Nghiên cứu phát triển hệ thống chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens cho nấm sợi Aspergillus oryzae

Bookmark not defined... Bookmark not defined.. oryzae thu c phân nhóm Flavic achi Aspergillus, trong h Trichocomaceae... Trong quá trình sinh tr ng và phát tri n, A.. căđi mădiătruy năc

I H C QU C GIA HÀ N I

KHOAăSINHăH C

-Nguy năTh ăKhuy n

NGHIểNăC UăPHÁTăTRI NăH ăTH NGăCHUY Nă GENăB NGăVIăKHU NăAgrobacterium tumefaciens

CHOăN MăS IăAspergillus oryzae

Chuyên ngành: Vi sinh v t h c

Mã s : 60420107

LU NăV NăTH CăS ăKHOAăH C

Ng iăh ngăd năkhoaăh c:ăTS.ăTr năV năTu n

HƠăN iă- 2016

M C L C

Trang

M Đ U 4

Ch ng T NG QUAN 6

1.1 Gi i thi u chung v n m s i Aspergillus oryzae 6

Đ c đi m sinh h c c a n m s i Aspergillus oryzae 6

Đ c đi m di truy n c a n m s i A oryzae 7

Vai trò c a n m s i A oryzae 8

Ph}n bi t Aspergillus oryzae v i Aspergillus flavus sinh đ c t aflatoxin 9

C|c ph ng ph|p chuy n gen v{o n m s i 12

Ph ng ph|p chuy n gen s d ng t b{o tr n (protoplast) 12

1.2.2 K thu t chuy n gen b ng xung đi n (electroporation) 13

Ph ng ph|p chuy n gen thông qua vi khu n A tumefaciens (ATMT) 13

1.2.4 Marker s d ng trong ch n l c c|c ch ng chuy n gen 17

1.2.5 M t s gen ch th dùng trong chuy n gen vi n m 19

Ch ng V T LI U VÀ PH NG PHÁP 23

Nguyên li u 23

2.1.1 Ch ng vi sinh v t 23

2.1.2 Thi t b v{ hóa ch t 25

Môi tr ng s d ng trong nghiên c u 28

Ph ng ph|p nghiên c u 28

2.2.1 Thu nh n b{o t n m 29

T|ch chi t DNA RNA v{ t ng h p cDNA 29

Quan s|t hình th|i v{ ki m tra m t s đ c đi m sinh lý sinh hóa 30

Ph}n bi t A oryzae v{ A Flavus b ng c|c k thu t sinh h c ph}n t 31

2.2.5 T o c|c vector nh th dùng cho chuy n gen 32 2.2.6 Chuy n gen v{o n m s i A oryzae Error! Bookmark not defined

X|c nh n ch ng A oryzae an to{n đ s d ng cho chuy n gen Error!

Bookmark not defined

Ph}n bi t c|c ch ng A oryzae an to{n v{ ch ng Aspergillus flavus sinh đ c

t aflatoxin Error! Bookmark not defined

3.1.2 L a ch n ch ng A oryzae ph c v cho chuy n gen Error! Bookmark not

defined

3.2 L a ch n marker chuy n gen v{o A oryzae Error! Bookmark not defined X}y d ng h th ng chuy n gen thông qua vi khu n A tumefaciens Error!

Bookmark not defined

Xóa gen pyrG đ t o ch ng đ t bi n tr d ng uridine/uracil Error!

Bookmark not defined

3.3.2 T o m t s vector nh th dùng cho chuy n gen v{o A oryzae tr d ng

uridine/uracil Error! Bookmark not defined

Đ|nh gi| hi u qu c a h th ng chuy n gen v i gen huỳnh quang GFP v{

DsRed Error! Bookmark not defined

3.4.1 Chuy n gen GFP v{ DsRed v{o n m s i A oryzae tr d ng uridine/uracil

Error! Bookmark not defined X|c nh n c|c th chuy n gen Error! Bookmark not defined

3.5 ng d ng h th ng chuy n gen m i thi t l p đ bi u hi n gen phyA m~ hóa

enzyme phytase c a A fumigatus A oryzae Error! Bookmark not defined

TÀI LI U THAM KH O 34

M U

Aspergillus oryzaelà loài n m s i đ c s d ng r ng rãi trong s n xu t th c

ph m truy n th ng và đ u ng t i nhi u n c châu Á bao g m Nh t B n, Trung

Qu c, Hàn Qu c, Vi t Nam, Thái Lan, Malaysia và Philippines Loài n m này đã

đ c C c Qu n lý Th c ph m và D c ph m Hoa K (FDA) công nh n là an toàn

(GRAS) Vi t Nam, A oryzae đ c s d ng đ s n xu tt ng truy n th ng t i m t

s đ a ph ng các t nh phía B c.A oryzae có kh n ng ti t m t l ng l n các enzyme khác nhau vào môi tr ng Do đó, loài n m này đ c s d ng nh nhà máy

t bào đ s n xu t th ng m i nhi u lo i enzyme và protein c d ng t nhiên và tái

t h p G n đây ch ng A oryzae RIB40 dùng trong s n xu t công nghi p t i Nh t

B n đã đ c gi i trình t toàn b h gen S hi u bi t t ng t n v h gen c a A

oryzae m ra nhi u c h i trong c i bi n di truy n và bi u hi n gen trên loài n m s i

an toàn này

Hi n nay, hai ph ng pháp ph bi n nh t trong chuy n gen vào n m s i là chuy n gen qua t bào tr n và chuy n gen thông qua vi khu n Agrobacterium

