Phân lập, tuyển chọn một số chủng nấm mốc có khả năng chuyển hóa bã mía thành mùn hữu cơ

Hay của Nguyễn Thị Dung 2013, nghiên cứu tiềm năng ứng dụng của chủng nấm mốc M4V có khả năng phân giải cellulose trên phế phụ phẩm nông nghiệp tốt nhất là vỏ trấu và xác định được điều

KHOA SINH – KTNN -

NGUYỄN THỊ THẮM

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG NẤM MỐC CÓ KHẢ NĂNG CHUYỂN HÓA BÃ MÍA THÀNH MÙN HỮU CƠ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Vi sinh vật

Người hướng dẫn khoa học:

PGS TS ĐINH THỊ KIM NHUNG

HÀ NỘI, 2016

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu khoa học và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp em đã nhận được sự quan tâm, giúp đỡ nhiệt tình của Nhà trường, Thầy cô và các bạn

Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới cô giáo, PGS.TS Đinh Thị Kim Nhung đã định hướng ý tưởng nghiên cứu, tận tình hướng dẫn, sửa luận văn để em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Em xin chân thành cảm ơn các Thầy, Cô giáo trong Khoa Sinh-KTNN, Trường ĐH Sư Phạm Hà Nội 2 đã giảng dạy, tạo điều kiện cho chúng em trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khóa luận

Em xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ Phòng Vi sinh vật, Khoa Sinh-KTNN, Trường ĐH Sư Phạm Hà Nội 2 đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn, tạo điều kiện tốt nhất giúp em học tập và làm việc trong suốt quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp

Bên cạnh đó, em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và người thân

đã động viên giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập để em có được kết quả này

Trong quá trình thực hiện đề tài, do bước đầu làm quen với nghiên cứu khoa học nên không tránh khỏi những thiếu sót, rất mong nhận được sự đóng góp ý kiến từ phía thầy cô và các bạn sinh viên

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 16 tháng 05 năm 2016

Sinh viên

Nguyễn Thị Thắm

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng mình Các số liệu, các kết quả thu đƣợc trong khóa luận là trung thực, chƣa từng đƣợc công

bố trong bất kỳ công trình khoa học nào

Nếu sai tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm

Hà Nội, ngày 16 tháng 05 năm 2016

Sinh viên

Nguyễn Thị Thắm

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Lí do chọn đề tài 1

2 Mục đích nghiên cứu 2

3 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 2

3.1 Đối tượng nghiên cứu 2

3.2 Phương pháp nghiên cứu 3

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 3

4.1 Ý nghĩa khoa học 3

4.2 Ý nghĩa thực tiễn 3

5 Nhiệm vụ nghiên cứu 3

6 Tính mới 4

CHƯƠNG 1.TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1.1 Đặc điểm và phân loại nấm mốc 5

1.1.1 Nấm bất toàn (Deuteromycetes) 5

1.1.2 Bào tử trần (conidia) 7

1.2 Sơ lược về chi Penicillium 8

1.3 Sơ lược về chi Aspergillus 9

1.3.1 Tình hình nghiên cứu phân loại Aspergillus trên thế giới 9

1.3.2 Đặc điểm sinh học của Aspergillus 9

1.4 Cellulose và Cellulase 11

1.4.1 Cellulose 11

1.4.2 Cellulase 12

1.5 Tình hình nghiên cứu trên Thế giới và Việt Nam 13

1.5.1 Trên Thế giới 13

1.5.2 Ở Việt Nam 14

1.6 Định hướng ứng dụng 15

1.6.1 Ứng dụng trong xử lý chất thải hữu cơ giàu cellulose 15

1.6.2 Ứng dụng trong ủ phân hữu cơ bón cho cây trồng 15

CHƯƠNG 2.NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 Nguyên liệu và thiết bị nghiên cứu 17

2.1.1 Vi sinh vật 17

2.1.2 Hóa chất – Thiết bị 17

2.2 Môi trường phân lập và nuôi cấy 17

2.2.1 Môi trường phân lập nấm mốc 17

2.2.2 Môi trường bảo quản và giữ giống 18

2.2.3 Môi trường nuôi cấy thử hoạt tính enzyme 18

2.3 Phương pháp nghiên cứu 18

2.3.1 Phương pháp ủ và lấy mẫu 18

2.3.2 Phương pháp phân lập nấm mốc 19

2.3.3 Phương pháp nuôi cấy và bảo quản chủng giống 19

2.3.4 Phương pháp quan sát hình thái nấm mốc 19

2.3.5 Phương pháp xác định hoạt tính cellulase của nấm mốc 20

2.3.6 Phương pháp thống kê và xử lý kết quả 21

CHƯƠNG 3.KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 22

3.1 Phân lập, tuyển chọn các chủng nấm mốc có khả năng sinh enzyme cellulase từ bã mía ủ 22

3.1.1 Phân lập các chủng nấm mốc trong bã mía ủ 22

3.1.2 Nghiên cứu đặc điểm hình thái của các chủng nấm mốc phân lập 23

3.1.3 Tuyển chọn các chủng nấm mốc có khả năng sinh cellulase cao 26

3.2 Nghiên cứu định loại sơ bộ 2 chủng nấm mốc M4 và M6 29

3.2.1 Đặc điểm hình thái chủng nấm mốc M6 29

3.2.2 Đặc điểm hình thái chủng nấm mốc M4 30

3.3 Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng có bổ sung bột đậu tương

