Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính kích thích sự phân bào của yến sào tại khánh hòa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG HUỲNH THỊ ANH BẢO NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH KÍCH THÍCH SỰ PHÂN BÀO CỦA YẾN SÀO TẠI KHÁNH HÒA LUẬN VĂN THẠC SĨ KHÁNH H

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

HUỲNH THỊ ANH BẢO

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH KÍCH THÍCH SỰ PHÂN BÀO CỦA

YẾN SÀO TẠI KHÁNH HÒA

LUẬN VĂN THẠC SĨ

KHÁNH HÒA –2016

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

HUỲNH THỊ ANH BẢO

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH KÍCH THÍCH SỰ PHÂN BÀO CỦA

YẾN SÀO TẠI KHÁNH HÒA

Người hướng dẫn khoa học:

PGS.TS Ngô Đăng Nghĩa

Chủ tịch hội đồng

PGS.TS Nguyễn Văn Duy

Khoa sau đại học

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan: Tôi là người trực tiếp tham gia thực hiện các nội dung của đề

tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính kích thích sự phân bào của yến sào tại Khánh Hòa” Các kết quả, số liệu, hình ảnh trình bày trong luận văn là hoàn

toàn trung thực, khách quan

Tôi xin cam đoan: mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện đề tài nghiên cứu và hoàn thành luận án đều đã được cảm ơn, các thông tin trích dẫn trong luận án đều chính xác

và được chỉ rõ nguồn gốc

Khánh Hòa, ngày tháng năm 2016

Tác giả luận văn

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, Khoa Sau đại học, Trường Đại học Nha Trang đã quan tâm giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu vừa qua

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Ngô Đăng Nghĩa đã tận tình

hướng dẫn, chỉ dạy, truyền đạt kinh nghiệm và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Quý thầy cô giáo Viện Công nghệ sinh học và Môi trường và tập thể lớp CHSH-2013 đã nhiệt tình giảng dạy, giúp đỡ, động viên trong quá trình học tập, nghiên cứu và các hoạt động khác tại trường

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS Ræder Inger Lin Uttakleiv, Đại học

Tromsor, Na Uy đã giúp đỡ trong quá trình nghiên cứu hoàn thành đề tài

Tôi cũng bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban lãnh đạo Công ty TNHH NN MTV Yến Sào Khánh Hòa đã nhiệt tình giúp đỡ, hỗ trợ tôi rất nhiều trong suốt thời gian thực hiện đề tài, đã tạo điều kiện về nguyên vật liệu và những ý kiến đóng góp quý báu để tôi thực hiện tốt đề tài tốt nghiệp của mình

Khánh Hòa, ngày tháng năm 2016 Tác giả luận văn

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN 1

LỜI CẢM ƠN iv

DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ix

DANH MỤC BẢNG xi

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN xii

LỜI MỞ ĐẦU 1

Chương 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về chim Yến 3

1.1.1 Hệ thống phân loại 3

1.1.2 Vị trí địa lý và phân bố 4

1.2 Tổng quan về tổ chim yến 5

1.2.1 Hình dạng 5

1.2.2 Kích thước 6

1.2.3 Màu sắc 6

1.2.4 Thành phần hóa học của yến sào 7

1.2.5 Cấu trúc và tính chất của các glucan trong Yến sào 7

1.2.5.1 Hợp chất N-acetylgalactosamine (galNAc) 8

1.2.5.2 Hợp chất N-acetylglucosamine (glcNAc) 8

1.2.5.3 Cấu trúc và tính chất của N-acetylneuraminic acid hay acid sialic 9

1.2.6 Sản phẩm trên thị trường trong nước và thế giới 9

1.2.6.1 Sản phẩm trên thị trường trong nước 9

1.2.6.2 Sản phẩm trên thị trường thế giới 10

1.2.7 Công dụng của yến sào 10

1.3 Tổng quan về một số Enzyme sử dụng trong phân cắt chuỗi protein 12

1.3.1 Giới thiệu về enzyme 12

1.3.2 Tính ưu việt của enzym so với các chất xúc tác vô cơ khác 12

1.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzym 13

1.3.4 Ứng dụng của enzyme 14

1.3.5 Một số enzyme sử dụng trong phân cắt chuỗi protein) 14

1.3.5.1 Alpha - Amylase 14

1.3.5.2 Enzym Alcalase 15

1.3.5.3 Enzyme Flavourzyme 15

1.4 Tổng quan về nấm men và Saccharomyces cerevisiae 15

1.4.1 Đặc điểm chung của nấm men 15

1.4.2 Quá trình phân bào của nấm men Saccharomyces cerevisiae 17

1.4.2.1 Hình thức sinh sản 17

1.4.2.2 Chu trình sinh sản của nấm men Saccharomyces cerevisia 18

1.4.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của nấm men 18

Chương 2: NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1 Nội dung nghiên cứu 21

2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 21

2.3 Đối tượng nghiên cứu 21

2.4 Vật liệu nghiên cứu 21

2.4.1 Mẫu nghiên cứu 21

2.4.2 Enzyme sử dụng trong nghiên cứu 21

2.4.3 Nấm men sử dụng trong nghiên cứu 22

2.4.4 Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất nghiên cứu 22

2.4.4.1 Dụng cụ, trang thiết bị 22

2.4.4.2 Hóa chất 22

2.5 Phương pháp nghiên cứu 23

2.5.1 Phương pháp thu mẫu và xử lý mẫu 28

2.5.2 Phương pháp xác định hàm lượng ẩm và hàm lượng khoáng 28

2.5.3 Phương pháp xác định hàm lượng protein 29

2.5.4 Phương pháp xác định protein hòa tan bằng phương pháp Biuret 30

2.5.5 Phương pháp xác đinh hàm lượng carbohydrate 31

2.5.6 Phương pháp xác định hàm lượng chất béo 31

2.5.7 Phương pháp xác định hàm lượng acid sialic 33

2.5.8 Phương pháp xác định sự phân bào của tế bào nấm men 35

2.5.9 Phương pháp xử lý số liệu 35

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36

3.1 Kết quả xác định hàm lượng ẩm và hàm lượng khoáng 36

3.2 Kết quả xác định hàm lượng protein 38

3.4 Kết quả xác định hàm lượng chất béo 43

3.5 Kết quả xác định hàm lượng acid sialic 44

3.6 Quá trình phân bào của nấm men Saccharomyces cerevisiae 44

CHƯƠNG 4 : KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 60

4.1 Kết luận 60

4.2 Kiến nghị 61

TÀI LIỆU THAM KHẢO 62

1 Tài liệu tiếng việt 62

2 Tài liệu tiếng Anh 62 PHỤ LỤC

DANH MỤC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

A1 Mẫu yến thiên nhiên được trích ly bằng enzyme α-Amylase 1,5% và enzyme Alcalase 1,5%

A2 Mẫu yến nhà được trích ly bằng enzyme α-Amylase 1,5% và enzyme Alcalase 1,5%

DNA Deoxyribonucleic acid

F1 Mẫu yến thiên nhiên được trích ly bằng enzyme α-Amylase 1,5% và enzyme Flavourzyme 1,5%

F2 Mẫu yến nhà được trích ly bằng enzyme α-Amylase 1,5% và enzyme Flavourzyme 1,5% GAG Glycoaminoglycan

YPD Yeast Pepton D-glucose

YPDA Yeast Pepton D-glucose Agar

DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình1.1 Một số loài đại diện của các họ Apodidae (Aerodramus fuciphagus), Hemiprocnidae (Hemiprocne coronata), Trochilidae (Archilochus alexandri) (theo

thứ tự từ trái sang phải) 3

Hình 1.2 Phân bố của các loài yến Aerodramus fuciphagus, Aerodramus maximus, Collocalia spp tại các khu vực địa lý khác nhau 4