tumefaciens Tuy nhiên vi cchuy n gen vào n m s iA oryzaecho đ n nay ch s

d ng ph ng pháp chuy n gen qua t bào tr n.Ph ng pháp này t ng đ i ph c t p

và t n kém, khó có th th c hi n t i đi u ki n phòng thí nghi m t i Vi t Nam

Ph ng pháp chuy n gen s d ng vi khu n A tumefaciens đ n gi n h n v i chi phí

h p lý Tuy nhiên ch a có m t nghiên c u nào báo cáo v vi c chuy n gen thành công n m s i A oryzae Bên c nh đó, A oryzaecókh n ng kháng l i h u h t các

h p ch t kháng sinh th ng đ c s d ng cho chuy n gen.Do đó phát tri n các

ch ng A oryzae tr d ngđ s d ng cho chuy n gen là gi i pháp duy nh t đ c i

bi n di truy n c ng nh bi u hi n gen A oryzae

V i m c đích xây d ng h th ng chuy n genhi u qu cho n m s i A oryzae thông quavi khu n A tumefaciensnh m ph c v h ng nghiên c u b n v ng v bi u

hi n enzyme/protein tái t h p loài n m này, chúng tôi th c hi n đ tài“Nghiênă

c uăphátătri năh ăth ngăchuy năgen b ngăviăkhu năAgrobacterium tumefaciens choăn măs iăAspergillus oryzae” v i nh ng n i dung chính nh sau:

- Xác nh n các ch ng A oryzae an toàn, có th s d ng làm đ i t ng chuy n gen

- T o ch ng A oryzae đ t bi n tr d ng uridine/uracil b ng cách xóa gen

- B c đ u ng d ng h th ng chuy n gen m i t ođ c đ bi u hi n gen

phyA mã hóa enzyme phytase t n m s i Aspergillus fumigatus

Ch ngă1.ăT NG QUAN 1.1 Gi i thi u chung v n m s iAspergillus oryzae

1.1.1 căđi măsinhăh căc aăn măs iAspergillus oryzae

N m s iA oryzae thu c phân nhóm Flavic achi Aspergillus, trong

h Trichocomaceae A oryzae có c u t o đa bào, khi đ c nuôi c y trên môi tr ng

đ a th ch,h s icó màu tr ng xámsau đó phát tri n chuy n sang màu vàng nh t đ n

xanh H s i n m A oryzae sinh tr ng r t nhanh và phân m nh, chi u ngang có kích

th c 5-7 µm Trên nh ng s i này hình thành c u trúc sinh s n vô tính, g i là cu ng

sinh bào t Cu ng sinh bào t c a A oryzae th ng dài 1-2 mm Trên cu ng ph ng lên t o thành b ng, t b ng này m c lên các t bào nh , thuôn dài hình chai, x p sát

nhau, g i là th bình; trên th bình có đính nh ng chu i bào t màu vàng l c hay màu vàng hoa cau (còn g i là bào t đính)[31, 53, 80, 99] Hình thái khu n l c và

cu ng sinh bào t c a n m s i A oryzae đ c Machida và c ng s mô t chi ti t nh

trong Hình 1.1

H̀nhă1.1.Hình thái khu n l c và c u trúc cu ng sinh bào t c a n m s i Aspergillus

oryzae RIB40[53]

N m s iA oryzae sinh tr ng t t nhi t đ 30ºC-40ºC, chúng có th sinh

tr ng và phát tri n d dàng trên nhi u lo i c ch t khác nhau nh các m nh v n

th c v t, cây lá, g m c nát, các lo i h t, th c n gia súc A oryzae phân b r ng rãi trên toàn th gi i, đ c bi t ph bi n các n c nhi t đ i Trong quá trình sinh tr ng

và phát tri n, A oryzae ti t ra môi tr ng m t l ng l n các enzyme th y phân nh

cellulase, pectinase, xylanase, amylase, protease, glucoamylase[36, 53]

1.1.2 căđi mădiătruy năc aăn măs iăA oryzae

G n đây, ch ng A oryzaeRIB40 đ c s d ngtrong công nghi p s n xu t các

th c ph m lên men truy n th ng t i Nh t B n đã đ c gi i trình t toàn b h gen, theo đó h genc a A oryzaeg m 8 nhi m s c th v i t ng kích th c là 37 megabase (Mb), d đoán có 12.074 gen mã hóa protein, l n h n 25%-30% so v i các loài khác thu c chi Aspergillus Ch ng h n,h gen c a A oryzae l n h n loài A nidulans(loài chu n dùng cho nghiên c u trong phòng thí nghi m) và A fumigatus(tác nhân gây

b nh c h i ng i) l n l t là 29% và 34%[53].H genc a A oryzae l n h nch

y u do thu n p thêm DNA trong quá trình ti n hóa Vi c m r ng kích th c h gen

d ng nh đ c tr ng cho các loài có quan h g n g i v i A oryzaenh A niger và A

flavus, các loài này cókích th c h gen t ng đ ng nhau c bi t loài có quan h

r t g n g i v i A oryzae là A flavuscó đ t ng đ ng DNA đ n 99,5%[2, 53, 85]

