Nghiên cứu phát triển hệ thống chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens cho nấm sợi Aspergillus oryzae

oryzaecó thể hình thành trong quá trình thuần hóa của con người [53].Sự hiểu biết tường tận về hệ gen của Aspergillus oryzae đã mở ra nhiều cơ hội mới trong nghiên cứu cải biến di truyề

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

KHOA SINH HỌC

-

Nguyễn Thị Khuyến

NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN HỆ THỐNG CHUYỂN

GEN BẰNG VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens

CHO NẤM SỢI Aspergillus oryzae

MỤC LỤC

Trang

MỞ ĐẦU 4

Chương 1 TỔNG QUAN 6

1.1 Giới thiệu chung về nấm sợi Aspergillus oryzae 6

1.1.1 Đặc điểm sinh học của nấm sợi Aspergillus oryzae 6

1.1.2 Đặc điểm di truyền của nấm sợi A oryzae 7

1.1.3 Vai trò của nấm sợi A oryzae 8

1.1.4 Ph}n biệt Aspergillus oryzae với Aspergillus flavus sinh độc tố aflatoxin 9

1.2 C|c phương ph|p chuyển gen v{o nấm sợi 12

1.2.1 Phương ph|p chuyển gen sử dụng tế b{o trần (protoplast) 12

1.2.2 Kỹ thuật chuyển gen bằng xung điện (electroporation) 13

1.2.3 Phương ph|p chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens (ATMT) 13

1.2.4 Marker sử dụng trong chọn lọc c|c chủng chuyển gen 17

1.2.5 Một số gen chỉ thị dùng trong chuyển gen ở vi nấm 19

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 23

2.1 Nguyên liệu 23

2.1.1 Chủng vi sinh vật 23

2.1.2 Thiết bị v{ hóa chất 25

2.1.3 Môi trường sử dụng trong nghiên cứu 28

2.2 Phương ph|p nghiên cứu 28

2.2.1 Thu nhận b{o tử nấm 29

2.2.2 T|ch chiết DNA, RNA v{ tổng hợp cDNA 29

2.2.3 Quan s|t hình th|i v{ kiểm tra một số đặc điểm sinh lý sinh hóa 30

2.2.4 Ph}n biệt A oryzae v{ A Flavus bằng c|c kỹ thuật sinh học ph}n tử 31

2.2.5 Tạo c|c vector nhị thể dùng cho chuyển gen 32

2.2.6 Chuyển gen v{o nấm sợi A oryzae Error! Bookmark not defined

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Error! Bookmark not defined

3.1 X|c nhận chủng A oryzae an to{n để sử dụng cho chuyển gen Error!

Bookmark not defined

3.1.1 Ph}n biệt c|c chủng A oryzae an to{n v{ chủng Aspergillus flavus sinh độc

tố aflatoxin Error! Bookmark not defined

3.1.2 Lựa chọn chủng A oryzae phục vụ cho chuyển gen Error! Bookmark not

defined

3.2 Lựa chọn marker chuyển gen v{o A oryzae Error! Bookmark not defined 3.3 X}y dựng hệ thống chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens Error!

Bookmark not defined

3.3.1 Xóa gen pyrG để tạo chủng đột biến trợ dưỡng uridine/uracil Error!

Bookmark not defined

3.3.2 Tạo một số vector nhị thể dùng cho chuyển gen v{o A oryzae trợ dưỡng

uridine/uracil Error! Bookmark not defined

3.4 Đ|nh gi| hiệu quả của hệ thống chuyển gen với gen huỳnh quang GFP v{

DsRed Error! Bookmark not defined

3.4.1 Chuyển gen GFP v{ DsRed v{o nấm sợi A oryzae trợ dưỡng uridine/uracil

Error! Bookmark not defined 3.4.2 X|c nhận c|c thể chuyển gen Error! Bookmark not defined

3.5 Ứng dụng hệ thống chuyển gen mới thiết lập để biểu hiện gen phyA m~ hóa

enzyme phytase của A fumigatus ở A oryzae Error! Bookmark not defined

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Error! Bookmark not defined TÀI LIỆU THAM KHẢO 34

MỞ ĐẦU

Aspergillus oryzaelà loài nấm sợi được sử dụng rộng rãi trong sản xuất thực

phẩm truyền thống và đồ uống tại nhiều nước châu Á bao gồm Nhật Bản, Trung Quốc, Hàn Quốc, Việt Nam, Thái Lan, Malaysia và Philippines Loài nấm này đã được Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) công nhận là an toàn

(GRAS) Ở Việt Nam, A oryzae được sử dụng để sản xuấttương truyền thống tại một

số địa phương ở các tỉnh phía Bắc.A oryzae có khả năng tiết một lượng lớn các

enzyme khác nhau vào môi trường Do đó, loài nấm này được sử dụng như nhà máy

tế bào để sản xuất thương mại nhiều loại enzyme và protein cả ở dạng tự nhiên và tái

tổ hợp Gần đây chủng A oryzae RIB40 dùng trong sản xuất công nghiệp tại Nhật Bản đã được giải trình tự toàn bộ hệ gen Sự hiểu biết tường tận về hệ gen của A oryzae mở ra nhiều cơ hội trong cải biến di truyền và biểu hiện gen trên loài nấm sợi

an toàn này

Hiện nay, hai phương pháp phổ biến nhất trong chuyển gen vào nấm sợi là

chuyển gen qua tế bào trần và chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Tuy nhiên việcchuyển gen vào nấm sợiA oryzaecho đến nay chỉ sử

dụng phương pháp chuyển gen qua tế bào trần.Phương pháp này tương đối phức tạp

và tốn kém, khó có thể thực hiện tại điều kiện phòng thí nghiệm tại Việt Nam

Phương pháp chuyển gen sử dụng vi khuẩn A tumefaciens đơn giản hơn với chi phí

hợp lý Tuy nhiên chưa có một nghiên cứu nào báo cáo về việc chuyển gen thành

công ở nấm sợi A oryzae Bên cạnh đó, A oryzaecókhả năng kháng lại hầu hết các

hợp chất kháng sinh thường được sử dụng cho chuyển gen.Do đó phát triển các

chủng A oryzae trợ dưỡngđể sử dụng cho chuyển gen là giải pháp duy nhất để cải biến di truyền cũng như biểu hiện gen ởA oryzae