Hình 1.3 Hình dạng tổ yến tại các nông trại 5

Hình 1.4 Kích thước tổ chim yến 6

Hình 1.5 Cấu trúc của galNAc 8

Hình 1.6 Cấu trúc của glcNAc 8

Hình 1.7 Cấu trúc của Neu5Ac 9

Hình 1.8 Cấu trúc của tế nào nấm men 16

Hình 1.9 Sự nảy chồi của nấm men 17

Hình 1.10 Chu kỳ sinh sản của nấm men 18

Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu thủy phân dịch yến 23

Hình 2.2 Sơ đồ nghiên cứu 24

Hình 3.2 Đồ thị biểu thị hàm lượng tro của Yến ở một số khu vực 37

Hình 3.3 Đồ thị biểu thị hàm lượng protein tổng số trong mẫu tại một số khu vực ở Malaysia và Indonesia 39

Hình 3.4 Mẫu A1 để xác định hàm lượng protein hòa tan ở bước sóng 570nm 39

Hình 3.5 Đồ thị biểu thị hàm lượng protein trong yến thiên nhiên và yến nhà 40

Hình 3.6 Đường chuẩn BSA tại bước sóng 570 nm 40

Hình 3.7 Vô cơ hóa mẫu yến thiên nhiên A1 và yến nhà A2 41

Hình 3.8 Mẫu yến thiên nhiên A1 và yến nhà A2 phản ứng với phenol 41

Hình 3.9 Đồ thị biểu diễn đường chuẩn glucose 42

Hình 3.10 Đồ thị biểu thị hàm lượng carbonhydrate của các mẫu yến tại các khu vực 43

Hình 3.11 Đồ thị so sánh đường cong sinh trưởng của các mẫu Saccharomyces cerevisiae khi bổ sung dịch yến (1%) 45

Hình 3.12 Khuẩn lạc giữa mẫu F2 1% so với mẫu đối chứng 47

Hình 3.13 Đồ thị biểu diễn đường cong sinh trưởng của nấm men khi bổ sung dịch yến A1 có nồng độ khác nhau 48

Hình 3.14 Khuẩn lạc giữa mẫu A2 2% so với mẫu đối chứng 50

Hình 3.15 Đồ thị biểu diễn đường cong sinh trưởng của nấm men khi bổ sung nồng độ dịch

yến F1 khác nhau 51

Hình 3.16 Khuẩn lạc giữa mẫu F1 1% so với mẫu đối chứng 53

Hình 3.17 Đồ thị biểu diễn đường cong sinh trưởng của Saccharomyces cerevisiae khi bổ sung dịch yến H1 có nồng độ khác nhau 54

Hình 3.18 Khuẩn lạc giữa mẫu H2 2% so với mẫu đối chứng 56

Hình 3.19 Hình thái của khuẩn lạc 57

Hình 3.20 Hình thái của tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae 58

Hình 3.21 Kích thước tế bào mẫu A1 so với kích thước tế bào mẫu đối chứng 58

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Thành phần hóa học của yến thiên nhiên và yến nhà 36

Bảng 3.2 Hàm lượng protein tổng của yến thiên nhiên và yến nhà 38

Bảng 3.3 Hàm lượng carbohydrate của yến thiên nhiên và yến nhà 42

Bảng 3.4 Hàm lượng lipid của yến thiên nhiên và yến nhà 43

Bảng 3.6 Tốc độ phát triển của nấm men Saccharomyces cerevisiae ở mẫu A1 bổ sung nồng độ yến khác nhau 49

Bảng 3.7 Số lượng tế bào nấm men ở mẫu A1 và A2 khi bổ sung với nồng độ khác nhau 50

Bảng 3.8 Tốc độ phát triển của nấm men Saccharomyces cerevisiae ở mẫu F1 bổ sung nồng độ yến khác nhau 52

Bảng 3.9 Số lượng tế bào nấm men ở mẫu yến F1 và F2 khi bổ sung dịch yến với nồng độ khác nhau 53

Bảng 3.10 Tốc độ phát triển của nấm men Saccharomyces cerevisiae ở mẫu F1 bổ sung nồng độ yến khác nhau 55

Bảng 3.11 Số lượng tế bào nấm men ở mẫu yến H1 và yến H2 khi bổ sung dịch yến được trích lý bằng nhiệt độ với nồng độ khác nhau 56

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN

Yến sào hay tổ chim yến, là tên một loại thực phẩm - dược phẩm nổi tiếng được làm bằng tổ chim yến Đây là món cao lương mĩ vị tại các quốc gia Đông Á như Nhật Bản, Triều Tiên, Trung Quốc, Việt Nam và nhiều quốc gia khác Theo luận án tiến sĩ dược khoa tại đại học Dược khoa Sài Gòn năm 1972 của TS Huỳnh Hữu Tạo, có 3 nhóm yến sào phân bố theo vùng địa lý chính: yến sào quanh vùng Cù Lao Chàm (Quảng Nam-Đà Nẵng), yến sào quanh vùng Quy Nhơn và yến sào quanh vùng Nha Trang- Cam Ranh Tuy nhiên hiện nay yến sào phân bố rải rác ở các đảo và được nuôi ngày càng phát triển do nhu cầu người tiêu dùng ngày càng nhiều Tại Khánh Hòa là nơi chim yến làm tổ nhiều nhất ở Việt Nam, đặc biệt yến sào Khánh Hòa có mùi vị thơm ngon đặc trưng được coi là tổ yến vua và giá cả luôn ở mức cao nhất thế giới

Các công trình nghiên cứu về thành phần của tổ yến trong nước còn hạn chế, chủ yếu là các nghiên cứu về đa dạng di truyền chim Yến như nghiên cứu của Hồ Thị Loan

và cs., 2015- Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, trường ĐH Sư phạm Hà Nội- “Mối

quan hệ di truyền của một số quần thể chim yến sống ngoài đảo và trong đất liền ở Việt Nam”

Mục tiêu của đề tài là xác định các thành phần hóa học của yến sào và hoạt tính kích thích sự phân bào tế bào của yến sào ở Khánh Hòa Các mẫu yến sào sau khi thu hoạch tại Khánh Hòa đã được làm sạch, sấy khô và bảo quản để thực hiện các phân tích Chúng tôi đã nghiên cứu các thành phần hóa học của yến thiên nhiên, yến nhà tại Khánh Hòa dựa trên các tiêu chuẩn Việt Nam Các mẫu yến sử dụng phương pháp trích lý bằng các enzyme α – Amylase 1,5% kết hợp với enzyme Alcalase 1,5%, α – Amylase 1,5% kết hợp với enzyme Flavourzyme 1,5% và nhiệt độ ở 1210C, 20 phút thu được dịch chiết

Từ đó bổ sung dịch yến với các nồng độ khác nhau vào môi trường nuôi cấy nấm men

Saccharomyces cerevisiae, quan sát quá trình sinh trưởng của nấm men bằng cách xây

dựng đường cong sinh trưởng, nuôi cấy nấm men đếm khuẩn lạc và quan sát kích thước

tế bào dưới kính hiển vi quang học

Kết quả nghiên cứu xác định được thành phần hóa học của yến thiên nhiên cao hơn

so với yến nhà và so sánh thành phần hóa học của yến sào tại Khánh Hòa với các khu

vực khác Xây dựng đường cong sinh trưởng của tế bào nấm men Saccharomyces

cerevisiae từ các mẫu bổ sung dịch yến có nồng độ khác nhau Sau 19 giờ bắt đầu từ

men đã kết thúc pha log, bắt đầu vào pha cân bằng và các mẫu có bổ sung dịch yến thì khoảng từ 15 -19 giờ Số khuẩn lạc của mẫu đối chứng khoảng 26 khuẩn lạc, mẫu bổ sung dịch yến từ 26 – 55 khuẩn lạc Hiệu suất trích ly bằng phương pháp nhiệt độ cao hơn so với phương pháp trích ly bằng enzyme, và giữa hai loại enzyme thì hiệu suất trích ly bằng enzyme α – Amylase kết hợp với enzyme Alcalase cao hơn so với α – Amylase kết hợp với enzyme Flavourzyme Với các nồng độ thì 1,5% hoặc 2% dịch yến thì đem lại hiệu quả tốt nhất Tuy nhiên kích thước của tế bào nấm men giữa mẫu đối chứng và mẫu bổ sung dịch yến không có sự khác nhau rõ ràng

Các thành phần hóa học của yến thiên nhiên và yến nhà được xác định và có nhận định ban đầu yến sào có ảnh hưởng tới tốc độ sinh trưởng của tế bào nấm men

Saccharomyces cerevisiae Kết quả nghiên cứu này làm cơ sở nghiên cứu ảnh hưởng

của yến sào tới các tế bào khác, các nghiên cứu chuyên sâu về các thành phần amino acid, glucan có trong tổ yến và so sánh thành phần của yến ở Khánh Hòa với các khu vực khác trong nước và ngoài nước Và kết quả nghiên cứu này làm cơ sở khoa học cho các ứng dụng của yến sào vào trong thực phẩm, mỹ phẩm và dược phẩm

Từ khóa: yến sào, thành phần hóa học, phân bào, nấm men Saccharomyces

cerevisae, đường cong sinh trưởng.

