Đánh giá đa dạng di truyền và phát triển kỹ thuật chẩn đoán virus lúa lùn sọc đen Phương Nam ở Việt Nam

Tuy nhiên, do chưa có kháng thể đặc hiệu nên việc chẩn đoán cây bị nhiễm SRBSDV đều được thực hiện bằng phương pháp RT-PCR sử dụng cặp mồi từ Trung Quốc hoặc tự thiết kế dựa trên trình t

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số : 62 42 02 01

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP

Hà Nội – 2017

2

Công trình đƣợc hoàn thành tại:

VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

Vào hồi giờ ngày tháng năm 2017

Có thể tìm hiểu luận án tại thƣ viện:

- Thƣ viện Quốc gia Việt Nam

- Thƣ viện Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam

1

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của tề tài

Việt Nam là quốc gia trồng lúa và là một trong các nước xuất khẩu lúa hàng đầu thế giới Sản xuất lúa có vai trò cực kỳ quan trọng đối với khoảng 70% dân số nông nghiệp và an ninh lương thực của đất nước Virus là một trong những tác nhân gây bệnh nguy hiểm nhất và là nguyên nhân chính làm cho sản lượng lúa không ổn định

và tình trạng mất an ninh lương thực Dịch bệnh vius mỗi khi xảy ra thường để lại những hậu quả nghiêm trọng, xảy ra luân phiên và tái bùng phát dịch sau một khoảng thời gian nhất định

Virus lúa lùn sọc đen Phương Nam (Southern rice black-streaked dwarf virus-SRBSDV)gây bệnh lúa lùn sọc đen được phát hiện lần đầu tiên vào năm 2001 tại các vùng trồng lúa thuộc tỉnh Quảng Đông, phía Nam Trung Quốc Virus này là thành viên mới thuộc

nhóm Fijivirus-2, họ Reoviridae Triệu chứng chủ yếu của cây lúa

nhiễm bệnh thường thấy là cây lúa tương đối thấp lùn, lá xanh đậm,

lá bị xoăn ở đầu lá hoặc toàn bộ lá, rách mép lá và đặc biệt có những

u sáp màu trắng đến đen chạy dọc các đường gân ở mặt sau lá, bẹ lá hoặc các đốt thân Bệnh chủ yếu nhiễm trên các cây thuộc dạng thực vật thân cỏ như: lúa, ngô, cỏ Môi giới truyền bệnh của SRBSDV là rầy lưng trắng và rầy nâu nhỏ nhưng chỉ có rầy lưng trắng mới có khả năng truyền SRBSDV từ lúa sang ngô Hệ gen virus có chiều dài

29124 bp, gồm 10 phân đoạn RNA sợi đôi có kích thước từ 1,8 đến 4,5 kb và được đặt tên theo thứ tự từ S1 đến S10 nhưng hầu hết đều chưa được xác định chức năng Dựa vào mức độ bảo thủ protein, phân đoạn S9 và S10 có mức độ bảo thủ cao, mã hóa cho protein vỏ

2

của virus, do vậy thích hợp để nghiên cứu chẩn đoán Phân đoạn S7 cũng có mức bảo thủ cao và mã hóa protein P7.1 có vai trò quan trọng trong tiến hóa, do vậy thích hợp để nghiên cứu mức độ biến động trong quần thể virus

Ở Việt Nam, dịch bệnh lúa lùn sọc đen được phát hiện thấy lần đầu tiên trên lúa mùa năm 2009 tại 20 tỉnh miền Bắc và miền Trung với diện tích lúa nhiễm bệnh lên tới 42.000 ha Vì là virus mới và lần đầu tiên xuất hiện ở Việt Nam nên công tác chẩn đoán gặp rất nhiều khó khăn Hai kỹ thuật chẩn đoán bệnh virus hiện đại và phổ biến nhất hiện nay là kỹ thuật RT-PCR và E IS Trong khi kỹ thuật chẩn đoán bằng RT-PCR cho kết quả có độ chính xác cao thì kỹ thuật chẩn đoán bằng ELISA cho kết quả tương đối chính xác, kỹ thuật đơn giản, giá thành rẻ nên rất phù hợp với điều kiện Việt Nam Tuy nhiên, do chưa có kháng thể đặc hiệu nên việc chẩn đoán cây bị nhiễm SRBSDV đều được thực hiện bằng phương pháp RT-PCR sử dụng cặp mồi từ Trung Quốc hoặc tự thiết kế dựa trên trình tự phân đoạn S10 của một số mẫu bệnh Ngoài ra, các virus thực vật vốn có tốc độ đột biến rất cao do đặc tính mắc lỗi sao mã của enzyme RdRP (RNA dependent RNA polymerase) của virus, sự thay đổi nhanh chóng các lực tiến hóa như ký chủ và vector cũng như bản chất bộ gen phân đoạn nên khả năng hình thành các chủng/loài virus mới rất cao Cho đến nay, chúng ta vẫn chưa có một nghiên cứu nào về đánh giá đa dạng di truyền SRBSDV gây bệnh ở các vùng sinh thái trồng lúa khác nhau ở Việt Nam cũng như nghiên cứu chuẩn hóa quy trình chẩn đoán SRBSDV Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành đề

tài: “Đánh giá đa dạng di truyền và phát triển kỹ thuật chẩn đoán virus lúa lùn sọc đen Phương Nam ở Việt Nam”

3

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Đánh giá đa dạng di truyền SRBSDV ở các vùng sinh thái trồng lúa khác nhau của Việt Nam dựa trên kết quả giải trình tự phân đoạn S7, S9 và S10

- Phát triển kỹ thuật chẩn đoán SRBSDV ở Việt Nam bằng kỹ thuật RT-PCR và ELISA

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Đối tượng

- Các mẫu virus lúa lùn sọc đen Phương Nam ở Việt Nam

- Các mẫu lúa nhiễm bệnh, sạch bệnh và các mẫu rầy nhiễm, sạch

virus lúa lùn sọc đen Phương Nam

Nội dung

- Phân lập, giải trình tự ba phân đoạn S7, S9, S10 của 13 mẫu SRBSDV đại diện cho các vùng sinh thái ở Việt Nam và đánh giá đa dạng di truyền

- Phát triển kỹ thuật chẩn đoán đặc hiệu SRBSDV tại Việt Nam bằng kỹ thuật RT-PCR

- Phát triển kỹ thuật chẩn đoán đặc hiệu SRBSDV tại Việt Nam

bằng ELISA

4 Tính mới của luận án

Luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu chuyên sâu và có hệ thống về đa dạng di truyền virus lúa lùn sọc đen phương Nam và bước đầu chứng minh chủng SRBSDV Việt Nam có quan hệ

di truyền gần gũi hơn với mẫu SRBSDV Quảng Đông

Luận án đã phát triển thành công kỹ thuật chẩn đoán SRBSDV bằng RT-PCR cho kết quả chính xác 100% với các mẫu lúa nhiễm bệnh đã biểu hiện rõ triệu chứng và có thể phát hiện sớm mẫu lúa nhiễm bệnh chưa biểu hiện rõ triệu chứng

4

Luận án cũng là công trình nghiên cứu đầu tiên tạo thành công kháng thể đa dòng kháng virus lúa lùn sọc đen Phương Nam bằng protein/peptide tái tổ hợp; kháng thể đa dòng có tính đặc hiệu cao, có thể phát hiện virus ở cả mẫu lúa và rầy nhiễm virus

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

Luận án cung cấp các cơ sở dữ liệu, thông tin khoa học mới về đa dạng di truyền SRBSDV ở Việt Nam, cung cấp tư liệu khoa học mới

về cơ sở khoa học và khả năng áp dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán SRBSDV ở Việt Nam

Kết quả đánh giá đa dạng di truyền SRBSDV ở Việt Nam làm cơ

sở cho nghiên cứu chẩn đoán, diễn biến phát dịch và đề xuất các biện pháp phòng trừ hiệu quả giúp giảm thiểu tổn thất mùa màng cho người nông dân

Kỹ thuật chẩn đoán SRBSDV bằng RT-PCR có độ chính xác cao, phát hiện được sự có mặt của virus trong những cây lúa chưa biểu hiện rõ triệu chứng và chẩn đoán virus bằng ELISA phát hiện nhanh sự có mặt của virus trong mẫu lúa và mẫu rầy nhiễm virus rất

có ý nghĩa trong công tác chẩn đoán sớm và chính xác tác nhân gây bệnh

6 Cấu trúc của luận án

Luận án dày 152 trang đánh máy vi tính khổ A4 với 6 bảng số liệu, 49 hình Luận án gồm 5 phần: Mở đầu 4 trang; Tổng quan tài liệu 34 trang; Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu 22 trang; Kết quả nghiên cứu và thảo luận 71 trang; Kết luận và kiến nghị 02 trang Đã tham khảo 125 tài liệu bao gồm 23 tài liệu tiếng Việt và 102 tài liệu tiếng Anh

