NGHIÊN cứu BIỂU HIỆN GEN GP5 của VIRUS gây hội CHỨNG rối LOẠN SINH sản và hô hấp ở lợn (PRRS) TRÊN tế bào THUỐC lá và hạt đậu TƯƠNG

Nhiều hướng nghiên cứu phát triển các loại vaccine thế hệmới đã và đang được tiến hành, trong đó dạng vaccine tiểu đơn vịbiểu hiện trong hệ thống thực vật là một hệ thống sản xuất mới có

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN GP5 CỦA VIRUS GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN (PRRS) TRÊN TẾ BÀO THUỐC LÁ VÀ HẠT ĐẬU TƯƠNG

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan:

Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với cáccộng sự khác;

Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án này là trung thực, một phần đãcông bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của cácđồng tác giả;

Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Hà Nội, ngày 19 tháng 8 năm 2016

Tác giả

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN VÀ VIRUS PRRS 4 1.1.1 Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn 4

1.1.2 Virus PRRS 6

1.1.3 Vaccine phòng PRRS 9

1.2 CÁC HỆ THỐNG BIỂU HIỆN VÀ GIẢI PHÁP TĂNG CƯỜNG SỰ BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP Ở THỰC VẬT 14

1.2.1 Các hệ thống biểu hiện thực vật 14

1.2.2 Giải pháp tăng cường sự biểu hiện protein tái tổ hợp ở thực vật 19

1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP TRONG THỰC VẬT CHỐNG LẠI PRRS 27

1.3.1 Phát triển protein tái tổ hợp trong thực vật làm vaccine 27

1.3.2 Nghiên cứu phát triển vaccine thú y trong thực vật 29

1.3.3 Tình hình nghiên cứu phát triển kháng nguyên tái tổ hợp trong thực vật phòng chống PRRS 31

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38

2.1 VẬT LIỆU 38

2.1.1 Thực vật 38

2.1.2 Vector và chủng vi khuẩn 38

2.1.3 Hóa chất và thiết bị máy móc 38

2.1.4 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 39

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39

2.2.1 Thiết kế gen GP5 đổi mã phù hợp biểu hiện trong thực vật 39

2.2.2 Tạo đoạn gen đa đoạn LTB-GP5 40

2.2.3 Thiết kế vector chuyển gen biểu hiện GP5 41

2.2.4 Tối ưu điều kiện nuôi cấy tế bào BY-2 44

2.2.5 Tối ưu điều kiện nuôi cấy BY-2 trong hệ thống lên men 5 L 45

2.2.6 Chuyển gen vào tế bào thuốc lá BY-2 45

2.2.7 Chuyển gen vào cây thuốc lá 46

2.2.8 Phương pháp tái sinh đa chồi và chuyển gen vào nách lá mầm đậu tương 47

2.2.9 Phương pháp phân tích cây và tế bào chuyển gen 48

2.2.10 Phương pháp đánh giá sơ bộ khả năng sinh miễn dịch của GP5 tái tổ hợp trên động vật thí nghiệm 51

2.2.11 Xử lí và phân tích thống kê kết quả thực nghiệm 52

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 54

3.1 NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GP5 TRONG TẾ BÀO THUỐC LÁ BY-2 54

3.1.1 Tối ưu điều kiện nuôi cấy tế bào thuốc lá BY-2 quy mô phòng thí nghiệm 54

3.1.2 Tối ưu điều kiện nuôi cấy tế bào BY-2 trong hệ thống lên men 5L Bioflo110 .59

3.1.3 Thiết kế vector virus TMV biểu hiện GP5 63

3.1.4 Biến nạp cấu trúc gen chuyển vào tế bào thuốc lá BY-2 73

3.1.5 Phân tích và đánh giá biểu hiện của GP5 trong các dòng tế bào BY-2 74

3.1.6 Đánh giá sơ bộ tính sinh miễn dịch của GP5 trên động vật thí nghiệm 77

3.2 NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GP5 TRONG HẠT ĐẬU TƯƠNG 80

3.2.1 Chọn lọc giống đậu tương thích hợp cho chuyển gen 80

3.2.2 Thiết kế vector biểu hiện GP5 đặc hiệu trong hạt đậu tương 87

3.2.3 Nghiên cứu biểu hiện gen GP5 đặc hiệu ở hạt trên cây mô hình 91

3.2.4 Nghiên cứu tạo cây đậu tương chuyển gen biểu hiện GP5 96

Chương 4: THẢO LUẬN 100

4.1 SỬ DỤNG GLYCOPROTEIN GP5 TRONG VIỆC PHÁT TRIỂN VACCINE TIỂU ĐƠN VỊ CHỐNG LẠI VIRUS PRRS 100

4.2 BIỂU HIỆN GP5 TÁI TỔ HỢP TRONG TẾ BÀO BY-2 103

4.2.1 Nuôi cấy huyền phù tế bào thuốc lá BY-2 103

4.2.2 Tăng cường biểu hiện protein tái tổ hợp trong chuyển gen ổn định ở tế bào thực vật BY-2 sử dụng cấu trúc vector dựa trên virus thực vật 108

4.3 BIỂU HIỆN KHÁNG NGUYÊN GP5 CỦA VIRUS PRRS ĐẶC HIỆU Ở HẠT 112

4.3.1 Biểu hiện GP5 của virus PRRS ở cây thuốc lá 113

4.3.2 Nghiên cứu tạo cây đậu tương chuyển gen 116

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 119

DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 120

SUMMARY 121

TÀI LIỆU THAM KHẢO 128

PHỤ LỤC

DANH MỤC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

CCM Cocultivation medium (Môi trường đồng nuôi cấy)

EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid

ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay

scFv Single-chain variable fragment

SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis

Ti- plasmid Plasmid tạo khối u

T0, T1 Các thế hệ cây chuyển gen

T1 Hạt của cây chuyển gen T0 nảy mầm thành cây T1

vvp volume per volume per minute, lít/phút

X-gluc 5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Một số vaccine PRRS thế hệ mới 12

Bảng 1.2 Các nghiên cứu biểu hiện gen của virus PRRS ở thực vật 32

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của các nguồn đường khác nhau đến sinh trưởng của BY-2 55

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của 2,4-D và kinetin đến sự phát triển của tế bào BY-2 sau 5 ngày 55

Bảng 3.3 Sự tăng trưởng của tế bào BY-2 sau 11 ngày nuôi cấy 58

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của tốc độ khuấy đến sinh trưởng và phát triển của tế bào BY-2 60

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của dung tích môi trường nuôi cấy đến tăng trưởng sinh khối huyền phù tế bào BY-2 62

Bảng 3.6 Trình tự các cặp mồi thiết kế và sử dụng 69

Bảng 3.7 Giá trị chu kỳ ngưỡng (Ct) của mẫu HSP-TMV-GP5 (1) 76

Bảng 3.8 Tổng hợp kết quả qRT-PCR của các dòng BY-2 chuyển gen 77

Bảng 3.9 Kết quả phân tích ELISA huyết thanh thu được của lợn thí nghiệm 79

Bảng 3.10 Kết quả kiểm tra huyết thanh lợn bằng phương pháp IPMA 79

Bảng 3.11 Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh đa chồi của các giống đậu tương 81

Bảng 3.12 Ảnh hưởng của GA 3 đến khả năng kéo dài chồi 84

Bảng 3.13 Ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ của giống đậu tương ĐT22, ĐT26 86

Bảng 3.14 Trình tự các mồi sử dụng trong thí nghiệm 88

Bảng 3.15 Kết quả biến nạp ở cây thuốc lá C 9-1 92

Bảng 3.16 Kết quả chuyển gen GP5 vào giống đậu tương ĐT26 97

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc và hình thái hạt virus PRRS 23

Hình 2.1 Sơ đồ các bước thiết kế các vector biểu hiện 57

Hình 2.2 Sơ đồ vector 30B-GFP 58

Hình 3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự phát triển của tế bào BY-2 72

Hình 3.2 Ảnh hưởng của ánh sáng tới sự phát triển của tế bào BY-2 73

Hình 3.3 Ảnh hưởng của tốc độ cung cấp khí đến sự phát triển của tế bào BY-2 77

Hình 3.4 Động thái quá trình tăng trưởng tế bào BY-2 trên bình Bioflo110 79

Hình 3.5 Sơ đồ hóa quá trình thiết kế và cấu trúc vector 35S-TMV-GFP và pCB-HSP-TMV-GFP 80

Hình 3.6 Hiệu quả chuyển gen vào BY-2 sử dụng các cấu trúc vector 81

Hình 3.7 Biểu hiện GFP sau 3 ngày cảm ứng nhiệt độ 37°C/ 2h 82

Hình 3.8 Mức độ biểu hiện GFP của các dòng BY-2 chuyển các cấu trúc 83

Hình 3.9 Trình tự gen GP5 đã đổi mã 84

Hình 3.10 So sánh trình tự nucleotide (A) và axit amin (B) của gen GP5 trước và sau khi đổi mã bộ ba 84

Hình 3.11 PCR kiểm tra phản ứng dòng hóa đoạn gen LTB-GP5 vào vector pBT 86

Hình 3.12 PCR kiểm tra vector pHSP-TMV-LTB-GP5 bằng mồi 5’AtHSP và P71 88

Hình 3.13 Bản đồ vector pCB-35S-TMV-LTB-GP5 và pHSP-TMV-LTB-GP5 89

Hình 3.14 Kết quả chuyển các cấu trúc mang gen GP5 vào tế bào BY-2 90

Hình 3.15 PCR kiểm tra sự có mặt của gen GP5 trong các dòng tế bào BY-2 91

Hình 3.16 Kết quả lai Western protein GP5 tách từ dòng BY-2 HSP-TMV-GP5(1) 94

Hình 3.17 Tái sinh chồi trên môi trường BAP khác nhau của giống ĐT26 98

Hình 3.18 Khả năng kéo dài chồi và ra rễ của ĐT26 trên môi trường nuôi cấy bổ sung GA 3 và IBA 103

Hình 3.19 Điện di sản phẩm PCR nhân đoạn gen LTB-GP5 104

Hình 3.20 Kết quả colony-PCR khuẩn lạc của phản ứng lai BP 105

Hình 3.21 Điện di sản phẩm cắt plasmid bằng enzyme giới hạn HindIII 105

Hình 3.22 Điện di colony-PCR khuẩn lạc pCB-35S-LTB-GP5 106

Hình 3.23 Kiểm tra vector chuyển gen pPhaso-LTB-GP5 107

Hình 3.24 Sơ đồ vector chuyển gen pPhaso-LTB-GP5 107

Hình 3.25 Một số hình ảnh chuyển gen thuốc lá 108 Hình 3.26 PCR kiểm tra cây thuốc lá chuyển gen bằng cặp mồi LTB-PacI-for/GP5-rev 109

Hình 3.27 Kết quả RT-PCR bằng cặp mồi LTB-PacI-for/GP5-rev của các dòng cây

thuốc lá chuyển cấu trúc 35S-LTB-GP5 109

Hình 3.28 Biểu hiện protein LTB-GP5 trong hạt bằng Western blot 110

Hình 3.29 Hàm lượng LTB-GP5 trong một số dòng thuốc lá chuyển gen 111

Hình 3.30 Một số hình ảnh chuyển gen vào đậu tương 114

Hình 3.31 ADN tổng số của các mẫu đậu tương chuyển gen 114

Hình 3.32 PCR kiểm tra cây đậu tương chuyển gen bằng cặp mồi GP5-for và GP5-rev 115