LỜI MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Tổ yến (hay yến sào) - tổ của loài chim yến được làm từ dãi của chim yến, hiện nay là một trong những loại thực phẩm, dược phẩm có nguồn gốc từ động vật có giá trị cao trên thế giới Từ hơn 400 năm trước, người Trung Hoa đã biết sử dụng tổ yến như một loại thực phẩm cao cấp

Tổ yến chủ yếu được khai thác từ loài yến cho tổ ăn được hay còn gọi là chim yến

tổ trắng (danh pháp khoa học: Aerodramus fuciphagus) Công dụng của Yến sào được

các nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu cho là chúng rất giàu giá trị dinh dưỡng, các hoạt tính của chúng mang lại lợi ích về sức khỏe cho người sử dụng như hỗ trợ tiêu hóa, làm giảm bệnh hen suyễn, tăng khả năng tập trung, tăng cường miễn dịch, tăng khả năng phân bào của tế bào, làm lành vết thương, trẻ hóa da,…

Yến sào được mệnh danh là “Caviar của phương Đông” Với giá trị dinh dưỡng của tổ yến, lượng tiêu thụ trên thị trường rất mạnh, tại Malaysia năm 2006 tiêu thụ 160 tấn Tại Việt Nam những năm gần đây lượng yến thiên nhiên (yến đảo) cung cấp không

đủ cho nhu cầu người tiêu dùng, vì thế mô hình nhà yến (yến nuôi) ngày càng phát triển mạnh mẽ Tuy nhiên, những nghiên cứu về thành phần, hoạt tính sinh học của yến sào tại Việt Nam còn hạn chế

Vì những lí do trên, dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Ngô Đăng Nghĩa tôi đã lựa

chọn đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính kích thích sự phân bào của yến sào tại Khánh Hòa”

2 Mục tiêu đề tài

Xác định các thành phần hóa học của yến sào ở Khánh Hòa và ảnh hưởng của yến

sào tới quá trình sinh trưởng của tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae

3 Nội dung chính của đề tài

- Xác định thành phần cơ bản của yến thiên nhiên

- Xác định thành phần cơ bản của yến nuôi (yến nhà)

- So sánh thành phần của yến thiên nhiên, yến nhà và các loại yến trong khu vực Đông Nam Á

- Ảnh hưởng của tổ yến tới sự phân bào của tế bào nấm men Saccharomyces

Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về chim Yến

Chim yến (Aerodramus spp.) thuộc bộ Apodiformes, trong đó bao gồm họ yến Apodidae, họ yến mào Hemiprocnidae và họ chim ruồi Trochilidae (Joel và cs., 1981)

Hình1.1 Một số loài đại diện của các họ Apodidae (Aerodramus fuciphagus), Hemiprocnidae (Hemiprocne coronata), Trochilidae (Archilochus alexandri) (theo thứ

tự từ trái sang phải) (Nguồn: http://en.wikipedia.org)

Họ yến được chia thành 2 phân họ là Apodinae và Cypseloidinae Phân họ

Apodinae bao gồm 79 loài khác nhau, được chia thành 3 tông: Collocaliini (28 loài),

Chaeturini (24 loài) và Aponidi (27 loài), trong khi phân họ Cypseloidinae bao gồm 13

loài khác nhau Như vậy trong họ yến có tất cả 19 giống, 92 loài (Camfield và cs., 2004)

1.1.1 Hệ thống phân loại

Hệ thống phân loại của chim yến tổ trắng (chim yến hàng) Aerodramus fuciphagu

(http://www.itis.gov, Taxonomic Serial No.: 554970):

Giới: Animalia

Ngành: Chordata

Phân ngành: Vertebrata

Lớp: Aves Bộ: Apodiformes Họ: Apodidae

Phân họ: Apodinae

Giống: Aerodramus Loài: Aerodramus fuciphagus

1.1.2 Vị trí địa lý và phân bố

Hầu hết các loài yến trong giống Aerodramus phân bố ở các vùng nhiệt đới thuộc khu vực Ấn Độ Dương – Thái Bình Dương và không di cư Loài Aerodramus fuciphagus

phân bố ở phía đông, từ các quần đảo Andaman và Nicobar ở Ấn Độ Dương đến Đông

Nam Á và các quần đảo Lesser Sunda (Glenister và cs., 1971)

Hình 1.2 Phân bố của các loài yến Aerodramus fuciphagus, Aerodramus maximus,

Collocalia spp tại các khu vực địa lý khác nhau

(Nguồn: http://www.padcogroup.com/eco-park.html)

Theo hình trên có thể thấy loài yến tổ trắng Aerodramus fuciphagus phân bố tại

các quốc gia: Việt Nam (từ khu vực miền trung đến miền nam), Campuchia, Malaysia,

Singapore và Indonesia Loài chim yến tổ đen Aerodramus maximus phân bố trong phạm

vi hẹp hơn: Malaysia và một phần của lãnh thổ Indonesia Riêng giống Collocalia lại có

phạm vi phân bố rộng hơn cả, bao gồm phần lãnh thổ của Malaysia, Indonesia, Philippines

1.2 Tổng quan về tổ chim yến

1.2.1 Hình dạng

Tổ yến bao gồm nhiều phiến mỏng được dệt từ nhiều sợi tơ bằng nước bọt chim yến và bện vào nhau, nó bị đông cứng lại sau khi tiếp xúc với không khí Là một vật chất hữu cơ thiên nhiên và dễ hấp thụ Tổ yến hình dạng như cái bát do chim trống xây trong khoảng thời gian 35 ngày và các tổ dính vào các thành hang động hoặc vách đá Hình dáng ưa thích nhất của tổ yến là hình nửa cái ly nhưng mà rộng, không dày

và không có lỗ

Hầu hết tổ chim yến được chia thành ba loại: loại A, loại B và loại C như hình 1.3 Hình dạng của tổ hạng A tương tự như hình nửa cái cốc với 1800

Hạng B hình dạng tương tự như hạng A nhưng nó tạo góc 1350 khi đặt trên mặt phẳng nằm ngang Hạng C

là phần nữa hạng A và nó là 900 cũng khi đặt trên mặt phẳng nằm ngang

Hình 1.3 cho thấy sự hình thành của loại khác nhau khi chim Yến xây dựng tổ của chúng trên các sàn gỗ Hầu hết tại các trang trại nuôi, chim Yến chiếm bốn góc của

Chú thích: A,B,C: là các hình dạng của tổ yến được cắt ngang

Chú thích: A,B,C: Vị trí bám trên trần nhà của tổ yến nhà

Hình 1.3 Hình dạng tổ yến tại các nông trại (Kok và cs., 2014)

dựng tổ với nguồn ít hơn Vì vậy, phần trăm hạng C của tổ yến sẽ cao hơn so với hạng

A và B (Kok và cs., 2014)

1.2.2 Kích thước

Truyền thống, kích thước của tổ yến được xác định bởi số lượng các ngón tay (chiều rộng của ngón tay người trưởng thành) Phương pháp này không chính xác bởi kích thước ngón tay khác nhau tùy từng người Phương pháp khoa học hơn được xác định bởi chiều cao và chiều dài của tổ yến như hình 1.4 Tổ yến hạng A có kích thước 3

cm x 6 cm và hạng B 2,5 cm x 5 cm Hoặc nó cũng được xác định bởi số lượng của từng

tổ trên một kilogram Hạng A sẽ là 100 tới 110 tổ và hạng B khoảng 120 tổ/kg (Kok và

khoảng 90% tổng số lượng tổ yến trên thị trường thế giới (Kok và cs., 2014)

Bên cạnh yến trắng còn yến hồng và yến đỏ còn gọi là yến huyết Đây là loại yến

có màu đỏ tươi và là loại có giá cao nhất trong tất cả các loại yến Mỗi năm loại yến

huyết này thu hoạch 1- 2 lần với tỉ lệ rất nhỏ Số lượng yến này chưa chiếm tới 10% tổng lượng tổ yến trên thị trường thế giới

Nghề khai thác yến tại Việt Nam những người thợ yến và buôn bán yến chuyên nghiệp thường phân biệt theo đẳng cấp như:

Huyết (đỏ, do vị trí chim yến làm tổ, tổ dần dần chuyển sang màu đỏ)

Hồng (Màu hồng, do vị trí chim yến làm tổ, tổ dần dần chuyển sang màu hồng) Quan (to, tổ yến có trọng lượng khoảng 10g trở lên)

Thiên (ở trên cao, tổ trắng, từ 8 – 10g)

Bài (yến nhỏ hơn 6- 7g)

Địa (nằm dưới cùng của vách núi, đen, bẩn)

Vụn (tổ yến bị vỡ do khai thác hoặc vận chuyển)

1.2.4 Thành phần hóa học của yến sào

Thành phần hóa học của yến sào (Marcone và cs., 2005) bao gồm

- Lipid: 0,14 – 1,28%

- Tro: 2,1% Hàm lượng khoáng chiếm lượng nhiều nhất là canxi từ 503,5 – 2071,3

mg/g và natri chiếm từ 39,8 – 509,6% (Norhayati và cs.,2010)

- Carbohydrate: 25,62 – 27,26%

- Protein: 62,0 – 63,0%

- Một trong thành phần chính của glyconutrients trong yến sào là acid sialic: 9%

(Colombo và cs., 2003)

1.2.5 Cấu trúc và tính chất của các glucan trong Yến sào

Bên cạnh các thành phần trên, yến sào còn có một số hợp chất thiết yếu cho cơ

thể như 9% N-acetylneuraminic acid (NeuAc) hay là acid sialic (Colombo và cs., 2003),

7,2% N-acetylgalactosamine (galNAc), 5,3% N-acetylglucosamine (glcNAc), 16,9%

galactose và 0,7% fucose (Dhawan và cs., 2002)

1.2.5.1 Hợp chất N-acetylgalactosamine (galNAc) (Argueso và cs., 2003)

 Cấu trúc:

Hình 1.5 Cấu trúc của galNAc

(Nguồn: https://en.wikipedia.org/wiki/N-Acetylgalactosamine)

 Chức năng của galNAc (2-(Acetylamino)-2-deoxy-D-galactose)

- Là dẫn xuất đường amin của galactose

- GalNAc liên quan tới chức năng của synapse, cầu nối giữa các tế bào thần kinh và sự thiếu hụt có thể là ảnh hưởng tới trí nhớ

1.2.5.2 Hợp chất N-acetylglucosamine (glcNAc) (Pasztoi và cs., 2009)

 Cấu trúc

Hình 1.6 Cấu trúc của glcNAc

(Nguồn: https://en.wikipedia.org/wiki/N-Acetylglucosamine)

 Chức năng của glcNAc (2-(Acetylamino)-2-deoxy-D-glucose)

- GlcNAc là một axit amin và là tiền thân của glycosaminoglucans

- Thành phần chính của khớp sụn

- Bổ sung glucoamin có thể giúp ngăn ngừa sự thoái hóa sụn và làm một số triệu chứng liên quan chứng viêm khớp

1.2.5.3 Cấu trúc và tính chất của N-acetylneuraminic acid hay acid sialic

- Có ích cho hệ thần kinh và có lợi cho não của trẻ em (Chau và cs., 2003)

- Là chất điều tiết tốt cho hệ thống miễn dịch , axit sialic tăng sức đề kháng của chất nhầy, làm giảm mật độ lipoprotein, ngăn chặn virus cúm chủng A và B (Chao-Tan,

2006), gia tăng khả năng phát triển tế bào và ức chế sự đông máu (Biddle và cs., 1962)

 Bên cạnh đó cả ba hợp chất trên đều ảnh hưởng tới khả năng phát triển của tế bào với các nồng độ nhất định (Aswir, 2011 và 2010)

 Ngoài ra galactose và fucose là hai glyconutrient ảnh hưởng tới phát triển não, truyền thông tin tế bào và có khả năng kháng khuẩn (Aswir, 2011 và 2010)

1.2.6 Sản phẩm trên thị trường trong nước và thế giới

1.2.6.1 Sản phẩm trên thị trường trong nước

Yến sào chỉ có ở các nước Đông Nam Á, với sản lượng cao nhất là Indonesia, nhưng tổ yến ngon nhất là ở Việt Nam Tổ yến Việt Nam được người tiêu dùng trên thế giới tấn phong là Tổ yến vua (theo tài liệu của tổ chức bảo vệ động vật hoang dã thế giới

- WWF và Cites)

Ở Việt Nam, chim yến cho tổ ăn được là loài Aerodramus fuciphagus, sinh sống

trong nhà phân bố từ Thanh Hóa đến Cà Mau, các tỉnh Tây Nguyên từ Bình Phước đến

Đắc Lăk (http://www.yensaokhanhhhoa.com.vn)

Công ty TNHH NN MTV Yến Sào Khánh Hòa và công ty CP Yến Việt là hai công

ty cung cấp hàng đầu về sản lượng yến Các sản phẩm yến có mặt trên thị trường ngày nay như (http://www.yensaokhanhhhoa.com.vn):

Yến sào thành phẩm: Là yến sào nguyên chất được khai thác trực tiếp từ các đảo

yến

Yến sào tinh chế: Là yến được làm sạch, loại bỏ các tạp chất

Các sản phẩm khác như: yến nước cao cấp, cháo yến dinh dưỡng, ngũ cốc yến dinh

dưỡng, …

1.2.6.2 Sản phẩm trên thị trường thế giới

Malaysia thị trường xuất khẩu chính sản phẩm yến tổ là Hồng Kông (50%), Trung Quốc (8%), Đài Loan (4%) và Macau (3%) với ước tính lượng tiêu thụ 160 tấn năm

2006 và là nơi sản xuất yến tổ đứng thứ ba sau Indonesia (60%) và Thái Lan (20%) (Kok

và cs., 2014)

Sản phẩm yến bán trên thị trường thường được chia thành ba loại chính: dạng hình nữa cái cốc, dạng mảnh vụn và dạng ép thành bánh

1.2.7 Công dụng của yến sào

Yến sào là tổ dạng khô của chim yến Collocalia được làm từ nước bọt của nó

Hiện nay người ta tìm thấy chất chiết xuất từ tổ yến có thể trung hòa sự nhiễm trùng của virus cúm trong các tế bào MDCK và ức chế sự ngưng kết hồng cầu của hồng cầu người bởi virus cúm A có nguồn gốc từ các vật chủ khác nhau như người, các loài chim và lợn

(Chao -Tan và cs., 2006) Yến sào kích thích hocmon cho quá trình phân bào nguyên

nhiễm và yếu tố tăng trưởng cho sự tăng trưởng biểu bì dẫn tới sự phục hồi của các tế

bào và kích thích hệ thống miễn dịch (Kong và cs., 1987; Ng và cs., 1986)