đến khả năng sinh enzyme cellulase của 2 chủng nấm mốc

Penicillium M4 và chủng Penicillium M6 32

3.4 Ứng dụng bã mía ủ có bổ sung bột đậu tương chuyển hóa thành mùn hữu cơ và trồng rau sạch 35

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40

TÀI LIỆU THAM KHẢO 41

PHỤ LỤC 45

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Kết quả các chủng nấm mốc thu được sau 5 lần phân lập 22 Bảng 3.2 Đặc điểm hình thái của các chủng nấm mốc đã phân lập 24 Bảng 3.3 Kết quả thử hoạt tính cellulase trên môi trường chứa 1% CMC 27 Bảng 3.4 Đánh giá hoạt tính cellulase của các chủng nấm mốc đã phân

lập 27

Bảng 3.5 Kết quả thử hoạt tính cellulase của 2 chủng Penicillium M4,

Penicillium M6 với các tỷ lệ bột đậu tương khác nhau 33 Bảng 3.6 Kết quả thử nghiệm trồng rau mầm củ cải xanh trên bã mía ủ

và đất đối chứng 36

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Các dạng Hyphomycetes 6

Hình 1.2 Giá sinh bào tử Coelomycetes 6

Hình 1.3 Các dạng cuống sinh bào tử trần đặc biệt 7

Hình 1.4 Một số hình dạng bào tử trần 8

Hình 1.5 Chi Penicillium (Các thành phần của chổi ) 9

Hình 1.6 Các kiểu cuống bào tử đính của Aspergillus: a 1 lớp - b 2 lớp - c phiến - d tia, e tể 10

Hình 1.7 Cấu trúc lập thể của cellulose 11

Hình 1.8 Tác dụng của từng enzyme trong hệ enzyme cellulase .13

Hình 3.1 Khuẩn lạc một số chủng nấm mốc trên môi trường Czapeck-dox 23

Hình 3.2 Hoạt tính cellulase của hai chủng nấm mốc đã tuyển chọn 28

Hình 3.3 Hình thái khuẩn lạc và tế bào chủng Penicillium M4 trên KHV (x1000) 30

Hình 3.4 Hình thái khuẩn lạc và tế bào chủng Penicillium M4 trên KHV (x1000) .32

Hình 3.5 Môi trường thử hoạt tính có bổ sung bột đậu tương 33

Hình 3.6 Hoạt tính cellulase của 2 chủng Penicillium M6 và Penicillium M4 trong môi trường bổ sung bột đậu tương 35

Hình 3.7 Hình ảnh rau củ cải trồng trên các môi trường đất khác nhau 37

Hình 3.8 Chiều cao của cây trồng trên bã mía ủ (CT1) 37

Hình 3.9 Hình ảnh rau củ cải trồng trên các môi trường đất khác nhau 38

là loại cây lấy đường quan trọng của ngành công nghiệp đường với tổng diện tích hàng triệu hec-ta và sản lượng mía thu hoạch mỗi năm lên tới 1,83 tỷ tấn Lượng bã mía thải ra ước tính chiếm 25-30% lượng mía đem ép, nguồn bã mía nếu không được xử lý sẽ đem lại một nguy cơ lớn về lượng phế phẩm gây

ô nhiễm môi trường

Trên thế giới, nhiều công trình khoa học đã đề cập đến công nghệ xử lý mùn cưa, trấu, rơm và một số nguyên liệu khác thành phân hữu cơ Ở Việt Nam trong những năm gần đây, vấn đề về xử lý bã mía, rơm rạ sau thu hoạch

đã nhận được nhiều sự quan tâm của các nhà nghiên cứu khoa học Trong đó

có nhiều công trình khoa học nghiên cứu và ứng dụng công nghệ xử lý phế

phụ phẩm như: xử lý rơm rạ bằng chế phẩm Trichoderma với nhiều loại đất

canh tác khác nhau của Trần Thị Ngọc Sơn, Viện Lúa Đồng bằng sông Cửu

Long (2013), đã sản xuất thành công chế phẩm sinh học Trichoderma có khả

năng xử lý rơm rạ trực tiếp ngoài đồng làm giảm tỷ lệ C/N trong rơm rạ và gia tăng hàm lượng NPK, gia tăng năng suất lúa c ng như tăng hiệu quả kinh

tế trồng lúa và cải thiện độ phì nhiêu đất Hay của Nguyễn Thị Dung (2013), nghiên cứu tiềm năng ứng dụng của chủng nấm mốc M4V có khả năng phân giải cellulose trên phế phụ phẩm nông nghiệp tốt nhất là vỏ trấu và xác định được điều kiện tối ưu về khả năng lên men rắn của chủng nấm mốc M4V, ứng dụng trong sản xuất thức ăn chăn nuôi Nghiên cứu gần đây của Phạm

2

Thị Thanh Nhàn (2014), đã nghiên cứu được 03 chủng vi khuẩn, 02 chủng xạ khuẩn có hoạt tính phân giải cellulose tốt nhất, đánh giá hoạt tính enzyme ngoại bào và thử nghiệm khả năng phân giải rơm rạ thực tế, có thể ứng dụng trong sản xuất chế phẩm sinh học chuyển hóa rơm rạ thành phân hữu cơ [13] Tuy nhiên chưa có nhiều công trình nghiên cứu đầy đủ về vi sinh vật tham gia chuyển hóa phế phẩm nông nghiệp, đặc biệt là chuyển hóa bã mía thành mùn hữu cơ

Việc ứng dụng phức hệ cellulase trong phân giải các nguồn phế phẩm giàu cellulose đã và đang được triển khai rộng rãi Quá trình phân giải này hầu hết là do sự chuyển hóa nhờ vi sinh vật, trong đó nấm mốc là một trong những đối tượng được các nhà khoa học quan tâm bởi lượng enzyme ngoại bào sinh ra tương đối lớn, có thể ứng dụng để phân giải nguồn rác thải giàu cellulose như rác thải sinh hoạt, phế phẩm nông nghiệp Do vậy, nghiên cứu các chủng nấm mốc có hoạt tính cellulase nhằm xử lý bã mía là hướng nghiên

cứu cần thiết Chính vì vậy tôi quyết định thực hiện đề tài:“Phân lập, tuyển chọn

một số chủng nấm mốc có khả năng chuyển hóa bã mía thành mùn hữu cơ”

2 Mục đích nghiên cứu

Tuyển chọn được các chủng nấm mốc có khả năng sinh enzyme phân giải cellulose từ khối ủ bã mía; xác định hàm lượng bột đậu tương bổ sung thích hợp vào môi trường nuôi cấy nhằm nâng cao hoạt tính enzyme cellulase của chủng nấm mốc tuyển chọn và ứng dụng chuyển hóa bã mía thành mùn hữu cơ, thử nghiệm trồng rau sạch

3 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

3.1 Đối tượng nghiên cứu

Một số chủng nấm mốc có khả năng phân giải cellulose trong khối ủ bã mía thu được tại Phường Xuân Hòa, Thị xã Phúc Yên, Tỉnh Vĩnh Phúc

3

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Phương pháp ủ và lấy mẫu

3.2.2 Phương pháp phân lập nấm mốc

3.2.3 Phương pháp nuôi cấy và bảo quản chủng giống

3.2.4 Phương pháp quan sát hình thái nấm mốc

3.2.5 Phương pháp xác định hoạt tính cellulase của nấm mốc

3.2.6 Phương pháp thống kê và xử lý kết quả

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

5 Nhiệm vụ nghiên cứu

5.1 Phân lập, tuyển chọn các chủng nấm mốc có khả năng sinh enzyme cellulase trong bã mía ủ

5.2 Nghiên cứu định loại sơ bộ 2 chủng nấm mốc M4 và M6

5.3 Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng có bổ sung bột đậu tương đến

khả năng sinh enzyme cellulase của 2 chủng nấm mốc Penicillium M4 và

chủng Penicillium M6

5.4 Ứng dụng bã mía ủ có bổ sung bột đậu tương chuyển hóa thành mùn hữu

cơ và trồng rau sạch

4

6 Tính mới

Từ nguồn cơ chất bã mía ủ đã tuyển chọn và định loại sơ bộ 2 chủng

nấm mốc M4 và M6 có hoạt tính cellulase cao với đường kính vòng phân giải

của chủng Penicillium M6 là D = 22mm, chủng Penicillium M4 là D = 21mm

Sử dụng bột đậu tương bổ sung với hàm lượng thích hợp vào môi trường nuôi cấy để nâng cao hoạt tính cellulase của 2 chủng đã tuyển chọn: ở chủng

Penicillium M6 là 0,7g/100ml, D = 29mm; ở chủng Penicillium M4 là 0,35g/100ml, D = 22,5mm Ứng dụng bổ sung bột đậu tương vào bã mía nhằm chuyển hóa nhanh thành mùn hữu cơ và ứng dụng trồng rau sạch, giảm thiểu ô nhiễm môi trường

5

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Đặc điểm và phân loại nấm mốc

Phần lớn nấm mốc thuộc nhóm phân loại Deuteromycetes, một số là dạng sinh sản vô tính của các nhóm nấm túi (Ascomycetes) hoặc nhóm nấm đảm (Basidiomycetes) Deuteromycetes bao gồm khoảng 2400 chi trong đó có

1700 chi thuộc nhóm nấm Hyphomycetes và 700 chi thuộc nhóm

Ceolomycetes Theo E Kiffer, M Morelet (2000), trong số các chi nấm thuộc

tổ chi Phialoconidiae (lớp phụ Euhyphomycetidae, lớp Hyphomycetes, ngành phụ Deuteromycetes) thì chi Penicillium có số loài nhiều nhất là khoảng 223 loài, tiếp theo là chi Aspergillus có khoảng 185 loài

1.1.1 Nấm bất toàn (Deuteromycetes)

Nấm bất toàn là giai đoạn vô tính của nấm túi hoặc nấm đảm Theo hệ thống phân loại căn cứ vào đặc điểm phát sinh của bào tử trần của Hughes

(1953) Lớp nấm bất toàn được chia thành 3 nhóm: Nhóm Hyphomycetes:

Gồm các nấm bất toàn không có túi giá và đĩa giá (giá sinh bào tử trần ở trên các sợi nấm hoặc các sợi nấm kết lại thành bó sợi, bó giá) Nhóm

Coelomycetes: Gồm các nấm bất toàn có túi giá hoặc đĩa giá, giá bào tử trần ở

trong các thể quả (Fruit - body) gọi là các conidiomata Nhóm Agonomycetes:

Gồm các nấm bất toàn không có bào tử trần Ở đây giới thiệu 2 khoá phân loại đến chi của lớp nấm bất toàn

1.1.1.1 Hyphomycetes (moniliaales- nấm bông, 1700 chi, 11000 loài)

Các dạng hệ sợi nấm mang các bào tử trên sợi riêng rẽ hoặc trên cụm sợi nấm (như các đệm nấm, các bó giá), nhưng không ở trong các conidiomata (fruit body) riêng biệt

6

Hình 1.1 Các dạng Hyphomycetes

1.1.1.2 Coelomycetes (nấm xoang, 700 chi, 9000 spp) riêng rẽ

Bào tử trần sinh ra trong các túi giá, đĩa giá, túi giá dạng cốc, đệm giá

Hình 1.2 Giá sinh bào tử Coelomycetes

1.1.1.3 Agonomycetes (mycelia sterilia - nấm bất thụ)

Agonomycetes không có khả năng sinh sản bằng bào tử Một số tạo

thành cấu trúc gọi là sclerotina, các bào tử áo (Chlamydospore) hoặc các tế bào dày (tế bào Hulle) Nói chung đây là nhóm không có các đặc điểm đặc trƣng để phân loại (Erick H.C Mckenzie, 2004; Michael J Carlie, Sarah C Watkinson, Graham, 1994) Năm 1995, Hughes đã đƣa ra khóa phân loại có

tính liên kết và tổng quát hơn về nhóm Hyphomycetes

Ông chia nhóm này thành 8 tổ chi dựa vào đặc điểm của giá bào tử trần (conidiophores) và bào tử trần (conidia) Năm 1968, Baron lại đƣa ra một

7

khóa phân loại khác hoàn chỉnh hơn mà ngày này nhiều nhà nấm học vẫn sử dụng (H.L Barneet & Barry B Hunter, 1973), trong đó các đặc điểm của conidia, các kiểu tạo thành conidia từ các tế bào sinh ra nó, sự tiến hóa của các tế bào conidia và các tế bào sinh ra nó là những đặc điểm quan trọng để phân loại (Erick H.C Mckenzie, 2004; E Kifer & N Morelet, Robert K Noyd, 2000)

Cuống sinh bào tử trần: Một sợi nấm phân nhánh hoặc đơn giản (một

sợi nấm sinh sản) mang hoặc gồm có các tế bào sinh bào tử trần mà từ đó các bào tử trần đƣợc sinh ra Đôi khi đƣợc dùng khi mô tả những cấu trúc biến đổi

đối với các tế bào sinh bào tử trần

Có nhiều dạng: dạng có hoặc không có vách ngăn đơn giản không phân nhánh (H1.3c), dạng cuống sinh bào tử trần kéo dài cùng với việc sinh bào tử trần (H1.3d), dạng cuống có vách ngăn, phát triển đơn độc hoặc phân nhánh (H1.3e)

Hình 1.3 Các dạng cuống sinh bào tử trần đặc biệt

8

Hình 1.4 Một số hình dạng bào tử trần

1.2 Sơ lược về chi Penicillium

Theo E Kiffer, M Morelet (2000), trong số các chi nấm thuộc tổ chi

Phialoconidiae (lớp phụ Euhyphomycetidae, lớp Hyphomycetes, ngành phụ Deuteromycotina) thì chi Penicillium có số loài nhiều nhất là khoảng 223 loài,

chúng phân bố khắp nơi trên trái đất, cư trú ở trên rất nhiều các ổ sinh thái

Theo Bùi Xuân Đồng và Nguyễn Huy Văn (2001) [5] chi Penicillium đặc

trưng bởi các đặc điểm:

Sợi nấm ngăn vách, phân nhánh, không màu hoặc màu nhạt, đôi khi màu sẫm Khuẩn lạc màu lục, vàng lục, xanh lục, lục xám, xám, đôi khi có màu vàng, đỏ, tím hoặc trắng Mặt trái khuẩn lạc không màu hoặc có màu sắc khác nhau, môi trường thạch nuôi cấy không màu hoặc có màu sắc do có mặt các sắc tố hòa tan tương ứng

Bộ máy mang bào tử trần hoặc chỉ gồm giá bào tử trần với một vòng thể bình ở đỉnh giá, hoặc gồm giá bào tử trần với hai đến nhiều cuống thể bình

ở phần ngọn giá, trên đỉnh của mỗi cuống thể bình đó có các thể bình

Giá bào tử trần có thể phát triển từ các sợi nấm nằm sát cơ chất, sát mặt môi trường thạch nuôi cấy (các sợi nền), khi đó thường có chiều dài đều nhau

và khẩn lạc có dạng mặt nhung (velutinate)

Bào tử trần c ng như giá bào tử trần, các nhánh, các cuống thể bình, các thể bình tùy từng loại có mặt ngoài nhẵn, ráp, có gai hoặc sần sùi, gồ ghề

9

Hình 1.5 Chi Penicillium (các thành phần của chổi)

1.3 Sơ lược về chi Aspergillus

1.3.1 Tình hình nghiên cứu phân loại Aspergillus trên thế giới

Chi Aspergillus do Micheli mô tả lần đầu tiên năm 1729, sau đó năm

1809, Link đã mô tả loài Aspergillus glaucus và loài nấm túi

Eurotiumherbariorum được phát hiện trên cùng một tiêu bản mẫu cây khô

Fries (1832) đã công nhận chi nấm này của Micheli De Bary (1850) phát hiện

ra rằng, giai đoạn bào tử trần của Eurotium herbariorum chính là Aspergillus

glaucus Như vậy, theo Luật pháp Quốc tế và danh pháp thực vật, chi Aspergillus chính thức mang tên Aspergillus Micheli ex Fries Hệ thống phân

loại chi Aspergillus của Raper và Fennell (1965) gồm 132 loài (đã được chấp

nhận) và được xếp vào 18 nhóm loài, đến nay vẫn ổn định và được sử dụng rộng rãi, về cơ bản không sửa đổi, mặc dù cho đến nay một số loài mới thuộc chi nấm

này đã được công bố với số loài hiện biết là 185 loài Aspergillus

1.3.2 Đặc điểm sinh học của Aspergillus

Hệ sợi nấm gồm các sợi có vách ngăn phân cách, không màu, màu nhạt, hoặc một số trường hợp trở nên nâu hay màu sẫm khác ở vùng nhất

định của khuẩn lạc Sinh sản vô tính bằng bào tử trần (conidia)

C ng như các loại nấm bất toàn khác, hình thái cơ quan sinh bào tử trần là một đặc điểm chủ yếu, đặc trưng dùng trong phân loại chi nấm này

10

Các đặc điểm cơ quan sinh bào tử trần: cơ quan sinh bào tử trần phát triển

tử một tế bào đặc biệt gọi là tế bào chân có đường kính lớn hơn, màng dày hơn

các tế bào lân cận của sợi nấm Từ tế bào chân phát triển thành giá bào tử trần

Giá bào tử trần có thể có vách ngăn, bề mặt nhẵn hoặc không nhẵn,

trong suốt hoặc có màu, dài hay ngắn tùy thuộc vào loài Phần ngọn của giá

bào tử phình rộng tạo thành bọng đỉnh giá (versicle) Bọng đỉnh giá có thể có

nhiều hình thái khác nhau, đây là một đặc điểm đặc trưng để phân loại

Aspergillus với các loại nấm Hyphomycetes khác, đặc biệt với các chi

Penicillium Bọng đỉnh giá có thể có hình cầu, hình bán cầu, hình chùy, hình

quả bầu, hình bàn chang

Từ bọng đỉnh giá sinh ra các tế bào sinh bào tử trần gọi là thể bình (phialide) Nếu các thể bình sinh ra trực tiếp từ bọng đỉnh giá thì gọi là dạng