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (Porcine

Respiratory Syndrome, PRRS) hay còn được gọi là bệnh lợn taixanh là một bệnh truyền nhiễm nguy hiểm, gây thiệt hại nặng nềcho ngành chăn nuôi lợn trên khắp thế giới Bệnh gây ra bởi virusPRRS Ở Việt Nam, virus PRRS được phát hiện lần đầu tiên, ở thểkinh điển, vào năm 1997 trên đàn lợn nhập từ Mỹ vào phía Nam.Virus thể độc lực cao được phát hiện vào đầu năm 2007 tại HảiDương, sau lây lan khắp cả nước, gây thiệt hại nặng nề cho ngànhchăn nuôi nước nhà

Với những nỗ lực kết hợp các biên pháp phòng chống và tiêmphòng vaccine, dịch bệnh lợn tai xanh tại Việt Nam đã giảm điđáng kể Tuy vậy, dịch bệnh vẫn còn xảy ra lẻ tẻ, tiềm ẩn nguy cơbùng phát dịch trong tương lai Nhiều loại vaccine thương mại hiệnđược sử dụng, chủ yếu là các vaccine truyền thống như vô hoạt vànhược độc Tuy nhiên, cho tới nay vẫn chưa có một vaccine phòngchống bệnh PRRS thỏa mãn được các yêu cầu về hiệu lực và antoàn như mong đợi Bên cạnh đó, với đặc tính sinh miễn dịch khác

lạ của virus PRRS so với các virus gây bệnh toàn thân khác, việcnghiên cứu phát triển các vaccine mới, làm đa dạng hóa các nguồnvaccine phòng chống bệnh là điều hết sức cần thiết

Nhiều hướng nghiên cứu phát triển các loại vaccine thế hệmới đã và đang được tiến hành, trong đó dạng vaccine tiểu đơn vịbiểu hiện trong hệ thống thực vật là một hệ thống sản xuất mới cónhiều ưu điểm như dễ dàng tăng quy mô sản xuất và thu sinh khối;

có thể dùng qua đường miệng; vì thế tiện lợi và dễ sử dụng hơn sovới các vaccine thông thường.

Gần đây, đã có nhiều nghiên cứu biểu hiện kháng nguyên tái tổ hợp của virusPRRS trên một số đối tượng thực vật như thuốc lá, chuối, khoai tây, đậu tương Song mức độ biểu hiện của các kháng nguyên tái tổ hợp này còn thấp chủ yếu dao

động từ 0,01-1% Xuất phát từ lí do trên, chúng tôi tiến hành đề tài luận án: “Nghiên cứu biểu hiện gen GP5 của virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS) trên tế bào thuốc lá và hạt đậu tương”.

2 Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu chung của luận án là nghiên cứu tăng cường biểu hiện khángnguyên GP5 của virus PRRS phân lập trên lợn nhiễm bệnh PRRS ở Việt Nam trong

tế bào thuốc lá BY-2 và hạt đậu tương Các mục tiêu cụ thể cần đạt như sau:

1) Phát triển được hệ vector chuyển gen dựa trên virus thực vật cho phépbiểu hiện có điều khiển kháng nguyên GP5 trong dòng tế bào thuốc lá BY-2

2) Thiết kế được vector chuyển gen sản xuất kháng nguyên GP5 chuyên biệt ởhạt đậu tương

3) Tạo được các dòng tế bào thuốc lá BY-2, cây thuốc lá và cây đậu tươngbiến đổi gen biểu hiện kháng nguyên GP5

4) Đánh giá sơ bộ tính sinh miễn dịch của protein tái tổ hợp GP5 biểu hiệntrong thực vật sử dụng qua đường miệng trên động vật thí nghiệm

3 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1 Nghiên cứu biểu hiện kháng nguyên GP5 của virus PRRS trong

hệ thống tế bào thuốc lá BY-2 nuôi cấy huyền phù:

- Tối ưu điều kiện nuôi cấy tế bào thuốc lá BY-2 quy mô phòng thí nghiệm

- Thiết kế vector biểu hiện ổn định GP5 dựa trên virus thực vật TMV dưới sự

điều khiển của promoter cảm ứng nhiệt HSP 18.2.

- Tạo dòng tế bào thuốc lá BY-2 chuyển gen biểu hiện GP5

- Đánh giá sơ bộ tính sinh miễn dịch của protein tái tổ hợp GP5 trên động vậtthí nghiệm

Nội dung 2 Nghiên cứu biểu hiện kháng nguyên GP5 của virus PRRS đặc

hiệu trong hạt đậu tương

- Đánh giá khả năng tái sinh đa chồi của một số giống đậu tương Việt Nam,

tạo nguyên liệu in vitro phục vụ chuyển gen.

- Thiết kế vector biểu hiện GP5 dưới sự điều khiển của promoter đặc hiệu ở

hạt β-phaseolin

- Biển hiện gen GP5 trong cây mô hình.

- Tạo cây đậu tương chuyển gen mang gen GP5.

4 Đóng góp mới của luận án

- Luận án đã thiết kế thành công 2 hệ vector tăng cường biểu hiện gen GP5 trên tế bào thuốc lá BY-2 và hạt đậu tương là pHsp-TMV-LTB-GP5 và pDest- phaso-LTB-GP5, mức độ biểu hiện của gen đích có thể đạt tới 3,4% hàm lượng

protein hoà tan tổng số;

- Protein tái tổ hợp GP5 thụ nhận được từ nghiên cứu của luận án đã có khảnăng kích thích tạo kháng thể đặc hiệu ở lợn

5 Ý nghĩa lý luận và ý nghĩa thực tiễn

5.1 Ý nghĩa lý luận

Đề tài bổ sung bằng chứng khoa học về tiềm năng của việc sản xuất cácprotein có hoạt tính sinh học trong hệ thống nuôi cấy tế bào thực vật bioreactor hoặctrong cơ quan tích trữ của cây trồng Ngoài những ưu điểm như an toàn và dễ dàngtăng quy mô sản xuất, những cái tiến trong hệ thống vector biểu hiện như dựa trênvirus thực vật và promoter cảm ứng hay promoter đặc hiệu đã cho phép tăng năngsuất các protein có hoạt tính sinh học, một trong những điểm vẫn còn là hạn chế củacác hệ thống biểu hiện khác nhau trong thực vật

5.2 Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả của đề tài đã cung cấp quy trình nuôi cấy huyền phù tế bào thuốc láBY-2 ở quy mô phòng thí nghiệm phục vụ cho nuôi cấy thu sinh khối tế bàochuyển gen Hệ thống này có thể ứng dụng cho việc sản xuất nhiều loại protein tái

tổ hợp khác nhau trong tế bào BY-2

Đề tài đã phát triển được cấu trúc vector chuyển gen dựa trên virus thực vậtTMV, có khả năng biểu hiện protein tái tổ hợp ổn định ở mức cao 3,4 % protein hòatan tổng số dưới sự điều kiển của promoter cảm ứng nhiệt trong tế bào BY-2 Cấutrúc vector này có thể ứng dụng để cải thiện mức độ biểu hiện các protein tái tổ hợp

ở tế bào thực vật khác nhau

Các dòng tế bào thuốc lá BY-2 biểu hiện GP5 của virus PRRS của luận án cóthể được phát triển sản xuất ở quy mô lớn hơn ứng dụng cho cho các thử nghiệmlâm sàng

Vector chuyển gen, trong đó gen GP5 của virus PRRS được điều khiển biểu

hiện của promoter đặc hiệu ở hạt có thể dùng chuyển gen ở các đối tượng cây trồnglấy hạt khác nhau ngoài đậu tương như lúa, ngô, lạc

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

VIRUS PRRS

1.1.1 Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn

Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (Porcine reproductive andrespiratory syndrome - PRRS) (còn gọi là bệnh lợn tai xanh) là một bệnh truyềnnhiễm nguy hiểm ở lợn (kể cả lợn rừng) Biểu hiện đặc trưng của lợn bệnh là bị cácrối loạn về sinh sản ở lợn nái như sảy thai, thai chết lưu, lợn sơ sinh chết yểu hoặcviêm đường hô hấp rất nặng, tỉ lệ chết cao ở lợn con theo mẹ và lợn nái hậu

Bệnh PRRS lần đầu tiên được phát hiện ở Hà Lan vào năm 1986, sau đó là ở

Mỹ năm 1987 rồi nhanh chóng lan rộng ra nhiều nước chăn nuôi lợn trên thế giới nhưCanada (1988); Đức (1990); Hà Lan, Tây Ban Nha, Bỉ, Anh (1991), Pháp (1992) (Rossow KD, 1998) Lúc đầu, do chưa xác định được căn nguyên bệnh nên được gọi

là “bệnh bí hiểm ở lợn” (mistery swine disease – MSD) Sau khi lan rộng trên toànthế giới, bệnh được gọi bằng nhiều tên như hội chứng hô hấp và sinh sản của lợn(Swine Infertility and Respiratory Syndrome – SIRS), hội chứng hô hấp và sảy thai ởlợn (Porcine Endemic Abortion and Respiratory Syndrome – PEARS), hội chứng hôhấp và sinh sản lợn (PRRS), bệnh tai xanh (Blue ears) Năm 1991, lần đầu tiênnguyên nhân gây bệnh “bí hiểm” đã được Wensvoort và cs thuộc Viện Thú y Trung ương - Lelystad - Hà Lan phân lập được trên tế bào đại thực bào phế nang của lợn, là một loại virus ARN và đặt tên là virus Lelystad-LV Năm

1992, Collins và cộng sự cũng báo cáo về việc phân lập được virus gây bệnh

với tên gọi là VR-2332 để chỉ các chủng phân lập ở Bắc Mỹ Hội nghị quốc tế

về bệnh này được tổ chức cũng vào năm 1992, tại St Paul, Minnesota đã thống nhấttên bệnh là hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn, được tổ chức Thú y thế giới(OIE) công nhận Từ đây, virus gây bệnh được gọi phổ biến trên thế giới là virusPRRS (Rossow KD, 1998)

Tại Trung Quốc, PRRS xuất hiện từ những năm 1995, gây chết hàng loạt conlợn Năm 2006, PRRS lại hoành hành tại đây trong vòng 3 tháng, làm trên 2 triệu lợnmắc bệnh, 400 nghìn con chết, ước tính tỉ lệ chết 20% Bệnh được xác định do virusPRRS thể độc lực cao gây ra với triệu chứng sốt cao, lợn chết ở mọi lứa tuổi, tốc độlây lan nhanh, chỉ sau 3- 5 ngày bệnh có thể lây ra toàn đàn, với biểu hiện sốt cao.Năm 2007 dịch lại bùng phát ở đây, xảy ra ở 26/33 tỉnh với 310000 con mắc, chếthơn 81000 con Các kết quả nghiên cứu đã phân lập từ mẫu bệnh phẩm của lợn bịbệnh được cả virus thể kinh điển và thể độc lực cao của dòng Bắc Mỹ Đến nay, bệnhvẫn diễn biến phức tạp Ở Philippines PRRS xuất hiện từ năm 2006, trong năm 2007

có 18 ổ dịch, 13542 con mắc, làm chết 1743 con và sau đó lan rộng, gây ốm và chếthàng loạt lợn nái và lợn con theo mẹ Tại Thái Lan, PRRS xuất hiện vào năm 1989 và

có mặt các chủng thuộc cả dòng châu Âu và dòng Bắc Mỹ (Tô Long Thành, 2008;Cục Thú y, 2008)

Từ năm 2005 trở lại đây, 25 nước và vùng lãnh thổ thuộc tất cả các châu lụctrên thế giới đều có dịch bệnh PRRS lưu hành (trừ châu Úc và Newzeland)

và đã gây ra những thiệt hại lớn về kinh tế cho người chăn nuôi Ở Mỹ, hàng nămbệnh PRRS gây tổn thất hàng trăm triệu đô la, ước tính năm 2011 thiệt hại lên đến

664 triệu USD (Holtkamp D, 2012) Cho đến nay chưa có nước nào trên thế giớikhẳng định là đã thanh toán được bệnh

Ở Việt Nam, bệnh được phát hiện lần đầu tiên, ở thể kinh điển, vào năm 1997trên đàn lợn nhập từ Mỹ vào các tỉnh phía Nam, 10 trong số 51 con có huyết thanhdương tính với PRRS Kết quả điều tra những năm sau đó ở một số địa bàn thuộcthành phố Hồ Chí Minh và các tỉnh lân cận cho thấy 25% mẫu huyết thanh lợn cókháng thể virus PRRS (596/2308 mẫu) và 5/15 trại (chiếm 33%) có lưu hành huyếtthanh bệnh lợn tai xanh Tuy nhiên, từ năm 1997 đến trước tháng 3 năm 2007 chưa

phát hiện các ổ dịch lâm sàng nào Dấu ấn quan trọng của dịch PRRS tạiViệt Nam bắt đầu từ ngày 12/3/2007 khi hàng loạt đàn lợn tại HảiDương có những biểu hiện ốm khác thường sau đó lây lan ra cáctỉnh đồng bằng Bắc Bộ, Trung Bộ và Nam Bộ gây thiệt hại rất lớncho ngành chăn nuôi lợn (Tô Long Thành, 2008).Việc xảy ra các ổ dịchlần đầu ở các tỉnh phía Bắc có liên quan đến tình hình dịch ở Trung Quốc Kết quảphân tích cấu trúc gen của virus PRRS gây bệnh tại Việt Nam cho thấy, virus PRRStại Việt Nam thuộc thể độc lực cao, chủng Bắc Mỹ Cấu trúc gen vùng NSP2 đượcphát hiện có sự thiếu hụt không liên tiếp về axit amin tại các vị trí 481 và từ 532 -

560 Tất cả các mẫu virus PRRS của Việt Nam đều có mức tương đồng cao so vớivirus PRRS chủng độc lực cao của Trung Quốc (99,0-99,7%) Nếu như cả năm

2007, toàn quốc có 18 tỉnh, thành phố có dịch với 70 577 con lợn mắc bệnh thì đếnnăm 2010, dịch đã lan trên 49 tỉnh thành với 833 641 con lợn mắc bệnh, trong đóchết và tiêu hủy 457 708 con (Cục Thú y, 2010) Dịch có xu hướng giảm năm 2011nhưng lại tiếp tục gia tăng vào năm 2012 Từ tháng 7/2013 đến tháng 09/2015, cảnước đã kiểm soát thành công dịch tai xanh Tuy nhiên, từ đầu tháng 10/2015 đếnnay cả nước đã xuất hiện 19 ổ dịch tai xanh tại 11 huyện của 06 tỉnh Nghệ An, HàTĩnh, Long An, Tiền Giang, Sóc Trăng và Cần Thơ Tổng số lợn mắc bệnh, chết vàtiêu hủy là 1 228 con (Phòng Dịch tễ, Cục Thú y, 2016) Nhìn chung, bệnh vẫn còndiễn biến phức tạp bởi đặc tính sinh miễn dịch khác lạ của virus PRRS và việc vẫncòn tồn tại virus trong những đàn lợn lành bệnh lâm sàng cho thấy nguy cơ lớn từbệnh này vẫn còn tiếp tục trong thời gian tới

1.1.2 Virus PRRS

1.1.2.1 Đặc điểm hình thái và phân loại

Virus PRRS (Porcine reproductive and respiratory syndrome virus) là virus

ARN sợi đơn, dương có vỏ bao bọc, thuộc chi Arterivirus, họ Arteriviridae, bộ

Nidovirales (Ansari IH, 2006)

Dựa trên đặc điểm sinh học và phân tích kiểu gen, virus PRRS được chia làmhai nhóm lớn, nhóm I gồm các virus có nguồn gốc ở châu Âu (đại diện tương ứng là

chủng Lelystad - LV), nhóm II gồm các virus có nguồn gốc Bắc Mỹ (đại diện tươngứng là chủng VR2332) với nhiều phân nhóm đã được xác định Mặc dù, hai nhómxuất hiện gần như đồng thời và gây ra các dấu hiệu lâm sàng gần giống nhau songmức độ tương đồng về cấu trúc chuỗi nucleotide của hai nhóm chỉ vào khoảng 50-60% (Fang Y, 2007) Hiện nay, cả hai nhóm virus này vẫn lưu hành rộng khắp trêntoàn cầu Báo cáo về mặt di truyền cho thấy, virus PRRS rất đa dạng và biến đổi hàngnăm Bản thân các virus trong cùng một nhóm cũng có sự thay đổi về chuỗinucleotide khá cao, đến 20%, đặc biệt là các chủng virus thuộc dòng Bắc Mỹ Chủngvirus gây bệnh tai xanh ở Trung Quốc và các nước châu Á trong đó có Việt Namtrong những năm gần đây được cho là thuộc nhóm Bắc Mỹ và đã biến chủng thànhchủng PRRSV độc lực cao (Lê Thanh Hòa, 2009; Shi M, 2010) Virus PRRS đượcđánh giá là loài có tốc độ tiến hóa nhất trong số các virus sợi ARN (Hanada K, 2005).Virion của virus PRRS có dạng hình cầu hoặc trứng với đường kính vàokhoảng 50-74 nm, bên trong là lõi nucleocapsid có đường kính khoảng 40 nm đượcbao bọc bởi một lớp vỏ lipid kép Bề mặt ngoài virus trơn với chỉ một vài điểm lồi

ra là các phức hợp protein vỏ gắn trên vỏ bọc lipid Thành phần protein chính của

vỏ virus là GP5 và M Các protein vỏ GP2, GP3, GP4, E chiếm tỉ lệ ít hơn Bên trong

là nucleocapsid tạo bởi nucleocapsid protein (protein N) bao bọc ARN genome củavirus Protein N chiếm khoảng 20-40% protein của hạt virus (Dokland T, 2010)

Hình 1.1 C u trúc và hình thái h t virus PRRSấu trúc và hình thái hạt virus PRRS ạt virus PRRS

A H t virus PRRS d ạt virus PRRS ưới kính hiển vi điện tử ( i kính hi n vi đi n t ( ển vi điện tử ( ện tử ( ử ( Ngu n: Spilman MS, 2009 ồn: Spilman MS, 2009 )

B S đ hóa c u trúc virion c a virus PRRS ( ơ đồ hóa cấu trúc virion của virus PRRS ( ồ hóa cấu trúc virion của virus PRRS ( ấu trúc và hình thái hạt virus PRRS ủa virus PRRS ( Ngu n ồn: Spilman MS, 2009 :http://viralzone.expasy.org)

1.1.2.2.Cấu trúc hệ gen và protein của virus

Hệ gen của virus PRRS là một phân tử ARN đơn, dương, kích thước khoảng13-15 kb gồm đầu mũ 5', đuôi polyA ở đầu 3' cùng 9 khung đọc mở (ORF - openreading frame) 1a, 1b, 2a, 2b và 3-7 mã hóa cho khoảng 20 protein (Britton P &,Cavanagh D, 2008) Khi phân tích hệ gen PRRS người ta thấy rằng các ORF gốivào nhau từ 1-253 bp Ví dụ: ORF4 và ORF5 lồng vào nhau bởi 1 bp, ORF3 vàORF4 lồng vào nhau bởi 253 bp Như vậy, các gen sau sử dụng một phần cuốichuỗi nucleotide của gen trước làm promoter hoạt động (Meng XJ, 2000)

ORF1a và ORF1b mã hóa cho các protein chức năng như Serine protease,helicase, polymerase Bảy khung đọc mở ORF2a, 2b, 3-7 mã hóa cho các proteincấu trúc GP3, E, GP3, GP4, GP5, M và N (Fang Y & Snijder EJ, 2010)

Các phân tử glycoprotein nhỏ GP2, GP3, GP4 và protein E tương tác với nhau

để tạo thành một cấu trúc heterotetrameric phức tạp trong các tế bào bị nhiễm Việchình thành phức hợp này là cần thiết trong việc truyền nhiễm của virion (Das PB,2011; Wissink E, 2005) GP2 được mã hóa bởi ORF2a, có kích thước khoảng 29-30kilodalton (kDa), mang trình tự tín hiệu N-terminal và cấu trúc neo màng ở đầu C.GP2 có chứa 2 điểm N-glycosyl hóa (Meulenberg JIM, 1995) Ở nhóm Bắc Mỹ, vịtrí N-glycosyl hóa nằm ở các vị trí N178 và N184 Vị trí glycosyl hóa có vai tròquan trong trong việc truyền nhiễm của virus, ít nhất một trong hai vị trí là điểmtương tác với receptor CD163 (Das PB, 2011)

Protein E có kích thước nhỏ khoảng 10 kDa, có mặt ở tất cả cácArteriviruses Protein E chứa một miền kị nước ở trung tâm Protein E chứa vị tríN-terminal N-myristoylation và vị trí casein kinase II phosphoryl hóa tiềm năngCác bằng chứng thực nghiệm cho thấy protein E hình thành homo-oligomers bởitương tác không cộng hóa trị trong vỏ virus hoạt động như một kênh vận chuyểnion (Lee C & Yoo D, 2006)

Glycoprotein GP3 có kích thước dao động 45-50 kDa, là một trong nhữngprotein biến đổi nhất của virus PRRS, mức độ tương đồng acid amin giữa 2 nhómchâu Âu và Bắc Mỹ chỉ vào khoảng 54-60% GP3 là protein glycosyl hóa cao, chứabảy vị trí N-oligosaccharides liên kết Các khu vực biến đổi nhất của GP3 nằm ở 35

axit amin đầu tiên, điểm biến đổi cao nhất được cho là trình tự peptide tín hiệu dẫntới ER với mức độ tương đồng chỉ đạt 29% giữa 2 nhóm châu Âu và Bắc Mỹ(Mardassi H, 1995).

Glycoprotein GP4 có trọng lượng phân tử vào khoảng 31-35 kDa GP4 chứa tínhiệu peptide dẫn tới ER GP4 có chứa epitope có khả năng kích thích kháng thể trunghòa yếu bào GP4 có vai trò trong quá trình tái bản của virus, có khả năng sử dụng hoặcthay đổi cấu trúc của tế bào chủ để vận chuyển virus hoặc thành phần tế bào đến bề mặt

tế bào (Welch S, 2004)

Glycoprotein GP5 có trọng lượng phân tử từ 24-25 kDa là protein liên kết vỏbọc kết hợp glycogen Đây là protein biến đổi nhất của virus PRRS, mức độ tươngđồng acid amin giữa hai nhóm châu Âu và Bắc Mỹ chỉ khoảng 50-55% (Mardassi

H, 1995) Các kháng thể trung hòa chủ yếu liên kết trực tiếp với các epitope có trên

bề mặt của protein GP5, do vậy virus có thể bị trung hòa Những epitope trung hòa

này nằm sát ngay cạnh các vị trí glycosyl hoá Có ba vị trí epitope kích thích tế bàolympho B đã được xác định, một epitope trung hòa chính nằm ở giữa củaectodomain GP5 (aa 36-52), một epitope không trung hòa (epitope A) và mộtepitope trung hòa (epitope B) trong ectodomain của GP5 (Ostrowski M, 2002).Protein màng (membrane protein) (M, ORF6): Có khối lượng phân tử khoảng 18-

19 kDa, không được glycosyl hoá, là protein liên kết vỏ bọc, mang tính kháng nguyên và

có tính bảo tồn cao nhất với mức độ tương đồng acid amin giữa hai nhóm châu Âu vàBắc Mỹ đạt đến 78-81% (Mardassi H, 1995) Protein M có cấu trúc tương tự như cấu

trúc protein M của các virus thuộc nhóm Coronavirus Protein M hình thành cầu nối

disunfit với glycoprotein 5 (GP5) cấu thành một phần virus và được tìm thấy trong tếbào nhiễm nhưng cầu nối sunfit này không cấu thành nên hạt virus (Meulenberg JJM,1997)

Nucleocapsid protein (N, ORF7) có khối lượng phân tử khoảng 14-15 kDa,đây là protein vỏ bọc nhân, có tính kháng nguyên cao Protein N chiếm khoảng 20-40% protein của hạt virus Nó không được glycosyl hóa, mặc dù chứa những vị tríglycosyl hóa tiềm tàng Hiện nay, protein N được dùng như là một kháng nguyên đểphát hiện kháng thể trong huyết thanh của lợn

Trong các tế bào bị nhiễm virus PRRS, có tất cả 6 ARN thông tin (mARN)được tổng hợp, tất cả 6 ARN thông tin đều chứa trình tự sắp xếp chung nhận được

từ đầu 5' của hệ gen ARN trong gen và tất cả chúng đều có gắn thêm đuôi 3' polyA

1.1.3 Vaccine phòng PRRS

Áp dụng các biện pháp an toàn sinh học, vệ sinh thú y kết hợp với sử dụngvaccine thích hợp và đúng cách là phương pháp phòng bệnh hữu hiệu và kinh tếnhất Hiện nay, trên thế giới đã có hơn 20 loại vaccine thương mại phòng bệnh lợntai xanh Các vaccine được chế từ các chủng virus dòng châu Âu và dòng Bắc Mỹdưới dạng vaccine truyền thống là vaccine sống - nhược độc (modified-live virusvaccine -MLV) và vaccine vô hoạt (killed vaccine - KV)

1.1.3.1 Vaccine truyền thống

Hầu hết các vaccine sống - nhược độc (MLV)thương mại được sản xuất trên các dòng tế bào động vật và được cấy chuyển nhiều lần dưới áp lực chọn lọc cho tới khi chủng vaccine bị mất độc lực Hầu hết các dòng tế bào động vật sử dụng bắt nguồn từ dòng tế bào thận khỉ MA-104, là những dòng tế bào liên tục đáp ứng cho sự nhân lên của virus PRRS Tuy nhiên, các dòng tế

bào khác, ví dụ như, MARC-Complimentary cells (Welch S, 2004), các tế bào PK,

FK, và BHK biểu hiện CD163, PK-15 với CD163, tế bào SJPL, bạch cầu đơn nhânlợn và ZMAC cũng được phát triển và sử dụng để nuôi cấy và phân lập virus PRRScho việc sản xuất vaccine (Renukaradhya GJ, 2015)

Các vaccine nhược độc hiện được cấp phép lưu hành rộng rãi trên thế giới vàtùy vào dịch bệnh trong từng nước để sử dụng vaccine được chế từ các chủng virusdòng châu Âu (như Porcilis PRRS (từ DV; Merck), Amervac-PRRS (từ VP046;Hipra), Pyrsvac-183 (từ All-183; Syva)) hay dòng Bắc Mỹ (như Ingelvac PRRSMLV; ReproCyc PRRS-PLE (cả hai đều của VR-2332; Boehringer Ingelheim),Ingel-vac PRRS ATP (từ JA-142; Boehringer Ingelheim), JXA1-R (chủng JXA1-

R, thể độc lực cao của Trung Quốc) hoặc cả hai dòng này Mới đây, Việt Nam lầnđầu tiên đã sản xuất thành công vaccine nhược độc phòng bệnh lợn tai xanh từchủng virus PRRS Hanvet1.VN gây bệnh ở Việt Nam

Các vaccine nhược độc tạo ra mức bảo vệ tốt đối với các chủng tương đồngnhưng vẫn tồn tại một số quan ngại như phản ứng bảo vệ tương đối chậm, thường

là 3 - 4 tuần sau khi tiêm chủng; chỉ có khả năng bảo vệ tốt đối với các chủng tươngđồng; việc tiêm vaccine có thể ảnh hưởng tới hiệu quả bảo vệ của các vaccine khác