Có khoảng 200 hợp chất đường tự nhiên nhưng trong đó có 8 hợp chất là thiết yếu cho cơ thể Các hợp chất này được biết như là glyconutrient và cần thiết cho các chức năng của cơ thể Bao gồm xylose, fucose, galactose, glucose, mannose, N-

acetylglucosamine, N-acetylgalactosamine, N-acetylneuraminic acid (sialic acid) Bảy trong tám chất dinh dưỡng này được tìm thấy trong yến sào Trong đó acid sialic chiếm

9% (Colombo và cs., 2003), nó có ích cho hệ thần kinh và có lợi cho não của trẻ em (Chau và cs., 2003), là chất điều tiết cho hệ thống miễn dịch tuyệt vời, acid sialic tăng

sức đề kháng của chất nhầy, làm giảm mật độ lipoprotein, ngăn chặn virus cúm chủng

A và B, gia tăng khả năng phát triển tế bào và ức chế sự đông máu (Biddle và cs., 1962)

Các thành phần khác của gluconutrient bao gồm 7,2% N-acetylgalactosamine (galNAc), 5,3% N-acetylglucosamine (glcNAc), 16,9% galactose và 0,7% fucose (Dhawan và Kuhad, 2002) GalNAc liên quan tới chức năng của synapse, cầu nối giữa các tế bào

thần kinh và sự thiếu hụt có thể ảnh hưởng tới trí nhớ (Argueso và cs., 2003) GlcNAc

là một axit amin và thành phần chính của khớp sụn Glucoamin bổ sung có thể giúp ngăn ngừa sự thoái hóa sụn và làm một số triệu chứng liên quan chứng viêm khớp (Pasztoi

và cs., 2009) Galactose và fucose là glyconutrient ảnh hưởng tới phát triển não, truyền

thông tin tế bào và có khả năng kháng khuẩn Bên cạnh đó, axit sialic, galNac, glcNac còn ảnh hưởng tới sự phát triển của tế bào Với hàm lượng axit sialic 2%, sự phát triển sinh sôi của tế bào tăng 50%, với hàm lượng 10%, tế bào tăng hơn 100%, tương tự lượng tối ưu tác động tới tăng trưởng tế bào của galNac và glcNac là 6% Yến sào còn ảnh

hưởng khả năng tạo sự chống viêm u bướu độc TNF-α trong tế bào RAW (Aswir và cs.,

2011) Thế kỷ 16, súp yến sào trở thành thức ăn ngon của người Trung Quốc và được

thay thế cho các thành phần của thuốc (Medway và cs., 1969) và như là một chất làm đẹp bởi vì đặc tính làm trẻ da và yếu tố cải thiện biểu bì (Kong và cs., 1987)

Yến sào được tạo từ nước bọt của chim yến vì vậy chứa chất nhầy glycoprotin

như condroitin glycosaminoglycans (GAG) và sialyglycoconjugates (Pozsgay và cs.,

1987) Condroitin GAG là một trong các thành phần chính của xương Và mục đích của

Matsukawa và cs., 2011 để định lượng ảnh hưởng ngăn ngừa các chất chiết xuất từ yến

sào chống lại chứng loãng xương, nên đã thử nghiệm trên chuột và đã đo độ khỏe của xương, khoáng (như canxi, photpho) và nồng độ hydroproxyline ở chuột Da ở lưng được lấy để định lượng mô Kết quả nồng độ canxi, photpho và hydroxyproline ở xương đùi, cũng như cân nặng của đùi tăng Chiều dày của các sợi collagen ở da cũng tăng Điều đó chứng minh yến sào được sử dụng giúp cho xương chắc khỏe và cải thiện lão

hóa da ở phụ nữ (Matsukawa và cs., 2011)

Có sáu loại hocmon có hoạt tính sinh học quan trọng trong tổ yến được chiết xuất và được xác định, bao gồm testosterone (T), estradiol (E2), progesterone (P), hocmon luteinizing (LH), hocmon follicle-stimulating (FSH) và prolactin (PRL) (Ma và

cs., 2012)

1.3 Tổng quan về một số Enzyme sử dụng trong phân cắt chuỗi protein

1.3.1 Giới thiệu về enzyme (Nguyễn Đức Lượng, 2008)

Enzym là protein có hoạt tính xúc tác, có phân tử lượng từ 20.000 đển 1.000.000 dalton (có kích thước nhỏ nhất là Ribonucleaza 12.700 dalton) Người ta đã khám phá

ra rằng các enzym đã xúc tác cho hầu hết các phản ứng hóa học xảy ra trong cơ thể sống tiến hành với tốc độ nhịp nhàng, cân đối, theo những chiều hướng xác định Như vậy enzyme đã đảm bảo cho sự trao đổi thường xuyên giữa cơ thể sống với môi trường bên ngoài, nghĩa là đảm bảo cho sự tồn tại của cơ thể sống

Enzym có hiệu suất xúc tác cực kỳ lớn Nó có thể gấp hàng trăm, hàng ngàn, hàng triệu lần các chất xúc tác vô cơ và hữu cơ khác Ví dụ: Dùng saccarasa làm chất xúc tác cho phản ứng thủy phân saccaroza thì tốc độ phản ứng tăng nhanh gấp 2*1012 lần so với khi dùng axid làm xúc tác Enzym có thể thực hiện hoạt động xúc tác trong điều kiện nhẹ nhàng, ở áp suất và nhiệt độ bình thường của cơ thế, pH môi trường gần pH sinh lý Enzym có tính đặc hiệu cơ chất cao, đó là khả năng lựa chọn cao đối với kiểu phản ứng

mà nó xúc tác cũng như đối với chất mà nó tác dụng

 Đặc hiệu cơ chất tuyệt đối: enzyme chỉ xúc tác cho một kiểu liên kết nhất định

và đòi hỏi rất khắt khe các nhóm nguyên tử xung quanh liên kết mà enzyme tác dụng

 Đặc hiệu cơ chất tương đối: enzyme chọn một kiểu liên kết để xúc tác nhưng đòi hỏi không quá khắt khe với nhóm nguyên tử xung quanh liên kết mà nó tác dụng

Do những đặc điểm trên, việc nghiên cứu và ứng dụng của enzym có ý nghĩa rất to lớn

từ vi sinh vật do tốc độ sinh trưởng, sinh sản quá nhanh nên trong thời gian ngắn ta có sinh khối vi sinh vật lớn để chiết được nhiều enzym nên đáp ứng được thời gian cũng như chất lượng của các quy trình Các thông số ảnh hưởng tới hoạt động của enzym: nhiệt độ (0C) 35-55 > 100, pH: trung tính; acid; kiềm, chất kìm hãm: cạnh tranh và không cạnh tranh, chất hoạt hóa

1.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzym (Nguyễn Đức Lượng, 2008)

Enzym là chất xúc tác sinh học có bản chất protein, xúc tác cho các phản ứng bên trong và ngoài cơ thể Hoạt động của enzym phụ thuộc chặt chẽ vào nhiều yếu tố khác nhau như: nhiệt độ, pH môi trường, nồng độ enzym và cơ chất, chất ức chế, chất hoạt hóa…Tất cả các yếu tố trên nếu thích hợp thì vận tốc phản ứng do enzym

sẽ là tối đa

 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ là yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến tính chất của enzym Nhiệt độ cao làm biến tính không thuận nghịch enzym Nhiệt độ thấp làm biến tính thuận nghịch enzym, tức là khi đưa enzym từ nhiệt độ thấp lên nhiệt độ bình thường, thì enzym sẽ phục hồi khả năng xúc tác của mình nên người ta thường bảo quản enzym ở nhiệt độ thấp Giá trị nhiệt