Với mục đích xây dựng hệ thống chuyển genhiệu quả cho nấm sợi A oryzae thông quavi khuẩn A tumefaciensnhằm phục vụ hướng nghiên cứu bền vững về biểu

hiện enzyme/protein tái tổ hợp ở loài nấm này, chúng tôi thực hiện đề tài“Nghiên

cứu phát triển hệ thống chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens cho nấm sợi Aspergillus oryzae” với những nội dung chính như sau:

- Xác nhận các chủng A oryzae an toàn, có thể sử dụng làm đối tượng

chuyển gen

- Tạo chủng A oryzae đột biến trợ dưỡng uridine/uracil bằng cách xóa gen pyrG

- Tạomột số vector nhị thể (binary vector) sử dụng cho chuyển gen và biểu

hiện gen ở nấm sợi A oryzae

- Đánh giá hiệu quả của hệ thống chuyển gen sử dụng các gen chỉ thị huỳnh

quangGFP vàDsRed

- Bước đầu ứng dụng hệ thống chuyển gen mới tạođược để biểu hiện gen

phyA mã hóa enzyme phytase từ nấm sợi Aspergillus fumigatus

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu chung về nấm sợiAspergillus oryzae

1.1.1 Đặc điểm sinh học của nấm sợiAspergillus oryzae

Nấm sợiA oryzae thuộc phân nhóm Flavicủachi Aspergillus, trong họTrichocomaceae A oryzae có cấu tạo đa bào, khi được nuôi cấy trên môi trường

đĩa thạch,hệ sợicó màu trắng xámsau đó phát triển chuyển sang màu vàng nhạt đến

xanh Hệ sợi nấm A oryzae sinh trưởng rất nhanh và phân mảnh, chiều ngang có kích

thước 5-7 µm Trên những sợi này hình thành cấu trúc sinh sản vô tính, gọi là cuống

sinh bào tử Cuống sinh bào tử của A oryzae thường dài 1-2 mm Trên cuống phồng

lên tạo thành bọng, từ bọng này mọc lên các tế bào nhỏ, thuôn dài hình chai, xếp sát nhau, gọi là thể bình; trên thể bình có đính những chuỗi bào tử màu vàng lục hay màu vàng hoa cau (còn gọi là bào tử đính)[31, 53, 80, 99] Hình thái khuẩn lạc và

cuống sinh bào tử của nấm sợi A oryzae được Machida và cộng sựmô tả chi tiết như

trong Hình 1.1

Hình 1.1.Hình thái khuẩn lạc và cấu trúc cuống sinh bào tử của nấm sợi Aspergillus

oryzae RIB40[53]

Nấm sợiA oryzae sinh trưởng tốt ở nhiệt độ 30ºC-40ºC, chúng có thể sinh

trưởng và phát triển dễ dàng trên nhiều loại cơ chất khác nhau như các mảnh vụn

thực vật, cây lá, gỗ mục nát, các loại hạt, thức ăn gia súc A oryzae phân bố rộng rãi

trên toàn thế giới, đặc biệt phổ biếnở các nước nhiệt đới Trong quá trình sinh trưởng

và phát triển, A oryzae tiết ra môi trường một lượng lớn các enzyme thủy phân như

cellulase, pectinase, xylanase, amylase, protease, glucoamylase[36, 53]

1.1.2.Đặc điểm di truyền của nấm sợi A oryzae

Gần đây, chủng A oryzaeRIB40 được sử dụngtrong công nghiệp sản xuất các

thực phẩm lên men truyền thống tại Nhật Bản đã được giải trình tự toàn bộ hệ gen,

theo đó hệ gencủa A oryzaegồm 8 nhiễm sắc thể với tổng kích thước là 37 megabase

(Mb), dự đoán có 12.074 gen mã hóa protein, lớn hơn 25%-30% so với các loài khác

thuộc chi Aspergillus Chẳng hạn,hệ gen của A oryzae lớn hơn loài A nidulans(loài chuẩn dùng cho nghiên cứu trong phòng thí nghiệm) và A fumigatus(tác nhân gây bệnh cơ hội ở người) lần lượt là 29% và 34%[53].Hệ gencủa A oryzae lớn hơnchủ

yếu do thu nạp thêm DNA trong quá trình tiến hóa Việc mở rộng kích thước hệ gen

dường như đặc trưng cho các loài có quan hệgần gũi với A oryzaenhư A niger và A flavus, các loài này cókích thước hệ gen tương đương nhau Đặc biệt loài có quan hệ rất gần gũi với A oryzae là A flavuscó độ tương đồng DNA đến 99,5%[2, 53, 85]