5

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 CÁC VIRUS HẠI LÚA

Virus hại lúa đã có từ lâu và được xem là bệnh hại nguy hiểm hàng đầu ở cây lúa trên thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng Tuy nhiên phải đến năm 1895 các nhà khoa học Nhật Bản mới nghiên cứu và lần đầu tiên virus gây bệnh lúa vàng lùn (Rice dwarf virus-RDV) được phát hiện Tiếp theo, virus lúa lùn sọc đen (RBSDV) được phát hiện và rất nhiều virus hại lúa khác được xác định như virus gây bệnh Tungro (Tungro baccili-form virus-RTBV

và Tungro spherical virus-RTSV), vàng lá di động (RTYV- Rice transitory yellow-ing virus), lá khảm đốm chết (RNMV-Rice necrosis mosaic virus), lùn xoắn lá (RRSV-Rice ragged stunt virus), vàng lùn (RGSV- Rice grassy stunt virus), trắng lá lúa (RHBV-Rice hoja blanca virus)… Cho tới nay, đã có 16 loại virus gây hại trên lúa được phát hiện

Các virus phát hiện (vàng lùn, lùn xoắn lá, tungro, lùn sọc đen phương Nam ) ở Việt Nam đều có tầm quan trọng kinh tế và lan truyền qua rầy Việc chẩn đoán các virus trên lúa thường khó do triệu chứng có thể bị nhầm lẫn do sử dụng thuốc trừ cỏ hoặc các nguyên nhân sinh lý Phát hiện virus trên rầy buộc phải sử dụng các kỹ thuật chẩn đoán như E IS hoặc PCR

1.2 ĐẶC ĐIỂM CÁC FIJIVIRUS THUỘC HỌ REOVIRIDAE

Các virus thuộc họ Reoviridae được đặc trưng bởi bộ gen RN

sợi kép (dsRN ), phân đoạn, bao gồm 9 đến 12 phân tử RNA sợi kép

mạch thẳng Chi Fijivirus có hệ gen phân đoạn gồm 10 phân tử RNA

sợi kép, mạch thẳng (S1-S10) Các phân tử RN này có kích thước dao động từ 1,4 kb đến 4,5 kb

6

1.3 VIRUS LÚA LÙN SỌC ĐEN PHƯƠNG N M

Bệnh lúa lùn sọc đen phương nam lần đầu tiên xuất hiện ở tỉnh Quảng Đông, Trung Quốc (2001) và được xem là một biến chủng của RBSDV Cây lúa bị nhiễm SRBSDV sinh trưởng còi cọc, lá xanh đậm, xoăn trắng ở lá, rách mép lá và đặc biệt có những u sáp màu trắng hoặc đen chạy dọc các đường gân ở mặt sau lá, bẹ lá hoặc các đốt thân Rầy lưng trắng và một tỷ lệ nhỏ rầy nâu nhỏ là vector truyền SRBSDV Hệ gen của SRBSDV có chiều dài 29124 bp, gồm

10 phân đoạn RNA sợi đôi, có kích thước từ 1,8 đến 4,5 kb Trong

đó, phân đoạn S7 dài 2176 bp, chứa hai ORF mã hóa hai protein (40,5 kDa và 36,4 kDa); phân đoạn S9 dài 1899 bp, chứa hai ORF

mã hóa hai protein (39,9 kDa và 24,2 kDa); phân đoạn S10 dài 1797

bp, chứa một ORF mã hóa protein (62.6 kDa) hình thành lớp vỏ ngoài của phân tử virus SRBSDV có sự tương đồng về triệu chứng, phổ ký chủ, hình thái học phân tử virus, huyết thanh học với các

thành viên khác trong chi Fijivius, đặc biệt là RBSDV Hai kỹ thuật

chẩn đoán SRBSDV phổ biến nhất là thử nghiệm miễn dịch liên kết men (E IS ) và phản ứng trùng hợp chuỗi (RT-PCR)