A oryzae có kh n ng phân gi i m nh nhi u lo i c ch t có trong t nhiêndo loài này s h u các gen mã hóa enzyme th y phân khác nhau Các loàiA oryzae, A

fumigatusvà A nidulans ch a l n l t 135, 99 và 90 gen mã hóa cho các protease,

chi m kho ng 1% t ng s các gen trong h gen T t c các gen mã hóa protease đ c tìm th y trong A fumigatus và/ho cA nidulansđ u có m t trong A oryzae, tuy nhiêncác gen mã hóa m t s enzyme aminopeptidase có m t trongA oryzael i không

có m t trong h gen c aA fumigatus và A nidulans Ngoài ra,A oryzaecòn s h u

thêm nhi u gen mã hóa protease ti t có kh n ng ho t đ ng trong môi tr ng có tính

axit S gia t ng các protease ho t đ ng trong pH axit c aA oryzaecó th hình thành trong quá trình thu n hóa c a con ng i [53].S hi u bi t t ng t n v h gen c a

Aspergillus oryzae đã m ra nhi u c h i m i trong nghiên c u c i bi n di truy n

ng d ng loài n m an toàn này trong s n xu t các s n ph m nh m ph c v m c đích

con ng i

1.1.3 Vaiătròăc aăn măs iA.oryzae

N m s iA oryzaeđ c thu n hóa t ít nh t 2000 n m tr c và hi n nay đ c

s d ng r ng rãitrong s n xu t th c ph m Nh t B n, Trung Qu c và các n c ông

Á nh lên men đ u nành, làm n c s t, t ng và m t s đ u ng có c n nh

huangjiu, sake, makgeolli và shochu[4, 36, 111] A oryzae đ c s d ng r ng rãi trong th c ph m do đ c tính sinh tr ng nhanh,ti t l ng l n các enzyme th y phânnh amylase, glucoamylase, carboxypeptidase, protease trong quá trình sinh

tr ng và t o mùi th m d ch u cho các s n ph m lên men[37].Trong lên men truy n

th ng, A oryzae th ng đ c nuôi môi tr ng r n, đi u ki n này thích h p cho s phát tri n hi u khí c a s i n m m thích h p trong quá trình lên men môi

tr ng r n giúp t ng kh n ng s n sinh các enzyme và các ch t chuy n hóa mà

th ng s không đ c s n xu t trong đi u ki n lên men l ng[99]

Ngoài vai trò trong s n xu t các th c ph m truy n th ng, n m s i A oryzae còn đ c s d ng trong m t s ngành công nghi p s n xu t enzyme có giá tr kinh t cao nh glucoamylase, -amylase và m t s protease ph c v s n xu t bánh k o, đ

u ng Glucoamylase và -amylase thu c nhóm enzyme amylase, chi m t i g n 20%

t ng s n l ng enzyme đ c s n xu t, trong đóch y u đ c s n xu t b in m s iA

oryzae[16, 81, 98, 113].Ngu n cung c p enzyme protease cho công nghi p s n xu t

th c ph m và các ch t t y r a đ n t các loài n m s i thu c chi Conidiobolus,

Verticillium, Penicillium và Aspergillus, trong đó ph i k đ n loài sinh protease r t cao là A oryzae[1, 106]

Bên c nh nh ng l i ích v kinh t , A oryzae còn đ c coi là vi sinh v t mô hình dùng cho nghiên c u v bi u hi n enzyme và protein tái t h p Ngoài ra nghiên

c u chuy n gen còn h tr trong vi ctìm ra ch c n ng c ng nh vai trò c a các gen

m i[54]

1.1.4 P hơnăbi tăAspergillus oryzae v iAspergillus flavussinhăđ căt ă

aflatoxin

Hi n nay, t l ng i m c b nh ung th t ng lên ngày m t t ng cao M t trong

nh ng nguyên nhân chính là do n ph i th c ph m ch a các ch t gây ung th , trong

đó cóđ c t n m aflatoxin c t aflatoxin đ c sinh ra b i n mm cAspergillus

flavusvà Aspergillus parasiticustrên các lo i h t nông s n quan tr ng không đ c b o

qu n t t nh g o,l c, ngô, đ u t ng Hình thái c aA flavusg n nh gi ng h tv i loàiA oryzaemà th ng đ c s d ng trong ngành công nghi p th c ph m[17, 26,

80]

A flavusvà A oryzaelà hai loài thu c phân nhóm Flavi c a chi Aspergillus

T ng t nh A oryzae, n m s i A flavus có kh n ng t n t i nhi t đ t 12ºC đ n 48ºC và sinh tr ng t i u nh t 28ºC đ n 37ºC H u h t trong chu trình s ng A

flavus t n t i d ng h s i và sinh s n b ng bào t đính.Gi ng v i m t s ch ng A

oryzae, d i đi u ki n b t l i, s i n m A flavus chuy n thành c u trúc đ c bi t g i là

h ch n m (sclerotia) H ch n m giúp chúng có th t n t i d i các đi u ki n kh c nghi t Khi đi u ki n tr nên thu n l i, các h ch n m s phát tri n thành d ng s i vàt

đó sinh ra các cu ng mang bào t đính, phát tán ra ngoài môi tr ng đ t và không

khí [17, 26]

Trong t nhiên, r t khó đ có th phân bi t hai loài A oryzae và A flavus b i hình thái r t gi ng nhau.H n n a,khi gi i trình t hai ch ng đ i di n cho hai loài,

nh n th y genome c a ch ng A oryzae RIB40 và A flavus NRRL 3357 có đ t ng

đ ng 99,5% DNA và 98% protein [85] Phân tích ti n hóa trên m t s ch ng thu c

hai chi này, nh n th yA flavus và A oryzaecó m c đ t ng đ ng tùy thu c vào

t ng ch ng Ví d nh hai ch ngA flavusSRRC 1357 và SRRC 2112có m i quan h

g n g i v i A oryzae h n các ch ngA flavus khác, do có nhi u đ c đi m c a A

oryzae h n (Hình 1.2) T các d li u v h gen, A oryzaeđ c cho r ng có ngu n

g c phát sinh t loài A flavus[18]