A oryzae có khả năng phân giải mạnh nhiều loại cơ chất có trong tự nhiêndo loài này sở hữu các gen mã hóa enzyme thủy phân khác nhau Các loàiA oryzae, A fumigatusvà A nidulans chứa lần lượt 135, 99 và 90 gen mã hóa cho các protease,

chiếm khoảng 1% tổng số các gen trong hệ gen Tất cả các gen mã hóa protease được

tìm thấy trong A fumigatus và/hoặcA nidulansđều có mặt trong A oryzae, tuy nhiêncác gen mã hóa một sốenzyme aminopeptidase có mặt trongA oryzaelại không

có mặt trong hệ gen củaA fumigatus và A nidulans Ngoài ra,A oryzaecòn sở hữu

thêm nhiều gen mã hóa protease tiết có khả năng hoạt động trong môi trường có tính

axit Sự gia tăng các protease hoạt động trong pH axit củaA oryzaecó thể hình thành

trong quá trình thuần hóa của con người [53].Sự hiểu biết tường tận về hệ gen của

Aspergillus oryzae đã mở ra nhiều cơ hội mới trong nghiên cứu cải biến di truyền

ứng dụng loài nấm an toàn này trong sản xuất các sản phẩm nhằm phục vụ mục đích con người

1.1.3 Vai trò của nấm sợiA.oryzae

Nấm sợiA oryzaeđược thuần hóa từ ít nhất 2000 năm trước và hiện nay được

sử dụng rộng rãitrong sản xuất thực phẩmởNhật Bản, Trung Quốc và các nước Đông

Á như lên men đậu nành, làm nước sốt, tương và một số đồ uống có cồn như

huangjiu, sake, makgeolli và shochu[4, 36, 111] A oryzae được sử dụng rộng rãi

trong thực phẩm do đặc tính sinh trưởng nhanh,tiết lượng lớn các enzyme thủy phânnhư amylase, glucoamylase, carboxypeptidase, protease trong quá trình sinh trưởng và tạo mùi thơm dễ chịu cho các sản phẩm lên men[37].Trong lên men truyền

thống, A oryzae thường được nuôi ởmôi trường rắn, điều kiện này thích hợp cho sự

phát triển hiếu khí của sợi nấm Độ ẩm thích hợp trong quá trình lên men ở môi trường rắn giúp tăng khả năng sản sinh các enzyme và các chất chuyển hóa mà thường sẽ không được sản xuất trong điều kiện lên men lỏng[99]

Ngoài vai trò trong sản xuất các thực phẩm truyền thống, nấm sợi A oryzae

còn được sử dụng trong một số ngành công nghiệp sản xuất enzyme có giá trị kinh tế cao như glucoamylase, α-amylase và một số protease phục vụ sản xuất bánh kẹo, đồ uống Glucoamylase và α-amylase thuộc nhóm enzyme amylase, chiếm tới gần 20%

tổng sản lượng enzyme được sản xuất, trong đóchủ yếu được sản xuất bởinấm sợiA oryzae[16, 81, 98, 113].Nguồn cung cấp enzyme protease cho công nghiệp sản xuất thực phẩm và các chất tẩy rửa đến từ các loài nấm sợi thuộc chi Conidiobolus, Verticillium, Penicillium và Aspergillus, trong đó phải kể đến loài sinh protease rất cao là A oryzae[1, 106]

Bên cạnh những lợi ích về kinh tế, A oryzae còn được coi là vi sinh vật mô

hình dùng cho nghiên cứu về biểu hiện enzyme và protein tái tổ hợp Ngoài ra nghiên cứu chuyển gen còn hỗ trợ trong việctìm ra chức năng cũng như vai trò của các gen mới[54]

1.1.4 Phân biệt Aspergillus oryzae vớiAspergillus flavussinh độc tố

80]

A flavusvà A oryzaelà hai loài thuộc phân nhóm Flavi của chi Aspergillus Tương tự như A oryzae, nấm sợi A flavus có khả năng tồn tại ở nhiệt độ từ 12ºC đến 48ºC và sinh trưởng tối ưu nhất ở 28ºC đến 37ºC Hầu hết trong chu trình sống A flavus tồn tại ở dạng hệ sợi và sinh sản bằng bào tử đính.Giống với một số chủng A oryzae, dưới điều kiện bất lợi, sợi nấm A flavus chuyển thành cấu trúc đặc biệt gọi là

hạch nấm (sclerotia) Hạch nấm giúp chúng có thể tồn tại dưới các điều kiện khắc nghiệt Khi điều kiện trở nên thuận lợi, các hạch nấm sẽphát triển thành dạng sợi vàtừ

đó sinh ra các cuống mang bào tử đính, phát tán ra ngoài môi trường đất và không

khí [17, 26]

Trong tự nhiên, rất khó để có thể phân biệt hai loài A oryzae và A flavus bởi

hình thái rất giống nhau.Hơn nữa,khi giải trình tự hai chủng đại diện cho hai loài,

nhận thấy genome của chủng A oryzae RIB40 và A flavus NRRL 3357 có độ tương

đồng 99,5% DNA và 98% protein [85] Phân tích tiến hóa trên một số chủng thuộc

hai chi này, nhận thấyA flavus và A oryzaecó mức độ tương đồng tùy thuộc vào từng chủng Ví dụ như hai chủngA flavusSRRC 1357 và SRRC 2112có mối quan hệ gần gũi với A oryzae hơn các chủngA flavus khác, do có nhiều đặc điểm của A oryzae hơn (Hình 1.2) Từ các dữ liệu về hệ gen, A oryzaeđược cho rằng có nguồn gốc phát sinh từ loài A flavus[18]

Hình 1.2.Mối quan hệ phát sinh loài và sự khác biệt trong hệ gen củaA oryzae và

A flavus (màu xanh lam là A oryzae, màu xanh lá cây là A flavus)[18]