đơn tầng (uniseriate) Nếu các thể bình được sinh ra qua một lớp tế bào gốc

xuất phát từ bọng đỉnh giá (lớp cuống thể bình, metulae) thì gọi là dạng lưỡng

tầng (biseriate) Philade hoặc metulae mọc trên bọng đỉnh giá c ng là đặc

điểm đặc trưng để phân biệt Aspergillus với các chi có quan hệ gần g i với

nó Từ thể bình sinh ra các bào tử trần (conidia) Bào tử trần không có vách

ngăn, khác nhau về hình dạng, kích thước, màu sắc ở các loài khác nhau

Hình 1.6 Các kiểu cuống bào tử đính của Aspergillus: a 1 lớp -

b 2 lớp - c phiến - d tia, e tể

và họ Lúa 30 - 40%) Trong đó, bã mía chứa trung bình 49% là nước, 48%

là xơ (45-55% cellulose) và 2,5% là chất hoà tan (đường)

Cellulose có màu trắng, không mùi Cellulose không tan trong nước (ngay cả khi đun nóng) và các dung môi hữu cơ thông thường nhưng tan trong một số dung dịch axit vô cơ mạnh (HCl, HNO3) và một số dung dịch muối (ZnCl2, PbCl2),

Cellulose là hợp chất cao phân tử được cấu tạo bởi hàng nghìn đến

hàng chục nghìn gốc β-D-Glucose liên kết với nhau bằng các liên kết

β-1,4-glycoside nên có cấu trúc mạch thẳng, rất bền và khó bị phân hủy Cellulose

có công thức cấu tạo là (C6H10O5)n hay [C6H7O2(OH)3]n trong đó n có thể

nằm trong khoảng 5000-14000 Trong đó có các nhóm hydroxyl đều nằm trên

mặt phẳng nằm ngang

Hình 1.7 Cấu trúc lập thể của cellulose

Các phân tử cellulose kết hợp với nhau tạo thành micel tức là bó sợi có

chiều dài 50 - 100Å Các micel lại tạo thành bó microfibril với đường kính

khoảng 250Å nhờ nhiều liên kết hydro tạo sợi bền chắc Toàn bộ cấu trúc này được bao bọc bởi lignin và hemicelluloses

12

1.4.2 Cellulase

Liên kết chủ yếu trong cấu trúc của cellulose là 1,4-glucoside Nói chung, để phá hủy hoàn toàn cấu trúc của polysaccharide này cần có các enzyme cellulase với những tác động đặc trưng riêng biệt Dựa theo nghiên

cứu về hệ enzyme cellulase của nấm Trichoderma reesei, hệ enzyme thủy

phân gồm 3 loại hoạt tính enzyme (Hình 1.8)

Endoglycanase hoặc 1,4-β-D-glucan glucanohydrolase

Enzyme endoglycanase hoặc 1,4-β-D-glucan glucanohydrolase là enzyme thủy phân nội bào liên kết 1,4-β-D-glucosidic trong phân tử cellulose bởi tác dụng ngẫu nhiên trong chuỗi polymer hình thành các đầu chuỗi khử tự

do và các chuỗi oligosaccharide ngắn Các endoglucanase không thể thủy phân cellulose tinh thể hiệu quả nhưng nó sẽ phá vỡ các liên kết tại khu vực

vô định hình tương đối dễ tiếp cận

Exoglucanase

Enzyme ngoại bào exoglucanase gồm cả 1,4-beta-D-glucan glucanohydrolase, giải phóng D-glucose từ β-glucan và cellodextrin và 1,4-beta-D-glucan cellobiohydrolase, giải phóng D-cellobiose Tỷ lệ thủy phân của enzyme cellobiohydrolase ngoại bào bị hạn chế bởi sự sẵn có các đầu chuỗi cellulose

β-glucosidase hay β-D-glucoside glucohydrolase

β-glucosidase hay β-glucoside glucohydrolase giải phóng phân tử glucose từ đường cellodextrin hòa tan và một loạt các glucoside khác [15]

D-13

Hình 1.8 Tác dụng của từng enzyme trong hệ enzyme cellulase

1.5 Tình hình nghiên cứu trên Thế giới và Việt Nam

Hàng năm, hoạt động trong ngành nông nghiệp đã thải ra môi trường hàng ngàn tấn phế phẩm và đang là một trong những nguyên nhân gây ô nhiễm môi trường Nếu lượng phế phẩm này được xử lý làm thức ăn gia súc hoặc phân bón vi sinh thì sẽ là một nguồn lợi lớn Vì vậy, trên Thế giới và ở Việt Nam đã có những nghiên cứu về khả năng sinh cellulase của các vi sinh vật trong đất để phân giải cellulose từ các phế phẩm nông nghiệp

1.5.1 Trên Thế giới

Từ lâu, trên Thế giới đã có những nghiên cứu về nấm mốc sinh cellulase Ngay từ 1963, Birgitta Norkrans đã nghiên cứu về khả năng sinh enzyme cellulase c ng như những ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh cellulase của nấm mốc Kế thừa sự phát triển, những nghiên cứu về sau của các nhà khoa học không chỉ dừng lại ở mức độ đó mà đã có những định hướng ứng dụng cao hơn Nghiên cứu của R.N Maeda tối ưu hóa nguồn