H̀nhă1.2.M i quan h phát sinh loài và s khác bi t trong h gen c aA oryzae và

A flavus (màu xanh lam là A oryzae, màu xanh lá cây là A flavus)[18]

A oryzaekhác v i A flavus vi c m t kh n ng sinh đ c t aflatoxin trong quá trình sinh tr ngdo trong quá trình ti n hóa đã tích l y nhi u đ t bi n đi m và đ t bi n

m t đo n m t s gen liên quan đ n sinh t ng h p aflatoxin[8] Con đ ng sinh t ng

h p aflatoxin b t ngu n t axit norsolorinic (NOR), tr i qua ít nh t 23 quá trình chuy n hóa

trung gian, nh các enzyme đ c mã hóa b i 25 gen n m trong m t vùng DNA kích th c

70 kb đ t o thành aflatoxin có đ c tính cao nh t là aflatoxin B1 (AFB1)[47, 97, 112]

Các b c chuy n hóa đ c th c hi n b i các enzyme có ch c n ng riêng bi t Các gen liên quan đ n t ng b c chuy n hóa trong quá trình s n xu t aflatoxin trong t bào

n m đ c li t kê t i B ng 1.1

B ngă1.1 Các gen liên quan trong quá trình sinh t ng h p aflatoxin

aflA (fas-2), aflB (fas-1), và aflC (pksA) Acetate -> NOR

aflD (nor-1), aflE (norA), và aflF (norB) NOR -> AVN

aflM (ver-1) và aflN (verA) VERA -> DMST

aflO (omtB, dmtA) DMST -> ST; DMDHST -> DHST

hình nucleotide đ n SNP (Single Nucleotide Polymorphism) [45] Tuy nhiên, các

ph ng pháp k trên v n còn nh ng h n ch nh t đ nh trong vi c phân bi tA

oryzaevàA flavus ho c thi u s n đ nh trong các l n l p l i thí nghi m[8] D a trên

s khác bi t v trình t DNA c a nhóm gen liên quan đ n sinh t ng h p aflatoxin

A flavus và A oryzae, m t s c p m i PCR đ c hi u cho các gen này đã đ c thi t

k và s d ng đ phân bi t A flavusvàA oryzae[10]

1.2. Các ph ng pháp chuy n gen vào n m s i

Các nghiên c u v di truy n h c phân t c a n m s i đã có nh ng đóng góp đáng k cho s hi u bi t c a con ng i v c ch gây b nh và các con đ ng sinh

t ng h p enzyme, protein Chuy n gen là m t công c không th thi u trong các nghiên c u này

Hi n nay, nhi u ph ng pháp chuy n gen đ c s d ng nh chuy n gen thông qua t bào tr n (protoplast), chuy n gen b ng xung đi n, chuy n gen b ng súng b n

gen và chuy n gen s d ng vi sinh v t trung gian là vi khu n Agrobacterium

tumefaciens M i ph ng pháp đ u có nh ng u, nh c đi m riêng và tùy thu c vào

t ng loài mà hi u su t chuy n gen khác nhau đ i v i t ng ph ng pháp Tuy nhiên

ph ng pháp đ c s d ng ph bi n nh t n m s i làchuy n gen qua t bào tr n

(protoplast), chuy n gen b ng xung đi n (electroporation)và chuy n gen trung gian qua vi khu n A.tumefaciens[6, 51, 62, 63]

1.2 1.ăPh ngăphápăchuy năgenăs ăd ngăt ăbƠoătr nă(protoplast)

Ð chuy n gen vào n m thông qua t bào tr n, t bào n m c n đ c x lý

enzyme nh m lo i b thành t bào, t đó t o protoplastgiúpDNA d dàng xâm nh p vào t bào Ph ng phápnày có th đ c s d ng đ chuy n tr c ti p các đo n DNA

ho c các vector mang gen mong mu n vào t bào Ð nâng cao hi u qu chuy n gen, protoplast th ng đ c x lý v i PEG (polyethylene glycol) ho c b ng xung đi n

Ph ng pháp chuy n gen này khá hi u qu , đ c bi t đ i v i nh ng loài mà các

ph ng pháp chuy n gen kháckhông th th c hi n đ c Tuy nhiên, quá trìnhchu n

b protoplast c ng nh các b c chuy n genkhá ph c t p, t n nhi u công s c, chi phí

cao và không n đ nh, đòi h i ng i th c hi n ph i có nhi u kinh nghi m, không th

áp d ng r ng rãi t i các phòng thí nghi m v a và nh c bi t protoplast ph i đ c

s d ng ngay sau khi chu n b [51, 57]

1.2.2 K ăthu tăchuy năgenăb ngăxungăđi nă(electroporation)

K thu t chuy n gen b ng xung đi n là ph ng pháp c h c đ c s d ng đ

đ a các phân t DNA vào trong t bào ch qua màng t bào Trong ph ng pháp này, m t xung đi n cao th trong th i gian r t ng n (vài ph n nghìn giây) t o ra các

l th ng t m th i giúp cho các phân t DNA ngo i lai t môi tr ng có th xâm nh p vào bên trong t bào Ph ng pháp xung đi n đã đ c áp d ng thành công trên nhi u

lo i t bào, trong đó có t bào n m s i[6, 7] Tr c khi x lý v i xung đi n, bào t

n m n y ch i s đ c lo i b thành t bào b ng m t s enzyme đ t o t bào tr n

Sau đó t bào tr n đ c tr n v i DNA và đ c đ a vào máy t o xung đi n đ chuy n

DNA vào trong t bào n m [7] Ph ng pháp này m i ch áp d ng thành công v i

m t s loài n m s i và đòi h i ph i có thi t b chuyên d ng dùng cho quá trình chuy n gen