độ mà enzym bắt đầu mất hoạt tính gọi là nhiệt độ tới hạn Giá trị nhiệt độ mà enzym thể hiện cao nhất khả năng xúc tác gọi là nhiệt độ tối thích Cùng một enzym nhưng lấy từ các nguồn khác nhau thì vùng nhiệt độ tối thích cũng khác nhau

 Ảnh hưởng của pH môi trường

Hầu hết enzym hoạt động ở pH môi trường lân cận bằng 7 Cá biệt có những enzyme hoạt động ở pH rất xa môi trường trung tính như: enzym pepsin (pH=1,5÷2,5), trypsin (pH ≈ 9) pH của môi trường làm thay đổi trạng thái ion hóa của enzym và cơ chất Tại pH tối thích thì enzym lẫn cơ chất đạt đến trạng thái ion hóa thích hợp nhất khiến cho chúng dễ dàng kết hợp với nhau nên vận tốc phản ứng tăng lên

 Ảnh hưởng của chất kìm hãm

Chất kìm hãm là những chất làm giảm khả năng xúc tác của enzym, có khi làm cho enzym vô hoạt Những chất kìm hãm thường là những chất hữu cơ phân tử nhỏ, các

 Ảnh hưởng của chất kích hoạt

Chất kích hoạt là những chất có khả năng làm tăng hiệu lực xúc tác của enzym hoặc chuyển enzym từ trạng thái không hoạt động sang trạng thái hoạt động Mỗi enzym đòi hỏi cho mình chất hoạt hóa riêng

Vai trò của chất hoạt hóa:

Phục hồi một số nhóm chức hoạt động yếu hoặc không hoạt động thành hoạt động Các chất hoạt hóa có khả năng cắt đứt một vài đoạn peptide đang kìm hãm sự hình thành trung tâm hoạt động của enzym Chất kích hoạt có thể là ion kim loại kiềm: Ba2+, Ca2+,

Cl-, Br-, I-… những ion này có vai trog làm cầu nối giữa enzym với cơ chất, tăng diện tích tiếp xúc giữ enzym với cơ chất, ổn định cấu trúc không gian cần cho sự xúc tác Ảnh hưởng của nồng độ enzym, cơ chất Trong điều kiện thừa cơ chất thì tăng nồng độ enzym thì vận tốc phản ứng do enzym sẽ tăng lên Nhưng nếu tăng nhiều thì vận tốc phản ứng sẽ không tăng nữa

1.3.4 Ứng dụng của enzyme

Các nghiên cứu ứng dụng của enzym ngày càng được mở rộng và đạt hiệu quả cao

Để sử dụng emzym trong thực tế có thể tiến hành theo hai cách chủ yếu sau đây:

 Điều hòa định hướng tác dụng của enzym trong các nguyên liệu chứa nó

 Tách enzym ra khỏi nguyên liệu ở dạng chế phẩm và sử dụng trong các quá trình sản xuất

Sử dụng enzym theo cách thứ nhất trong nhiều trường hợp có thể đơn giản hơn Ví dụ: có thể dùng yếu tố nhiệt độ để điều chỉnh hoạt độ một số enzym trong cá, chè, thuốc lá…để làm tăng rõ rệt hương vị Tuy nhiên cách này hạn chế phạm vi ứng dụng enzym vì

nó chỉ có thể dùng enzym đối với quy trình chế biến chính nguyên liệu của nó

1.3.5 Một số enzyme sử dụng trong phân cắt chuỗi protein (Nguyễn Đức Lượng,

2008)

1.3.5.1 Alpha - Amylase

Alpha - Amylase (α-amylaza) là một enzyme loại protein thủy phân liên kết alpha của các polysaccharide chứa liên kết alpha như tinh bột và glycogen, tạo ra glucose và

maltose Đây là dạng chủ yếu của amylase được tìm thấy ở người và các động vật có vú khác Nó cũng có mặt trong các loại hạt giống sử dụng tinh bột như một loại năng lượng

dự trữ, và trong chất tiết của nhiều loại nấm

1.3.5.2 Enzym Alcalase

Enzym Alcalase là một loại enzym endoprotease có hoạt độ cao

Enzym Alcalase bị bất hoạt trong 10-15 phút ở 850C (1850F) Hoặc bằng các loại acid như acid tricloacetic, clohidric, photphoric, malic, lactic hoặc acid acetic Tuy nhiên bất hoạt enzyme còn phụ thuộc nhiều vào nồng độ enzym, pH Hoạt động tối ưu của enzym Alcalase là pH trung tính Nhiệt độ 55 - 700C Hoạt độ của enzym phụ thuộc vào nhiệt độ bảo quản Enzym Alcalase được bảo quản ở nhiệt độ 50C ( 410F)

Trong nghiên cứu sản phẩm này dạng lỏng, có màu nâu, chất để ổn định là glycerol,

được sản xuất từ loại vi khuẩn Bacillus Licheniformis Hoạt độ: 2,4 AU/g, liều lượng sử

dụng là 9,6 – 24 AU/kg protein và điều kiện pH hoạt động tối ưu của chế phẩm enzyme này là 6,5 – 8,5

1.3.5.3 Enzyme Flavourzyme

Flavourzyme là peptidase mang cả hai hoạt tính endo và exoprotease

(aminopeptidase), được sản xuất từ quá trình lên men chìm loài Aspergillus oryzae

Enzyme này hoạt động thủy phân protein trong điều kiện trung tính hoặc acid yếu Điều kiện hoạt động tối ưu của flavourzyme 500 MG là pH 4,5 – 8,5, nhiệt độ khoảng 500C Flavourzyme 500 Mg có hoạt tính 1000 LAPU/g, một LAPU (leucine aminopeptidase unit) là số lượng của enzyme để thủy phân 1µmol của L-leucine-p-nitroanilide trong 1 phút Liều lượng có thể được sử dụng với lượng: 5 -10 LAPU/g protein, là dạng bột mịn, màu nâu, tan tốt trong nước Flavourzyme có thể bị ức chế hoạt động ở 850C trong 10 phút hoặc 1200C trong 5 giây

1.4 Tổng quan về nấm men và Saccharomyces cerevisiae (GS Bùi Tấn Anh, 2003)

1.4.1 Đặc điểm chung của nấm men

Nấm men là tên chung để chỉ những nhóm nấm có cấu tạo đơn bào, sống riêng lẻ hoặc sống thành từng đám, không di động và sinh sản vô tính chủ yếu bằng hình thức nảy chồi Chúng phân bố rộng rãi trong thiên nhiên như trong đất, nước, lương thực thực phẩm…,

đặc biệt có nhiều trong các loại hoa quả chín, ngọt Hình dạng và kích thước nấm men thay đổi tùy theo loài, giống, điều kiện dinh dưỡng và nhiều yếu tố khác

Hình 1.8 Cấu trúc của tế nào nấm men

(Nguồn: men-yeast-extract-la-gi/s_cerevisiae/)

http://icfood.vn/home/2014/01/02/chiet-xuat-nam-Nấm men thường có dạng hình trứng, hình bầu dục (Saccharomyces cerevisiae,

Saccharomyces ellipsoideus…), hình tròn (Candida utilis), hình ống dài (Pichia), hình

quả dưa chuột (Saccharomyces pastorianus), hình một đầu nhọn (Brettanomyces), hình

tam giác (Trigonopsis) và một số hình đặc biệt khác Một số nấm men có tế bào hình dài, nối tiếp nhau thành những dạng sợi gọi là khuẩn ty (mycelium) hoặc khuẩn ty giả (pseudomycelium) Ở khuẩn ty giả, các tế bào không nối liền nhau một cách chặt chẽ như ở khuẩn ty Khuẩn ty và khuẩn ty giả thường quan sát thấy ở các giống