1.4 VIRUS LÚA LÙN SỌC ĐEN PHƯƠNG N M Ở VIỆT NAM

SRBSDV lần đầu tiên xuất hiện vào tháng 8 2009, tại Nghệ An, sau đó lan ra tại 20 tỉnh miền Bắc và Bắc Trung Bộ với diện tích bị hại tới 42.000 ha Do tính chất nghiêm trọng của SRBSDV, ngoài việc xác định tác nhân gây bệnh, nhiều nghiên cứu về bản chất hệ gen và đa dạng di truyền của SRBSDV ở Việt Nam được nghiên cứu trong thời gian qua Năm 2010 và 2011, bệnh có xu hướng mở rộng

ra nhiều địa bàn trồng lúa khác nhau và có tới 34 tỉnh có diện tích

trồng lúa bị bệnh

do phòng Bệnh học phân tử - Viện di truyền Nông nghiệp cung cấp Các mẫu rầy khỏe, rầy nhiễm SRBSDV; các cây lúa nhiễm SRBSDV, RRSV lây nhiễm nhân tạo đƣợc cung cấp bởi Trung tâm bệnh cây nhiệt đới, Học viện Nông nghiệp Việt Nam

Bảng 2.1 Mẫu lúa nhiễm SRBSDV dùng trong nghiên cứu STT Tên mẫu Giống lúa Thời vụ Địa điểm

thu mẫu

1 SonLa-1 Xén cù Vụ xuân 2010 Sơn a

2 SonLa-2 Xén cù Vụ xuân 2010 Sơn a

3 LaoCai -1 Nhị ƣu 838 Vụ xuân 2009 Lào Cai

4 NinhBinh-1 BT7 Vụ mùa 2009 Ninh Bình

5 NinhBinh-2 BT7 Vụ mùa 2010 Ninh Bình

6 ThaiBinh-1 BT7 Vụ mùa 2009 Thái Bình

7 ThaiBinh-2 BT7 Vụ mùa 2010 Thái Bình

8 NamDinh-1 BT7 Vụ mùa 2009 Nam Định

9 NgheAn-1 Xi 23 Vụ mùa 2009 Nghệ An

10 QuangTri-1 Nhị ƣu 986 Vụ xuân 2010 Quảng Trị

11 QuangTri-2 Xi 23 Vụ xuân 2010 Quảng Trị

12 Hue-1 Nhị ƣu 986 Vụ xuân 2010 Huế

13 Hue-2 Nhị ƣu 986 Vụ xuân 2010 Huế

2.1.2 Chủng vi sinh vật

Chủng vi khuẩn E coli DH5α mua của hãng Invitrogen, E.coli

8

Rosetta (DE3) mua của hãng Novogen

2.1.3 Vector và oligonucleotide

Vector pET28a/P10 do phòng Bệnh học phân tử, Viện di truyền

Nông nghiệp cung cấp; pET32a mua của hãng Novogen; pGEM-T

mạch thẳng có đầu T mua của hãng Promega

Các oligonucleotide sử dụng trong nghiên cứu đặt mua từ hãng

Invitrogen và Sigma

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Đánh giá đa dạng di truyền SRBSDV ở Việt Nam

- Phát triển kỹ thuật chẩn đoán SRBSDV ở Việt Nam bằng RT-PCR

- Phát triển kỹ thuật chẩn đoán SRBSDV ở Việt Nam bằng ELISA

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

- Tách chiết, định lượng DNA/RNA

- Định lượng protein bằng bằng phương pháp Bradford

- Thiết kế mồi dựa trên trình tự được công bố trên GenBank

(EU784841.1, EU784843.1, EU784840)

- Nhân bản DNA/RNA bằng PCR và RT-PCR

- Nhân dòng và giải trình tự DNA

- Phát triển kỹ thuật chẩn đoán SRBSDV bằng RT-PCR

- Xác định vùng gen mã hóa polypeptide giàu tính kháng nguyên

bằng phần mềm Immune Epitope Database Analysis Resource

- Thiết kế vector biểu hiện gen đích trong tế bào vi khuẩn

- Tạo kháng thể đa dòng kháng SRBSDV theo phương pháp

Amero (1994) và Regenmortel (1993)

- Phương pháp kháng nguyên kháng thể: Kỹ thuật Western blot

của Sambrook & Rusel (2001); kỹ thuật Dot-blot của Wang

(2012); kỹ thuật PTA-ELISA của Mowat & Dawson (1987)

