng loại phylogenetic tree b ng cách s d ng phần mềm M G v6.06 [30 Cây phát sinh chủng loại được xây dựng theo phương pháp Neighbour Joining NJ , bootstrap 1 lần được thực hiện nh m đánh giá độ tin cậy của sự phân nhánh trên cây phát sinh chủng loại NJ Đ ng thời, giá tr khoảng cách di truyền gi a các loài được t nh toán theo thuật toán Kimura 2-Parameter (K2P)

(Spinibarbus , bao g m: cá ng nguy n Spinibarbus nguyenhuuduci sp.n) và

cá Chầy đất Spinibarbus hollandi, Oshima 1919) Một loài được xác đ nh thuộc giống cá Paraspinibarbus là cá Cầy Paraspinibarbus macracanthus)

Cá ng nguy n S.nguyenhuuduci sp.n) là một loài mới được phát hiện

Về m t hình thái, cá B ng nguy n có một số đ c đi m khác với các loài cá khác trong giống cá ng [5] Hơn n a, cá ng nguy n lại có đ c đi m môi dưới là

lớp s ng giống với giống cá Chát (Acrossocheilus) và giống cá Sỉnh (Onychstoma o đó, đ kh ng đ nh v tr phân loại của loài cá này, cần kết hợp

với nh ng nghiên c u về m t di truyền phân t

Cá Chầy đất S hollandi, Oshima 1919 là loài cá đã được mô tả và đ nh

danh t lâu Hệ gen ty th của loài này đã được giải mã hoàn toàn [20] Tuy nhiên, trong nghiên c u này chúng tôi vẫn tiếp t c phân lập và giải mã hai gen

ty th của mẫu cá Chầy đất thu thập tại Việt Nam với các l do sau: 1 kh ng

đ nh lại kết quả phân loại hình thái; 2 đánh giá sự khác biệt nếu có của cá Chầy đất phân bố Việt Nam với c ng loài phân bố nước khác vì dưới loài còn có th có các loài ph

Cá Cầy Paraspinibarbus macracanthus là một loài cá ban đầu được phân

loại thuộc giống cá ng, sau đó được tách khỏi giống cá ng do có một số

đ c đi m hình thái khác biệt [21] o vậy, có th nói loài cá Cầy có mối quan hệ rất gần g i với các loài thuộc giống cá ng Với m c đ ch xác đ nh chỉ th mã vạch phân t N barcoding marker thì việc phân biệt được với loài gần với

nó có ý ngh a quan trọng, cho thấy rõ được hiệu quả của các chỉ th phân t ên cạnh đó, nghiên c u này s góp phần cung cấp nh ng d liệu phân t đầu tiên về

loài cá Cầy Paraspinibarbus macracanthus) c ng như của giống

Paraspinibarbus cho ngân hàng gen

3.2 K t uả t h hi t NA t ng số

ước đầu tiên trong nghiên c u sinh học phân t là thu nhận được một lượng N t ng số dạng tinh sạch không b ho c đ t gẫy t, với lượng đủ đ tiến hành các nghiên c u tiếp theo DNA t ng số của ba mẫu cá nghiên c u được tách chiết, sau đó được xác đ nh n ng độ b ng cách đo quang ph bước sóng 260nm (OD260 và đánh giá độ tinh sạch thông qua giá tr O 260/280 Kết quả xác đ nh n ng độ và O 260/280 của các mẫu được th hiện ảng 3.1:

Sau khi xác đ nh n ng độ, các mẫu được hiệu chỉnh về c ng một n ng độ

300 ng/ l và được điện di đ ki m tra kết quả tách chiết N t ng số trên gel agarose 0,8% Kết quả điện di ki m tra sản ph m tách chiết N t ng số được

th hiện Hình 3.1:

H nh 3 1: Kết quả điện di ki m tra sản ph m tách N t ng số

trên gel agarose 0,8%

Kết quả điện di N t ng số Hình 3.1 cho thấy, cả ba giếng điện di của

ba mẫu cá đều xuất hiện băng N t ng số lớn > 1 kb , v ng sáng k ch thước nhỏ là RN mẫu cá Sp1 xuất hiện một vệt sáng kéo dài, điều này cho thấy N

t ng số của mẫu Sp1 có th có một phần b đ t gãy ho c còn ch a nhiều tạp chất

do giá tr O 260/280 của mẫu Sp1 chỉ đạt 1,1 Kết quả điện di cho thấy, mẫu N của Sp2 và Sp3 được tách tốt hơn với 1 băng N đậm và rõ ràng Tuy nhiên, cả

ba mẫu giá tr O 260/280 là thấp so với tiêu chu n ảng 3.1 Điều này do chúng tôi

s d ng phương pháp tách chiết N nhanh, không có các bước chiết b ng phenol, chloroform Tuy vậy, kết quả này không ảnh hư ng đến các bước th nghiệm tiếp theo ước đầu, chúng tôi nhận đ nh N t ng số của các mẫu cá nghiên c u đã được tách chiết đảm bảo yêu cầu làm ngu n nguyên liệu cho việc khuếch đại hai đoạn gen COI 13 bp và 16S rRN 12 bp

3.3 K t uả hu h i gen 16S rRNA và COI ằng thuật PCR

Sản ph m của phản ng PCR khuếch đại hai đoạn gen 16S rRN và COI được ki m tra b ng phương pháp điện di trên gel agarose ,8 với thang marker

N chu n 1Kb Kết quả điện di được th hiện Hình 3.2:

H nh 3 2: Kết quả điện di ki m tra sản ph m PCR trên gel agarose ,8

MK (1 Kb): ar er chuẩn Kb

Kết quả điện di ki m tra sản ph m phản ng PCR của các mẫu nghiên c u Hình 3.2 cho thấy: các giếng điện di sản ph m PCR khuếch đại đoạn gen 16S rRN của cả 3 mẫu cá nghiên c u xuất hiện một băng sáng đậm có k ch thước khoảng 12 bp; các giếng điện di sản ph m PCR khuếch đại đoạn gen COI của

3 mẫu cá c ng xuất hiện 1 băng đậm có k ch thước khoảng 1300 bp K ch thước sản ph m PCR là ph hợp với t nh toán l thuyết (Bảng 2.3 Như vậy, chúng tôi nhận đ nh hai đoạn gen 16S rRN và COI của 3 mẫu cá nghiên c u có khả năng cao đã được khuếch đại thành công b ng phản ng PCR Sản ph m PCR thu được cần được tinh sạch đ tiến hành đọc trình tự

3.4 K t uả tinh s h sản h PCR

Đ tinh sạch sản ph m phản ng PCR Chúng tôi đã tiến hành tinh sạch s

d ng bộ Kit tinh sạch GeneJ T PCR Purification của Lithuania-EU Các sản

ph m N sau khi tinh sạch được xác đ nh n ng độ, đo O 260/280 b ng máy BioSpectrometer và được điện di ki m tra trên gel agarose ,8 Kết quả xác

đ nh n ng độ và đo O 260/280 b ng máy ioSpectrometer của các sản ph m N sau khi tinh sạch được th hiện ảng 3.2 sau:

H nh 3 3: Kết quả điện di ki m tra sản ph m PCR sau khi đã tinh sạch

A: Sản phẩm C sau tinh sạch c a đoạn gen 16S rRNA, B: Sản phẩm C

sau tinh sạch c a đoạn gen C I

Kết quả ảng 3.2 và Hình 3.3 cho thấy các sản ph m PCR đều đã được tinh sạch, đảm bảo về khối lượng và chất lượng cho bước giải trình tự tiếp theo

3.5 K t uả giải tr nh tự gen

3.5.1 K t uả giải ã n gen 16S rRNA a a u nghiên u

Trình tự giải mã t sản ph m PCR khuếch đại đoạn gen 16S rRN của các mẫu cá được x l loại bỏ nh ng đoạn có t n hiệu kém và kết hợp thông tin đọc

cả hai chiều xuôi và ngược thu được có k ch thước như sau: 1 66 bp Sp1 , 1 65

bp Sp2 và 1 62 Sp3 Các trình tự gen này được th hiện Ph l c 2 Trình tự gen 16S rRN thu được của m i mẫu cá nghiên c u được so sánh với d liệu trên ngân hàng gen qua công c L ST Một phần d liệu tương đ ng nhất được th hiện ảng 3.3: