Nghiên cứu đặc điểm và chuyển gen GmDREB2 nhằm cải thiện tính chịu hạn của cây đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) (LA tiến sĩ)

Nghiên cứu đặc điểm và chuyển gen GmDREB2 nhằm cải thiện tính chịu hạn của cây đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) (LA tiến sĩ) (LA tiến sĩ)Nghiên cứu đặc điểm và chuyển gen GmDREB2 nhằm cải thiện tính chịu hạn của cây đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) (LA tiến sĩ) (LA tiến sĩ)Nghiên cứu đặc điểm và chuyển gen GmDREB2 nhằm cải thiện tính chịu hạn của cây đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) (LA tiến sĩ) (LA tiến sĩ)Nghiên cứu đặc điểm và chuyển gen GmDREB2 nhằm cải thiện tính chịu hạn của cây đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) (LA tiến sĩ) (LA tiến sĩ)Nghiên cứu đặc điểm và chuyển gen GmDREB2 nhằm cải thiện tính chịu hạn của cây đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) (LA tiến sĩ) (LA tiến sĩ)Nghiên cứu đặc điểm và chuyển gen GmDREB2 nhằm cải thiện tính chịu hạn của cây đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) (LA tiến sĩ) (LA tiến sĩ)Nghiên cứu đặc điểm và chuyển gen GmDREB2 nhằm cải thiện tính chịu hạn của cây đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) (LA tiến sĩ) (LA tiến sĩ)Nghiên cứu đặc điểm và chuyển gen GmDREB2 nhằm cải thiện tính chịu hạn của cây đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) (LA tiến sĩ) (LA tiến sĩ)Nghiên cứu đặc điểm và chuyển gen GmDREB2 nhằm cải thiện tính chịu hạn của cây đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) (LA tiến sĩ) (LA tiến sĩ)Nghiên cứu đặc điểm và chuyển gen GmDREB2 nhằm cải thiện tính chịu hạn của cây đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) (LA tiến sĩ) (LA tiến sĩ)Nghiên cứu đặc điểm và chuyển gen GmDREB2 nhằm cải thiện tính chịu hạn của cây đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) (LA tiến sĩ) (LA tiến sĩ)Nghiên cứu đặc điểm và chuyển gen GmDREB2 nhằm cải thiện tính chịu hạn của cây đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) (LA tiến sĩ) (LA tiến sĩ)Nghiên cứu đặc điểm và chuyển gen GmDREB2 nhằm cải thiện tính chịu hạn của cây đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) (LA tiến sĩ) (LA tiến sĩ)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

ĐÀO XUÂN TÂN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM VÀ CHUYỂN GEN GmDREB2

NHẰM CẢI THIỆN TÍNH CHỊU HẠN CỦA

CÂY ĐẬU TƯƠNG (Glycine max (L.) Merrill)

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2017

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

ĐÀO XUÂN TÂN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM VÀ CHUYỂN GEN GmDREB2

NHẰM CẢI THIỆN TÍNH CHỊU HẠN CỦA

CÂY ĐẬU TƯƠNG (Glycine max (L.) Merrill)

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 62 42 01 21

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1 GS.TS Chu Hoàng Mậu

2 PGS.TS Lê Văn Sơn

THÁI NGUYÊN - 2017

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn của GS.TS Chu Hoàng Mậu (Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên)

và PGS.TS Lê Văn Sơn (Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học

và Công nghệ Việt Nam). Các kết quả được trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được công bố trong các Tạp chí Khoa học và Công nghệ trong, ngoài nước, phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác Tất cả các nội dung trích dẫn trong luận án đều ghi rõ nguồn gốc

Thái Nguyên, tháng 02 năm 2017

TÁC GIẢ

Đào Xuân Tân

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến GS.TS Chu Hoàng Mậu, PGS.TS

Lê Văn Sơn đã tận tình hướng dẫn tôi trong suốt quá trình nghiên cứu, thực hiện

đề tài luận án

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, cán bộ Bộ môn Sinh học hiện đại và Giáo dục Sinh học thuộc Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm, Đại học Thái Nguyên đã giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành đề tài luận án

Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ của Phòng Công nghệ ADN ứng dụng và Phòng Công nghệ Tế bào thực vật thuộc Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành đề tài luận án

Tôi xin cảm ơn các thầy cô giáo, cán bộ của Khoa Sinh học và cán bộ Phòng Đào tạo thuộc Trường Đại học Sư phạm, Đại học Thái Nguyên đã giúp đỡ

và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành khoá học này

Tôi xin cảm ơn lãnh đạo Sở Giáo dục và Đào tạo Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành khoá học và công tác

Tôi xin cảm ơn những người thân trong gia đình, đồng chí, đồng nghiệp, bạn bè luôn quan tâm, động viên tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án./

Thái Nguyên, tháng 02 năm 2017

TÁC GIẢ

Đào Xuân Tân

MỤC LỤC

Trang

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục những chữ viết tắt trong luận án iv

Danh mục bảng trong luận án v

Danh mục hình trong luận án vi

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 3

3 Nội dung nghiên cứu 3

4 Những đóng góp mới của luận án 3

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài luận án 4

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 6

1.1 CƠ CHẾ PHÂN TỬ CỦA ĐẶC TÍNH CHỊU HẠN Ở THỰC VẬT 6

1.1.1 Cơ chế chịu hạn của thực vật 6

1.1.2 Họ nhân tố phiên mã AP2 8

1.1.3 Cơ chế tác động của một số nhân tố phiên mã đối với các phản ứng stress phi sinh học ở thực vật .

14 1.2 NHÂN TỐ PHIÊN MÃ VÀ TĂNG CƯỜNG KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA THỰC VẬT

21 1.2.1 Nâng cao khả năng chống chịu các stress bằng kỹ thuật biểu hiện mạnh nhân tố phiên mã DREB ở thực vật .

21 1.2.2 Hiệu quả đa hiệu trong cây chuyển gen 25

1.2.3 Nghiên cứu điều khiển hoạt động của nhân tố phiên mã trong cải tiến giống cây trồng .

26

1.3 ỨNG DỤNG KỸ THUẬT CHUYỂN GEN TRONG CẢI THIỆN KHẢ

NĂNG CHỊU HẠN CỦA CÂY ĐẬU TƯƠNG

28 1.3.1 Cây đậu tương và tác động của hạn đối với cây đậu tương 28

1.3.2 Nghiên cứu chuyển gen ở cây đậu tương 31

1.3.3 Tiềm năng ứng dụng kỹ thuật chuyển gen trong tạo giống đậu tương chịu hạn .

34 Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37

2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 37

2.1.1 Vật liệu thực vật 37

2.1.2 Các chủng vi khuẩn và các loại vector 40

2.1.3 Các loại mồi sử dụng trong nghiên cứu 40

2.2 HOÁ CHẤT, THIẾT BỊ VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 41

2.2.1 Hóa chất, thiết bị nghiên cứu 41

2.2.2 Địa điểm nghiên cứu và hoàn thiện luận án 41

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 42

2.3.1 Phương pháp phân lập, tách dòng và xác định trình tự gen GmDREB2 42

2.3.2 Phương pháp thiết kế vector chuyển gen thực vật mang gen GmDREB2 46

2.3.3 Phương pháp tạo cây chuyển gen thông qua vi khuẩn A.tumefaciens 51

2.3.4 Nhóm các phương pháp phân tích cây chuyển gen 55

2.3.5 Các phương pháp phân tích, xử lý số liệu 57

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 58

3.1 ĐẶC ĐIỂM CỦA GEN GmDREB2 PHÂN LẬP TỪ CÂY ĐẬU TƯƠNG 58

3.1.1 Tách dòng, xác định trình tự gen GmDREB2 từ một số giống đậu tương 58

3.1.2 Sự đa dạng của gen GmDREB2 phân lập từ cây đậu tương 66

3.2 THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN THỰC VẬT MANG GEN GmDREB2

70 3.2.1 Đặc điểm của vector chuyển gen mang cấu trúc chứa gen GmDREB2 70

3.2.2 Tạo vi khuẩn A tumefacien tái tổ hợp 75

3.3 CHUYỂN GEN VÀ PHÂN TÍCH SỰ BIỂU HIỆN CỦA GEN GmDREB2

TRÊN CÂY THUỐC LÁ .

76 3.3.1 Kết quả chuyển cấu trúc mang gen GmDREB2 vào cây thuốc lá thông qua A.tumefaciens

76 3.3.2 Phân tích sự biểu hiện của protein tái tổ hợp GmDREB2 trên cây thuốc lá chuyển gen ở thế hệ T0

79 3.3.3 Hàm lượng prolin trong các cây thuốc lá chuyển gen 80

3.4 KẾT QUẢ CHUYỂN GEN GmDREB2 VÀ TẠO CÂY ĐẬU TƯƠNG CHUYỂN GEN TỪ GIỐNG DT84 82

3.4.1 Tái sinh in vitro và chuyển cấu trúc chứa gen chuyển GmDREB2 vào giống đậu tương DT84 qua A tumefaciens

83 3.4.2 Xác định sự có mặt của gen chuyển GmDREB2 trong hệ gen của các cây đậu tương được chuyển gen ở thế hệ T 0 86

3.4.3 Phân tích sự biểu hiện của protein tái tổ hợp GmDREB2 trên cây đậu tương chuyển gen

89 Chương 4 THẢO LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 92

4.1 Về kết quả phân lập gen GmDREB2 93

4.2 Về kết quả phân tích biểu hiện chức năng của gen GmDREB2 96

4.3 Về kết quả chuyển gen và phân tích cây đậu tương chuyển gen 98

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 101

CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 102

TÀI LIỆU THAM KHẢO 104

DANH MỤC CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN ÁN

ABRE ABA-responsive element Yếu tố cảm ứng ABA

CCM Cocultivation medium Môi trường đồng nuôi cấy

CRT C-repeat responsive element Yếu tố đáp ứng C-repeat

DRE Dehydration responsive element Yếu tố có liên quan tới sự mất

ELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent

EST Expressed Sequence Tag Trình tự đánh dấu biểu hiện

ERF Ethylene-responsive element binding

GFP Green Fluorescene Protein Protein huỳnh quang xanh

GM Germination Medium Môi trường nảy mầm

Responsive Element Binding gene

Gen DREB2 - Gen thuộc phân

họ DREB ở cây đậu tương

β-Glucuronidace

nuôi cấy vi khuẩn

MS Murashige và Skoog, 1962 Tên một loại môi trường dinh

dưỡng cơ bản nuôi cấy mô

PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp

QTL Quantitative trait locus Locus quy định tính trạng số

lượng

liên quan đến ABI3/VP1

RT-PCR Reverse Transcription Polymerase

Chain Reaction

Phản ứng chuỗi trùng hợp - phiên mã ngược

SEM Shoot Elongation Medium Môi trường kéo dài chồi

SIM Shoot Induction Medium Môi trường tạo đa chồi

thực vật

Ti-plasmid Tumor inducing - plasmid Plasmid gây khối u

DANH MỤC BẢNG TRONG LUẬN ÁN

Trang

Bảng 1.1 Các gen mã hóa nhân tố phiên mã được sử dụng trong kỹ thuật

chuyển gen nhằm tăng cường khả năng chịu hạn của thực vật 23

Bảng 2.1 Thống kê một số giống đậu tương sử dụng làm vật liệu nghiên cứu 38

Bảng 2.2 Trình tự nucleotide của các cặp mồi PCR 41

Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR với Master Mix 44

Bảng 2.4 Thành phần phản ứng gắn gen GmDREB2 vào vector tách dòng 45

Bảng 2.5 Thành phần môi trường nuôi cấy vi khuẩn 45

Bảng 2.6 Thành phần phản ứng cắt plasmid bằng NotI, NcoI 47

Bảng 2.7 Thành phần phản ứng cắt plasmid bằng HindIII 48

Bảng 2.8 Thành phần môi trường tái sinh cây thuốc lá 52

Bảng 2.9 Môi trường tái sinh cây đối với giống đậu tương DT84 54

Bảng 3.1 Các vị trí sai khác trong trình tự nucleotide của gen GmDREB2 giữa các giống đậu tương 62

Bảng 3.2 Các vị trí sai khác trong trình tự amino acid suy diễn từ gen GmDREB2 giữa các giống đậu tương 64

Bảng 3.3 Các vị trí amino acid sai khác ở miền AP2 của protein DREB2 giữa các giống đậu tương nghiên cứu 65

Bảng 3.4 Các trình tự gen GmDREB2 phân lập từ các giống đậu tương Việt Nam và các trình tự gen mang mã số trên Ngân hàng Gen được sử dụng phân tích 67 Bảng 3.5 Hệ số tương đồng và hệ số phân ly của các giống đậu tương dựa trên trình tự nucleotide của gen GmDREB2 68

Bảng 3.6 Hệ số tương đồng và hệ số phân ly của các giống đậu tương dựa trên trình tự amino acid suy diễn của gen GmDREB2 69

Bảng 3.7 Kết quả biến nạp cấu trúc pBI121/35S-GmDREB2-cmyc vào cây thuốc lá 77

Bảng 3.8 Hàm lượng prolin của các cây thuốc lá chuyển gen và đối chứng sau

5 ngày, 9 ngày stress hạn ( = 0,001) 81

Bảng 3.9 Kết quả chuyển cấu trúc chứa gen GmDREB2 vào giống đậu tương

DT84 85

Bảng 3.10 Hiệu suất chuyển gen GmDREB2 vào giống đậu tương DT84 ở

thế hệ T 0 ở các giai đoạn phân tích 88

DANH MỤC HÌNH TRONG LUẬN ÁN

Trang

Hình 1.1 Cơ chế chịu hạn của thực vật 7 Hình 1.2 Cây phát sinh của họ nhân tố phiên mã AP2/ERF ở thực vật có diệp lục 10 Hình 1.3 Điều hòa phiên mã và sau phiên mã của DREB2A trong cây

Arabidopsis 20

Hình 2.1 Sơ đồ thí nghiệm tổng quát 43 Hình 2.2 Sơ đồ thí nghiệm thiết kế vector chuyển gen pBI121-GmDREB2 49 Hình 3.1 (A): Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR khuếch đại cDNA của

gen GmDREB2 từ 6 giống đậu tương; (B): Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm colony-PCR với cặp mồi pUC18-F/pUC18-R từ 6 dòng khuẩn lạc Hình 3.2 Trình tự đoạn mã hóa của gen GmDREB2 phân lập từ các giống đậu tương DT2008, CB, CBD, ĐT26, ĐVN5, ĐT51 so với trình tự gen DREB2 của

giống đậu tương mang mã số DQ054363 trên Ngân hàng Gen

GmDREB2

66

Hình 3.6 Sơ đồ hình cây mô tả mối quan hệ của 16 giống đậu tương dựa trên

trình tự nucleotide của gen GmDREB2 68

Hình 3.7 Sơ đồ hình cây mô tả mối quan hệ của 16 giống đậu tương dựa trên

trình tự amino acid suy diễn của gen GmDREB2 70 Hình 3.8 Kết quả kiểm tra sản phẩm cắt vector pBT-GmDREB2 và vector pRTRA7/3 bằng cặp enzyme NcoI và NotI 71 Hình 3.9 Kết quả PCR kiểm tra các dòng khuẩn E.coli DH5α chứa vector pRTRA7/3 với cặp mồi đặc hiệu GmDREB2-NcoI-F/ GmDREB2-NotI-R 72

Hình 3.10 (A): Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm cắt thu cấu trúc

35S-GmDREB2-cmyc từ pRTRA7/3; (B): Sơ đồ cấu trúc 35S-35S-GmDREB2-cmyc với

2 đầu LB và RB

74

Hình 3.11 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm colony-PCR từ các dòng khuẩn

A.tumefaciens CV58 được biến nạp plamid pBI121/35S-GmDREB2-cmyc 75

Hình 3.12 Hình ảnh mô tả quá trình biến nạp và tái sinh tạo cây thuốc lá chuyển gen 76 Hình 3.13 Kết quả PCR kiểm tra 35 cây thuốc lá được chuyển gen trồng trong nhà lưới 78 Hình 3.14 Kết quả lai Western từ một số cây thuốc lá chuyển gen thế hệ T0 80 Hình 3.15 Biểu đồ so sánh hàm lượng prolin của các cây thuốc lá chuyển gen

và đối chứng không chuyển gen trong điều kiện không xử lý hạn và sau 5, 9 ngày stress hạn

82

Hình 3.16 Kết quả tạo cây đậu tương chuyển gen từ giống DT84 bằng kỹ thuật

lây nhiễm A tumefaciens tái tổ hợp qua nách lá mầm hạt chín 84

Hình 3.17 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm DNA tổng số tách chiết từ các cây đậu tương được chuyển gen ở thế hệ T 0 của giống DT84 87 Hình 3.18 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR xác định sự có mặt của gen

chuyển GmDREB2 trong hệ gen của các cây đậu tương được chuyển gen 87 Hình 3.19 Kết quả lai Southern blot xác định gen chuyển GmDREB2 trong hệ

gen cây đậu tương được chuyển gen ở thế hệ T 0 89 Hình 3.20 Kết quả lai Western blot trên các cây đậu tương chuyển gen thế hệ T0 90

Hình 4.1 Locus GmDREB2 trên nhiễm sắc thể số 6 và một đoạn trong bản đồ

gen trên nhiễm sắc thể số 6 của đậu tương 95

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) là một trong những cây trồng

quan trọng hàng đầu ở nhiều quốc gia trên thế giới, trong đó có Việt Nam Việc tiêu thụ đậu tương và các sản phẩm từ đậu tương đang gia tăng trên toàn thế giới

do những tác dụng có lợi tới sức khỏe của con người, như phòng chống ung thư, ngăn ngừa bệnh tiểu đường và béo phì, hạ cholesterol và bảo vệ rối loạn thận Hạt đậu tương là nguồn cung cấp dồi dào protein (32%-52%), lipid (12%-25%), vitamin (B1, B2, C, D, E ), nhiều amino acid thiết yếu (lysine, tryptophan, methionine, cysteine và leucine), chất xơ, năng lượng và các chất chuyển hóa thứ cấp Vì vậy, hạt đậu tương được sử dụng làm thực phẩm cho con người, thức ăn cho gia súc, là nguồn nguyên liệu cho công nghiệp chế biến, mặt hàng xuất khẩu có giá trị kinh tế cao Không chỉ có giá trị kinh tế và dinh dưỡng cao, cây đậu tương còn giữ vai trò quan trọng trong việc cải thiện độ phì và sử dụng bền vững tài nguyên đất canh tác Gần đây, một trong những ứng dụng được quan tâm nhiều nhất của cây đậu tương là sản xuất dầu diesel sinh học

Đậu tương được xem là cây trồng nhạy cảm với hạn Hạn là yếu tố phi sinh học gây ảnh hưởng nghiêm trọng nhất và có thể làm giảm năng suất cây đậu tương khoảng 40% Hạn ảnh hưởng đến tất cả các thời kì sinh trưởng và phát triển của cây đậu tương, trong đó thời kì ra hoa và thời kì sau ra hoa đã được chứng minh là những thời kì bị ảnh hưởng nghiêm trọng nhất Hiện nay, do những biến đổi về khí hậu, đặc biệt là hạn kéo dài, lượng mưa không đều ở các thời điểm trong năm và giữa các vùng miền gây khó khăn cho sản xuất nông nghiệp ở nhiều quốc gia, tại Việt Nam cũng không tránh khỏi những tác động tiêu cực đó Hơn nữa, Việt Nam có khoảng 75% diện tích là đồi núi, đất dốc, khả năng giữ nước kém nên việc canh tác các cây trồng nói chung và cây đậu tương

nói riêng gặp rất nhiều khó khăn Do đó, việc chọn tạo giống đậu tương có khả năng chịu hạn tốt là vấn đề cấp thiết, mang tính thời sự ở Việt Nam cũng như trên thế giới

Tính chịu hạn của cây đậu tương do nhiều gen quy định, sản phẩm của các gen này liên quan trực tiếp đến sự biểu hiện khả năng chịu hạn hoặc có chức năng điều hoà nhóm gen chịu hạn Một số gen của đậu tương đã được mô tả là

có phản ứng với tác động của hạn ở mức phiên mã Trình tự cis và nhân tố trans

giữ vai trò quan trọng trong sự biểu hiện gen đáp ứng tác động của hạn Các

protein DREB - Những nhân tố có tác động trans liên kết với các trình tự cis để

kích hoạt sự biểu hiện của các gen mục tiêu khi có tín hiệu stress ở thực vật

Việc cải thiện đặc tính di truyền của cây đậu tương để thích nghi với hạn được các nhà khoa học tiếp cận theo nhiều hướng: Lai hữu tính, gây đột biến thực nghiệm, chọn lọc quần thể, công nghệ tế bào, công nghệ gen Trong đó, công nghệ gen được xem là biện pháp đem lại hiệu quả cao Gần đây, đã có những tiến bộ trong việc cải thiện tính chịu hạn của cây đậu tương thông qua các

kỹ thuật tác động vào nhân tố phiên mã hoặc yếu tố tín hiệu ở cây trồng chuyển gen Tuy nhiên ở nước ta, một số nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở việc chuyển các gen chức năng liên quan trực tiếp đến tính chịu hạn vào cây đậu tương, ít thấy công bố kết quả hoàn chỉnh về chuyển gen mã hóa protein là nhân tố kích hoạt

quá trình phiên mã, trong đó có gen GmDREB2 Do đó, việc nghiên cứu đặc tính

phân tử, xác định chức năng gen mã hóa nhân tố phiên mã liên quan tới tính chịu hạn, cũng như việc chuyển các gen này từ các giống đậu tương có khả năng chịu hạn tốt sang giống có khả năng chịu hạn kém đang trở thành hướng nghiên cứu triển vọng, nhận được sự quan tâm đặc biệt của các nhà khoa học ở trong và ngoài nước

Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi đã tiến hành đề tài luận án:

"Nghiên cứu đặc điểm và chuyển gen GmDREB2 nhằm cải thiện tính chịu hạn của cây đậu tương (Glycine max (L.) Merrill)"

2 Mục tiêu nghiên cứu

2.1 Phân tích được đặc điểm của gen GmDREB2 phân lập từ các giống đậu

tương Việt Nam có khả năng chịu hạn khác nhau

2.2 Biểu hiện được protein tái tổ hợp và chức năng sinh học của gen chuyển

GmDREB2 trên cây thuốc lá chuyển gen

2.3 Tạo cây đậu tương chuyển gen và biểu hiện được protein tái tổ hợp

GmDREB2 trên cây đậu tương chuyển gen

3 Nội dung nghiên cứu

3.1 Nghiên cứu thông tin, tách dòng và xác định trình tự gen GmDREB2 phân lập

từ cây đậu tương Phân tích tính đa dạng trong trình tự nucleotide và protein của

gen GmDREB2 ở cây đậu tương

3.2 Nghiên cứu thiết kế vector chuyển gen thực vật chứa cấu trúc mang gen

3.4 Nghiên cứu chuyển cấu trúc mang gen GmDREB2 vào cây đậu tương và

phân tích cây đậu tương chuyển gen

4 Những đóng góp mới của luận án

Luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu có hệ thống, từ việc

phân lập, tách dòng phân tử gen GmDREB2 đến thiết kế vector chuyển gen, tạo cây chuyển gen và phân tích sự biểu hiện gen chuyển GmDREB2, cụ thể là: (1) Gen GmDREB2 phân lập từ cây đậu tương có kích thước 480 nucleotide,

mã hóa cho 159 amino acid Các trình tự gen GmDREB2 đã được đăng ký trên

Ngân hàng Gen mang các mã số: LK936507, LK936508, LK936509, HG965097, HG965098, HG965099

(2) Protein tái tổ hợp GmDREB2 biểu hiện mạnh trên cây thuốc lá chuyển gen Khi bị hạn, ở các dòng thuốc lá chuyển gen có hàm lượng prolin tăng từ 211,17% - 332,44% sau 5 ngày bị stress hạn và tăng từ 262,79% - 466,04% sau

9 ngày bị stress hạn

(3) Tạo được cây đậu tương chuyển gen mang gen GmDREB2 và biểu hiện

thành công protein tái tổ hợp GmDREB2 trên giống đậu tương DT84

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài luận án

5.1 Về mặt khoa học

Kết quả nghiên cứu góp phần làm sáng tỏ đặc điểm cấu trúc của gen

GmDREB2 phân lập từ 6 giống đậu tương Việt Nam (DT2008, CB, CBD, ĐT26,

ĐT51, ĐVN5) Những cơ sở khoa học của việc sử dụng kỹ thuật chuyển gen nhằm cải thiện đặc tính chịu hạn của cây trồng đã được khẳng định thông qua việc tăng cường protein tái tổ hợp GmDREB2 và biểu hiện chức năng sinh học

của gen chuyển GmDREB2 trên cây thuốc lá và cây đậu tương Những kết quả

bước đầu về tạo cây chuyển gen đã mở ra hướng nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật chuyển gen trong mục đích nâng cao khả năng chịu hạn của cây đậu tương ở Việt Nam

Các bài báo công bố trên các tạp chí Khoa học - Công nghệ quốc tế và ở trong nước, cùng với 6 trình tự gen công bố trên Ngân hàng Gen là những tư liệu tham khảo có giá trị trong việc nghiên cứu, giảng dạy sinh học và công nghệ sinh học

5.2 Về mặt thực tiễn

Các trình tự gen GmDREB2 phân lập được, cấu trúc vector chuyển gen thực vật mang gen GmDREB2, các cây thuốc lá chuyển gen tạo được có khả năng

chịu hạn tốt hơn so với cây đối chứng, các cây đậu tương chuyển gen đã góp phần giải quyết những vấn đề cụ thể về việc ứng dụng kỹ thuật chuyển gen trong cải thiện khả năng chịu hạn ở cây đậu tương nói riêng và các cây trồng khác nói chung, mở ra triển vọng ứng dụng công nghệ mới trong thực tiễn chọn giống cây trồng chịu hạn ở Việt Nam

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CƠ CHẾ PHÂN TỬ CỦA ĐẶC TÍNH CHỊU HẠN Ở THỰC VẬT

1.1.1 Cơ chế chịu hạn của thực vật

Stress phi sinh học là nguyên nhân chính dẫn đến mất mùa trên toàn thế giới, gây thiệt hại đến năng suất bình quân hơn 50% ở các loại cây trồng chính [18] Trong số các stress phi sinh học, hạn là yếu tố chính làm giảm năng suất cây trồng Stress hạn phá vỡ sự cân bằng nội môi và phân bố ion trong tế bào [197] Cây trồng phản ứng với các stress hạn thông qua các con đường truyền tin và phản ứng tế bào như sản xuất protein stress, tăng cường các chất chống oxi hóa, tích lũy các chất tan [36] Các nghiên cứu gần đây cho thấy, hạn gây ra những tác động tiêu cực tới tất cả các cấp độ và các giai đoạn phát triển của thực vật Để chống chịu với các stress hạn, thực vật phải thực hiện thông qua chuỗi các quá trình, với sự tham gia của rất nhiều yếu tố Khi có hạn, các phản ứng sinh hóa khác nhau được kích hoạt trong cây trồng để tích lũy nhiều loại chất dễ hòa tan, như đường, amino acid, glycine betaine và polyamine để giúp các cây trồng đối phó với hạn [71], tăng lượng chất chống oxy hóa khác nhau, chẳng hạn như glutathione S-transferase (GST), superoxide dismutase (SOD), guaiacol peroxidase (POD) và catalase (CAT) chống lại điều kiện oxy hóa để phục hồi sau một thời gian nhất định bị hạn [12]

Gần đây, những tiến bộ trong việc hiểu biết về biểu hiện gen, cơ chế phiên mã và việc truyền tín hiệu phản ứng với stress hạn của cây trồng đã được công bố [198] Mặt khác, phân tích sinh học phân tử và di truyền học đã tạo điều kiện thuận lợi cho những khám phá về chức năng gen [155], [170] và được ứng dụng trong kỹ thuật di truyền với việc sử dụng một số gen chức năng hoặc một

số gen điều hòa để kích hoạt các cơ chế liên quan đến tính chịu hạn, chịu mặn của cây trồng [176] Vì vậy, cơ sở phân tử đặc tính chịu hạn của thực vật nói chung và cây đậu tương nói riêng cũng dần được sáng tỏ Các gen phản ứng với

stress hạn có thể chia thành 2 nhóm chính: Nhóm gen chức năng mà sản phẩm của chúng tham gia trực tiếp vào các phản ứng stress hạn như gen điều hòa áp suất thẩm thấu [167], gen mã hóa các protein chống oxi hóa [100], gen mã hóa protein LEA (Late embryogenesis abundant) [181], gen mã hóa protein vận chuyển LTP (Lipid trasfer protein) [111], aquaporin [48]; nhóm gen điều khiển cho ra các sản phẩm bao gồm các nhân tố phiên mã và các protein kinase truyền tin Các nhân tố phiên mã liên quan đến khả năng chịu hạn đang được quan tâm nghiên cứu bao gồm DREB [24], WRKY [193], [195], bZIP (Basic leucine zipper) [54], MYB (Myeloblastosis oncogene) [90], [103], NCED (Nine-cis-

epoxycarotenoid dioxygenase) [137] và AP2/ERF [193] Các protein kinase truyền tin bao gồm: Protein kinase phụ thuộc Ca2+ [80], MAPK (Mitogen activated protein kinase) [112], RPK (Receptor-like protein kinase)[29], PIK (Phophatidyl inositol kinase) [185] và protein kinase serine/threonine [102] (Hình 1.1)

Hình 1.1 Cơ chế chịu hạn của thực vật

Sự biểu hiện của các gen cảm ứng với hạn liên quan chặt chẽ với quá trình phiên mã Vì vậy, sự biểu hiện của các gen này chịu ảnh hưởng rất nhiều của môi trường trong và ngoài cơ thể, với nhiều mức độ điều hòa

Các nhân tố phiên mã (Transcription factors - TFs) đóng vai trò điều khiển quan trọng của những thay đổi trong biểu hiện gen và phản ứng với các stress môi trường Có thể thấy rõ ở cây trồng, các gen mã hóa nhân tố phiên mã

chiếm một phần lớn trong hệ gen Ví dụ, ở cây Arabidopsis có đến 1500 TF

trong hệ gen [140] Cả hai loại: Nhân tố kích hoạt và ức chế quá trình phiên mã

đã được sử dụng để nâng cao khả năng chịu hạn cho cây trồng, hầu hết các gen

này đã được xác định và phân tích ở cây Arabidopsis [19] Hiện nay, các protein

DREB (một trong bốn phân họ lớn của họ AP2/ERF) là nhóm TF được nghiên cứu thành công nhất trong điều kiện phi sinh học, bởi vì nó kích hoạt sự biểu hiện của nhiều gen mục tiêu chịu trách nhiệm kiểm soát các yếu tố liên quan

[71] Wang và cs (2009) đã xác định được trong cây Arabidopsis có 474 gen

mục tiêu mà các nhân tố phiên mã DREB tác động [183] Trong số những gen này,

có 160 gen có đáp ứng với stress phi sinh học và 27 gen cảm ứng với tình trạng thiếu nước [106]

1.1.2 Họ nhân tố phiên mã AP2

Các nhân tố phiên mã có thể được phân chia thành nhiều loại khác nhau dựa trên cấu trúc vùng liên kết của chúng với sợi DNA Các nhân tố phiên mã như

nhân tố có tác động trans và trình tự cis giữ vai trò trung tâm hoạt hóa promoter

trong biểu hiện của các gen mục tiêu Kết quả những phân tích về hoạt hóa

promoter phản ứng với điều kiện bất lợi, trình tự cis và nhân tố có tác động trans

liên quan đến phản ứng của các gen với điều kiện bất lợi đã được xác định [178]

Họ AP2/ERF là một nhóm lớn các nhân tố phiên mã ở thực vật, bao gồm bốn phân họ lớn: AP2 (APETALA 2), RAV (RelatedtoABI3/VP1), ERF (Ethylene-responsive element binding factor) và DREB (Dehydration responsive element binding) [148]

1.1.2.1 Cây phát sinh của họ nhân tố phiên mã AP2/ERF

Họ AP2/ERF là một nhóm lớn các nhân tố phiên mã có chứa miền

AP2/ERF Ở cây Arabidopsis chứa 145 locus gen mã hóa các nhân tố phiên mã

của họ AP2/ERF [148] và ở lúa có 167 locus [152] Miền AP2/ERF lần đầu tiên

được tìm thấy ở Arabidopsis homeotic APETALA 2 [74] Tương tự, miền này cũng tìm thấy ở cây thuốc lá (Nicotiana tabacum), đó là yếu tố phản ứng với

ethylene (EREBPs) [124] Miền AP2/ERF có khoảng 60 amino acid có liên quan chặt chẽ với nhau [184] Protein thuộc họ AP2/ERF là những nhân tố phiên mã

có ở thực vật và người ta cũng tìm thấy ở cả những thực vật bậc thấp như tảo

xanh (Chlamydomonas reinhardtii) [157], tương đồng với các miền AP2/ERF ở

vi khuẩn Do đó, có giả thuyết cho rằng các miền AP2/ERF được chuyển từ một

loài vi khuẩn Cyanobacterium cộng sinh hoặc từ một loại vi khuẩn hay virus bởi

hiện tượng biến nạp gen [98] Ở đầu N và ở đầu C của miền AP2/ERF có chứa một đoạn xoắn β tương tự như kiểu xoắn α có chức năng nhận biết điểm bám trên promoter [158]

Phân tích mối quan hệ và thiết lập cây phát sinh họ AP2/ERF từ bốn

phân họ: Arabidopsis, Selaginella moellendorffii, Physcomitrella patens và

Chlamydomonas reinhardtii, mà đại diện tương ứng là thực vật hạt kín, thông đất,

rêu và tảo xanh (Hình 1.2) Mỗi nhánh trong cây phát sinh đại diện cho một nhóm

và các thành viên của họ AP2/ERF có thể được chia thành ba nhóm dựa trên cấu trúc tổng thể [141]

Phân họ AP2/ERF trong nhóm Arabidopsis gồm 14 thành viên chứa hai

miền AP2/ERF, phân họ RAV gồm 6 thành viên có chứa một miền AP2/ERF và thêm một miền B3, trong khi các phân họ khác gồm 125 thành viên chỉ có một miền AP2/ERF [152] Phân họ AP2/ERF ở thực vật có hạt có thể được chia thành các phân nhóm AP2 và nhóm ANT [13]

Sakuma và cs (2002) đã phân tích mối quan hệ của 125 thành viên chứa

duy nhất miền AP2/ERF dựa trên cơ sở miền AP2/ERF của nhóm Arabidopsis

Thông qua phân tích này, 125 thành viên có một miền AP2/ERF được chia thành

ba nhóm: Nhóm A gồm 56 thành viên thuộc phân họ DREB, nhóm B gồm 65 thành viên thuộc phân họ ERF và nhóm còn lại gồm 4 thành viên thuộc những phân họ khác Phân họ DREB được chia thành 6 phân nhóm, từ A-1 đến A-6, phân họ ERF cũng được chia thành 6 phân nhóm, từ B-1 đến B-6 Các DREB1/CBF thuộc phân nhóm A-1 và các DREB2 thuộc phân nhóm A-2 [148] Nakano và cs (2006) phân tích mối quan hệ của các thành viên chứa duy nhất

miền AP2/ERF trong Arabidopsis và lúa, kết quả thu được tương tự như phân

loại của Sakuma và cs (2002) Tuy nhiên, ông cho biết thêm phân nhóm A-1 và A-4 cùng nguồn gốc và phân nhóm A-2 và A-3 cùng nguồn gốc [115]

Hình 1.2 Cây phát sinh của họ nhân tố phiên mã AP2/ERF ở thực vật có

diệp lục [109]

Họ nhân tố phiên mã AP2/ERF chỉ có ở thực vật và điều này đặt ra câu hỏi: Chúng đã tiến hóa như thế nào trong lịch sử phát triển của thực vật? Trong

sơ đồ cây phát sinh loài ở hình 1.2, P patens và chi nhánh S moellendorffii được

tìm thấy trong tất cả bốn phân họ lớn và trong một nhánh của AT4G13040

orthologues Hơn nữa, P Patens và S moellendorffii được tìm thấy trong tất cả

các phân nhóm, trừ A-1 và B-2 Điều đó chứng tỏ, rêu và thực vật có mạch chung nguồn gốc Phân nhóm A-1 (DREB1s) có quan hệ gần gũi với phân nhóm A-4 và cùng chung nguồn gốc với phân nhóm A-5 Trong thực tế, người ta không tìm thấy phân nhóm A-1 ở cây hạt trần Trong cây phát sinh loài ở hình 1.2,

C reinhardtii tìm thấy ở bốn nhánh, hai nhánh trong phân họ ERF và hai nhánh

trong phân họ AP2 Điều đó chứng tỏ, trước khi xuất hiện thực vật ở cạn, nhân tố phiên mã AP2/ERF đã chứa một miền AP2/ERF hoặc chứa hai miền AP2/ERF

Ngược lại, người ta chưa tìm thấy phân họ RAV ở C reinhardtii [109]

1.1.2.2 Nhân tố phiên mã DREB

Từ những năm 80 của thế kỷ XX, các nhà khoa học trên thế giới đã quan tâm

nghiên cứu về DREBs, tiến hành giải trình tự gen DREBs trên các loài họ cúc (Asteraceae), hướng dương (Helianthus annuus), lúa mì (Triticum aestivum L.)

… và so sánh trình tự gen này của các loài cây trồng và hoang dại cho thấy có sự sai khác giữa chúng [5] Từ đó, họ đã đề xuất phương án cải thiện khả năng chống chịu thông qua việc cải tiến ở mức phân tử của cơ chế này với điều kiện bất lợi trong môi trường sống, đó là chuyển gen mục tiêu từ loài chống chịu tốt vào loài chống chịu kém Những gen này bao gồm cả các gen chức năng, như gen mã hóa những chất chuyển hóa khác nhau quan trọng đối với khả năng chịu hạn, hoặc gen mã hóa các nhân tố phiên mã Đối với cây đậu tương, hướng nghiên cứu này bước đầu đã đạt được những thành công nhất định [6]

Nhiều thành viên phân họ DREB nhạy cảm với điều kiện bất lợi đã được phân lập, mô tả và các nghiên cứu đã khẳng định chúng là những thành tố quan trọng, liên quan đến sự phản ứng với nhân tố phi sinh học ở thực vật bằng cách

quy định biểu hiện gen thông qua các trình tự DRE/CRT [188] Khi phân tích các gen mã hóa nhân tố phiên mã DREB, các nhà khoa học đã xác định được 36

gen DREB/CBF trong cây nho (Vitis Vinifera) [200], 57 gen trong cây

Arabidopsis, 52 gen trong cây lúa (Oryza sativa L.) [115], 77 gen trong cây

Populos trichocarpa thuộc họ liễu [199], 36 gen trong cây đậu tương [192]

Một số thành viên của phân họ gen DREB được xác định có trong hệ gen của cây đậu tương như: GmDREBa, GmDREBb, GmDREBc, GmDREB1,

GmDREB2, GmDREB3, GmDREB5, GmDREB6, GmDREB7 [141] Mỗi gen

trong phân họ DREB có trình tự, độ dài khác nhau nhưng đều được biểu hiện

mạnh khi đậu tương gặp các điều kiện về hạn Nhóm DREB1 điều khiển tính chịu hạn, mặn và lạnh, trong khi nhóm DREB2 có vai trò chủ yếu trong điều

khiển tính chịu hạn, chịu nóng Chen và cs (2004) đã phân lập gen DREB1 từ

mRNA của cây đậu tương có kích thước 705 bp [27] Charlson và cs (2009) đã

phân lập được gen DREB1 từ DNA của cây đậu tương cũng có kích thước 705

bp [23] Chen và cs (2007) đã phân lập gen GmDREB5 từ mRNA ở cây đậu

tương với kích thước là 927 bp [25] Chen và cs (2009) đã phân lập gen

GmDREB3 từ mRNA ở cây đậu tương với kích thước là 597 bp [26] Liu và cs

(2007) đã phân lập gen GmDREB6 từ mRNA ở cây đậu tương với kích thước là

693 bp [96] Ở Việt Nam, vấn đề nghiên cứu về các gen DREB ở cây trồng nói

chung và cây đậu tương nói riêng vẫn còn rất mới mẻ, chỉ có một vài công trình

công bố về các gen DREB trong những năm gần đây, đó là các nghiên cứu về đặc điểm cấu trúc và chức năng của gen DREB1 và DREB5 ở cây đậu tương

của Chu Hoàng Mậu và cs (2011) [5]

1.1.2.3 Phân nhóm DREB2

Phân nhóm DREB2 gồm có 8 thành viên ở trong cây Arabidopsis [148]

và 5 thành viên trong cây lúa [107] Phân tích sự phát sinh của các protein

DREB2 từ cây Arabidopsis và cây lúa, cũng như các protein liên quan cho thấy,

phân nhóm DREB2 liên quan chặt chẽ với phân nhóm A-3, trong đó có ABI4

(ABA-Insensitive 4) Phân nhóm DREB2 trong cây Arabidopsis và lúa có thể

đều được chia thành ba phân nhóm phụ [107] Ngoài ra, phân nhóm DREB2 cũng đã được phân lập từ một số loài thực vật hạt kín khác như hướng dương

[41], lúa [42], [107], lúa mì [43], [153], lúa mạch (Hordeum vulgare) [187], ngô

(Zea mays L) [134] Hầu hết các gen DREB2 đã được công bố đều cảm ứng với

sự mất nước hoặc nhiệt độ cao, nhưng các gen DREB2 từ thực vật thân cỏ còn

cảm ứng với lạnh [43], [107], [153] Điều đáng chú ý là tất cả các DREB2 được phân lập có cảm ứng stress thuộc phân nhóm phụ 1, trong đó bao gồm DREB2A,

DREB2B, DREB2C, DREB2E và DREB2H của cây Arabidopsis, cũng như

OsDREB2A và OsDREB2B của cây lúa Điều đó chứng tỏ, phân nhóm phụ 1 mà đại diện là các DREB2 có cảm ứng với các stress Phân nhóm phụ 2 bao gồm

DREB2D, DREB2G ở cây Arabidopsis và OsDREB2C ở cây lúa, trong khi phân nhóm phụ 3 gồm DREB2F ở cây Arabidopsis và OsDREB2E ở cây lúa Các gen

DREB2 ở hai phân nhóm phụ này không có hoặc cảm ứng không đáng kể trước

các stress và cũng chưa được phân lập từ các thực vật khác, mặc dù tất cả các loài thực vật hạt kín đều có các gen thuộc 2 phân nhóm phụ này, song vai trò của chúng còn ít được biết đến [107], [148]

Chen và cs (2007) đã phân lập gen GmDREB2 từ đậu tương và dựa trên

sự giống nhau về miền AP2, gen GmDREB2 được xếp vào phân nhóm A-5 trong phân họ DREB Gen GmDREB2 được biểu hiện mạnh trong môi trường có

hạn, mặn, nhiệt độ thấp và ABA [24] Trong cây thuốc lá chuyển gen

GmDREB2, sự biểu hiện của gen này đã làm tăng sự tích lũy hàm lượng prolin

[88] Trong Ngân hàng Gen, trình tự gen GmDREB2 phân lập từ DNA của cây

đậu tương đã được công bố lần đầu tiên bởi Wang và cs (2006) có kích thước

480 bp, mã hóa 159 amino acid, miền AP2 có 59 amino acid (từ vị trí amino

acid 34 đến 92) [180] Gen GmDREB2 ở cây đậu tương có chức năng kích hoạt

sự phiên mã của nhóm gen chịu hạn Sản phẩm biểu hiện của gen GmDREB2

được tìm thấy khi cây đậu tương gặp hạn, lạnh và mặn Như vậy, gen

GmDREB2 đã được chứng minh là tích cực tham gia vào việc chống chịu với

hạn ở cây đậu tương [24], [88], [109]

1.1.3 Cơ chế tác động của một số nhân tố phiên mã đối với các phản ứng stress phi sinh học ở thực vật

Cho đến nay, nhiều nhân tố phiên mã họ AP2/ERF từ các loài thực vật khác nhau đã được chứng minh có liên quan đến phản ứng của stress phi sinh học Cụ thể, các DREB1/CBF và phân nhóm DREB2 đóng vai trò quan trọng trong việc chống chịu stress bằng cách điều hòa biểu hiện của gen thông qua trình tự DRE/CRT trong các promoter ở những gen nhạy cảm với stress

1.1.3.1 Hoạt động của nhân tố phiên mã AP2/ERF và các trình tự cis

chịu hạn và chịu mặn của cây Arabidopsis [94] Ngược lại, DREB2A và

DREB2B cảm ứng với tình trạng mất nước, mặn và nhiệt độ cao, không cảm ứng với lạnh [94], [116], [147] Sự biểu hiện mạnh của DREB2A đã kích hoạt sự biểu hiện của các gen cảm ứng với nhiệt độ cao hoặc sự mất nước, do đó đã cải

thiện khả năng chống chịu hạn, chịu mặn, chịu nhiệt độ cao của cây Arabidopsis

[147], [146] Những phát hiện này đã chỉ ra rằng, các DREB1 và DREB2 tham

gia vào quá trình thích nghi với stress trong cây Arabidopsis bằng cách kích hoạt

phiên mã thông qua liên kết với các trình tự DRE/CRT trong các promoter điều khiển các gen mục tiêu phản ứng với các stress

Cho đến nay, nhiều DREB cảm ứng stress đã được phân lập từ nhiều loại

cây trồng, bao gồm các loài thực vật hai lá mầm, như cây cải dầu (Brassica

napus) và cà chua (Solanum lycopersicum) [73], các cây một lá mầm như ngô

[134], [135], lúa [42], lúa mạch [187] và thậm chí từ cây rêu [93] Sự tồn tại của những DREB cảm ứng với stress ở các loài thực vật khác nhau đã chỉ ra tầm

quan trọng của trình tự cis DRE/CRT và DREBs trong phản ứng stress của thực

vật trên cạn

1.1.3.2 Hoạt động của các phân họ DREB và ERF

Phân tích chi tiết các điểm liên kết của DREB1A và DREB2A đã cho thấy, các protein này có ái lực cao nhất đối với trình tự A/GCCGAC của DRE [148] Hơn nữa, DREB1A có ái lực mạnh với A/GCCGACNT và DREB2A có ái lực mạnh với ACCGAC [104], [146] Những liên kết chặt chẽ này đã được xác nhận

bằng kết quả phân tích các promoter hoạt hóa biểu hiện các gen DREB trong cây

chuyển gen [104], [146] Ngược lại, năm phân họ protein ERF có ái lực lớn nhất với hộp (GCC) của trình tự AGCCGCC trong ERE [46] Tuy nhiên, trong một số trường hợp, TINY thuộc phân nhóm A-4 của phân họ DREB có thể liên kết với

cả DRE và hộp (GCC) [163] Một phân nhóm protein A DREB2 (A-2) từ lúa mạch (HvDRF1) cũng cho thấy ái lực mạnh với TT/AACCGCCTT [31] Protein

ABI4 từ cây ngô và cây Arabidopsis thuộc về phân nhóm A-3, có liên kết với

yếu tố ghép nối CE1 (Coupling Element 1) là các trình tự CACCG và CCAC [83], [120]

1.1.3.3 Hoạt động của phân nhóm DREB2

Vai trò của nhân tố phiên mã DREB2 trong điều kiện thiếu nước và nhiệt độ cao

Trong cây Arabidopsis, gen DREB2A và gen DREB2B được cảm ứng bởi

tình trạng mất nước, mặn và nhiệt độ cao [116], [147] (Hình 1.3), trong khi

DREB2C được kích hoạt chậm hơn bởi nhiệt độ cao so với DREB2A hoặc DREB2B [91] Các gen DREB2C, DREB2D và DREB2F cảm ứng với mặn và

DREB2E phản ứng với ABA, mặc dù biểu hiện của chúng là rất yếu [148] Vì vậy,

DREB2A và DREB2B dường như là các DREB2 liên quan chính đến tình trạng biểu hiện gen cảm ứng mất nước thông qua trình tự DRE/CRT và độc lập với

ABA [116], [148] Ngược lại với các gen DREB1/CBF, sự biểu hiện mạnh của

DREB2A gây ra những thay đổi không đáng kể trong sinh trưởng của thực vật,

trong biểu hiện gen hoặc khả năng chịu đựng stress [94] Sakuma và cs (2006) cho rằng, DREB2A có một vùng điều hòa âm tính (NRD) tiếp giáp điểm liên kết với DNA và tạo thành một phức hợp hoạt động chủ yếu là DREB2A CA Cây

chuyển gen có DREB2A CA thường biểu hiện còi cọc, tăng khả năng chịu hạn và

chịu mặn nhưng không có khả năng chịu lạnh [146] Nhiều gen cảm ứng với tình trạng mất nước, chẳng hạn như gen mã hóa protein LEA được biểu hiện trong các cây chuyển gen Ngoài ra, nhiều gen cảm ứng với nhiệt độ cao cũng được điều chỉnh và thực tế cây chuyển gen thể hiện tính kháng với các sốc nhiệt

[147] Những thể đột biến gen DREB2A có biểu hiện làm giảm một phần của sự

mất nước hoặc sốc nhiệt, điều đó cho thấy, DREB2A đóng vai trò quan trọng trong biểu hiện các gen cảm ứng với mất nước và sốc nhiệt [147] (Hình 1.3)

Hoạt động điều hòa sau phiên mã của DREB2

Điều hòa sau phiên mã của DREB2A có liên quan đến sự ổn định của protein (Hình 1.3) Vùng NRD trong DREB2A là một trình tự giàu amino acid serine/threonine ưa nước và tạo thành một chuỗi PEST, đây là một loại protein không ổn định được tìm thấy ở sinh vật nhân chuẩn [142], [145] Trong điều kiện không có stress, protein huỳnh quang xanh GFP (Green fluorescence protein) ở nhân liên kết với DREB2A CA được tích lũy ổn định hơn so với GFP liên kết với DREB2A [146]

Theo Qin và cs (2008), các protein DRIP1 và DRIP2 đã được phân lập, tương tự như enzyme RING E3 ligase, nó tương tác với DREB2A trong nhân cũng tương tự như chất môi giới ubiquitin của DREB2A Biểu hiện mạnh của

DRIP1 đã làm chậm lại biểu hiện phản ứng mất nước của các gen chức năng Ngược lại, phản ứng mất nước của các gen chức năng được tăng cường đáng kể

ở cả hai thể đột biến drip1 và drip2 Ngoài ra, có sự tích lũy ổn định GFP liên kết với DREB2A trong nhân của hai thể đột biến drip1 và drip2 ở cây không

chuyển gen trong điều kiện bình thường hoặc có chất ức chế proteasome Vì vậy,

có giả thuyết cho rằng DRIP1 và DRIP2 điều hòa âm tính biểu hiện gen cảm ứng mất nước bằng cách tạo điều kiện cho ubiquitin hoạt động và làm mất chức năng của DREB2A [136] (Hình 1.3)

Phosphoryl hóa được xem như là một cơ chế điều hòa sau phiên mã đối với PgDREB2A, đó là một protein thuộc phân nhóm DREB2 được phân lập từ thực

vật thân cỏ như cây Pennisetum glaucum (thuộc phân họ kê) [11] Toàn bộ dịch chiết của tế bào cây P glaucum có thể phosphoryl hóa một protein tái tổ hợp PgDREB2A ở trong Escherichia coli Sự phosphoryl hóa thường xảy ra tại

threonine dư, làm giảm ái lực liên kết của các protein PgDREB2A với trình tự DRE/CRT Mặc dù vị trí phosphoryl hóa chưa được xác định, song việc phát hiện này cho thấy sự phosphoryl hóa như là một cơ chế điều hòa sau phiên mã của các DREB2 Trong thực vật thân cỏ, DREB2 điều hòa qua nhiều bước Các DREB2 cảm ứng với các stress trong thực vật thân cỏ được chia thành hai nhánh: OsDREB2A và OsDREB2B [107] Cơ chế điều hòa này đã được tìm thấy

ở các gen trong nhánh thứ hai của lúa mạch (HvDRF1) [187], lúa mì (WDREB2) [43], ngô (ZmDREB2A) [134] và lúa (OsDREB2B) [107] Những gen này có hai

loại: Sao chép nhưng không hoạt động do có một codon kết thúc trước vùng liên kết với DNA và sao chép hoạt động mà có thể mã hóa một protein có chiều dài đầy đủ Nói chung, loại sao chép không hoạt động được thể hiện dưới điều kiện không có stress Sao chép hoạt động để cảm ứng với các tín hiệu stress cao hơn

so với sao chép không hoạt động Hiện tượng điều hòa qua nhiều bước đối với

các gen DREB2 trong các loài thực vật thân cỏ có thể cho phép cảm ứng với

stress nhanh chóng bằng cách bỏ qua các bước kích hoạt của các chất hoạt hóa

DREB2 hoặc cung cấp trước một lượng của mRNA DREB2s

DREB2 với cảm ứng với sốc nhiệt

Trong cây Arabidopsis, DREB2A là một nhân tố phiên mã trong cảm ứng với sốc nhiệt Khi gặp điều kiện nhiệt cao, gen DREB2A nhanh chóng biểu hiện

và kích hoạt nhiều gen cảm ứng sốc nhiệt, chẳng hạn như các nhân tố phiên mã

và môi giới phân tử Biểu hiện trực tiếp của các thể đột biến gen DREB2A làm

giảm biểu hiện của các gen này và rất nhạy cảm với sự thay đổi đột ngột về nhiệt

độ [147] Một trong những gen đích quan trọng của DREB2A là HsfA3, một thành viên của nhóm HSF, gồm có 21 thành viên trong cây Arabidopsis [122]

Biểu hiện mạnh của HsfA3 là sẽ kích hoạt cho nhiều gen cảm ứng sốc nhiệt,

trong khi sự gián đoạn hoạt động của gen HsfA3 làm giảm phản ứng của các gen

cảm ứng sốc nhiệt và giảm khả năng chống sốc nhiệt [150], [189] Các báo cáo

gần đây cho thấy, sự tác động của gen DREB2A chỉ ức chế một nhóm các gen

HsfA1 [85] (Hình 1.3)

Hiện nay, có ý kiến cho rằng, nhiệt độ cao kích hoạt mạnh các protein

HsfA1, còn gen HsfA2 gây nên sự phiên mã của DREB2A và là một nhân tố phiên mã quan trọng [151] DREB2A sau đó kích hoạt gen HsfA3 và các protein

HsfA3 biểu hiện để tiếp tục tác động các gen chức năng (Hình 1.3) Hoạt động

sao chép của gen OsDREB2B ở cây lúa sẽ hiển thị một mô hình biểu hiện tương

tự như của gen DREB2A dưới điều kiện nhiệt độ cao [107] và một số gen HSF

trong cây lúa có DRE/CRT, và có thể gặp ở hầu khắp thực vật hạt kín

Chức năng của DREB2 trong điều kiện sốc nhiệt và hạn

Hạn và nhiệt độ cao gắn liền với những điều kiện stress của môi trường tự nhiên và thường xảy ra đồng thời [110] Sự tác động đồng thời của hạn và nhiệt

độ cao ảnh hưởng đến sinh trưởng của các cây trồng nhiều hơn những stress đơn

lẻ [110], [143], [144] Về mặt sinh trưởng, phân tích sự phiên mã và trao đổi chất

ở cây thuốc lá, cây Arabidopsis đã chỉ ra rằng, phản ứng của cây đối với sự kết

hợp của nhân tố hạn và nhiệt độ cao một phần có sự chồng chéo lên nhau, nhưng

rõ ràng những chồng chéo này nhằm chống lại stress đơn lẻ [143], [144] Gen

DREB2A không chỉ được cảm ứng bởi hạn hay nhiệt độ cao đơn lẻ mà còn bởi

sự kết hợp của hạn và nhiệt độ cao [144], do đó các gen DREB2 đóng vai trò

trong việc điều hòa biểu hiện gen dưới sự tác động đồng thời của hạn và nhiệt độ cao lên thực vật

1.1.3.4 Mối quan hệ về chức năng giữa DREB1/CBF, DREB2 và các nhân tố phiên mã khác

Sự khác biệt về đặc tính liên kết của DREB1A/CBF3 và DREB2A với

DRE/CRT có thể là chìa khóa để điều hòa các gen trong cây Arabidopsis đối với các stress cụ thể Trong cây Arabidopsis, sự biểu hiện mạnh của các gen

DREB1/CBF đã cải thiện khả năng chịu hạn và lạnh [42], [77], [135] Ngược lại,

sự biểu hiện mạnh của các gen DREB2 tăng cường đáng kể khả năng chịu hạn

nhưng không cải thiện khả năng chịu lạnh [134], [146] Maruyama và cs (2009) chứng minh rằng, các gen chức năng được kích hoạt bởi DREB1A/CBF3 và DREB2A CA chịu tác động một phần sự kết hợp của các stress Tuy nhiên, các gen chức năng cụ thể lại tương ứng với từng loại protein DREB Gen mã hóa enzyme để chuyển hóa carbohydrate chịu tác động của DREB1A, trong khi gen

mã hóa những chất môi giới phân tử chịu tác động của DREB2A CA [105]

Về mặt chuyển hóa cho thấy, mô hình tích lũy chất chuyển hóa là giống

nhau giữa các cây biểu hiện mạnh gen DREB1A ở cây chịu lạnh, cũng như giữa cây biểu hiện mạnh gen DREB2A CA ở cây chịu hạn [105] Điều này cho thấy,

những sự khác biệt trong tích lũy chất chuyển hóa đã gây ra sự khác biệt trong khả năng chịu stress của thực vật Maruyama và cs (2004), Sakuma và cs (2006)

đã chứng minh rằng, DREB1A có ái lực mạnh với A/GCCGACNT và DREB2A

có ái lực mạnh ACCGAC cả ở điều kiện in vitro và ở cây trồng Bởi vì, tác động

lạnh đối với thực vật gây ra tình trạng mất nước của tế bào, tác động tới hệ thống

bảo vệ chung giữa phản ứng stress lạnh và mất nước Chẳng hạn như protein LEA, được quy định thông qua một trình tự DRE/CRT chung (ACCGACNT) và được cảm ứng bởi các tín hiệu stress lạnh và mất nước Ngược lại, các gen hoạt động trong điều kiện stress cụ thể được quy định bởi trình tự DRE/CRT riêng Như vậy, sự khác biệt nhỏ về các trình tự DRE/CRT cùng với sự điều hòa của

một số gen phân họ DREB có thể cải thiện sức sống của cây chống lại điều kiện

bất lợi của ngoại cảnh [104], [146]

Hình 1.3 Điều hòa phiên mã và sau phiên mã của DREB2A trong cây

Arabidopsis [109]

Về sự tương tác của DREB1/CBF và DREB2 với các nhân tố phiên mã khác, DRE/CRT tương tác với các trình tự cis và DREB tương tác với các nhân

tố phiên mã khác (Hình 1.3) Trong promoter RD29A, DRE/CRT có một mối

quan hệ chặt chẽ với ABRE và có chức năng như một yếu tố liên kết của ABRE

[117] Dưới sự điều khiển của promoter RD29A, đoạn có chứa cả DRE/CRT và

ABRE tăng cường biểu hiện đồng thời của DREB1A/CBF3 hoặc DREB2A với AREB1/ABF2 hoặc AREB2/ABF4 [117] Các protein DREB1A, DREB2A và DREB2C tương tác với các protein AREB1/ABF2 và AREB2/ABF4 ở nấm men

và trong ống nghiệm [89] Tương tự, DRE/CRT và các các yếu tố sốc nhiệt - HSEs (Heat shock elements) phối hợp hoạt động trong promoter để điều khiển biểu hiện của một loại protein sốc nhiệt có kích thước nhỏ ở phôi cây hướng dương [41] Protein HaDREB2 và HaHSFA9 liên kết với promoter và gián tiếp điều khiển sự phiên mã của các gen đích Trong ống nghiệm, HaDREB2 và HaHSFA9 tương tác với nhau, tại các miền AP2/ERF của HaDREB2 và ở đầu C của HaHSFA9 có chứa các miền kích hoạt tương ứng, được xác định là vùng tương tác cho mỗi protein

1.2 NHÂN TỐ PHIÊN MÃ VÀ TĂNG CƯỜNG KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA THỰC VẬT

1.2.1 Nâng cao khả năng chống chịu các stress bằng kỹ thuật biểu hiện mạnh nhân tố phiên mã DREB ở thực vật

Biểu hiện mạnh những gen điều hoà phiên mã của các gen chức năng có khả năng đáp ứng hạn là một cách tiếp cận đầy hứa hẹn trong sự phát triển các giống cây trồng chống chịu hạn và ưu việt hơn kỹ thuật chuyển gen chức năng đơn lẻ Vì vậy, việc tăng cường khả năng điều tiết của một nhân tố phiên mã quan trọng kích thích sự biểu hiện của nhiều gen mục tiêu kiểm soát các đặc tính tương quan là rất quan trọng Nhiều gen giữ vai trò quan trọng đã được xác định

có liên quan đến mạng lưới điều hòa trong điều kiện stress phi sinh học [155]

Có thể nói rằng, nhóm gen TF liên quan đến stress phi sinh học, đặc biệt là hạn

và lạnh được nhận thấy rõ nhất là các gen DREB [56], [134], [147] Nhiều gen

cảm ứng rối loạn thẩm thấu chứa một yếu tố đáp ứng hạn (DRE) bảo thủ trong promoter của chúng [156], [166] Một số cDNA mã hóa các protein gắn DRE,

DREB1A và DREB2A đã được phân lập từ cây Arabidopsis, thể hiện sự ràng

buộc và kích hoạt phiên mã của gen chứa trình tự DRE [94] Trong thực tế, nhiều nghiên cứu về biểu hiện mạnh của nhân tố phiên mã DREB cảm ứng với stress đã được tìm thấy để kích hoạt sự biểu hiện của các gen mục tiêu có trình tự DRE trong các promoter của chúng và kết quả cho thấy cây chuyển gen có khả năng chống chịu stress tốt hơn cây không chuyển gen (Bảng 1.1) Một ứng dụng

rộng rãi hiện nay là các DREB1A được định hướng bằng một promoter

CaMV35S hoặc promoter cảm ứng với khô hạn RD29A đều biểu hiện mạnh Với

cách tiếp cận này, các DREB1A đã kích hoạt biểu hiện của nhiều gen chống chịu

stress trong điều kiện phát triển bình thường và kết quả là các thế hệ cây chuyển

gen đã được tăng cường khả năng chịu hạn, lạnh và mặn [77] Gen DREB1A có thể biểu hiện tốt ở nhiều cây trồng khác nhau; sự biểu hiện mạnh các AtDREB1A

trong cây thuốc lá, cây lúa mì, cây lúa, cây lạc đã chứng minh khả năng chịu hạn

tốt hơn và tăng cường sự biểu hiện của gen LEA ít nhất là trong điều kiện nhà

kính [16], [78], [131]

Gần đây, dòng lạc chuyển gen DREB1A phân lập từ cây Arabidopsis

dưới tác động của promoter cảm ứng với stress hạn đã biểu hiện tốt, tích lũy đáng kể một số enzyme quan trọng so với cây không chuyển gen trong điều kiện gây hạn nhân tạo, những enzyme này không có mối liên hệ nào với hiệu quả

thoát hơi nước [17] Cây lúa chuyển gen DREB1A phân lập từ cây Arabidopsis

đã biểu hiện tốt khả năng chịu hạn, chịu mặn, chịu được lạnh và sự tích lũy nồng độ các chất hòa tan cao, như các prolin tự do và các chất đường hòa tan

khác nhau Kết quả biểu hiện các gen DREB từ cây Arabidopsis ở những loài

cây trồng khác cũng được chứng minh như lúa mì, lúa mạch, đậu tương, cà chua, thuốc lá, dâu tây, lúa, cải dầu, khoai tây và các loại cây thân cỏ khác [35], [92], [113]

Bảng 1.1 Các gen mã hóa nhân tố phiên mã được sử dụng trong kỹ thuật chuyển

gen nhằm tăng cường khả năng chịu hạn của thực vật

DREB2/DREB3 Nhân tố phiên mã Lúa mì và

lúa mạch Chịu hạn và băng giá [113] ABF3 Nhân tố phiên mã Arabidopsis Chịu hạn [9]

OsWRKY45 Nhân tố phiên mã Arabidopsis Chịu hạn [138] ABP9 Nhân tố phiên mã bZIP Arabidopsis Cải thiện quang năng trong

điều kiện hạn hán [194]

TaSrg6 Nhân tố phiên mã Arabidopsis Chịu hạn [168] HvCBF4 Nhân tố phiên mã Lúa Chịu hạn, mặn, băng giá [125] DREB2A Nhân tố phiên mã Arabidopsis Chịu hạn và nhiệt độ cao [134] CAP2 Nhân tố phiên mã Thuốc lá Chịu hạn và mặn [159] DREB1 hoặc

OsDREB1

Nhân tố phiên mã trong điều kiện phi stress Lúa

Chịu hạn, mặn và lạnh với tốc độ tăng trưởng giảm [72] DREB2A Nhân tố phiên mã Arabidopsis Chịu hạn [146] HsfA2 Nhân tố phiên mã Arabidopsis Chống chịu với các stress

DREB1A Arabidopsis protein 1

ZmDREB1A Nhân tố phiên mã Arabidopsis Chịu hạn [135] DREB1C/CBF2 Nhân tố phiên mã Arabidopsis Chịu hạn [123] NAC Nhân tố phiên mã

NAM/ATAF/CUC Arabidopsis Chịu hạn và chịu mặn [170] DREB1A Nhân tố phiên mã Thuốc lá Chịu hạn và lạnh [78] DREB1A Nhân tố phiên mã Lúa mì Làm chậm quá trình héo úa

trong điều kiện stress hạn [131] OsDREB1A Nhân tố phiên mã Arabidopsis Chịu hạn, mặn, băng giá [42] CBF4 Nhân tố phiên mã Arabidopsis Chịu hạn và băng giá [57]

ABF3/ABF4 Nhân tố phiên mã

finger proteins Arabidopsis Chịu hạn [76] DREB Nhân tố phiên mã Arabidopsis Chịu hạn, lạnh [77]

Một số nghiên cứu đã cho thấy, sự biểu hiện của các gen cấu trúc CBF ở

cây trồng chuyển gen đã thể hiện rõ khả năng chịu stress cao Biểu hiện mạnh

CBF3/DREB1A và ABF3 của cây Arabidopsis trong cây lúa chuyển gen cho thấy

khả năng chịu hạn và chịu mặn, nhưng khả năng chịu lạnh kém Điều này có thể

cho thấy, bằng cách kích hoạt sự biểu hiện gen mục tiêu 12 (CBF3/DREB1A) và gen mục tiêu 7 (ABF3) trong điều kiện bình thường và gen bổ sung 13 và 27 đã

được kích hoạt trong điều kiện hạn mà không làm chậm sự phát triển hoặc các hiệu ứng kiểu hình có thể quan sát thấy [126]

Những gen có thể biểu hiện trong điều kiện stress sẽ giúp cây trồng thích nghi với điều kiện stress phi sinh học [177] Các gen mục tiêu của

DREB1A/CBF3 bao gồm: Các gen mã hóa TFs, phospholipase C, các protein

vận chuyển đường, sự trao đổi chất liên quan đến protein carbohydrate, protein LEA, protein KIN (protein cảm ứng lạnh), protein tổng hợp các chất hòa tan và

các chất ức chế proteinase [44] Biểu hiện mạnh của DREB1A/CBF3 trong cây

Arabidopsis chuyển gen cho thấy những thay đổi trong biểu hiện của một số gen

cảm ứng stress và những thay đổi này dẫn đến làm tăng khả năng chịu lạnh, mặn

và hạn [104], [126] Có thể do cây Arabidopsis có khả năng thích nghi với lạnh

đã được hình thành trong quá trình tiến hóa khác với cây lúa không trải qua sự

thích nghi lạnh [73] Hơn nữa, gen CBF4 từ cây lúa mạch dường như có hiệu quả hơn DREB1A/CBF3 từ cây Arabidopsis trong việc nâng cao tính chống chịu

stress ở cây lúa biến đổi gen [125] Những dữ liệu này cho thấy, sự khác biệt về chức năng giữa các thành viên trong phân họ DREB/CBF và làm nổi bật sự khác biệt trong khả năng chống chịu các stress giữa các loài cây trồng biến đổi gen khác nhau Những khác biệt chức năng có thể là do tính phức tạp, tính chất của các gen mục tiêu có mặt trong hệ gen và khả năng của các nhân tố phiên mã để

kích hoạt hay ức chế mỗi gen mục tiêu Các gen CBF rõ ràng đã sản sinh ra yếu

tố kháng stress phi sinh học bằng cách điều tiết các con đường tự nhiên đáp ứng

các stress, tạo ra sự thích nghi về mặt sinh lý, cho phép các tế bào thực vật đối phó với rối loạn về thẩm thấu [44], [104]

1.2.2 Hiệu quả đa hiệu trong cây chuyển gen

Một tác dụng không mong muốn của các biểu hiện mạnh ở một nhân tố phiên mã là đôi khi ảnh hưởng tiêu cực đến sự sinh trưởng và phát triển của cây như gây độc hoặc làm chậm quá trình phát triển và có thể có một số hiệu ứng đa hiệu khác [72], [94] Biểu hiện mạnh của các nhân tố phiên mã DREB1A/CBF dẫn đến tình trạng chậm phát triển của cây trồng biến đổi gen Điều này có thể là

do sự nhạy cảm của các loại tế bào nhất định đối với sự biểu hiện quá mạnh của một gen nào đó Tuy nhiên, sự biểu hiện cấu trúc DREB1A/CBF3 ở cây

Arabidopsis và OsDREB1F trong cây lúa không dẫn đến việc ức chế sự sinh

trưởng cũng như thay đổi kiểu hình [126], [182] Tương tự, không quan sát được ảnh hưởng đa hiệu nào biểu hiện ra bên ngoài của nhân tố phiên mã ABF3 bZIP đối với cây lúa [126] Sự biểu hiện mạnh của AtDREB2A sau khi xóa miền điều hòa âm tính (xóa một vùng giữa vị trí 136 và 165) sẽ điều chỉnh các gen cảm ứng

với hạn và cải thiện được khả năng chịu hạn của cây Arabidopsis [148]

Tuy nhiên, trong trường hợp các tác động đa hiệu được quan sát, vấn đề này có thể khắc phục bằng cách lựa chọn một promoter phù hợp, chẳng hạn một promoter cảm ứng với stress RD29A [77], [78] Vì vậy, trong kỹ thuật chuyển gen, việc hạn chế những tác động có hại của các nhân tố phiên mã đối với cây trồng là đặc biệt quan trọng Cũng tương tự như vậy, các con đường trao đổi chất

có thể bị ảnh hưởng bởi các hoạt động của nhân tố phiên mã hoặc gián tiếp hoặc

là một loạt các phản ứng trong chuyển hóa Cây trồng chuyển gen DREBs/CBFs

biểu hiện tốt khả năng tích lũy đường hòa tan và prolin tự do như là một phần của phản ứng khử nước mà các nhân tố phiên mã gây ra [53], [72] Gần đây,

Abdeen và cs (2010) bằng kết quả phân tích microarray ở cây Arabidopsis

chuyển gen đã chứng minh rằng, sự biểu hiện mạnh của nhân tố phiên mã ABF3 dẫn đến các tác động của ABF3 được kiểm soát chặt chẽ mà không biểu hiện bất

kỳ tác dụng không mong muốn nào [9] Vì vậy, trong kỹ thuật chuyển gen, việc lựa chọn các nhân tố phiên mã trực tiếp kiểm soát hầu hết các con đường trao đổi chất và hạn chế tối thiểu tác dụng phụ không mong muốn là rất quan trọng

1.2.3 Nghiên cứu điều khiển hoạt động của nhân tố phiên mã trong cải tiến giống cây trồng

Tiềm năng của các nhân tố phiên mã như là một công cụ để phân tích và tìm kiếm công nghệ điều khiển các gen trong nhóm gen liên quan đến đặc tính chống chịu của thực vật nhằm nghiên cứu chức năng gen và cải thiện khả năng chống chịu của cây trồng Một trong những mục tiêu đạt được từ các nỗ lực này

là việc điều tiết hoạt động của nhân tố phiên mã đã đem lại nhiều hứa hẹn cho việc điều hòa con đường trao đổi chất của cây trồng

Một số hiện tượng biểu hiện mạnh của các gen DREB2 trong cây chuyển

gen lại không cải thiện được khả năng chịu stress là do sự xuất hiện các protein

có chứa các miền ngăn chặn sự kích hoạt các gen mục tiêu [94] Sau khi sửa đổi những gen này bằng kỹ thuật tạo đột biến điểm, chức năng ức chế đã không biểu hiện, các cây trồng có được khả năng chịu hạn [45], [147] Các cây chuyển gen chứa protein DREB2A tổng hợp từ gen đột biến sinh trưởng bình thường và không chỉ chịu được stress hạn và mặn mà còn có thể chịu được nhiệt độ cao Điều này cho thấy, vai trò của DREB2A trong mối liên hệ giữa phản ứng với stress hạn và phản ứng với nhiệt độ cao Trường hợp này cho thấy, DREB2A kiểm soát sự biểu hiện của các nhân tố phiên mã HsfA3 đáp ứng với nhiệt độ cao

[150] Ở cây ngô, biểu hiện mạnh của gen ZmDREB2A dưới tác động của

promoter cảm ứng stress đã làm tăng khả năng chịu hạn ở cây chuyển gen [134]

Ngoài đột biến mất vùng ức chế, đột biến điểm cũng đóng một vai trò quan trọng trong việc khôi phục các hình thức hoạt động của các chất hoạt hoá phiên mã Đột biến điểm từ serine đến acid asparatic tại điểm phosphoryl hóa trong TRAB1 (nhân tố phiên mã bZIP ở cây lúa) đã góp phần đáng kể vào việc

kích hoạt phiên mã mà không cần sự có mặt của ABA trong cây [75] Tương tự như vậy, cây chuyển gen biểu hiện AREB1 với nhiều đột biến cũng đã tạo được nhiều gen phản ứng với ABA, đáp ứng chức năng khi không có mặt ABA Những dữ liệu này cho thấy, các nhân tố phiên mã kích hoạt bởi đột biến điểm

có tiềm năng để đóng góp vào việc tăng cường khả năng chịu hạn ở thực vật chuyển gen [47]

Các yếu tố ức chế phiên mã ít điều hòa biểu hiện gen trong điều kiện stress cũng là công cụ có giá trị trong kỹ thuật làm tăng khả năng chịu hạn ở thực vật Biểu hiện mạnh của một yếu tố ức chế bao gồm cả các nhân tố phiên mã chiếm ưu thế trong việc ức chế sự biểu hiện của các gen mục tiêu thể hiện trong kiểu hình mẫn cảm [45], [65], [82] Cơ chế chính xác vẫn chưa rõ ràng nhưng yếu tố ức chế này có thể được sử dụng để xác định vai trò của nhân tố phiên mã thông qua việc tạo ra các đột biến mất chức năng chiếm ưu thế Tương tự như

vậy, CaZPF1 hoạt động như một chất ức chế phiên mã trong nấm men, cho thấy khả năng chịu đựng stress hạn khi được biểu hiện trong cây Arabidopsis chuyển

gen [81] Như vậy, các nhân tố phiên mã được sửa đổi có thể là một nguồn tài nguyên có giá trị trong kỹ thuật chuyển gen, tạo những đặc điểm mới cho cây chuyển gen Kỹ thuật này và các công nghệ có liên quan trở thành công cụ di truyền quan trọng, cho phép các nhà nghiên cứu có được thông tin nhanh chóng Điều này cũng mở ra cánh cửa cho việc kích hoạt phiên mã dựa vào sự ức chế hay kích hoạt các con đường trao đổi chất trong cây trồng

Gần đây, Morran và cs (2010) đã tạo ra cây lúa mì và cây lúa mạch

chuyển gen biểu hiện tốt TaDREB2 và TaDREB3 dưới tác động của promoter

35S và promoter cảm ứng hạn RAB17 (ở cây ngô) một cách riêng biệt [113] Những biểu hiện gia tăng các nhân tố phiên mã dẫn đến sự biểu hiện cao của 10

gen DREB/CBF khác và một số lượng lớn các gen LEA/COR/DHN đáp ứng các

stress Cây biến đổi gen với sự biểu hiện mạnh cảm ứng stress cho thấy, rất ít hoặc không có tác dụng không mong muốn Trong khi đó, cây chuyển gen có