A oryzaekhác với A flavus ở việc mất khả năng sinh độc tốaflatoxin trong quá

trình sinh trưởngdo trong quá trình tiến hóa đã tích lũy nhiều đột biến điểm và đột biến mất đoạn ở một số gen liên quan đến sinh tổng hợp aflatoxin[8] Con đường sinh tổng hợp aflatoxin bắt nguồn từ axit norsolorinic (NOR), trải qua ít nhất 23 quá trình chuyển hóa trung gian, nhờ các enzyme được mã hóa bởi 25 gen nằm trong một vùng DNA kích thước

70 kb để tạo thành aflatoxin có độc tính cao nhất là aflatoxin B1 (AFB1)[47, 97, 112]

Các bước chuyển hóa được thực hiện bởi các enzyme có chức năng riêng biệt Các gen liên quan đến từng bước chuyển hóa trong quá trình sản xuất aflatoxin trong tế bào nấm được liệt kê tại Bảng 1.1

Bảng 1.1 Các gen liên quan trong quá trình sinh tổng hợp aflatoxin

Các gen liên quan Quá trình chuyển đổi

aflA (fas-2), aflB (fas-1), và aflC (pksA) Acetate -> NOR

aflD (nor-1), aflE (norA), và aflF (norB) NOR -> AVN

aflM (ver-1) và aflN (verA) VERA -> DMST

aflO (omtB, dmtA) DMST -> ST; DMDHST -> DHST

DMDHST -> AFB2, AFG2

Trong hai thập kỷ qua, nhiều kỹ thuật sinh học phân tử đã được sử dụng để

phân biệt các loài thuộc phân nhóm Flavi như kỹ thuật PCR (Polymerase Chain

Reaction)[10], RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)[38], AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) [66], phân tích so sánh trình tự vùng ITS (Internal Transcribed Spacer) của DNA ribosome[41] hoặc phân tích tính đa

hình nucleotide đơn SNP (Single Nucleotide Polymorphism) [45] Tuy nhiên, các

phương pháp kể trên vẫn còn những hạn chế nhất định trong việc phân biệtA oryzaevàA flavus hoặc thiếu sự ổn định trong các lần lặp lại thí nghiệm[8] Dựa trên

sự khác biệt về trình tự DNA của nhóm gen liên quan đến sinh tổng hợp aflatoxin ở

A flavus và A oryzae, một số cặp mồi PCR đặc hiệu cho các gen này đã được thiết

kế và sử dụng để phân biệt A flavusvàA oryzae[10]

1.2.Các phương pháp chuyển gen vào nấm sợi

Các nghiên cứu về di truyền học phân tử của nấm sợi đã có những đóng góp đáng kể cho sự hiểu biết của con người về cơ chế gây bệnh và các con đường sinh tổng hợp enzyme, protein Chuyển gen là một công cụ không thể thiếu trong các nghiên cứu này

Hiện nay, nhiều phương pháp chuyển gen được sử dụng như chuyển gen thông qua tế bào trần (protoplast), chuyển gen bằng xung điện, chuyển gen bằng súng bắn

gen và chuyển gen sử dụng vi sinh vật trung gian là vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Mỗi phương pháp đều có những ưu, nhược điểm riêng và tùy thuộc vào

từng loài mà hiệu suất chuyển gen khác nhau đối với từng phương pháp Tuy nhiên phương pháp được sử dụng phổ biến nhấtở nấm sợi làchuyển gen qua tế bào trần (protoplast), chuyển gen bằng xung điện (electroporation)và chuyển gen trung gian

qua vi khuẩn A.tumefaciens[6, 51, 62, 63]

1.2.1 Phương pháp chuyển gen sử dụng tế bào trần (protoplast)

Ðể chuyển gen vào nấm thông qua tế bào trần, tế bào nấm cần được xử lý enzyme nhằm loại bỏ thành tế bào, từ đó tạo protoplastgiúpDNA dễ dàng xâm nhập vào tế bào Phương phápnày có thể được sử dụng để chuyển trực tiếp các đoạn DNA hoặc các vector mang gen mong muốn vào tế bào Ðể nâng cao hiệu quả chuyển gen, protoplast thường được xử lý với PEG (polyethylene glycol) hoặc bằng xung điện Phương pháp chuyển gen này khá hiệu quả, đặc biệt đối với những loài mà các phương pháp chuyển gen kháckhông thể thực hiện được Tuy nhiên, quá trìnhchuẩn

bị protoplast cũng như các bước chuyển genkhá phức tạp, tốn nhiều công sức, chi phí

cao và không ổn định, đòi hỏi người thực hiện phải có nhiều kinh nghiệm, không thể

áp dụng rộng rãi tại các phòng thí nghiệm vừa và nhỏ Đặc biệt protoplast phải được

sử dụng ngay sau khi chuẩn bị[51, 57]

1.2.2 Kỹ thuật chuyển gen bằng xung điện (electroporation)

Kỹ thuật chuyển gen bằng xung điện là phương pháp cơ học được sử dụng để đưa các phân tử DNA vào trong tế bào chủ qua màng tế bào Trong phương pháp này, một xung điện cao thế trong thời gian rất ngắn (vài phần nghìn giây) tạo ra các

lỗ thủng tạm thời giúp cho các phân tửDNA ngoại lai từ môi trường có thể xâm nhập vào bên trong tế bào Phương pháp xung điện đã được áp dụng thành công trên nhiều loại tế bào, trong đó có tế bào nấm sợi[6, 7] Trước khi xửlý với xung điện, bào tử nấm nảy chồi sẽ được loại bỏ thành tế bào bằng một số enzyme để tạo tế bào trần Sau đó tế bào trần được trộn với DNA và được đưa vào máy tạo xung điện để chuyển DNA vào trong tế bào nấm [7] Phương pháp này mới chỉ áp dựng thành công với một số loài nấm sợi và đòi hỏi phải có thiết bị chuyên dụng dùng cho quá trình chuyển gen

