Nghiên cứu tạo dòng thuốc lá (nicotiana tabacum l ) mang gen GmDREB2 phận lập từ cây đậu tương

Hiện nay, người ta vẫn chưa tìm được một gen cụ thể nào thực sự quyết định tính chịu hạn, mà mới chỉ xác định được các gen liên quan đến tính chịu hạn của cây thực vật.. Khi gặp hạn trạn

Trang 1

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

NGUYỄN THỊ PHƯƠNG THẢO

NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG THUỐC LÁ (NICOTIANA

TABACUM L.) MANG GEN GmDREB2 PHẬN LẬP

TỪ CÂY ĐẬU TƯƠNG

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 60.42.01.21

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS.Vũ Thị Thu Thuỷ

Thái Nguyên, năm 2015

Trang 2

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan bản luận văn là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của TS Vũ Thị Thu Thủy, sự giúp đỡ của các thầy cô giáo, cán bộ

Bộ môn Di truyền & Sinh học hiện đại Khoa Sinh học– Trường Đại học Sư phạm- Đại học Thái Nguyên Các số liệu nêu trong luận văn là trung thực Các kết quả chưa được công bố trong bất kỳ các công trình nào khác

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những số liệu trong luận án này

Thái Nguyên, tháng 11 năm 2015

TS Vũ Thị Thu Thủy

Trang 3

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn ii

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Vũ Thị Thu Thủy đã định hướng khoa học, tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất trong suốt quá trình tôi tiến hành nghiên cứu và hoàn thành luận văn này

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới GS.TS Chu Hoàng Mậu đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành Bản luận văn thạc sĩ này Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô, cán bộ Bộ môn Di truyền & Sinh học hiện đại, khoa Sinh học, trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên; xin cảm ơn chị Trần Thị Hồng - KTV phòng Công nghệ tế bào thực vật, đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện các thí nghiệm của đề tài

Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn tới bạn bè cùng toàn thể gia đình đã động viên, khuyến khích, giúp đỡ tôi, luôn quan tâm và là chỗ dựa cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn

Thái Nguyên, tháng 11 năm 2015

Tác giả

Nguyễn Thị Phương Thảo

Trang 4

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn iii

MỤC LỤC

Trang

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục chữ cái viết tắt iv

Danh mục bảng v

Danh mục hình vi

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Cây thuốc lá và hệ thống tái sinh cây thuốc lá 3

1.1.1 Cây thuốc lá 3

1.1.2 Hệ thống tái sinh và chuyển gen cây thuốc lá 4

1.2 Tính chịu hạn và gen liên quan đến tính chịu hạn ở thực vật 6

1.2.1 Hạn và tác hại của hạn lên thực vật 6

1.2.2 Đặc tính chịu hạn của thực vật 8

1.2.3 Gen liên quan đến tính chịu hạn 10

1.2.4 Gen DREB và gen DREB2 12

1.3 Phương pháp tạo cây trồng chuyển gen 18

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.1 Vật liê ̣u hoá chất và thiết bi ̣ 26

2.1.1 Vật liệu 26

2.1.2 Hóa chất 26

2.1.3 Thiết bị 26

2.1.4 Đi ̣a điểm nghiên cứu 26

2.2 Phương pháp nghiên cứu 27

2.2.1 Phương pháp tạo nguyên liệu biến nạp 27

Trang 5

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn iv

2.2.2 Phương pháp chuyển gen vào cây thuốc lá thông qua A tumefaciens 27 2.2.3 Phân tích sự có mặt của cấu trúc mang gen GmDREB2 bằng phương pháp PCR 29

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 32

3.1 Kết quả tạo nguyên liệu biến nạp 32 3.2 Kết quả chuyển vector mang cấu trúc GmDREB2 vào thuố c lá 33 3.2.1 Đồng nuôi cấy với dung dịch A tumefaciens và cảm ứng tạo cụm chồi 34 3.2.2 Tạo rễ và chuyển cây ra môi trường tự nhiên 37 3.3 Kết quả kiểm tra sự có mặt của gen chuyển trong các dòng thuốc lá chuyển gen bằng kỹ thuật PCR 39

KẾT LUÂ ̣N VÀ ĐỀ NGHI ̣ 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO 43 PHỤ LỤC

Trang 6

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn iv

DANH MỤC CHỮ CÁI VIẾT TẮT

A.tumefacines Agrobacterium tumefacines

DREB Dehydration Responsive Binding protein

EDTA Ethylene Diamine Tetra-acetate Acid

MS Môi trường cơ bản theo Murashige và Skoog (1962)

Ti-plasmid Plasmid tạo khối u

Trang 7

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn v

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 2.1 Thành phần dung dịch đệm chiết DNA tổng số 29

Bảng 2.2 Trình tự nucleotide của că ̣p mồi PCR khuếch đa ̣i đoa ̣n GmDREB2 30 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu nhân gen GmDREB2 31 Bảng 2.4 Chu trình nhiệt cho phản ứng nhân gen GmDREB2 31

Bảng 3.1 Kết quả cảm ứng chồi từ mảnh lá thuốc lá 36

Bảng 3.2 Kết quả tạo rễ và tái sinh cây thuốc lá ở thí nghiệm và đối chứng 38

Trang 8

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn vi

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Cây thuốc lá giai đoạn trưởng thành và giai đoạn ra hoa 3

Hình 1.2 Cấu trúc Ti - Plasmid 22

Hình 1.3 Mô hình chuyển gen gián tiếp nhờ A tumefaciens 23

Hình 3.1 Tạo nguyên liệu biến nạp 32

Hình 3.2 Vùng T-DNA của vector pBI121 - GmDREB2 33

Hình 3.3 Hình ảnh nhiễm khuẩn mẫu và đồng nuôi cấy 35

Hình 3.5 Hình ảnh tạo rễ trên môi trường kháng sinh chọn lọc 38

Hình 3.6 Các dòng thuốc lá chuyển gen ở thế hê ̣ T0 trồng trên châ ̣u trong nhà lưới 39

Hình 3.7 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân đoa ̣n GmDREB2 từ 17 dòng cây thuốc lá chuyển gen 40

Trang 9

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 1

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Một trong những hiện tượng thay đổi của môi trường ảnh hưởng tới sự sinh trưởng và phát triển của thực vật là tình trạng hạn Hạn hán có ảnh hưởng xấu ở các mức độ khác nhau trong suốt quá trình hay từng giai đoạn sống của

cơ thể thực vật dẫn đến làm giảm năng suất cây trồng, chậm phát triển và gây chết Hiện nay trên thế giới diện tích đất nông nghiệp bị hạn hán ngày càng tăng Ở Việt Nam tình trạng hạn hán trở nên báo động trong năm 2015, diện tích đất nông nghiệp không có nước để sản xuất này càng tăng cao

Khả năng chịu hạn của thực vật là tính trạng do nhiều gen quy định Hiện nay, người ta vẫn chưa tìm được một gen cụ thể nào thực sự quyết định tính chịu hạn, mà mới chỉ xác định được các gen liên quan đến tính chịu hạn của cây thực vật Nhiều trình tự gen liên quan đến tính chịu hạn ở đậu tương đã

được công bố trên Ngân hàng gen Quốc tế, trong đó có gen DREB

DREB (Dehydration Responsive Element Binding) là một họ gen sản xuất

protein kích hoạt nhóm gen liên quan đến tính chịu hạn của thực vật Việc

nghiên cứu gen DREB2 liên quan đến tính chịu hạn cho thấy đây là nhóm gen

đa dạng về cấu trúc, chức năng và các tác giả khuyến cáo cần tiếp tục mở rộng nghiên cứu

Hiện nay, nhờ những tiến bộ mới trong kỹ thuật di truyền mà người ta đã tạo ra các giống cây trồng có khả năng chịu hạn bằng cách lai giống, đột biến thực nghiệm, công nghệ tế bào, chuyển gen Chọn tạo giống cây trồng có thể được thực hiện bằng nhiều phương pháp khác nhau như chọn dòng biến dị soma, lai giống, gây đột biến thực nghiệm, sử dụng công nghệ tế bào và chuyển gen Đã có nhiều giống cây trồng đã được chọn tạo như các giống lúa chịu hạn của tác giả Đinh Thị Phòng [17], các dòng lúa chịu nóng của Nguyễn Thị Tâm [19] Các dòng lạc chịu hạn cũng đã được tạo ra bằng cách gây đột biến

Trang 10

thực nghiệm- tác giả Vũ Thị Thu Thủy [23] Chuyển gen là kỹ thuật cho phép đưa một hay một số gen nhất định nào đó vào hệ gen của cây chủ được quan tâm để tạo ra những cây trồng biến đổi gen nhằm cải thiện một số đặc tính hay tính trạng theo hướng có lợi cho con người Chuyển gen đang là hướng nghiên cứu có nhiều triển vọng, đã được tiến hành thực nghiệm trên nhiều giống cây trồng như: cà chua, lúa, ngô, đậu tương và được áp dụng ở nhiều nước trên thế giới Trong đó chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn

Agrobacterium tumefacines (A.tumefacines) tỏ ra ưu thế hơn cá kỹ thuật

chuyển gen khác do ít tốn kém, quy trình đơn giản, nhanh chóng, dễ áp dụng trên nhiều đối tượng cây trồng

Do hệ thống tái sinh cây thuốc lá tương đối đơn giản và thời gian phân hóa từ mô thành cây hoàn chỉnh khá ngắn nên trong những nghiên cứu về chuyển gen các nhà khoa học thường chọn cây thuốc lá làm cây mô hình

Xuất phát từ cơ sở trên chúng tôi đã lựa chọn và tiến hành nghiên cứu đề

tài: “Nghiên cứu tạo dòng thuốc lá (Nicotiana tabacum L.) mang gen

GmDREB2 phận lập từ cây đậu tương”

2 Mục tiêu nghiên cứu

Tạo được dòng thuốc lá chuyển gen mang gen GmDREB2 phân lập từ

cây đậu tương

3 Nội dung nghiên cứu

(1) Nghiên cứu tạo nguyên liệu biến nạp từ cây thuốc lá giống K326

(2) Nghiên cứu lây nhiễm A tumefaciens mang vector chuyển gen vào mảnh lá thuốc lá Tái sinh in vitro, chọn lọc và tạo các dòng cây thuốc lá chuyển gen

(3) Phân tích sự có mặt của gen chuyển trong các dòng cây chuyển gen ở thế hệ

T0 bằng kỹ thuật PCR

Trang 11

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cây thuốc lá và hệ thống tái sinh cây thuốc lá

1.1.1 Cây thuốc lá

Cây thuốc lá có tên khoa học là: Nicotiana tabacum L thuộc ngành hạt

kín, lớp 2 lá mầm, phân lớp Cúc, bộ Cà, họ Cà Họ này có trên dưới 85 chi với tổng số trên 1800 loài Một số loài trong họ này được trồng rộng rãi như khoai tây, cà chua, ớt và các loại cà, trong đó có chi Nicotiana

Hình 1.1 Cây thuốc lá giai đoạn trưởng thành và giai đoạn ra hoa

(Hình ảnh chụp tại vườn thực nghiệm khoa Sinh học trường ĐH Sư phạm)

Rễ thuốc lá là một hệ thống gồm rễ cái (rễ trục) và rễ nhánh (rễ bên) và rễ hấp phụ Ngoài ra thuốc lá còn có rễ bất định mọc ở cổ rễ, sát mặt đất Rễ trụ được hình thành từ trục của rễ cái, thường có độ xiên 30 – 40 độ Rễ hấp thu được phát triển trên các rễ nhánh Có nhiệm vụ cung cấp nước và các chất dinh dưỡng cho cây Rễ bất định mọc từ thân, những rễ bất định ở phần sát gốc dễ phát sinh thành rễ hút khi có độ ẩm không khí cao Rễ thuốc lá tập trung dày đặc

ở lớp đất 0 – 30 cm, phát triển theo các hướng [3]

Các dạng thuốc lá trồng có dạng thân đứng, tiết diện thân tròn, chiều cao thân cây có thể đạt từ 1 – 3m, chia làm nhiều đốt, mỗi đốt mang một lá Đường kính thân đạt 2 – 4 cm, nách lá trên thân có chồi sinh trưởng gọi là chồi nách

Có 2 loại chồi nách: Chồi nách chính và chồi nách phụ [3] Trên thân chính của

Trang 12

cây thuốc lá có nhiều lá Lá thuốc lá có các hình dạng chủ yếu là: hình trứng, hình tim, hình elip, hình mũi mác [3]

Hoa thuốc lá là hoa đơn, lưỡng tính, có năm cánh, nhị cái ở giữa, xung quanh có 5 nhị đực thường mọc cao hơn nhị cái Thuộc loại hoa tự hữu hạn, được hình thành do sự phân hóa đỉnh sinh trưởng thân Chính giữa chùm hoa có hoa trung tâm và có các nhánh hoa mọc từ trục chính của chùm hoa [3]

Quả thuốc lá được hình thành trên đài hoa Mỗi cây có 100 – 150 quả trên mỗi chùm hoa, có những cây hoặc những giống có tới 400 – 500 quả trên chùm hoa Mỗi quả có hai ngăn, khi chín chúng thường tách ra Hạt thuốc lá rất nhỏ, khối lượng 1000 hạt của các giống thuốc lá vàng sấy lò là 0,07 – 0,10 gam, trong mỗi gam hạt có từ 10000 đến 15000 hạt [3]

1.1.2 Hệ thống tái sinh và chuyển gen cây thuốc lá

Tất cả các tế bào của một cơ thể đều mang bộ máy thông tin di truyền giống nhau Do đó chúng có tiềm năng tổng hợp nên các protein giống nhau Các tế bào được lấy từ bất kỳ mô sống nào của cơ thể thực vật (bao phấn, đỉnh sinh trưởng, lá mầm, đoạn thân, rễ ) đều có thể được kích thích để tái sinh thành cây hoàn chỉnh đặc trưng cho loài, phát triển và ra hoa kết quả bình thường, thông qua phát sinh cơ quan hoặc hình thành phôi vô tính, miễn là chúng được nuôi cấy trong điều kiện dinh dưỡng thích hợp và bổ sung các chất kích thích sinh trưởng cần thiết [62] Các loại mô đã phân hóa tách từ cơ thể thực vật có khả năng tái sinh trực tiếp thành cây hoàn chỉnh, hoặc là chúng phát triển thành tế bào mô sẹo Đó là loại tế bào không phân hóa, phân chia liên tục

và có khả năng phân hóa thành phôi, chồi để tạo cây hoàn chỉnh Khả năng đó gọi là tính toàn năng của tế bào Tính toàn năng chính là cơ sở của kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào, là cơ sở của công nghệ tế bào thực vật đang ngày càng phát triển

và hoàn thiện

Các nhà khoa học đã phát hiện thấy 5 nhóm chất điều tiết sinh trưởng ở thực vật đó là auxin, cytokinin, ethylen, giberelin, axit absixic Những chất này

Trang 13

được phân thành các nhóm dựa vào tính tương đồng về cấu trúc và chức năng sinh lý, tuy nhiên về chức năng nhiều khi chúng có tác động chồng chéo và hỗ trợ nhau Còn một số nhóm khác điều khiển từng giai đoạn sinh trưởng nhất định Trong nuôi cấy mô tế bào người ta thường sử dụng ba nhóm chát điều tiết sinh trưởng là dẫn xuất của auxin, cytokinin và giberelin [24], [27]

Tái sinh cây được xem là khâu mấu chốt quyết định thành công trong nuôi cấy mô và chuyển gen ở thực vật Nguồn mẫu ban đầu dùng cho tái sinh cây rất đa dạng như : phôi hữu tính, lá non, lá mầm, phần trụ của lá mầm, đoạn thân Các mẫu này được sử dụng trong hệ thống tái sinh thông qua hai con đường: tái sinh trực tiếp hoặc qua giai đoạn mô sẹo và tái sinh thông qua hình thành phôi soma trên các môi trường thích hợp

Theo con đường thứ nhất, sự tái sinh chồi trực tiếp từ các mẫu vật như lá mầm, nách lá mầm, mảnh lá là một phương pháp có hiệu quả được sử dụng trong tái sinh và chuyển gen một số loài thực vật Giai đoạn cảm ứng tạo chồi

là giai đoạn quan trọng trong quá trình phát triển chồi trực tiếp từ nách lá mầm Môi trường cảm ứng tạo chồi ở thực vật thường sử dụng các chất kích thích sinh trưởng nhóm auxin và cytokinin như IBA, IAA, BAP Trong đó, BAP là kích thích sinh sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin được sử dụng nhiều trong môi trường cảm ứng tạo chồi ở thực vật [30], [72] Sự tái sinh thông qua giai đoạn mô sẹo thường bắt đầu từ các mẫu vật như phôi trục, lá non, đoạn thân Tuy nhiên, mô sẹo được tạo thành cho tỉ lệ đa chồi rất thấp thường là một hoặc hai chồi, điều này không có ý nghĩa trong chuyển gen

Con đường tái sinh thứ hai, chồi được tái sinh thông qua hình thành phôi soma Các phôi soma thường là sự biến đổi của khối mô sẹo, chúng có cấu trúc tương tự như phôi hữu tính Hệ thống tái sinh cây thông qua phôi soma được sử

dụng khá phổ biến trong nuôi cấy in vitro do khả năng tái sinh cây khá cao và

giảm được đáng kể hiện tượng khảm của cây chuyển gen [16]

Trang 14

Đối với cây thuốc lá, gen thường được chuyển thông qua trung gian A tumefaciens hoặc thông qua các phương pháp chuyển giao DNA trực tiếp như

xung điện hoặc bắn gen bằng vi đạn Trong lịch sử, cả hai phương pháp đã được sử dụng để chuyển DNA, tuy nhiên phương pháp chuyển gen qua trung

gian Agrobacterium được áp dụng rộng rãi hơn, thời gian tái sinh cây chuyển gen ngắn hơn, kết quả các locus gen chuyển từ việc nhiễm khuẩn A.tumefacines

ít phức tạp hơn so với việc được tạo ra bằng các phương pháp chuyển gen trực tiếp, do đó làm giảm nguy cơ tái sắp xếp gen chuyển và bất hoạt gen Do đó thuốc lá thường được chọn làm cây mô hình

Trên thế giới và ở Việt Nam đã có nhiều thành công trong chuyển gen

cây thuốc lá Gen cryIII được chuyển vào cây thuốc lá và cây khoai tây để kháng sâu Colorado potato beetle (leptiontarsa deeecemlineata) do Perlak và cs thực hiện năm 1993 [64] Liu và cs đã chuyển gen DREB4 vào cây thuốc lá

[57] Nguyễn Thị Thu Ngà (2014) sử dụng cây thuốc lá để chuyển gen mã hóa

nhân tố phiên mã NAC2 bằng phương pháp xung điện, thành công đã được

minh chứng bằng sự có mặt của protein do gen chuyển tạo ra bằng kĩ thuật lai Western [16] Nghiên cứu của Phạm Thị Vân và cs (2009) đã tạo cây thuốc lá chuyển gen kháng virus TMV bằng kĩ thuật RNAi [25] Gen kháng kanamycine cũng được chuyển thành công vào mô thuốc lá là nghiên cứu của Nguyễn Liên Chi và cs (1989) [3]

1.2 Tính chịu hạn và gen liên quan đến tính chịu hạn ở thực vật

1.2.1 Hạn và tác hại của hạn lên thực vật

Hạn là tình trạng mất nước ở cây nguyên nhân có thể do nhiều lý do: như

sự thiếu nước trong môi trường hay do nhiệt độ thấp, đốt nóng, nồng độ muối khoáng trong môi trường quá cao

Có ba hình thức hạn gặp ảnh hưởng đến cây trồng là hạn đất, hạn không khí và hạn tổ hợp [11]

Trang 15

Hạn đất xảy ra khi lượng nước trong đất thiếu nhiều không đủ cho rễ hút để cung cấp cho cây Vì thế, cây có thể bị héo và chết Tuy nhiên, cũng có những trường hợp đủ nước mà cây vẫn héo, nguyên nhân là do hạn sinh lý gây nên Hạn không khí thường xẩy ra khi không khí trong môi trường có nhiệt độ cao và độ

ẩm thấp, ví dụ như gió nóng Israel, gió Lào ở miền Trung nước ta làm cho cây thoát hơi nước quá mạnh, vượt xa mức bình thường và dẫn tới hiện tượng mất nước, do rễ hút vào không đủ bù lượng nước mất đi, làm các bộ phận non của

cây thiếu nước Hạn tổ hợp là sự phối hợp thiếu nước trong đất và không khí

Tác hại của hạn lên thực vật

Thiếu nước sẽ gây nên các hậu quả rất lớn đối với hoạt động sống của cây Trước tiên ảnh hưởng đến sự cân bằng nước của cây, từ đó ảnh hưởng đến các chức năng sinh lý khác như quang hợp, hô hấp, dinh dưỡng khoáng và cuối cùng là ảnh hưởng đến sự sinh trưởng phát triển của thực vật dẫn đến giảm năng suất

Khi gặp hạn trạng thái của chất nguyên sinh trong tế bào thay đổi mạnh, ảnh hưởng đến tính chất hóa lý của chất nguyên sinh như tính thấm, mức độ thủy hóa keo, thay đổi pH, độ nhớt, dẫn đến sự thay đổi vị trí các thành phần cấu tạo nên chất nguyên sinh, cuối cùng ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất bình thường của cơ thể [5] Trong thời gian cây bị hạn, hàm lượng nước tự do trong lá giảm xuống nhưng hàm lượng nước liên kết lại tăng lên Chất nguyên sinh của tế bào có tính đàn hồi lớn thì cây có khả năng chịu hạn cao [ 28]

Hạn còn ảnh hưởng đến hô hấp Trong thời gian khô hạn, ở những cây trung sinh thường tăng cường hô hấp Nhờ gia tăng hô hấp mà cây giữ được độ ngậm nước của keo nguyên sinh chất [5] Sự tăng cường quá trình thủy phân khi gặp điều kiện khô hạn là nguyên nhân tăng cường hô hấp trong cây Khi mất nước ban đầu hô hấp tăng, nhưng sau đó giảm đột ngột, nếu tình trạng thiếu nước kéo dài [28]

Trang 16

Thiếu nước ảnh hưởng đến quang hợp Hạn hán đã ảnh hưởng xấu đến quá trình hình thành diệp lục, phá hoại lạp thể nên hiệu suất quang hợp giảm xuống nhanh chóng [28]

Hạn ảnh hưởng đến hoạt động hút khoáng của hệ rễ, dẫn đến tình trạng thiếu những nguyên tố dinh dưỡng quan trọng trong quá trình trao đổi và tổng hợp các chất hữu cơ khác nhau trong cơ thể thực vật [5] Hạn ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình sinh trưởng các tế bào, đặc biệt là trong pha giãn của tế bào,

từ đó mà ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng của toàn cây [28]

1.2.2 Đặc tính chịu hạn của thực vật

Mỗi loài cây trồng có một ghới hạn nhất định đối với các nhân tố sinh thái của môi trường như: nhiệt độ, nước, phèn, độ mặn Hạn tác động lên cây theo hai hướng chính làm tăng nhiệt độ cây và gây mất nước trong cây Trong những nhân tố sinh thái của môi trường thì nước là một nhân tố ghới hạn quan trọng của cây trồng là sản phẩm khởi đầu, trung gian và cuối cùng của các quá trình chuyển hóa diễn ra trong cơ thể thực vật

Cơ sở sinh lý của tính chịu hạn

Nước có ý nghĩa quyết định đến đời sống của thực vật Thiếu nước cây sẽ chết non hoặc giảm sức sống, giảm năng suất Do sự thiếu nước của môi trường, nhiệt độ thấp hay cao có thể gây ra hiện tượng mất nước của cây Để đáp ứng sự thiếu hụt nước trong điều kiện cực đoan, cây bắt buộc phải có những cơ chế thích ứng đặc biệt giúp cây duy trì sự tồn tại khi bị hạn

Khi gặp hạn thực vật luôn có những biến đổi về mặt sinh lý, sinh hoá để nhằm không mất nước Có hai cơ chế bảo vệ để thực vật tồn tại trên môi trường thiếu nước đó là vai trò của bộ rễ và khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu Vai trò của bộ rễ: Những cây chịu hạn có bộ rễ khỏe, dài, mập, có sức xuyên sâu giúp cây hút được nước ở tầng đất sâu Bộ rễ lan rộng, có nhiều rễ phụ

và có nhiều mô thông khí, cùng với hệ mạch dẫn phát triển giúp cho việc thu

Trang 17

nhận và cung cấp nước tới các bộ phận khác của cây trong điều kiện khó khăn về nước Thực vật nói chung và cây đậu tương nói riêng khi ở giai đoạn cây non thường chịu tác động mạnh của hạn vì bộ rễ phát triển chưa đầy đủ còn yếu Khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu (ASTT): Là một đặc tính quan trọng của tế bào khi mất nước do nóng hạn Khi tế bào bị mất nước dần dần, các chất hòa tan sẽ được tích lũy trong tế bào chất (như: đường, axit hữu cơ, amino acid, các ion chủ yếu là ion K+ ), các chất này có tác dụng điều chỉnh

áp suất thẩm thấu Những thực vật tồn tại trên môi trường cân bằng về áp suất thẩm thấu đòi hỏi phải có khả năng chống lại điều kiện khắc nghiệt đó Trong điều kiện khô hạn ASTT được điều chỉnh tăng lên giúp cho tế bào thu nhận được những phân tử nước từ đất Bằng cơ chế như vậy thực vật có thể chịu được sự mất nước trong thời gian ngắn [11]

Ngoài ra, thực vật còn có khả năng chống chịu bằng những biến đổi về hình thái như lá cuộn lại thành ống, lá có nhiều lông, cutin dày để giảm thoát hơi nước [5]

Cơ sở sinh hóa và di truyền của tính chịu hạn

Khi phân tích thành phần hóa sinh của các cây chịu hạn, các nghiên cứu đều cho rằng, khi gặp hạn có hiện tượng tăng lên về hoạt độ enzyme, hàm lượng ABA, hàm lượng proline, nồng độ ion K+, các loại đường, axit hữu cơ, giảm CO2, protein và axit nucleic [2],[4],[13],[17]

Nghiên cứu sự đa dạng và hoạt động của enzyme trong điều kiện gây hạn

đã được nhiều tác giả quan tâm Trần Thị Phương Liên (1999) nghiên cứu đặc tính hóa sinh của một số giống đậu tương có khả năng chịu nóng, hạn đã nhận xét rằng áp suất thẩm thấu cao ảnh hưởng rõ rệt tới thành phần và hoạt độ protease, kìm hãm sự phân giải protein dự trữ [11] Một số nghiên cứu trên các đối tượng như lạc, lúa, đậu xanh, đậu tương cho thấy, có mối tương quan thuận giữa hàm lượng đường tan và hoạt độ α - amylase, giữa hàm lượng protein và hoạt độ protease [10],[16],[22] Đường tan là một trong những chất

Trang 18

tham gia điều chỉnh áp suất thẩm thấu trong tế bào Sự tăng hoạt độ α - amylase

sẽ làm tăng hàm lượng đường tan, do đó làm tăng áp suất thẩm thấu và tăng khả năng chịu hạn của cây trồng [14],[17]

Những thay đổi hóa sinh khác do hạn gây ra cũng đã được nhiều tác giả quan tâm nghiên cứu, trong đó có sự biến đổi hàm lượng proline Nghiên cứu khả năng chịu hạn của một số giông lúa cạn địa phương ở vùng núi phía Bắc, tác giả Chu Hoàng Mậu và cs đã nhận xét, khả năng chịu hạn của cây lúa cạn phụ thuộc tuyến tính vào hàm lượng proline [15] Xử lý bằng dung dịch sorbitol 5% đối với một số dòng lúa tái sinh từ mô sẹo chịu mất nước, tác giả Đinh Thị Phòng cho thấy, hàm lượng proline của các dòng chọn lọc khi bị xử

lý sorbitol tăng lên và vượt xa so với đối chứng [17]

1.2.3 Gen liên quan đến tính chịu hạn

Tính chịu hạn là tính trạng đa gen, được biểu hiện khác nhau trong các giai đoạn phát triển của cây Trên thực tế vẫn chưa tìm được gen thực sự quyết định tính chịu hạn mà mới chỉ tìm thấy các gen liên quan đến tính chịu hạn Có thể chia các gen liên quan đến tính chịu hạn làm hai nhóm: (1) Các gen liên quan đến khả năng chịu hạn của thực vật; (2) Nhóm gen mã hóa protein điều khiển hoạt động phiên mã của các gen liên quan đến tính chịu hạn

Nhóm thứ nhất, các gen liên quan đến khả năng chịu hạn tiếp tục được chia nhỏ thành các nhóm: (i) Các gen tham gia vào quá trình bảo vệ thành tế bào; (ii) Các gen tham gia vào quá trình tổng hợp các chất điều hòa áp suất thẩm thấu và (iii) Các gen liên quan đến sự phát triển bộ rễ Một số gen được

nghiên cứu nhiều trong những năm gần đây là: LEA, P5CS, NCED, PLD [32],[40],[46]

Gen LEA (Late Embryogenesis Abundant) là một trong những nhóm gen

liên quan tới sự mất nước của thực vật Bình thường, sản phẩm của gen LEA được tạo ra với lượng lớn trong giai đoạn muộn của quá trình hình thành phôi Khi tế bào bị mất nước protein LEA được tổng hợp nhiều hơn, mức độ phiên

Trang 19

mã của LEA được điều khiển bởi ABA Biểu hiện mạnh của gen LEA sẽ làm

giảm độ mất nước và tăng áp suất thẩm thấu trong tế bào [32], [45]

Nhóm gen P5CS mã hóa tổng hợp pyrroline 5 carboxylate synthetase Biểu hiện của gen P5CS mạnh sẽ làm tăng hàm lượng proline trong cây, theo

đó tăng áp suất thẩm thấu của tế bào và khả năng chống chịu với các yếu tố bất lợi của cây được cải thiện [8],

Gen NCED mã hóa tổng hợp 9 - cis epoxycarotenoid dioxygenase Theo

nghiên cứu của Guerrini và đtg (2005), sự bất lợi của điều kiện về hạn, muối làm cho gen điều khiển tổng hợp 9-cis epoxycarotenoid dioxygenase biểu hiện mạnh hơn Hoạt động của 9-cis epoxycarotenoid dioxygenase sẽ biến đổi neoxathin thành xathoxin, đây chính là giai đoạn trước khi hình thành ABA Do

đó, hoạt động của NCED được xác nhận có mối liên quan với khả năng chống chịu của thực vật [46]

Gen PLD mã hóa phospholipase D Hoạt động của phospholipase D

mạnh mẽ tạo một phân tử phospholipid và một gốc chứa nhóm hydroxyl tự do, hoạt động của các PLD được khẳng định có liên quan đến hạn [40],[48],[75]

Nhóm thứ hai, các gen mã hóa protein điều khiển phiên mã có khả năng hoạt hóa hoặc ức chế biểu hiện của các gen liên quan đến tính chịu hạn Cơ chế hoạt động thông qua việc bám vào trật tự DNA trên vùng khởi động gen (promoter) và tương tác với RNA polymerase tạo thành phức hợp khởi đầu quá trình phiên mã Nhóm gen mã hóa các yếu tố phiên mã chiếm khoảng 8 - 10% trong hệ gen mỗi loài và đóng vai trò quan trọng trong mọi hoạt động sống như quá trình sinh trưởng phát triển và chống chịu với bất lợi môi trường Các nhà khoa học đã xác định nhóm gen liên quan đến tham gia vào quá trình phiên mã

DREB, NAC, MYB [67], [73]

Trang 20

1.2.4.Các nhân tố phiên mã và gen DREB

Nhân tố phiên mã trong tế bào được kí hiệu là TF (transcription factor) Đặc điểm đặc trưng của các nhân tố phiên mã là có hai vùng hoạt động: (1) Vùng hoạt hoá các protein chức năng và (2) vùng liên kết với các trật tự DNA

đặc hiệu trên promoter TF là các protein có khả năng nhận biết các trình tự cis

– yếu tố điều hòa sự phiên mã đặc hiệu trên promoter và hoạt hóa sự phiên mã

Yếu tố cis chứa trình tự hộp GC là một trình tự dài 11 bp (5’-

C/AACACGTGGCA – 3’) nằm ở phía trước của rất nhiều gen mã hóa cho các tiểu đơn vị nhỏ của ribulose biphosphate carboxylase [39], [77] Các protein tham gia điều khiển biểu hiện gen có chức năng trong việc phản ứng với nhờ các tiết tấu trình tự có khả năng gắn với DNA như bZIP, MYB, MYC…

Vùng khởi động gen của hầu hết các gen liên quan đến tính chịu hạn thường chứa một hoặc nhiều trật tự DNA đặc hiệu Các trật DNA phổ biến là ABRE (ABA responsive element) và DRE/ CRT (Dehydration responsive element/ C repeat), NAC, MYB Trong điều kiện cực đoan, các nhân tố phiên

mã sẽ gắn với các trật tự trên và biểu hiện phụ thuộc hoặc không phụ thuộc vào nồng độ ABA [77]

Trong điều kiện biểu hiện của các nhân tố phiên mã phụ thuộc vào ABA, thì ABA được xem là chất có vai trò chủ yếu phối hợp với một hệ thống điều hòa cho phép thực vật đối phó với điều kiện thiếu nước Các nhân tố phiên mã phụ thuộc vào ABA được xác định gần đây gồm MYB, MYC, bZIP [40] Ở

Arabidopsis, MYB gồm nhiều loại và được kí hiệu là AtMYB Nghiên cứu của

Abe và cs (2008) xác định loại AtMYB2 nhận biết trình tự TGGTTAG trên

promoter để hoạt hóa gen rd22 trong điều kiện mất nước [29] Gen AtMYB60

biểu hiện trong tế bào khí khổng đã giúp thực vật vượt qua được tình trạng mất nước [12] MYC có thể nhận biết trình tự CAxxTG trên promoter (x là một nucleotit bất kì) [12] bZIP (nhân tố phiên mã AREB/ABF) có trình tự gắn đặc hiệu là ACGT [44]

Trang 21

Với các nhân tố phiên mã sự biểu hiện không phụ thuộc ABA, các nhân

tố được xác định gần đây phải kể đến như DRE, NAC Theo Ernst (2004) NAC liên kết với một đoạn gồm 21bp trong promoter 35S của virus khảm súp

lơ, trung tâm là hai đoạn CGTA và CGTC [42] Theo Trần và cs (2004), hai

đoạn trên được xem như các motif trung tâm của gen cảm ứng bởi hạn ERD1 (Early response to dehydration 1) ở Arabidopsis [73] DRE là tên của trình tự

dài 9 bp nằm trên promoter là TACCGACAT [36] Trong đó, vùng quan trọng nhất của tiết tấu trình tự DRE là vùng lặp lại giàu C là CCGAC Các yếu tố gắn với trình tự DRE được gọi là DREBs Nhân tố DREB chứa các vùng bảo thủ như các protein EREBP (ethylene responsive binding protein - tham gia biểu hiện ethylene) và AP2 (Apetala2 - tham gia vào quá trình biểu hiện ở thực vật

có hoa) Các protein này còn được ký hiệu là nhân tố gắn với CRT (CRT binding factor – CBF) Chúng phản ứng rất nhanh với trạng thái cực đoan, trước khi xuất hiện lượng ABA đáng kể [39]

DREB (Dehydration Responsive Binding protein) là họ gen tổng hợp

protein được tìm thấy trong thực vật khi gặp điều kiện bất lợi như hạn, mặn và

lạnh Các nhà khoa học cho rằng, DREB là nhân tố phiên mã tham gia tích cực

vào quá trình kích hoạt nhanh hoạt động của các gen tham gia chống lại các điều kiện bất lợi từ môi trường như hạn hán, mặn và lạnh Khi nghiên cứu cấu

trúc protein họ DREB đã cho thấy chúng có chứa vùng bảo thủ duy nhất để gắn

với trình tự DNA đặc hiệu là AP2/ERF Các miền AP2/ERF khá bảo thủ và có

khoảng 60 amino acid [36], [52] DREB đã được các nhà khoa học trên thế giới

quan tâm và nghiên cứu từ những năm 80 của thế kỷ XX, tập trung vào các giống cây trồng như hoa cúc [54], hướng dương [39], ngô [64], lúa [41]… và

đã thu được nhiều kết quả trong việc cải thiện khả năng chống chịu của thực vật trong điều kiện khắc nghiệt của môi trường Ngoài ra, các nhà khoa học Trung

Quốc, Đức, Pháp, Mỹ… đã nghiên cứu giải trình tự gen DREB trên các đối tượng cây trồng khác nhau như Arabidopsis [56], lúa mì [50], thuốc lá [57]…và

Trang 22

so sánh trình tự gen của các loài cây trồng với hoang dại thấy sự sai khác giữa chúng Từ đó, các nhà khoa học nghiên cứu tạo ra các giống cây trồng mới có khả năng chống chịu cao hơn nhờ phương pháp chuyển gen

Ở cây Arabidopsis, trên cơ sở số lượng và sự giống nhau của các miền

gắn vào DNA, 145 nhân tố phiên mã được phân thành 5 nhóm: AP2 (14 gen),

RAV (6 gen), DREB (56 gen), ERF (còn gọi là EREBP, 65 gen) và nhóm gen

khác (4 gen) Trên cơ sở tương tự và đặc tính cấu trúc của chuỗi amino acid, 10

họ gen DREB (kí hiệu từ DREB2 đến DREB11) được phân thành 5 nhóm, nhóm thứ nhất gồm DREB3, DREB4, DREB4 và DREB5; nhóm thứ hai gồm W5, DREB6, DREB7 và DREB1; nhóm thứ ba gồm DREB2 và DREB8; nhóm thứ tư gồm có DREB9 và DREB10; nhóm thứ năm gồm DREB11, ERF1 và ERF2 [56], [68] Hai gen DREB2A và DREB2B chỉ biểu hiện trong điều kiện

hạn và hoạt hoá các gen chức năng tham gia vào tính chịu hạn của thực vật

Tuy nhiên, biểu hiện của các gen DREB2A và DREB2B không làm tăng tính kháng hạn của các cây Arabidopsis chuyển gen, điều này chứng tỏ nhóm gen

này cần quá trình sửa đổi sau phiên mã ví dụ như qua quá trình phosphoryl hóa

để chuyển protein sang dạng hoạt hoá [49] Gen DREB2A được thay đổi cấu

trúc để loại bỏ 30 amino acid tương ứng với trật tự từ 136 đến 165 để tạo ra

dạng DREB2ACA Kết quả, sự biểu hiện của gen DREB2ACA giúp cây chuyển gen Arabidopsis tăng cường đáng kể tính chịu hạn Các phân tích sử dụng kỹ thuật DNA microarray và Northern blot đã chứng minh là gen DREB2ACA điều

khiển sự biểu hiện của rất nhiều gen chức năng tham gia vào tính kháng hạn ở thực vật [49], [56]

Ở lúa (Oryza sativa L.) gen DREB, kí hiệu là OsDREB, Dubouzet và cộng sự (2003), đã nghiên cứu phân lập 5 họ gen DREB: OsDREB1A, OsDREB1B, OsDREB1C, OsDREB1D và OsDREB2A Biểu hiện của OsDREB1A và OsDREB1B được gây ra bởi lạnh, còn biểu hiện của OsDREB2A được gây ra bởi hạn và muối cao Qua biểu hiện của OsDREB1A

Trang 23

trong Arabidopsis chuyển gen làm tăng khả năng chịu hạn, mặn và lạnh Các

phân tích sử dụng kỹ thuật ADN microarray và Northern blot đã chứng minh là

OsDREB1A rất hữu ích trong việc tạo cây một lá mầm biến đổi gen có khả năng chịu hạn hán, mặn và lạnh Gen OsDREB1A (được đăng kí trên Ngân

hàng gen Quốc tế với mã số AF300970) có chiều dài 909 nucleotide, gồm phần

mã hóa gen có chiều dài 720 nucleotide mã hóa 240 amino acid, phần không

mã hóa đầu 5’ có chiều dài 80 nucleotide và phần không mã hóa gen đầu 3’ có chiều dài 109 nucleotide [41]

Ở Ngô (Zea May), Quin và cộng sự (2007), đã phân lập gen ZmDREB2A có chiều dài 1283 bp gồm phần mã hóa gen có chiều dài 954 bp

mã hóa cho 318 amino acid, phần không mã hóa gen đầu 5’ có chiều dài 400 bp

và phần không mã hóa gen đầu 3’ có chiều 204 bp [66]

Diaz-Martin và cộng sự (2008), đã phân lập gen DREB2 từ mRNA của cây hướng dương (Helianthus annuus) và công bố trên ngân hàng gen quốc tế với

mã số AY508007 có kích thước 1301 bp, mã hóa cho 314 amino acid [39]

Javad và cộng sự (2009) đã phân lập 4 gen DREB từ mRNA đặc trưng của bốn giống lúa mì Alvand, Bayat, Darab1 và Shahi ở Iran và đã công bố

trình tự gen trên ngân hàng gen quốc tế với mã số lần lượt là FC556845, FC556846, FC556847, FC556850 có kích thước là 500 bp, với sự tương đồng

về trình tự gen của bốn giống này khá cao là 99% Nghiên cứu protein suy luận của các gen này, cho thấy, chúng có chứa vùng AP2 với ba chuỗi β – sheet và một đường xoắn ốc, gồm 57 amino acid bảo tồn vị trí valine thứ 14

và glutamic thứ 19 [50]

Liu và Feng (2008) đã phân lâ ̣p gen DREB4 từ mRNA ở cây thuốc lá

và đã công bố trình tự gen trên ngân hàng gen quốc tế với mã số EU727158 có

kích thước là 699 bp, mã hóa cho 232 amino acid, trong đó vùng AP2 chứa 59

amino acid [57] Các tác giả này cũng đã phân lập gen DREB2 từ mRNA ở cây

thuốc lá và công bố trình tự gen trên ngân hàng gen quốc tế với mã số

Trang 24

EU727156 có kích thước là 648 bp, mã hóa cho 215 amino acid, trong đó vùng AP2 chứa 59 amino acid [57]

Liu và cộng sự (2007) đã nghiên cứu gen DREB2 ở cây hoa cúc (Dendranthema vestitum, kí hiệu DvDREB2A) DvDREB2A được phân lập có

chứa một khung đọc mở (open reading frame - ORF) dài 1471 bp mã hóa 366

amino acid và được xếp vào phân họ DREB2 dựa trên sự liên kết nhiều trình tự

Trong đó, trình tự protein điển hình chứa AP2/EREBP với các điểm gắn DNA gần khu vực đầu N Trong một phân tích, protein DvDREB2A đã bị ràng buộc bởi yếu tố DRE (AGCCGAC) và kích hoạt sự biểu hiện của HIS3 và giải

phóng lacZ Các thí nghiệm cho thấy mức độ biểu hiện của DvDREB2A đã bị

ảnh hưởng đáng kể bởi nhiệt độ, hạn hán, độ mặn cao Như vậy, gen

DvDREB2A là một yếu tố mới của các yếu tố phiên mã DREB, có thể đóng một

vai trò quan trọng trong việc tăng khả năng chịu áp lực môi trường [54]

Nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu ở cây đậu tương về protein DREB và

thu được thành quả nhất định cho khoa học như: Liu và cộng sự (2005) đã nghiên

cứu phân lập gen DREB3 từ mRNA ở cây đậu tương với kích thước 819 bp, mã

hóa cho 272 amino acid, trong đó vùng AP2 chứa 60 amino acid và được công bố trình tự gen trên Ngân hàng gen Quốc tế với mã số DQ055133 [55]

Chen và cộng sự (2007) đã nghiên cứu phân lập gen DREB5 từ mRNA ở

cây đậu tương với kích thước là 927 bp [36]; Cao và cộng sự (2008), phân lập

và nhận dạng GmGβ1 liên quan tới protein GmDREB5 trong đậu tương [33]

Li và cộng sự đã phân lập ba gen DREB (GmDREBa, GmDREBb và GmDREBc) từ cây đậu tương và cho rằng mỗi phân tử protein của các gen này

chứa một miền AP2 gồm 64 amino acid [52] Thực nghiệm đã chứng minh cả 3 protein này đều liên quan đến sự mất nước và đáp ứng sự mất nước của tế bào

Ở nấm men, GmDREBa và GmDREBb có khả năng kích hoạt quá trình phiên

mã còn GmDREBc lại không có khả năng này Các protein GmDREBa và

Trang 25

GmDREBb trong lá của cây đậu tương được tổng hợp bởi tác động của muối,

hạn, mặn và lạnh

Năm 2009, nhóm tác giả Charlson và cộng sự nghiên cứu phân lập gen

DREB1 ở đậu tương từ DNA tổng số có kích thước là 705 bp với mã số

FJ965342 trên Ngân hàng gen Quốc tế [38], [35]

Ở Việt Nam, Nguyễn Vũ Thanh Thanh và cộng sự, (2008), đã nghiên

cứu phân lập gen DREB1 ở đậu tương từ DNA tổng số có kích thước 705 bp

với mã số đăng kí trên Ngân hàng gen Quốc tế HE647689 [65]

Tsui-Hung Phang và cộng sự, (2008), đã tổng kết phân họ DREB ở đậu tương bao gồm các gen biểu hiện không phụ thuộc vào ABA là GmDREBa, GmDREBb, GmDREBc, GmDREB1, GmDREB2, GmDREB3, GmDREB5, GmDREB6, GmDREB7 [69]

Như vậy nhóm gen DREB có nhiều chủng loại, kích thước khác nhau, tham gia vào quá trình chịu hạn của thực vật Trong đó, có nhóm DREB2 là nhóm tham gia tích cực vào việc chống hạn Gen DREB2 được biểu hiện trong

môi trường có xử lý bởi hạn hán, nồng độ muối cao, nhiệt độ thấp

Nakashima và cs đã xác định được ở cây Arabidopsis gen DREB2 có liên

quan đến sự mất nước và độ mặn cao trong biểu hiện gen Trong cây Arabidopsis, gen biểu hiện bởi nhân tố phiên mã DRE/CRT là DREB2A và DREB2B Khi phân tích thấy rằng, cả hai gen này được biểu hiện bởi sự mất nước và độ mặn cao Mức độ biểu hiện của hai gen rất cao ở rễ trong điều kiện nồng độ muối cao và biểu hiện ở thân, rễ khi cây bị mất nước Gen DREB2A nằm trên NST số 5 và DREB2B nằm trên NST số 3 cả hai gen bị gián đoạn bởi một intron duy nhất tại các vị trí giống hệt nhau [63]

Khi nghiên cứu về tính đa dạng di truyền trong điều kiện khô hạn của một nhóm đậu tương hoang dã được tìm thấy dọc theo dãy núi Andes ở Nam Mĩ và

Trang 26

khu vực Trung Mĩ, Cortes và cs (2012) cho rằng mức độ đa dạng nucleotide khi

gặp điều kiện khô hạn của DREB2A cao hơn DREB2B [34]

Xiaoshuang Li và cs ( 2014 ) đã nghiên cứu EsDREB2B trong nhóm gen DREB2 ở 1 nhóm cây họ đậu và thấy rằng EsDREB2B mã hóa cho các polypeptide DREB2 Sự biến đổi gen quá mức và EsDREB2B làm tăng khả năng chịu nhiều stress phi sinh học trong cây EsDREB2B là một gen khả năng trong DREB2 có thể ảnh hưởng đến phản ứng sinh lý và sinh hóa của thực vật

khi gặp điều kiện ngoại cảnh bất lợi [78]

Chen và cs (2007) đã phân lập gen GmDREB2 từ cây đậu tương và dựa trên sự giống nhau về miền AP2, gen GmDERB2 xếp vào phân họ A5 trong gen GmDREB2 nhóm gen DREB2 Sự biểu hiện của gen GmDREB2 trong môi

trường có xử lý bởi hạn hán, nồng độ muối cao, nhiệt độ thấp và AB [36]

Trên Ngân hàng gen Quốc tế (NCBI) trình tự gen GmDREB2 ở cây đậu

tương đã được công bố bởi các tác giả: Chen và cs (2007), Wang và cs (2005)

Theo Chen và cộng sự (2007), nghiên cứu mối quan hệ giữa GmDREB2 và các gen DREB khác sử dụng phần mềm SMART [75], trình tự amino acid suy diễn của protein GmDREB2 so với sáu protein DREB của đậu tương thì có sự tương

đồng với vị trí valine thứ 14 và axit glutamic ở vị trí thứ 19 trong vùng AP2

Trong đó, GmDREB2 có sự liên quan chặt chẽ với gen GmDREB1 (có mã số

trên Ngân hàng gen là AF514908) với 64% sự giống nhau về trình tự amino

acid Dựa trên cấu trúc gen GmDREB2 do Chen và cộng sự công bố năm 2007, cho thấy gen GmDREB2 phân lập từ mRNA của cây đậu tương có trình tự gồm

480 nucleotide, mã hóa cho 159 amino acid, với mã số đăng kí trên Ngân hàng gen Quốc tế là DQ054363 [36] Thông tin trên, là cơ sở cho việc nghiên cứu

cấu trúc gen GmDREB2 ở đậu tương

1.3 Phương pháp tạo cây trồng chuyển gen

Kỹ thuật chuyển gen là kỹ thuật đưa một hay nhiều gen lạ đã được thiết kế

ở dạng DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ của cây trồng nói riêng và của các sinh

Trang 27

vật nói chung (vi sinh vật, động vật) làm cho gen lạ có thể tồn tại ở dạng plasmid tái tổ hợp hoặc gắn vào bộ gen tế bào chủ Trong tế bào chủ các gen này hoạt động tổng hợp nên các protein đặc trưng dẫn tới việc xuất hiện các đặc tính mới của cơ thể chuyển gen [1],[20] Có hai nhóm phương pháp dùng để chuyển gen vào thực vật: đó là phương pháp chuyển trực tiếp và phương pháp chuyển gián tiếp

Phương pháp chuyển gen trực tiếp, gen được chuyển trực tiếp vào tế bào thực vật với sự giúp đỡ của các phương tiện hóa học hay vật lí Có thể

kể đến các phương pháp như: phương pháp chuyển gen nhờ kĩ thuật xung điện; phương pháp chuyển gen bằng vi tiêm; phương pháp chuyển gen trực tiếp qua ống phấn; nhờ súng bắn gen

Phương pháp bắn gen là phương pháp sử dụng các hạt kim loại nặng được bao bọc bởi DNA và chuyển vào mô tế bào nhờ súng bắn gen Ưu điểm của phương pháp này là thao tác dễ dàng, biến nạp gen vào được nhiều tế bào, nguyên liệu đa dạng, hạt phấn, tế bào nuôi cấy, tế bào của các mô biệt hóa và

mô phân sinh Phôi soma được sử dụng như vật liệu đích đối với kỹ thuật

chuyển gen nhờ vi khuẩn A.tumefacines cũng là vật liệu sử dụng tốt cho kỹ

thuật chuyển gen bằng súng bắn [61],[70] Ở cây đậu tương, sử dụng súng bắn gen để biến nạp gen vào phôi sau khi phôi được tạo thành 7 tuần [51]

Chuyển gen bằng xung điện là phương pháp sử dụng xung điện trong thời gian ngắn để tạo ra các lỗ trên màng tế bào trần làm cho DNA có thể xâm nhập

vào bên trong tế bào Ưu điểm phương pháp này có thể thực hiện với các mô in vivo còn nguyên vẹn Đoạn DNA ngoại lai được biến nạp có kích thước lớn [21]

Với kỹ thuật chuyển gen qua ống phấn, DNA ngoại lai theo đường ống phấn chui vào bầu nhụy Thời gian chuyển gen là lúc hạt phấn mọc qua vòi nhụy và đưa tinh vào thụ tinh Thời điểm chuyển gen tốt nhất xảy ra khi quá trình thụ tinh ở noãn và cho tế bào hợp tử phân chia Như vậy sự chuyển gen chỉ xẩy ra ở một tế bào cái duy nhất [21]

Trang 28

Ngoài các phương pháp chuyển gen trực tiếp ở thực vật còn có phương pháp chuyển gen gián tiếp thông qua virus hoặc vi khuẩn Những vi khuẩn thực hiện quá trình chuyển gen vào tế bào thực vật thông qua các cơ chế rất tự nhiên Quy trình chuyển gen gián tiếp ở thực vật bao gồm những bước chính sau: (1) Xác định thông tin về gen liên quan đến đặc tính quan tâm; (2) Phân lập gen; (3) Thiết kế vector chuyển gen; (4) Tạo vi khuẩn mang cấu trúc gen chuyển; (5) Biến nạp cấu trúc gen chuyển vào mô hoặc tế bào thực vật; (6) Chọn lọc các thẻ biến nạp; (7) Tái sinh cây biến nạp; (8) Phân tích cây chuyển gen [60]

Một trong những phương pháp chuyển gen gián tiếp ở thực vật được sử dụng, nghiên cứu và ứng dụng khá phổ biến là phương pháp chuyển gen thông

qua loài vi khuẩn đất A.tumefacines

Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium được nghiên cứu từ những năm 1960- 1970 Việc phát kiến ra Agrobacterium có khả năng chuyển gen vào thực

vật vào đầu năm 1980 đã biến loài này trở thành một trong những công cụ quan trọng nhất của công nghệ sinh học thực vật với những ưu điểm nổi trội: số bản sao của gen biến nạp được chuyển vào tế bào thực vật thấp (khoảng 1-2 gen) trong khi sử dụng súng bắn gen là nhiều hơn, do vậy, giảm tối thiểu sự không biểu hiện của gen được chuyển, tăng khả năng chuyển gen bền vững, hiệu quả chuyển gen cao, tránh được sự hình thành của các cây chuyển gen khảm, kỹ thuật đơn giản, dễ thực hiện, không đòi hỏi thiết bị đắt tiền [21]

Agrobacterium là một vi khuẩn đất gram (-) gây bệnh khối u ở thực vật và

có khả năng lây nhiễm một cách tự nhiên từ loài thực vật này sang loài thực vật khác [7] Trong tự nhiên, ở vùng cổ rễ các loài thực vật hai lá mầm thường gặp một số loại khối u gồm các tế bào không phân hóa và phát triển có tổ chức Những tế bào trong tế bào khối u này mất khả năng phân cực và phân chia liên tục giống như tế bào ung thư ác tính ở động vật Theo cơ chế hình thành, người

ta phân biệt hai loại khối u chính: khối u di truyền và khối u cảm ứng

Trang 29

Loại khối u cảm ứng được biết đến nhiều nhất là mụn cây do vi khuẩn

A.tumefaciens gây nên [21] A.tumefacines là chi vi khuẩn gram (-) bao gồm các loài gây bệnh kí sinh và vi sinh vật sống trong đất A.tumefacines là loại vi

khuẩn đất có khả năng chèn gen của mình vào tế bào thực vật chủ và sau đó sử dụng bộ máy của sinh vật chủ để biểu hiện các gen này dưới dạng hợp chất

dinh dưỡng cho chúng A.tumefacines sẽ tạo ra những nốt sần ở cây (bệnh mụn

cây - crown gall diease)

Cơ chế hình thành loại khối u cảm ứng này được nghiên cứu từ nhiều năm

nay và mang lại nhiều thành tựu quan trọng trong chuyển gen thực vật A tumefaciens được sử dụng như một hệ thống trung gian hữu hiệu để chuyển gen vào nhiều loài nấm, chẳng hạn như A awamori, A fumigatus, Penecillium digitatums [59]

Đến nay người ta đã khám phá được bản chất phân tử của quá trình cảm

ứng phát sinh khối u do vi khuẩn A tumefaciens gây ra ở thực vật Trước hết là

quá trình nhiễm khuẩn ở vùng tế bào của cây bị thương Các tế bào bị thương

tiết ra những hợp chất polyphenol thu hút các tế bào vi khuẩn A tumefaciens

Tuy nhiên, vi khuẩn không thâm nhập vào tế bào thực vật mà chỉ chuyển gen vào chúng một đoạn DNA nhỏ (T – DNA: tranferred DNA) nằm trên một loại plasmid đặc biệt và gây nên trình trạng phát sinh khối u Plasmid đặc biệt là Ti plasmid (tumor inducing) T – DNA sẽ tạo ra khối u thực vật và sự phát triển

của khối u sau đó sẽ không phụ thuộc vào sự có mặt của vi khuẩn A tumefaciens [21]

Ti- plasmid là một phân tử DNA vòng tương đối lớn, kích thước khoảng

150 kb – 200 kb (Hình 1.2) Tuy nhiên chỉ một đoạn 2 kb – 3 kb có khả năng thâm nhập vào genome của tế bào chủ Đó là đoạn T–DNA [58] T–DNA được xác định bởi trình tự ở hai đầu khoảng 25 bp gọi là vùng biên (T – DNA borders), phần còn lại ngoài vùng biên sẽ không có chức năng gì trong quá trình chuyển gen [20]

Trang 30

Hình 1.2 Cấu trúc Ti - Plasmid (Nguồn : http://www.biotech.ubc)

Trên T – DNA có các gen tạo khối u Gen tạo khối u sau khi gắn vào hệ gen của tế bào chủ sẽ tham gia quá trình sinh tổng hợp auxin và cytokinin Đây

là các hợp chất gây nên sự phân chia tế bào liên tục và dẫn đến hình thành các khối u [43] Nhờ đặc điểm này, người ta có thể loại bỏ khả năng gây hại của T – DNA bằng cách thay các gen tạo khối u (oncogenes) nằm trong 2 đầu vùng biên bằng các gen mong muốn Khi các gen tạo khối u bị loại bỏ, tế bào hoặc

mô thực vật chuyển gen sẽ phát triển bình thường Gen tổng hợp opine cần thiết

để tổng hợp opine Hợp chất này không được tổng hợp trong A tumefaciens mà

chỉ được tổng hợp trong tế bào chủ vì gen điều khiển sự biểu hiện của gen sinh tổng hợp opine chỉ hoạt động trong tế bào nhân chuẩn Bằng cách này, vi khuẩn cảm ứng tế bào chủ tạo ra năng lượng và nguồn nitơ cần thiết cho chúng [1]

Ngoài ra, Ti plasmid còn gồm 2 hệ gen: hệ gen gây độc vir và hệ gen sinh tổng hợp opine Vùng gen độc vir nằm trên Ti plasmid gồm nhiều gen độc khác

Trang 31

nhau cùng tham gia quá trình vận chuyển T – DNA [20] Khi xâm nhiễm vào tế

bào vật chủ, các gen gây độc vir được biểu hiện, chuyển T – DNA sang tế bào

chủ và khối u được tạo thành do sự hình thành auxin và cytokinin Đây là các chất gây nên sự phân chia tế bào liên tục [21], dẫn đến thay đổi sự cân bằng hormon thực và hình thành các khối u Tỷ lệ auxin so với cytokin tạo ra từ các

gen vir sẽ quyết định hình thái khối u Bên cạnh những gen chức năng, Ti

plasmid gồm gen sinh tổng hợp amino acid hiếm, ví dụ: Một loại u tạo octopine

và loại khác tạo nopanine, vì vậy người ta phân biệt 2 loại Ti plasmid là loại nopalin và loại octopine Trình tự nucleotid của chúng chỉ khác nhau ở trình tự gen mã hóa các enzyme tham gia sinh tổng hợp nopalin và octopin [21]

Quá trình chuyển nạp của vi khuẩn A tumefaciens

A tumefaciens chủ yếu lây nhiễm thực vật qua các vết thương Thực vật bị

thương sẽ sản sinh ra hợp chất amino acid, trong đó đường và axit vô cơ là những yếu tố thu hút vi khuẩn xâm nhiễm bằng cách hóa hướng động

Hình 1.3 Mô hình chuyển gen gián tiếp nhờ A tumefaciens [47]

Định dạng
Số trang	62
Dung lượng	1,21 MB