1.2 3.ăPh ngăphápăchuy năgenăthôngăquaăviăkhu năA tumefaciens

(ATMT)

Vi khu n A tumefacienslà m t loài vi khu n Gram âm s ng trong đ t, thu c

chi Agrobacterium, h Rhizobiaceae Vi khu n A tumefaciens là tác nhân gây kh i u trên th c v t nh chuy n m t ph n DNA (T-DNA) trên plasmid c m ng kh i u (Ti-plasmid) c a nó vào t bào th c v t Các gen n m trên T-DNA mã hóa cho các enzyme nh h ng đ n s sinh tr ng m t ki m soát c a t bào th c v t là nguyên nhân chính d n đ n s hình thành kh i u[28, 108] Quá trình chuy n gen gây kh i u

n m trên Ti-plasmid c a vi khu n A tumefaciens đ c mô t trên Hình 1.3

H̀nhă1.3.Vi khu n A tumefaciens gây kh i u trên th c v t [95]

Ti plasmid có kích th c 200 kb-800 kb, bao g m đo n T-DNA đ c gi i h n

b i biên trái (LB) và biên ph i (RB), các biên có kích th c kho ng 25 bp.T-DNA mang gen t ng h p auxin, cytokinin và opine Các gen này s tích h p vào h gen

c a th c v t m t v trí ng u nhiên Ngoài T-DNA, trên Ti plasmid còn có vùng gen

đ c, ch a các gen virmã hóa các protein (virA, virG, và m t s protein khác)giúp v n chuy n T-DNA vào trong t bào th c v t[28] Các gen vir này chính là y u t quy t

đ nhkh n ng chuy n T-DNA vào t bào ch c a vi khu n Agrobacterium S ho t

đ ng c a các gen virđ c c m ng b i h p ch t phenolic có ngu n g c t th c v t,

có tên là acetosyringone (AS) [63] Khi có m t ch t c m ng, gen vir ho t đ ng d n

t i quá trình chuy n T-DNA trên Ti plasmid vào t bào

1.2.3.2 Chuy n gen thông qua vi khu n A tumefaciens

Trong đi u ki n có ch t c m ng, vi khu nA tumefaciens s chuy n m t ph n

DNA trên Ti plasmid (còn g i là T-DNA) c a nó vào t bào th c v t T-DNA sau đó

đ c tích h p ng u nhiên vào h gen [24, 28] L i d ng c ch này, vi khu n A

tumefaciens đ c s d ng làm sinh v t trung gian đ chuy n gen vào th c v t t

nh ng n m 1980, sau đó vào n m 1998 vi khu n này l n đ u tiên đ c ng d ng thành công đ chuy n gen vào n m[12]

Ph ng pháp chuy n gen thông qua vi khu n A tumefaciens đ c coi là

ph ng pháp đ n gi n nh t đ chuy n gen vào n m s i Ph ng pháp ATMT chuy n gen vào n m d a trên c ch chuy n đo n T-DNA trên Ti-plasmid có m t trong t bào vi khu n sau đó tích h p ng u nhiên vào h gen n m Các gen c n chuy n s

đ c g n vào vùng T-DNA, sau đó đ c bi n n p vào vi khu n A tumefaciensdùng

cho chuy n vào n m Ph ng pháp chuy n gen này đã đ c th c hi n thành công trên nhi u loài n m s i khác nhau[12, 23, 62, 63, 93]

Chuy n gen vào n m thông qua vi khu n A tumefaciens c n m t h th ng

g m hai plasmid là plasmid tr giúp (vir helper)có ch acác gen vir (virulence) giúp

v n chuy n DNA vào t bào ch , và m t vector nh th (binary vector)ch a đo n DNA đã đ c c i bi n cho m c đích chuy n gen[63] Trên vectornh th cóch a gen kháng kháng sinh dùng đ ch n l c vi khu n mang vector và vùng T-DNA gi i h n

T-b i hai T-biên LB (left T-border) và RB (right T-border) có ch a marker ch n l c th chuy n gen và m t vùng DNA có th đ c c i bi n tùy vào m c đích chuy n gen[27,

74] Mô hình h th ng vector nh th hi n trong Hình 1.4

H̀nhă1.4.Mô hình t ng quát v h th ng vector nh th cho chuy n gen vào n m

thông qua vi khu n A tumefaciens[46]

M t trong nh ng u đi m l n nh t c a ph ng pháp chuy n gen nh vi khu n

A tumefaciens là có th t o ra m t lo t các th đ t bi n ng u nhiên do T-DNA t

t bào vi khu n chèn ng u nhiên vào h gen c a vi n m M t s nghiên c u ch ra

r ng A tumefaciens chèn T-DNA vào h gen c a n m ch y u ch d ng m t b n

đ n và đo n T-DNA này có th phá h y m t gen duy nh t th bi n n p t ng ng

T vi c nghiên c u các th đ t bi n chèn ng u nhiên có th giúp xác đ nh ch c n ng

c a gen.Ngoài ch c n ng bi u hi n và t o các th đ t bi n ng u nhiên, ph ng pháp chuy n gen b ng A tumefaciens còn đ c s d ng trong vi c xóa các gen nh c ch trao đ i chéo t ng đ ng trong t bào n m[49]