1.2.3 Phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens

(ATMT)

1.2.3.1 Cơ chế chuyển gen vào tế bào chủ của A tumefaciens

Vi khuẩn A tumefacienslà một loài vi khuẩn Gram âm sống trong đất, thuộc chi Agrobacterium, họ Rhizobiaceae Vi khuẩn A tumefaciens là tác nhân gây khối u

trên thực vật nhờ chuyển một phần DNA (T-DNA) trên plasmid cảm ứng khối u plasmid) của nó vào tế bào thực vật Các gen nằm trên T-DNA mã hóa cho các enzyme ảnh hưởng đến sự sinh trưởng mất kiểm soát của tế bào thực vật là nguyên nhân chính dẫn đến sự hình thành khối u[28, 108] Quá trình chuyển gen gây khối u

(Ti-nằm trên Ti-plasmid của vi khuẩn A tumefaciens được mô tả trên Hình 1.3

Hình 1.3.Vi khuẩn A tumefaciens gây khối u trên thực vật [95]

Ti plasmid có kích thước 200 kb-800 kb, bao gồm đoạn T-DNA được giới hạn bởi biên trái (LB) và biên phải (RB), các biên có kích thước khoảng 25 bp.T-DNA mang gen tổng hợp auxin, cytokinin và opine Các gen này sẽ tích hợp vào hệ gen của thực vật ở một vị trí ngẫu nhiên Ngoài T-DNA, trên Ti plasmid còn có vùng gen

độc, chứa các gen virmã hóa các protein (virA, virG, và một số protein khác)giúp vận chuyển T-DNA vào trong tế bào thực vật[28] Các gen vir này chính là yếu tố quyết địnhkhả năng chuyển T-DNA vào tế bào chủ của vi khuẩn Agrobacterium Sự hoạt động của các gen virđược cảm ứng bởi hợp chất phenolic có nguồn gốc từ thực vật,

có tên là acetosyringone (AS) [63] Khi có mặt chất cảm ứng, gen vir hoạt động dẫn

tới quá trình chuyển T-DNA trên Ti plasmid vào tế bào

1.2.3.2 Chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens

Trong điều kiện có chất cảm ứng, vi khuẩnA tumefaciens sẽ chuyển một phần

DNA trên Ti plasmid (còn gọi là T-DNA) của nó vào tế bào thực vật T-DNA sau đó

được tích hợp ngẫu nhiên vào hệ gen [24, 28] Lợi dụng cơ chế này, vi khuẩn A tumefaciens được sử dụng làm sinh vật trung gian để chuyển gen vào thực vật từ

những năm 1980, sau đó vào năm 1998 vi khuẩn này lần đầu tiên được ứng dụng thành công để chuyển gen vào nấm[12]

Phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens được coi là

phương pháp đơn giản nhất để chuyển gen vào nấm sợi Phương pháp ATMT chuyển gen vào nấm dựa trên cơ chế chuyển đoạn T-DNA trên Ti-plasmid có mặt trong tế bào vi khuẩn sau đó tích hợp ngẫu nhiên vào hệ gen nấm Các gen cần chuyển sẽ

được gắn vào vùng T-DNA, sau đó được biến nạp vào vi khuẩn A tumefaciensdùng

cho chuyển vào nấm Phương pháp chuyển gen này đã được thực hiện thành công trên nhiều loài nấm sợi khác nhau[12, 23, 62, 63, 93]

Chuyển gen vào nấm thông qua vi khuẩn A tumefaciens cần một hệ thống gồm hai plasmid là plasmid trợ giúp (vir helper)có chứacác gen vir (virulence) giúp

vận chuyển DNA vào tế bào chủ, và một vector nhị thể(binary vector)chứa đoạn DNA đã được cải biến cho mục đích chuyển gen[63] Trên vectornhị thể cóchứa gen kháng kháng sinh dùng để chọn lọc vi khuẩn mang vector và vùng T-DNA giới hạn bởi hai biên LB (left border) và RB (right border) có chứa marker chọn lọc thể chuyển gen và một vùng DNA có thể được cải biến tùy vào mục đích chuyển gen[27, 74] Mô hình hệ thống vector nhị thể hiện trong Hình 1.4

T-Hình 1.4.Mô hình tổng quát về hệ thống vector nhị thể cho chuyển gen vào nấm

thông qua vi khuẩn A tumefaciens[46]

Một trong những ưu điểm lớn nhất của phương pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn

A tumefaciens là có thể tạo ra một loạt các thể đột biến ngẫu nhiên do T-DNA từ

tế bào vi khuẩn chèn ngẫu nhiên vào hệ gen của vi nấm Một số nghiên cứu chỉ ra

rằng A tumefaciens chèn T-DNA vào hệ gen của nấm chủ yếu chỉ ở dạng một bản

đơn và đoạn T-DNA này có thể phá hủy một gen duy nhất ở thể biến nạp tương ứng

Từ việc nghiên cứu các thể đột biến chèn ngẫu nhiên có thể giúp xác định chức năng của gen.Ngoài chức năng biểu hiện và tạo các thể đột biến ngẫu nhiên, phương pháp

chuyển gen bằng A tumefaciens còn được sử dụng trong việc xóa các gen nhờ cơ chế

trao đổi chéo tương đồng trong tế bào nấm[49]

Phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens đã được ghi nhận chuyển thành công ở một số loài nấm sợithuộc chi Aspergillus (A fumigatus, A awamori, A japonicas, A niger), tuy nhiên chưa có một nghiên cứu nào đề cập đến việc chuyển gen vào A oryzae thông qua vi khuẩn A tumefaciens[12, 23, 62, 63, 93] 1.2.3.3 Ưu và nhược điểm của phương pháp