9

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1 NGHIÊN CỨU Đ DẠNG DI TRUYỀN SRBSDV Ở VIỆT NAM Mục tiêu của phần nghiên cứu này là đánh giá đặc điểm phân tử

và đa dạng di truyền SRBSDV của Việt Nam dựa trên trình tự 3 phân đoạn S7, S9 và S10 của các mẫu virus thu thập từ các vùng sinh thái trồng lúa Việt Nam

Hình 3.2 Tinh sạch phân đoạn S10, S9 và S7

Ghi chú: Giếng M: thang chuẩn DNA 1 kb; giếng 1: hệ gen SRBSDV; giếng

2: phân đoạn S10; giếng 3: phân đoạn S9; giếng 4: phân đoạn S7

Hệ gen của 13 mẫu SRBSDV đại diện cho các vùng sinh thái trồng lúa được tách chiết và điện di trên gel agarose Các băng RN tương ứng với các phân đoạn S7, S9 và S10 được tinh sạch từ gel agarose Kết quả điện di cho thấy sản phẩm tinh sạch có kích thước tương ứng với kích thước lý thuyết của các phân đoạn (Hình 3.2) Phân đoạn S7, S9, S10 được dòng hóa vào vector nhân dòng pGEM-T, giải trình tự và phân tích đa dạng di truyền bằng phần mềm MEGA5

Kết quả giải trình tự cho thấy thấy tất cả các phân đoạn S7, S9

và S10 của 13 mẫu SRBSDV phân lập tại Việt Nam đều có kích thước giống nhau, lần lượt là 2176 bp, 1849 bp và 1798 bp Mức độ tương đồng nucleotide của các mẫu virus Việt Nam với nhau dao động từ 97,6-100% và với các chủng Trung Quốc dao động từ 97,3 - 99,8% Kết quả so sánh trình tự axit amin trên các khung đọc mở cho

10

thấy chủng SRBSDV Việt Nam có quan hệ di truyền gần gũi hơn với SRBSDV Quảng Đông (Hình 3.10, Hình 3.11, Hình 3.13)

Hình 3.10 So sánh trình tự amino acid của protein P9.1

Hình 3.11 So sánh trình tự amino acid của protein P9.2

Hình 3.13 So sánh trình tự amino acid của protein P10

11

Cây phả hệ dựa trên trình tự nucleotide của SRBSDV cho thấy các mẫu Việt Nam và Trung Quốc xuất hiện xen kẽ trên cây phả hệ, chứng tỏ chúng là một quần thể virus gây hại trong một vùng địa lý ở cùng một thời điểm, chƣa hình thành chủng mới

Hình 3.9 Xây dựng cây phả hệ của SRBSDV dựa trên trình tự

phân đoạn S7

Ghi chú: Các số trên mỗi nốt là giá trị boostrap tính theo %) Mẫu Việt

Nam được chỉ rõ bằng chấm đen Thanh bar là số thay thế nucleotide

Hình 3.12 Xây dựng cây phả hệ của SRBSDV dựa trên trình tự

phân đoạn S9

Ghi chú: Các số trên mỗi nốt là giá trị boostrap tính theo % (1000 lần lặp)

Mẫu Việt Nam được chỉ rõ bằng chấm đen

NinhBinh-2 JQ692578.1-VN

JN388912.1-TQ ThaiBinh-2 NamDinh Hue-1 EU784841.1-QuangDong-TQ FN563995.1-HaiNam-TQ

HQ731498.1-ThuaThienHue HM998850.1-TQ

Hue-2 HM585273.1-TQ JQ034354.1-TQ

SonLa-1 SonLa-2

NgheAn NinhBinh-1 LaoCai ThaiBinh-1

QuangTri-1

QuangTri-2

100 100

80

40 80 100

80

50

100 60 20

2

HQ731500-VN QuangTri-1 EU523359-HaiNam-TQ LaoCai

ThaiBinh-2 HM585271-TQ JQ692580.1-ThuaThienHue NinhBinh-2

ThaiBinh-1 SonLa-2 HM998852-TQ JQ773428-TQ QuangTri-2 Hue-1 Hue-2 SonLa-1 NgheAn JQ034356-TQ EU784843-QuangDong-TQ NamDinh

NinhBinh-1

100 100

100 100 100

77

55 66

33

33 44 77