Ph ng pháp chuy n gen thông qua vi khu n A tumefaciens đã đ c ghi nh n chuy n thành công m t s loài n m s ithu c chi Aspergillus (A fumigatus, A

awamori, A japonicas, A niger), tuy nhiên ch a có m t nghiên c u nào đ c p đ n

vi c chuy n gen vào A oryzae thông qua vi khu n A tumefaciens[12, 23, 62, 63, 93]

1.2.3.3 u và nh c đi m c a ph ng pháp

Chuy n gen vào n m thông qua vi khu n A tumefaciens th c hi n đ n gi n

h n nhi u so v i các ph ng pháp khác, tuy nhiênth i gian ti n hành dài h n do c n

th i gian đ ng nuôi c y c m nggi a n m và vi khu n [62] Nguyên li u c a chuy n gen có th s d ng h s i ho c bào t n m mà không c n b t c khâu x lý b xung nào nh chuy n gen qua protoplast hay chuy n gen b ng xung đi n Th m chí, ch s

d ng ph ng pháp này m i kh thi đ i v i m t s loài n m[90, 102] Hi u qu chuy n gen vàon m s ikhi s d ng vi khu n Agrobacterium thu đ c s th chuy n cao h n nhi u l n so v i chuy n gen b ng t bào tr n nh PEG [61, 86] Bên c nh

đó, các nghiên c u g n đây c ng ch ra r ng vi c xóa gen n m nh c ch trao đ i

DNA t ng đ ng nh A tumefaciens đ t hi u qu cao h n so v i xóa gen b ng các

ph ng pháp khác Hi u qu xóa gen khi s d ng protoplast ch đ t 1%-50%, nh ng khi s d ng vi khu n A tumefaciens hi u qu có th đ t đ n 97% [11]

1.2.3.4 ng d ng c a ph ng pháp ATMT trong c i bi n di truy n

Ph ng pháp chuy n gen vào n m b ng vi khu n A tumefaciens đã đ c

ch ng minh l i th h n các ph ng pháp chuy n gen thông th ng Nguyên li u ban

đ u có th đ c s d ng nh s i n m, t bào tr n ho c bào t Chuy n gen b ng

ph ng pháp ATMT t o m t t l cao các th đ t bi n ng u nhiên do T-DNA chèn vào h gen v t ch [12, 61, 68] Ngoài ra, chuy n gen b ng ph ng pháp này có th

t o ra các trao đ i chéo t ng đ ng Do đó là công c h u ích đ xóa và xác đ nh các

ch c n ng c a gen [63]

xác đ nh ch c n ng c a m t genc th , ph ng pháp h u hi u nh t là gây

đ t bi n xóa ho c làm h ng gen đó Xóa m t gen c th Saccharomyces

cerevisiaeđ t hi u qu cao và ch c n hai đo n t ng đ ng nh (50 bp) hai phía trình t mã hóa[91].Tuy nhiên, n m s i c n hai đo n t ng đ ng kích th c l n

h n.Xóa gen s d ng ph ng pháp ATMT đ c ghi nh n là có hi u qu cao h n so các ph ng pháp chuy n gen khác Hi u qu xóa gen dao đ ng t 14% đ n 75%, cao

h n h n so v i các ph ng pháp chuy n gen thông th ng[63]

1.2.4 M arkerăs ăd ngătrongăch năl căcácăch ngăchuy năgen

Hi n nay, marker dùng trong ch n l c các th chuy n geng m 2 lo i là gen kháng kháng sinhvà các gen liên quan đ n sinh t ng h p m t hay nhi u h p ch t thi t y u trong quá trình sinh tr ng c a n m

1.2.4.1 Gen kháng kháng sinh dùng trong chuy n gen n m

Các lo i kháng sinh kháng n m thông d ng nh t đ c s d ng trong ch n l c

th chuy n gen là hygromycin B, phleomycin và nourseothricin Hygromycin B là

m t lo i kháng sinh thu c nhóm aminoglycoside, đ c s n xu t t x khu n

Streptomyces hygroscopicus Chúng có th tiêu di t vi khu n, n m và các t bào nhân chu n b ng cách c ch t ng h p protein[76] Phleomycin đ c s n xu t b i x khu n Streptomyces verticillus, là m t kháng sinh ph r ng có hi u qu ch ng l i h u

h t các lo i vi khu n, n m s i, n m men, th c v t và t bào đ ng v t Kháng sinh

phleomycin thu c nhóm kháng sinh glycopeptide, gây ch t t bàob ng cách bám vào

DNA và làm phá v s i kép c a DNA d n đ n các ho t đ ng c a t bào b ng ng và

ch t[9] Nourseothricin, v i tên th ng m i là clonNAT, thu c nhóm kháng sinh

aminoglycoside có ngu n g c t loài x khu n thu c chi Streptomyces Kháng sinh nàyho t đ ng b ng cách gây l i mã hóa trong quá trình d ch mã d n t i không t ng

h p đ c protein ClonNAT đ c dùng r t ph bi n làm marker ch n l c th chuy n

gen g m c vi khu n, n m men, n m s i và t bào th c v t [39]

1.2.4.2 Gen tr d ng dùng làm marker cho chuy n gen

Ch ng n m đ t bi n tr d ng là các ch ng m t kh n ng sinh t ng h p m t

lo i axit amin ho c m t h p ch tc n thi t trong quá trình sinh tr ng, vi c m t kh

n ng t t ng h p khi n chúng không còn kh n ng sinh tr ng trên môi tr ng t i thi u mà c n ph i b sung thêm axit amin ho c h p ch t t ng ng Gen tr d ng