Chuyển gen vào nấm thông qua vi khuẩn A tumefaciens thực hiện đơn giản

hơn nhiều so với các phương pháp khác, tuy nhiênthời gian tiến hành dài hơn do cần thời gian đồng nuôi cấy cảm ứnggiữa nấm và vi khuẩn [62] Nguyên liệu của chuyển gen có thể sử dụng hệ sợi hoặc bào tử nấm mà không cần bất cứ khâu xử lý bổ xung nào như chuyển gen qua protoplast hay chuyển gen bằng xung điện Thậm chí, chỉ sử dụng phương pháp này mới khả thi đối với một số loài nấm[90, 102] Hiệu quả

chuyển gen vàonấm sợikhi sử dụng vi khuẩn Agrobacterium thu được số thể chuyển

cao hơn nhiều lần so với chuyển gen bằng tế bào trần nhờ PEG [61, 86] Bên cạnh

đó, các nghiên cứu gần đây cũng chỉ ra rằng việc xóa gen ở nấm nhờ cơ chế trao đổi

DNA tương đồng nhờ A tumefaciens đạt hiệu quả cao hơn so với xóa gen bằng các

phương pháp khác Hiệu quả xóa gen khi sử dụng protoplast chỉ đạt 1%-50%, nhưng

khi sử dụng vi khuẩn A tumefaciens hiệu quả có thể đạt đến 97% [11]

1.2.3.4 Ứng dụng của phương pháp ATMT trong cải biến di truyền Phương pháp chuyển gen vào nấm bằng vi khuẩn A tumefaciens đã được

chứng minh lợi thế hơn các phương pháp chuyển gen thông thường Nguyên liệu ban đầu có thể được sử dụng như sợi nấm, tế bào trần hoặc bào tử Chuyển gen bằng phương pháp ATMT tạo một tỷ lệ cao các thể đột biến ngẫu nhiên do T-DNA chèn vào hệ gen vật chủ[12, 61, 68] Ngoài ra, chuyển gen bằng phương pháp này có thể

tạo ra các trao đổi chéo tương đồng Do đó là công cụ hữu ích để xóa và xác định các chức năng của gen [63]

Để xác định chức năng của một gencụ thể, phương pháp hữu hiệu nhất là gây

đột biến xóa hoặc làm hỏng gen đó Xóa một gen cụ thể ởSaccharomyces cerevisiaeđạt hiệu quả cao và chỉ cần hai đoạn tương đồng nhỏ (50 bp) ở hai phía

trình tự mã hóa[91].Tuy nhiên, ở nấm sợi cần hai đoạn tương đồng kích thước lớn hơn.Xóa gen sử dụng phương pháp ATMT được ghi nhận là có hiệu quả cao hơn so các phương pháp chuyển gen khác Hiệu quả xóa gen dao động từ 14% đến 75%, cao hơn hẳn so với các phương pháp chuyển gen thông thường[63]

1.2.4 Marker sử dụng trong chọn lọc các chủng chuyển gen

Hiện nay, marker dùng trong chọn lọc các thể chuyển gengồm 2 loại là gen kháng kháng sinhvà các gen liên quan đến sinh tổng hợp một hay nhiều hợp chất thiết yếu trong quá trình sinh trưởng của nấm

1.2.4.1 Gen kháng kháng sinh dùng trong chuyển gen ở nấm

Các loại kháng sinh kháng nấm thông dụng nhất được sử dụng trong chọn lọc thể chuyển gen là hygromycin B, phleomycin và nourseothricin Hygromycin B là một loại kháng sinh thuộc nhóm aminoglycoside, được sản xuất từxạ khuẩn

Streptomyces hygroscopicus Chúng có thể tiêu diệt vi khuẩn, nấm và các tế bào nhân

chuẩn bằng cách ức chế tổng hợp protein[76] Phleomycin được sản xuất bởi xạ

khuẩn Streptomyces verticillus, là một kháng sinh phổ rộng có hiệu quả chống lại hầu

hết các loại vi khuẩn, nấm sợi, nấm men, thực vật và tế bào động vật Kháng sinh phleomycin thuộc nhóm kháng sinh glycopeptide, gây chết tế bàobằng cách bám vào DNA và làm phá vỡ sợi kép của DNA dẫn đến các hoạt động của tế bào bị ngừng và chết[9] Nourseothricin, với tên thương mại là clonNAT, thuộc nhóm kháng sinh

aminoglycoside có nguồn gốc từ loài xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces Kháng sinh

nàyhoạt động bằng cách gây lỗi mã hóa trong quá trình dịch mã dẫn tới không tổng

hợp được protein ClonNAT được dùng rất phổ biến làm marker chọn lọc thể chuyển gen gồm cả vi khuẩn, nấm men, nấm sợi và tế bào thực vật [39]

1.2.4.2 Gen trợ dưỡng dùng làm marker cho chuyển gen

Chủng nấm đột biến trợ dưỡng là các chủng mất khả năng sinh tổng hợp một loại axit amin hoặc một hợp chấtcần thiết trong quá trình sinh trưởng, việc mất khả năng tự tổng hợp khiến chúng không còn khả năng sinh trưởng trên môi trường tối thiểu mà cần phải bổ sung thêm axit amin hoặc hợp chất tương ứng Gen trợ dưỡng

được sử dụng nhiều nhất trong chọn lọc thể chuyển gen là gen pyrG (mã hóa protein

tham gia quá trình tổng hợp uridine/uracil)[49, 59, 94] Ngoài ra còn có các gen trợ

dưỡng khác cũng được sử dụng nhưadeA(gen mã hóa enzyme tham gia tổng hợp adenine), met(gen mã hóa enzyme tham gia tổng hợp methionine), trp(gen mã hóa enzyme tham gia quá trình tổng hợp tryptophan), argB (gen mã hóa enzyme tham gia

quá trình tổng hợp arginine)…[30, 116]