Nitrogen sản xuất cellulase của Penicillium [21] Hay Castro, M.L.A Carvalho nghiên cứu enzyme cellulase từ Penicillium funiculosum: sản xuất

và các ứng dụng để thủy phân cellulose [17] Milala M., Shehu (2009), nghiên

cứu xử lý chất thải bằng cellulase từ Aspergillus candidus [18] Nhìn chung,

có khá nhiều nghiên cứu về khả năng phân giải cellulose nấm mốc c ng như

“Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu các đặc điểm hình thái của một số chủng nấm mốc có khả năng sinh cellulase cao”, kết quả nghiên cứu đã tuyển chọn được 25 chủng nấm mốc, trong đó 3 chủng M4V, M251, M151 có hoạt tính

cellulase mạnh nhất Luận văn thạc sĩ của Khưu Phương Yến Anh (2007),

“Nghiên cứu khả năng sinh enzyme cellulase của một số chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ” đã phân lập được 312 chủng nấm sợi khác nhau từ RNM Cần Giờ Trong đó có 114 chủng phân lập từ đất, 96 chủng phân lập từ lá, 102 chủng phân lập từ thân, cành và tuyển chọn ba chủng có hoạt độ cellulase cao nhất là: chủng Đ’0 (55,70 IU/g), chủng Đ’3 (55,01 IU/g)

và chủng Đ2b (53,10 IU/g), đồng thời xác định được điều kiện môi trường thích hợp cho sự sinh trưởng và sinh tổng hợp cellulase của ba chủng nấm sợi

[1] Hay nghiên cứu của Trịnh Đình Khá, Nguyễn Quyền Thi, Nguyễn Sỹ Lê

Thanh (2007), “Tuyển chọn và nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố môi

trường lên khả năng sinh tổng hợp cellulase của chủng Penicillium

sp.DTQ-HK1” [7]

Ngoài ra có nhiều các nghiên cứu khác ở trong và ngoài nước về vấn đề phân giải và ứng dụng cellulose, phế phẩm giàu cellulose của nấm mốc c ng như các loài vi sinh vật [2], [6], [12], [19], [20] Tuy nhiên chưa có công trình

15

nghiên cứu đầy đủ về nấm mốc sinh enzyme cellulase đặc biệt là từ nguồn bã mía trong quá trình phân giải tạo mùn

1.6 Định hướng ứng dụng

1.6.1 Ứng dụng trong xử lý chất thải hữu cơ giàu cellulose

Thành phần hữu cơ trong rác thải chủ yếu là cellulose, nên việc sử dụng công nghệ vi sinh trong xử lý rác thải cải thiện môi trường rất có hiệu quả Có nhiều những nghiên cứu về việc sử dụng cellulase do các chủng vi sinh vật tiết ra nhằm phân giải cellulose trong rác thải Phức hệ cellulase sử dụng để xử lý nguồn rác thải thu được từ vi sinh vật trong đó nấm mốc phân giải cellulose là một trong những đối tượng đã và đang được các nhà khoa học quan tâm bởi lượng enzyme ngoại bào sinh ra tương đối lớn, có thể ứng dụng

để phân giải nguồn rác thải giàu cellulose như rác thải sinh hoạt, phế phẩm nông nghiệp

1.6.2 Ứng dụng trong ủ phân hữu cơ bón cho cây trồng

Nấm mốc là nhóm vi sinh vật có khả năng hoạt động tốt trong đất mùn, khả năng sinh enzyme cellulase ngoại bào tương đối cao, không những giúp phân giải nhiều hợp chất hữu cơ mà còn giúp cải tạo đất trồng, giúp cây trồng phát triển nhanh [4], [11]

Phân hữu cơ là hợp chất hữu cơ dùng trong nông nghiệp, được hình thành từ các loại phân động vật, lá, cành cây xanh, than bùn, mùn bã Phân bón giúp tăng độ màu mỡ cho đất bằng cách bổ sung các chất hữu cơ, phân ủ lâu ngày trong tự nhiên có thể sử dụng cho cây trồng, rau xanh

Do việc lạm dụng quá mức các loại phân bón hóa học và thuốc bảo vệ thực vật trong sản xuất nông nghiệp, sử dụng các loại phân ủ thiên nhiên ngày càng ít, đã làm cho diện tích đất trồng trọt bị suy giảm độ phì nhiêu, mất cân đối dinh dưỡng, tốn kém Trong khi đó hầu hết các hộ gia đình nông nghiệp đều tham gia trồng trọt chăn nuôi, có sẵn nguyên liệu nhưng chưa biết cách