đ c s d ng nhi u nh t trong ch n l c th chuy n gen là gen pyrG (mã hóa protein tham gia quá trình t ng h p uridine/uracil)[49, 59, 94] Ngoài ra còn có các gen tr

d ng khác c ng đ c s d ng nh adeA(gen mã hóa enzyme tham gia t ng h p

adenine), met(gen mã hóa enzyme tham gia t ng h p methionine), trp(gen mã hóa enzyme tham gia quá trình t ng h p tryptophan), argB (gen mã hóa enzyme tham gia quá trình t ng h p arginine)…[30, 116]

Các marker dùng cho ch n l c các th chuy n gen gi vai trò h t s c quan

tr ng, quy t đ nh s thành công c a quá trình chuy n gen Ph n l n các nghiên c u chuy n gen vào n m s i s d ng các ch t kháng sinh di t n m Tuy nhiên, các kháng sinh này th ng có giá thành r t cao, khi n vi c chuy n gen b h n ch Bên c nh đó, nhi u loài n m s i (tiêu bi u là A oryzae) có kh n ng kháng t nhiên v i nhi u lo i kháng sinh ho c ch b c ch n ng đ kháng sinh r t cao.Do đó vi c s d ng kháng sinh trong ch n l c th chuy n gen là không kh thi[96] kh c ph c nh c

đi m này, m t s loài n m s i đã đ c c i bi n di truy n đ có th s các gen tr

d ng d ng làm các marker chuy n gen Chuy n gen vào các ch ng tr d ng giúp

gi m chi phí, an toàn đ i v i môi tr ng và có ti m n ng ng d ng vào s n xu t th c

hi n b i enzyme orotidine 5’-monophosphate decarboxylase (OMP decarboxylase)

đ c mã hóa b i gen pyrG n m s i ho c gen URA3 n m men [13, 49] Gen pyrG giúp t bào n m t t ng h p UMP trong quá trình sinh tr ng Tuy nhiên v i nh ng

ch ng đ t bi n h ng gen pyrG, chúng ch có th sinh tr ng đ c trong đi u ki n môi tr ng ngo i bào có b sung uridine ho c uracil Khi gen pyrG đ c đ a tr l i các ch ng đ t bi n này, chúng có th sinh tr ng bình th ng Chính vì lý do đó nhi u nghiên c u tr c đây đã s d ng gen pyrG làm marker ch n l c trong quá

trình chuy n gen [13, 58, 73, 104, 107]

V i ch ng t nhiên (wild type), ho t đ ng c a enzyme OMP decarboxylase

mã hóa b i gen pyrGs chuy n hóa h p ch t 5-fluoroorotic acid (5-FOA) không đ c thành ch t gây đ c t bào là 5-fluorouracil Ng c l i, các ch ng b đ t bi n sai h ng

v gen pyrG s không th chuy n hóa h p ch t 5-FOA và các ch ng này có th sinh

tr ng bình th ng trên môi tr ng ch a 5-FOA.Chính vì v y 5-FOA th ng đ c

b sung vào môi tr ng trong quá trình ch n l c các ch ng vi n m đ t bi n h ng

ho c m t gen pyrG Vi c đ a gen pyrGquay tr l i th đ t bi n t ng ng s giúp th

đ t bi n t t ng h p uridine/uracil và sinh tr ng đ c trên môi tr ng t i thi u (không b sung uridine/uracil)[116]

Nhi u nghiên c u đã đ c ti n hànhnh m t o ra các ch ngn m s i tr d ng

uridine/uracil, trong đó có các loài thu c chi Aspergillus Ph ng pháp ph bi n nh t

đ t o ch ng đ t bi n tr d ng uridine/uracil là chi u tia UV sau đó sàng l c trên môi tr ng ch n l c có ch a h p ch t 5-FOA, uridine và uracil[34, 49, 104] Ngoài cách chi u UV, th đ t bi n tr d ng uridine/uracil còn đ c t o ra nh ph ng pháplo i b tr c ti p gen pyrG thông qua vi c chuy n c u trúc xóa gen pyrGvào t bào n m Nh c ch trao đ i chéo t ng đ ng, gen pyrG trong h gen c a n m có

th đ c lo i b đ t o ra th đ t bi n m t kh n ng t ng h p uridine/uracil[25, 49,

116]

1.2.5 M tăs ăgenăch ăth ădùngătrongăchuy năgen ăviăn m

Gen ch th mã hóa các protein t ng ng đ c s d ngtrong đánh giá hi u

qu chuy n gen ho c dùng nh d u hi u đ sàng l c các th chuy n gen S có m t

c a gen ch th khi n các t bào/khu n l c c a th chuy n gen có ki u hình khác bi t

và d dàng phân bi t v i các ch ng t nhiên.Gen ch th không gây nh h ng đ n

ch c n ng sinh lý c ng nh sinh tr ng c a các th chuy n gen[33]

Ng c l i v i marker ch n l c b o v th chuy n gen trên môi tr ng ch n

ch n l c và gây ch t ho c ng n ch n s phát tri n c a ch ng t nhiên, gen ch th

đ c s d ng đ sàng l c các ch ng chuy n gen làm cho các t bào/khu n l c ch a

gen ch th có đ c đi m có th quan sát tr c quan b ng m t Các gen ch th có th

đ c g n li n v i gen đích và đ c đi u khi n d i cùng m t promoter ho c bi u

hi n đ c l p mà không có gen đích đi kèm.M t s các gen ch th hay đ c s d ng

nh : GFP, DsRed, GUS, lacZ…[40, 69, 72] Các gen ch th đ c dùng ph bi n trong chuy n gen n m s i là gen mã hóa protein hu nh quang xanhGFP và gen mã hóa protein hu nh quang đ DsRed