Các marker dùng cho chọn lọc các thể chuyển gen giữ vai trò hết sức quan trọng, quyết định sự thành công của quá trình chuyển gen Phần lớn các nghiên cứu chuyển gen vào nấm sợi sử dụng các chất kháng sinh diệt nấm Tuy nhiên, các kháng sinh này thường có giá thành rất cao, khiến việc chuyển gen bị hạn chế Bên cạnh đó,

nhiều loài nấm sợi (tiêu biểu là A oryzae) có khả năng kháng tự nhiên với nhiều loại

kháng sinh hoặc chỉ bị ức chế ở nồng độ kháng sinh rất cao.Do đó việc sử dụng kháng sinh trong chọn lọc thể chuyển gen là không khả thi[96] Để khắc phục nhược điểm này, một số loài nấm sợi đã được cải biến di truyền để có thể sử các gen trợ dưỡng dụng làm các marker chuyển gen Chuyển gen vào các chủng trợ dưỡng giúp giảm chi phí, an toàn đối với môi trường và có tiềm năng ứng dụng vào sản xuất thực tiễn

1.2.4.3 Marker pyrG

Uridine 5’-monophosphate (UMP) và uracil là những hợp chất quan trọng trong quá trình sinh trưởng và phát triển của tế bào, bởi chúng liên quan đến sự tổng hợp các axit nucleic cần thiết cho mọi tế bào sống Sinh tổng hợp UMP được thực

hiện bởi enzyme orotidine 5’-monophosphate decarboxylase (OMP decarboxylase)

được mã hóa bởi gen pyrG ở nấm sợi hoặc gen URA3 ở nấm men [13, 49] Gen pyrG

giúp tế bào nấm tự tổng hợp UMP trong quá trình sinh trưởng Tuy nhiên với những

chủng đột biến hỏng gen pyrG, chúng chỉ có thể sinh trưởng được trong điều kiện môi trường ngoại bào có bổ sung uridine hoặc uracil Khi gen pyrG được đưa trở lại

các chủng đột biến này, chúng có thể sinh trưởng bình thường Chính vì lý do đó

nhiều nghiên cứu trước đây đã sử dụng gen pyrG làm marker chọn lọc trong quá

trình chuyển gen [13, 58, 73, 104, 107]

Với chủng tự nhiên (wild type), hoạt động của enzyme OMP decarboxylase

mã hóa bởi gen pyrGsẽ chuyển hóa hợp chất 5-fluoroorotic acid (5-FOA) không độc

thành chất gây độc tế bào là 5-fluorouracil Ngược lại, các chủng bị đột biến sai hỏng

về gen pyrG sẽ không thể chuyển hóa hợp chất 5-FOA và các chủng này có thể sinh

trưởng bình thường trên môi trường chứa 5-FOA.Chính vì vậy 5-FOA thường được

bổ sung vào môi trường trong quá trình chọn lọc các chủng vi nấm đột biến hỏng

hoặc mất gen pyrG Việc đưa gen pyrGquay trở lại thể đột biến tương ứng sẽ giúp thể

đột biến tự tổng hợp uridine/uracil và sinh trưởng được trên môi trường tối thiểu (không bổ sung uridine/uracil)[116]

Nhiều nghiên cứu đã được tiến hànhnhằm tạo ra các chủngnấm sợi trợ dưỡng

uridine/uracil, trong đó có các loài thuộc chi Aspergillus Phương pháp phổ biến nhất

để tạo chủng đột biến trợ dưỡng uridine/uracil là chiếu tia UV sau đó sàng lọc trên môi trường chọn lọc có chứa hợp chất 5-FOA, uridine và uracil[34, 49, 104] Ngoài cách chiếu UV, thể đột biến trợ dưỡng uridine/uracil còn được tạo ra nhờ phương

pháploại bỏ trực tiếp gen pyrG thông qua việc chuyển cấu trúc xóa gen pyrGvào tế bào nấm Nhờ cơ chế trao đổi chéo tương đồng, gen pyrG trong hệ gen của nấm có

thể được loại bỏ để tạo ra thể đột biến mất khả năng tổng hợp uridine/uracil[25, 49, 116]

1.2.5 Một số gen chỉ thị dùng trong chuyển gen ở vi nấm

Gen chỉ thị mã hóa các protein tương ứng được sử dụngtrong đánh giá hiệu quả chuyển gen hoặc dùng như dấu hiệu để sàng lọc các thể chuyển gen Sự có mặt của gen chỉ thịkhiến các tế bào/khuẩn lạc của thểchuyển gen có kiểu hình khác biệt

và dễ dàng phân biệt với các chủng tự nhiên.Gen chỉ thị không gây ảnh hưởng đến chức năng sinh lý cũng như sinh trưởng của các thể chuyển gen[33]

Ngược lại với marker chọn lọc bảo vệ thể chuyển gen trên môi trường chọn chọn lọc và gây chết hoặc ngăn chặn sự phát triển của chủng tự nhiên, gen chỉ thị được sử dụng để sàng lọc các chủng chuyển gen làm cho các tế bào/khuẩn lạc chứa gen chỉ thịcó đặc điểm có thể quan sát trực quan bằng mắt Các gen chỉ thị có thể được gắn liền với gen đích và được điều khiển dưới cùng một promoter hoặc biểu hiện độc lập mà không có gen đích đi kèm.Một số các gen chỉ thị hay được sử dụng

như: GFP, DsRed, GUS, lacZ…[40, 69, 72] Các gen chỉ thị được dùng phổ biến trong chuyển genở nấm sợi là gen mã hóa protein huỳnh quang xanhGFP và gen mã hóa protein huỳnh quang đỏ DsRed