Endomycopsis, Candida, Trichosporon…, nhiều loài nấm chỉ sinh khuẩn ty giả khi

không được cung cấp đủ oxy Hình dạng nấm men không ổn định, nó còn phụ thuộc vào

tuổi giống và điều kiện ngoại cảnh Ví dụ, Saccharomyces thường có hình bầu dục trong

môi trường nuôi cấy giàu dinh dưỡng Trong điều kiện yếm khí thường có hình tròn, trong điều kiện hiếu khí tế bào có hình dài hơn Kích thước tế bào nấm men thay đổi rất nhiều tùy theo giống, loài và từng giai đoạn phát triển Nhìn chung, tế bào nấm men to hơn tế bào vi khuẩn một cách rõ rệt, kích thước trung bình 3 – 5 * 10 – 12 µm

Kích thước chiều ngang tế bào nấm men giống Torulopsis là 5 – 8 µm, ở một số loại men rượu là 10 – 11 µm, men bia là 6 – 8 µm, nấm men gia súc thường nhỏ hơn

Để quan sát hình thái và đo kích thước tế bào nấm men, người ta thường sử dụng môi trường mạch nha dịch thể với nồng độ đường khoảng 10 – 150B (độ Baumé, đơn vị

nuôi cấy là 3 ngày ở 25 – 300C Nấm men là sinh vật có nhân thật, cấu tạo tế bào có màng tế bào, nguyên sinh chất, nhân, ty thể, ribosome, không bào, một số thể vùi (glycogen, lipit, volutin…)

1.4.2 Quá trình phân bào của nấm men Saccharomyces cerevisiae

1.4.2.1 Hình thức sinh sản

 Sinh sản vô tính theo kiểu nảy chồi: đây là hình thức sinh sản phổ biến và đặc trưng của nấm men Khi trưởng thành, tế bào nấm men sẽ nảy ra một chồi nhỏ, các enzyme thủy phân sẽ làm phân giải phần polysaccharide của thành tế bào làm cho chồi chui ra khỏi tế bào mẹ Vật chất mới được tổng hợp được tổng hợp sẽ được huy động đến chồi và làm chồi phình to dần lên, một phần nhân của tế bào mẹ được chuyển sang chồi, sau đó tách ra thành nhân mới, rồi hình thành vách ngăn mới để ngăn cách với tế bào mẹ, tạo nên một tế bào mới Tế bào con được tạo thành có thể tách khỏi tế bào mẹ hoặc vẫn dính trên tế bào mẹ và tiếp tục nảy sinh tế bào mới

Hình 1.9 Sự nảy chồi của nấm men

(Nguồn: Giáo trình sinh học đại cương A2- Khoa Khoa học trường ĐH Cần Thơ

http://vietsciences.free.fr/giaokhoa/biology/virologie/nammocnamnhaydiay.htm)

 Sinh sản hữu tính bằng cách hình thành bào tử túi: bào tử túi được sinh ra trong túi, mỗi túi có 2, 4 hoặc 8 bào tử Túi được hình thành do sự tiếp hợp của hai tế bào nấm men Khi hai tế bào nấm men mang trái dấu đứng gần nhau sẽ mọc ra mấu lồi Chúng tiến lại sát nhau và tiếp nối với nhau Ở chổ tiếp nối sẽ tạo ra một lỗ thông và qua lỗ

phân cắt thành 2, 4 hoặc 8 nhân con, mỗi nhân con được bao bọc bởi nguyên sinh chất, rồi tạo thành màng dày xung quanh và tạo thành các bào tử túi

1.4.2.2 Chu trình sinh sản của nấm men Saccharomyces cerevisiae

 Nấm men Saccharomyces cerevisiae có hai dạng tế bào đơn bội (n) là a và α có thể tồn tại độc lập nhờ sinh sản vô tính qua nguyên phân

 Khi hai dạng a và α gặp nhau bắt cặp, rồi phối hợp tế bào và hợp nhân tạo một

tế bào lưỡng bội (2n) Tế bào lưỡng bội có thể sinh sản vô tính vô hạn và trong những điều kiện nhất định, tế bào lưỡng bội (2n) sinh sản hữu tính qua giảm phân tạo nang có bốn bào tử (2a và 2α), mà sự kết hợp a và α tạo tế bào 2n lặp lại chu trình

Hình 1.10 Chu kỳ sinh sản của nấm men

(Nguồn: Ebook online: Đại cương về tế bào- Trịnh Hoàng Kim

ebook/Phan3/chuong43/index.html)

http://docsachysinh.com/dsys-1.4.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của nấm men (Nguyễn Đức Lượng,

2008)

 Môi trường nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy thích hợp nhất cho nấm men cần có nguồn hydrate cacbon, nguồn nitơ, phosphor, một số nguyên tố vi lượng như K, Na, Mg, Ca và vitamin

 Nhiệt độ

Mỗi vi sinh vật đều có khoảng nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng và phát triển của

chúng Với Saccharomyces cerevisiae, nhiệt độ tối ưu là 27 – 300C, trên 430C và dưới

270C thì sự sinh sản của nấm men chậm hoặc ngừng hẳn Ở 300C, nấm men hoang dại

phát triển nhanh hơn S cerevisiae 2 – 3 lần, ở 35 – 380C chúng phát triển nhanh hơn 6 – 8 lần Ở nhiệt độ cao, hoạt tính của nấm men giảm nhanh; còn ở nhiệt độ thấp khoảng

20 – 230C, hạn chế được mức độ tạp nhiễm và khả năng lên men cao, kéo dài hơn

 pH của môi trường

pH tối ưu cho nấm men khoảng 4,5 – 5,6 Ở pH = 4, tốc độ tích luỹ sinh khối giảm,

pH = 3 – 3,5 thì sự sinh sản của nấm men ngừng lại Mức độ hấp thụ chất dinh dưỡng vào tế bào, hoạt động của hệ thống enzyme, sự sinh tổng hợp protein đều bị ảnh hưởng bởi pH nên chất lượng của nấm men sẽ giảm đi nếu pH môi trường nằm ngoài khoảng 4,5 – 5,6

1.4.4 Những nghiên cứu ứng dụng yến sào trong việc thúc quá trình phân bào của

tế bào đẩy

 Aswir và cs., 2010 Ảnh hưởng của yến sào tới sinh trưởng của tế bào Caco-2 Nghiên cứu sử dụng 5 mẫu yến (2 mẫu thương mại, 3 mẫu chưa làm sạch) để xác định ảnh hưởng tới phát triển của tế bào Caco-2 qua thí nghiệm MTT, tế bào được nuôi trong môi trường có bổ sung yến sào hàm lượng 5 ppm trong thời gian 24 giờ và sử dụng máy

yến khác nhau, các khu vực khác nhau mà ảnh hưởng tới sự sinh trưởng của tế bào khác nhau

 Theo Zainal Abidin và cs., 2011 đã nghiên cứu ảnh hưởng của yến sào đến tế bào keratin giác mạc được phân lập từ thỏ trắng New Zealand và nuôi cấy Ảnh hưởng của yến sào tới sự sinh trưởng của tế bào keratin giác mạc được xác định bởi thí nghiệm MTT (3-(4,5- dimethylthiazolyl-2)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide ở môi trường chứa huyết thanh (FDS) và môi trường không chứa huyết thanh (FD) Sự thay đổi của

tế bào này được đánh giá về mặt hình thái và biểu hiện gene của aldehyde dehydrogenase (ALDH), collagen type 1 và lumican được xác định bằng phương pháp RT-PCR Kết quả nghiên cứu tốc độ phát triển cao nhất của tế bào được xác định ở cả hai môi trường khi bổ sung hàm lượng yến sào 0,05% và 0,1% Và sự phát triển của tế bào trong môi trường chứa huyết thanh cao hơn so với môi trường không có huyết thanh Khi phân tích biểu hiện gen được xác định tế bào keratin giác mạc vẫn giữ được phenotip của chúng khi bổ sung thêm yến Tuy với nồng độ thấp, yến có thể gây ra sự tăng sinh tế bào, đặc biệt là trong môi trường có chứa huyết thanh Đây có thể là một bước đột phá mới có thể là cả hai tăng sinh tế bào và duy trì chức năng là rất quan trọng trong quá trình chữa lành vết thương giác mạc