1.2.5.1 Gen mã hóa hu nh quang xanh (GFP)

Gen GFPcó chi u dài 720 bp đ c phân l p l n đ u tiên t s a

Aequoreavictoria b i Osamu Shimomura n m 1962.GFP mã hóa protein có kích

th c 238 axit amin (26,9 kDa) Protein này phát ánh sáng hu nh quang màu xanh lá cây khi ti p xúc v i ánh sáng b c sóng 509 nm (Hình 1.5)[78, 89]

Trong l nh v c sinh h c phân t , genGFP th ng đ c s d ng nh m t gen

ch th trong chuy n gen và bi u hi n gen GFPth ng đ c đ a vào t bàothông qua các k thu t chuy n gen vàs tích h p c a GFP trong h gen c a t bào có th đ

b n v ng qua các th h sau n nay, GFP đã đ c bi u hi n nhi u loài, bao g m

c sinh v t nhân s và nhân chu n, trong đó có n m s i[52]

H̀nhă1.5.Bi u hi n genGFP n m s iAspergillus fumigatus[35]

Gen hu nh quang GFPr t h u ích trong vi c nghiên c u xác đ nh v trí c a

protein ho c ki m tra m c đ bi u hi n c a m t gen mong mu n Trong nghiên c u phát tri n các ph ng pháp chuy n gen, bi u hi n gen ch th GFPđã đ c ch ng minh là thành công trên nhi u loài n m s i nh Aspergillus fumigatus [35],

Aspergillus oryzae[56], Aspergillus nidulans[5], Aspergillus niger[21], Fusarium oxysporum[48]…

1.2.5.2 Gen mã hóa hu nh quang đ (DsRed)

Gen mã hóa protein hu nh quang đ DsRedcó chi u dài 678 bp đ c phân l p

t m t loài san hô thu c chi Discosoma Protein DsRed g m 226 axit amin v i kích

th c 28 kD, phát hu nh quang màu đ và tín hi u hu nh quang m nh nh t khi đ c quan sát d i ánh sáng b c sóng 583 nm[3].Do đ c tính t ng t nh gen hu nh

quang GFP nên DsRed c ng đ c s d ng làm gen ch th trong nghiên c u nhi u loài sinh v t khác nhau Riêng v i n m s i, gen DsRed đ c bi u hi n thành công trên nhi u loài nh Sordaria macrospora[15], Fusarium oxysporum[70],Acremonium

chrysogenum[32], Aspergillus fumigatus[44]…Các t bào nh n đ c gen DsRed s

có màu đ d i kính hi n vi hu nh quang v i b c sóng phù h p (Hình 1.6)

H̀nhă1.6 Bi u hi n gen DsRed n m s iFusarium oxysporum[70]

Ch ngă2.ăV T LI UăVẨăPH NGă

PHÁP 2.1 Nguyên li u

2.1.1 Ch ngviăsinhăv t

Các ch ng vi sinh v t s d ng trong nghiên c u đ c li t kê trong B ng 2.1

B ng 2.1 Các ch ng vi sinh v t dùng trong nghiên c u

1 RIB40 A oryzae National Research Institute of Brewing

8 VTCCF 053 A oryzae Vi n Vi sinh v t h c và Công ngh Sinh

h c, HQGHN

9 VTCCF 912 A oryzae Vi n Vi sinh v t h c và Công ngh Sinh

h c, HQGHN

10 VTCCF 914 A oryzae Vi n Vi sinh v t h c và Công ngh Sinh

h c, HQGHN

11 VS1 A oryzae Phòng Genomic- Phòng thí nghi m Tr ng

đi m Công ngh Enzyme và Protein,

Tr ng i h c Khoa h c T nhiên

12 NRRL 3357 A flavus ARS (NRRL) Culture Colection (M )

13 VTCCF 013 A flavus Vi n Vi sinh v t h c và Công ngh sinh

h c, HQGHN

14 N402 A niger CBS Fungal Biodiversity Centre (Hà Lan)

15 VTCCF 015 A fumigatus Vi n Vi sinh v t h c và Công ngh sinh

Ch ngA tumefaciens AGL1 là ch ng đã đ c c i bi n di truy n và đ c

s d ng làm sinh v t trung gian đ chuy n gen vào n m Ch ng AGL1 mang gen

nh th

Ch ng A oryzae AUT1-PlD có ngu n g c t ch ng R)B Ch ng n{yđ~

b xóa gen pyrG trong h gen v{ đ c s d ng tr c ti p đ chuy n gen s

d ng marker pyrG

2.1.2.ăThi tăb ăvƠăhóaăch t

Các hóa ch t đ c s d ng trong nuôi c y vi sinh v t và trong các thí nghi m sinh h c phân t g m: glucose, sucrose, KCl, NaCl, MgSO4, KH2PO4, K2HPO4, FeSO4, MnSO4, glycerol, NaNO3, (NH4)2SO4, NH4Cl, EDTA, KOH, HCl, Tris-HCl,

SDS…Các hóa ch t v i đ tinh khi t cao đ c mua t nh ng hãng uy tín nh

Thermo Scientific, Biobasic, Merck, Sigma, Biozym

Các m i dùng cho ph n ng PCR do công ty IDT (Singapore) t ng h p Danh sách m i đ c li t kê B ng 2.2

B ngă2.2 M i PCR dùng trong nghiên c u