1.2.5.1 Gen mã hóa huỳnh quang xanh (GFP)

Gen GFPcó chiều dài 720 bp được phân lập lần đầu tiên từ sứa Aequoreavictoria bởi Osamu Shimomura năm 1962.GFP mã hóa protein có kích

thước 238 axit amin (26,9 kDa) Protein này phát ánh sáng huỳnh quang màu xanh lá cây khi tiếp xúc với ánh sáng bước sóng 509 nm (Hình 1.5)[78, 89]

Trong lĩnh vực sinh học phân tử, genGFP thường được sử dụng như một gen chỉ thịtrong chuyển gen và biểu hiện gen GFPthường được đưa vào tế bàothông qua các kỹ thuật chuyển gen vàsự tích hợp của GFP trong hệ gen của tế bào có thể đủ bền vững qua các thế hệ sau Đến nay, GFP đã được biểu hiện ở nhiều loài, bao gồm

cả sinh vật nhân sơ và nhân chuẩn, trong đó có nấm sợi[52]

Hình 1.5.Biểu hiện genGFPởnấm sợiAspergillus fumigatus[35]

Gen huỳnh quang GFPrất hữu ích trong việc nghiên cứu xác định vị trí của

protein hoặc kiểm tra mức độ biểu hiện của một gen mong muốn Trong nghiên cứu

phát triển các phương pháp chuyển gen, biểu hiện gen chỉ thị GFPđã được chứng minh là thành công trên nhiều loài nấm sợi như Aspergillus fumigatus [35], Aspergillus oryzae[56], Aspergillus nidulans[5], Aspergillus niger[21], Fusarium oxysporum[48]…

1.2.5.2 Gen mã hóa huỳnh quang đỏ (DsRed)

Gen mã hóa protein huỳnh quang đỏ DsRedcó chiều dài 678 bp được phân lập

từ một loài san hô thuộc chi Discosoma Protein DsRed gồm 226 axit amin với kích

thước 28 kD, phát huỳnh quang màu đỏ và tín hiệu huỳnh quang mạnh nhất khi được quan sát dưới ánh sáng bước sóng 583 nm[3].Do đặc tính tương tự như gen huỳnh

quang GFP nên DsRed cũng được sử dụng làm gen chỉ thị trong nghiên cứu ở nhiều loài sinh vật khác nhau Riêng với nấm sợi, gen DsRed được biểu hiện thành công trên nhiều loài như Sordaria macrospora[15], Fusarium oxysporum[70],Acremonium chrysogenum[32], Aspergillus fumigatus[44]…Các tế bào nhận được gen DsRed sẽ

có màu đỏ dưới kính hiển vi huỳnh quang với bước sóng phù hợp (Hình 1.6)

Hình 1.6 Biểu hiện gen DsRed ở nấm sợiFusarium oxysporum[70]

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG

PHÁP

2.1 Nguyên liệu

2.1.1 Chủngvi sinh vật

Các chủng vi sinh vật sử dụng trong nghiên cứu được liệt kê trong Bảng 2.1

Bảng 2.1 Các chủng vi sinh vật dùng trong nghiên cứu

1 RIB40 A oryzae National Research Institute of Brewing

8 VTCCF 053 A oryzae Viện Vi sinh vật học và Công nghệ Sinh

học, ĐHQGHN

9 VTCCF 912 A oryzae Viện Vi sinh vật học và Công nghệ Sinh

học, ĐHQGHN

10 VTCCF 914 A oryzae Viện Vi sinh vật học và Công nghệ Sinh

học, ĐHQGHN

11 VS1 A oryzae Phòng Genomic- Phòng thí nghiệm Trọng

điểm Công nghệ Enzyme và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên

12 NRRL 3357 A flavus ARS (NRRL) Culture Colection (Mỹ)

13 VTCCF 013 A flavus Viện Vi sinh vật học và Công nghệ sinh

học, ĐHQGHN

14 N402 A niger CBS Fungal Biodiversity Centre (Hà Lan)

15 VTCCF 015 A fumigatus Viện Vi sinh vật học và Công nghệ sinh

ChủngA tumefaciens AGL1 là chủng đã được cải biến di truyền và được

sử dụng làm sinh vật trung gian để chuyển gen vào nấm Chủng AGL1 mang gen

kar kháng kháng sinh kanamycin sử dụng trong chọn lọc các chủng mang vector

nhị thể

Chủng A oryzae AUT1-PlD có nguồn gốc từ chủng RIB40 Chủng n{yđ~

bị xóa gen pyrG trong hệ gen v{ được sử dụng trực tiếp để chuyển gen sử dụng marker pyrG

2.1.2 Thiết bị và hóa chất

Các hóa chất được sử dụng trong nuôi cấy vi sinh vật và trong các thí nghiệm sinh học phân tử gồm: glucose, sucrose, KCl, NaCl, MgSO4, KH2PO4, K2HPO4, FeSO4, MnSO4, glycerol, NaNO3, (NH4)2SO4, NH4Cl, EDTA, KOH, HCl, Tris-HCl, SDS…Các hóa chất với độ tinh khiết cao được mua từ những hãng uy tín như Thermo Scientific, Biobasic, Merck, Sigma, Biozym

Các mồi dùng cho phản ứng PCR do công ty IDT (Singapore) tổng hợp Danh sách mồi được liệt kê ở Bảng 2.2

Bảng 2.2 Mồi PCR dùng trong nghiên cứu

giới hạn

Kích thước

Tham khảo