16

tận dụng để làm phân ủ bón cho cây trồng, vừa ô nhiễm môi trường do tiêu hủy hoặc chất đống, vừa mất thời gian cải tạo đất Vì vậy, ứng dụng bón phân hữu cơ có ý nghĩa rất lớn trong nông nghiệp [4] Với sản lượng phế phụ phẩm

bã thải hàng năm thải ra môi trường nếu như được tận dụng, xử lý ủ mủn rồi đem bón cho cây trồng sẽ đem lại nhiều lợi ích đáng kể Vì vậy hướng nghiên cứu này có ý nghĩa thực tiễn và là tiền đề cho nghiên cứu ứng dụng trong sản xuất phân hữu cơ vi sinh, đồng thời góp phần xử lý nguồn phế thải bã mía, giảm thiểu ô nhiễm môi trường

17

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu và thiết bị nghiên cứu

2.1.1 Vi sinh vật

Các chủng vi sinh vật có khả năng phân giải bã mía, phân lập từ khối ủ

bã mía tại Phường Xuân Hòa, Thị xã Phúc Yên, Tỉnh Vĩnh Phúc

- Cacboxyl methyl cellulose (CMC)

- Thuốc thử Lugol 1%, đỏ Congo 1%

- Các hóa chất: NaNO3, MgSO4.7H2O, KCl, KH2PO4, NaCl, FeSO4,

NH4Cl, (NH4)2SO4, saccarose các hóa chất thông dụng khác

Thiết bị

- Tủ ấm, tủ sấy Binder

- Nồi hấp (TOMY - Nhật)

- Máy lắc, máy li tâm (shorwall super T21- Mỹ)

- Cân điện tử (Presica XT320M - Thụy Sĩ)

- Kính hiển vi quang học

2.2 Môi trường phân lập và nuôi cấy [10]

2.2.1 Môi trường phân lập nấm mốc

Môi trường phân lập, nuôi cấy và giữ giống: môi trường Crapek-dox Sau khi vô trùng dụng cụ xong, tiến hành pha môi trường để phân lập Môi trường được hấp thanh trùng ở 121oC trong khoảng 20 phút, sau đó phân phối

18

khoảng 25ml môi trường vào mỗi hộp lồng đã vô trùng, để có môi trường thạch nghiêng thì ta rót khoảng 3 - 4 ml môi trường (chưa thanh trùng) vào ống nghiệm rồi đậy nút bông, đem hấp thanh trùng ở 121oC trong khoảng 20 phút sau đó đặt nghiêng ống nghiệm chứa môi trường khi còn đang nóng

Môi trường Czapeck - dox

2.2.2 Môi trường bảo quản và giữ giống

Môi trường lỏng: để nuôi cấy thu enzyme, tôi sử dụng môi trường có thành phần giống với môi trường Crapek-dox cơ sở nhưng không có thạch Agar và thay đường saccarose bằng bột giấy (có bản chất là cellulose)

2.2.3 Môi trường nuôi cấy thử hoạt tính enzyme

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp ủ và lấy mẫu

Mẫu được phơi khô tự nhiên trước khi ủ nhằm tìm trọng lượng khô tương đối của bã mía là 41,67% Xác định trọng lượng khô theo công thức:

M = (m : mo) x 100%

Với mo: Khối lượng mẫu trước khi phơi

m : Khối lượng mẫu sau khi phơi

Bã mía cắt nhỏ ủ trộn với tỷ lệ: 5Kg bã mía khô + 0,5Kg đất + 0,5L nước

19

Sau 3 - 5 ngày, từ mẫu bã mía trong khối ủ: lấy ở giữa khối ủ (5g), trộn

đều, rồi lấy 1g mẫu này phân lập VSV trên môi trường Czapeck-dox

2.3.2 Phương pháp phân lập nấm mốc

Cân 1 gam mẫu giữa khối ủ rùi pha loãng ở các nồng độ từ 10-1

-10-9 , Ở mỗi độ pha loãng ta dùng pipet vô trùng hút 0,5ml dung dịch nhỏ lên bề mặt thạch trong hộp petri, lấy bàn trang thủy tinh trang đều khắp bề mặt thạch

Sau đó nuôi trong tủ ấm trong vòng từ 3 - 5 ngày, theo dõi các khuẩn lạc mọc trên bề mặt thạch Cấy truyền những khuẩn lạc nấm mốc riêng rẽ lên ống thạch nghiêng và được đưa vào tủ ấm

2.3.3 Phương pháp nuôi cấy và bảo quản chủng giống

Cấy truyền định kì 2 tuần 1 lần, để mẫu cấy nuôi trong tủ ấm từ 3 - 5 ngày Sau đó giữ ở tủ lạnh từ 4 - 50C Trước khi sử dụng phải cấy truyền sang ống thạch nghiêng mới

2.3.4 Phương pháp quan sát hình thái nấm mốc

Sử dụng các phương pháp làm tiêu bản VSV sống, kĩ thuật tiêu bản ép lam và tiêu bản cố định nhuộm mầu để quan sát hình thái tế bào các chủng nấm mốc và chụp ảnh qua kính hiển vi quang học Đồng thời dựa vào phương pháp nhận diện nấm mốc truyền thống (Maren A Klich, 2002) để định loại