 Zhao và cs., 2016 chứng minh ảnh hưởng của yến trong việc cải thiện khả năng miễn dịch của chuột cả in vivo và in vitro Và yến thúc đẩy quá trình sinh trưởng và hoạt hóa của lympho lá lách Ngoài ra còn đánh giá tới khả năng miễn dịch niêm mạc Kết quả cho thấy yến sào có thể thúc đẩy sự phát triển và hoạt hóa tế bào B và tăng IgE, IgA, IgM và IgG3 Qua nghiên cứu cũng thấy rằng chiết xuất của yến sào có thể thúc đẩy sự bài tiết của slgA trong ruột non Yến còn làm giảm sự tổn thương miễn dịch đường ruột gây ra bởi cyclophosphamide bằng cách thúc đẩy nhanh sự phát triển và hoạt hóa của tế bào B và tăng cường bài tiết kháng thể của tế bào B

Chương 2: NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU 2.1 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu thành phần hóa học tổ yến thiên nhiên và yến nhà

- Nghiên cứu ảnh hưởng của yến sào tới sự phân bào của tế bào nấm men

Sachharomyces cerevisiae

2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

- Địa điểm: Trung tâm công nghệ cao, Trường Đại học Nha Trang, Nha Trang - Khánh Hòa

- Thời gian nghiên cứu:

2.3 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu: bao gồm yến thiên nhiên và yến nhà Các mẫu yến sau khi thu hoạch khoảng 10 tổ/mẫu, yến nhà thu hoạch tại nhà yến Diên Khánh, yến thiên nhiên thu hoạch tại đảo Hòn Nội, các tổ yến được ngâm nước khoảng 6 giờ, làm sạch loại bỏ các tạp chất và lông chim, sau đó sấy khô bằng máy quạt và bảo quản trong bao bì kín

ở nhiệt độ thường

Nấm men Saccharomyces cerevisiae có kích thước lớn, dễ theo dõi sự phát triển,

hình thái, được dùng nhiều trong công nghiệp và thực phẩm, nghiên cứu y học nên được chọn làm đối tượng nghiên cứu trong nghiên cứu này Nấm men được hoạt hóa và nuôi cấy chuyền, sau đó được nuôi trong môi trường YPD và bảo quản ở - 200C

2.4 Vật liệu nghiên cứu

2.4.1 Mẫu nghiên cứu

Mẫu yến tổ sử dụng trong nghiên cứu này được lấy mẫu tại công ty TNHH NN

MTV Yến Sào Khánh Hòa- Nha Trang- Khánh Hòa

2.4.2 Enzyme sử dụng trong nghiên cứu

Trong thành phần yến, các glucan kết nối với các protein, phải thuỷ phân tách các acid sialic ra để thể hiện hoạt tính Do đó, phân giải yến bằng enzyme để có thể bộc lộ các thành phần có hoạt tính sinh học

Enzym sử dụng trong quá trình làm thí nghiệm được mua tại công ty Novozyme

Tp Hồ Chí Minh Chế phẩm dạng dung dịch và bột màu nâu Sản phẩm sản xuất tuân

- Enzyme α-amylase 100447 Nhiệt độ tối ưu 370C, pH = 5 – 7 (tối ưu khoảng 6,1)

- Enzyme Alcalase P4860 Hoạt độ: 2,4 AU/g Hoạt động tối ưu của enzym Alcalase là pH trung tính Nhiệt độ 55 - 700C

- Enzyme Flavourzyme 500MG pH 4,5 – 8,5, nhiệt độ khoảng 500C Flavourzyme 500 Mg có hoạt tính 1000 LAPU/g

2.4.3 Nấm men sử dụng trong nghiên cứu

Nấm men Saccharomyces cerevisia TBS được cung cấp bởi trường Khoa Học Tự

- Máy cô quay chân không

- Máy đo quang phổ

- Máy đồng hoá

- Tủ hút

- Tủ sấy chân không

- Các dụng cụ thủy tinh của bộ chưng cất đạm kèm theo và một số dụng cụ thủy tinh khác như ống đong, bình định mức, cốc chịu nhiệt của Đức

- NaCl 0,9%

- Na2CO3

- Thuốc thử tashiro (2g metyl xanh: 1g metyl đỏ pha trong 1000ml cồn 96o)

- Thuốc thử Biuret: CuSO4.5H2O, NaKC4H4O6.4H2O

- Phenol 5%

- Các hóa chất đều của hang Merck

2.5 Phương pháp nghiên cứu

Sơ đồ nghiên cứu

Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu thủy phân dịch yến

Yến sào (đã xử lý)

Nhiệt độ 1210C, 20

phút

Hình 2.2 Sơ đồ nghiên cứu

Yến sào (đã xử lý)

triển nấm men

Tốc độ sinh trưởng Số lượng tế bào Kích thước tế bào

Hàm lượng

carbonhydrate Hàm lượng lipid Hàm lượng acid sialic

Yến sào (đã xử lý)

triển nấm men

Bố trí thí nghiệm

 Thí nghiệm 1: Thủy phân dịch yến

Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm thủy phân dịch yến

Yến: m= 0,5g, ngâm trong nước tỷ lệ 1:100

 Thí nghiệm 2: Xác định thành phần hóa học

Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu thành phần hóa học của dịch yến

 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của yến sào tới sinh trưởng của nấm men

- Nấm men Saccharomyces cerevisiae có kích thước lớn, dễ theo dõi sự phát triển,

hình thái, được dùng nhiều trong công nghiệp và thực phẩm, nghiên cứu y học nên được chọn làm đối tượng nghiên cứu trong nghiên cứu này

- Nấm men được hoạt hóa trên môi trường YPDA (cao nấm men 10g/l, pepton 20 g/l, glucose 20g/l, agar 15%) Sau đó cấy chuyền và giữ nấm men ở - 200C để bảo quản

- Nấm men được hoạt hóa trong môi trường YPD khoảng 12h, được chuyển sang môi trường YPD mới khoảng 6 – 7 giờ và nấm men được sử dụng cho các thí nghiệm

Yến (đã được làm sạch)

- Hàm ẩm:m=1g Sấy

cốc ở 1050C, 6h Làm

nguội, cân khối lượng

Cho mẫu vào cốc và

vô cơ 4h - Chưng cất

và chuẩn độ bằng HCl 0,02N

- Làm tương tự mẫu trắng Lặp 3 lần

Protein hòa tan:

- Ngâm 1g mẫu trong NaOH 4% tỷ lệ 1:10, 6h, 950C Lọc và định mức lên 100ml

- 1 ml dịch thêm 4 ml thuốc thử Biuret, 30 phút Đo ở bước sóng

- Đồng hóa 1 phút

- Thêm 5ml methanol,

10 ml chloroform, 20 giây

Acid sialic:

- m=0,01g hòa tan 200µl acid acetic 2M + 1% BHT, 800C, 3h

- Ly tâm 13000rpm, 3 phút

- Lọc thu dịch nổi và sấy chân không 2h

- Đem mẫu phân tích

Hình 2.4 Sơ đồ thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của dịch yến tới nấm men

- Nấm men sau khi được nuôi cấy trên môi trường YPDA, khuẩn lạc tại các nồng

độ khác nhau của các dịch yến khác nhau được nhuộm, quan sát dưới kính hiển vi quang

Dịch yến, dùng lần lượt 3 loại dịch yến

OD600 0,25 trong bình tam giác 250ml

20 phút ở OD600 0,25 trong bình tam giác 250ml có mt YPDA

OD600 0,25 trong bình tam giác 250ml

có mt YPDA

- Đổ đĩa và cấy nâm men ở nồng độ pha loãng 10-5

72h, 270C

- Bổ sung 0,5 %, 1%, 1,5%, … , 4% dịch yến được thủy phân bằng nhiệt độ 1210C,

20 phút ở OD600 0,25 trong bình tam giác 250ml có mt YPDA

Đổ đĩa và cấy nâm men ở nồng độ pha loãng 10-5

72h, 270C