ở lợn (Renukaradhya GJ, 2015) Trong đó, một trở ngại lớn đối với vaccine nhượcđộc là khả năng phát triển trở lại độc tính do đột biến gen của virus vaccine hay doquá trình tái tổ hợp gen Virus trong vaccine có khả năng vượt qua nhau thai vàogiai đoạn cuối của thai kỳ có thể gây chết lưu hoặc chết non Lợn con sinh ra từnhững lợn nái được tiêm chủng có thể bị nhiễm virus PRRS và có khả năng lâytruyền cho những con lợn khác Một điểm nữa là phản ứng bảo vệ xuất hiện chậm,khoảng 4 tuần sau khi tiêm chủng, vì thế trong thời gian này có khả năng lây lanvirus cho những con lợn chưa bị nhiễm khác

Các vaccine vô hoạt PRRS hiện được cấp phép sử dụng ở châu Âu và nhiềunước trên thế giới ngoại trừ Mỹ Các vaccine vô hoạt có thể được chế từ hai chủngchâu Âu và Bắc Mỹ Một số vaccine thương mại phổ biến như Ingelvac PRRS KV(nguồn gốc từ P120; Boehringer Ingelheim), Suipravac-PRRS (từ 5710; Hipra),Progressis (từ chủng độc quyền; Merial), Suivac PRRS-ine (từ VD-E1 và VD-E2;Dyntec), Suivac PRRS-IN (từ VD-E1, VD-E2 và VD-A1; Dyntec)

Vaacine vô hoạt PRRS có hiệu quả bảo vệ kém hơn vaccine nhược độc Việc

sử dụng vaccine vô hoạt thường được ứng dụng như là một vaccine trị liệu trongcác trại lợn dương tính với virus PRRS (Renukaradhya GJ, 2015)

1.1.3.2 Vaccine thế hệ mới

Mặc dù, nhiều loại vaccine phòng bệnh lợn tai xanh đã được phát triển vàthương mại hóa bao gồm vaccine nhược độc và vô hoạt Tuy nhiên, cho tới nay, vẫnchưa có một vaccine phòng chống PRRS thỏa mãn được các yêu cầu về hiệu lực và

an toàn như mong đợi vì vaccine nhược độc tuy bảo vệ tốt với các chủng tươngđồng nhưng lại có nguy cơ trở lại độc tính, giá thành vaccine cao, đòi hỏi nghiêmngặt trong khâu bảo quản và vận chuyển Vì vậy, việc tiếp tục tìm kiếm phát triểncác vaccine phòng bệnh PRRS mới hướng tới như vaccine không chứa mầm bệnh

virus, có khả năng bảo vệ tốt cũng như khắc phục được các hạn chế mà các vaccinehiện hành là cần thiết Nhiều hướng nghiên cứu phát triển vaccine đã và đang tiếptục như cải tiến công nghệ trong sản xuất vaccine truyền thống như bổ sung tá chất,phương pháp vô hoạt, sử dụng các hạt nano Hay phát triển các vaccine mới nhưvaccine ADN, vector tái tổ hợp biểu hiện protein của virus, vaccine thực vật.

Ch ng ủng

t ương ng

đ ng ồng

Ch ng ủng không

Bi u hi n côn ển vi điện tử ( ện tử ( ở côn

Chia, 2010

Ghi chú: (+): có; (-): không; ND: không xác đ nh. ịnh.

Protein cấu trúc của virus, đặc biệt là GP3, GP5 và M là đích để phát triển

vaccine tái tổ hợp Plana Duran và cs (1997) sử dụng baculovirus để biểu hiện ORF

2-7 riêng rẽ, tuy nhiên chỉ có các ORF 2,3,5 và 7 là biểu hiện được Trong đó, sản

phẩm của gen ORF 3 và ORF 5 (GP3 và GP5) được xác định là ứng cử chính đểphát triển vaccine vì tạo được mức độ bảo hộ tương đối cao là 68,4% và 50% khiđánh giá trên lợn con khỏe mạnh và lợn ở thời kỳ cai sữa Trong khi đó, protein Nkhông có khả năng bảo vệ Chuột được tiêm chủng với adenoviruses (rAd) mangGP3 hoặc GP5 đã bị đột biến mất axit amin từ 2-64 tạo ra kháng thể trung hòa đặchiệu với PRRSV (Jiang Y, 2007) Virus Pseudorabies tái tổ hợp biểu hiện proteinGP5 tạo ra bảo hộ tốt hơn vaccine bất hoạt có trên thị trường.

Để tăng cường đáp ứng miễn dịch của vật chủ đối với kháng nguyên của virusPRRS, các vector tái tổ hợp biểu hiện các protein của virus được gắn với các proteinkhác nhau hoặc cùng biểu hiện nhiều protein của virus cùng một lúc Chuột tiêmGP5 và M biểu hiện từ vector replication-defective adenovirus có hàm lượng khángthể trung hòa cao hơn đáng kể so với chuột chỉ được tiêm vector biểu hiện GP5hoặc M riêng rẽ (Jiang W, 2006) Fowlpox virus tái tổ hợp đồng biểu hiện GP5 vàGP3 cũng cho làm chuột được tiêm giảm sốt và số lượng virus trong các tế bào phổithấp hơn so với đối chứng (Shen G, 2007) Tổ hợp GP3-GP5 hoặc GP3-GP4-GP5cũng đồng thời tăng cường miễn dịch thể và tế bào (Jiang W, 2008) Tuy nhiên, hạnchế về thời gian và mức độ miễn dịch, khả năng bảo vệ hiện là những hạn chế củavaccine tiểu đơn vị biểu hiện ở baculovirus

Vaccine ADN chống lại PRRSV là một dạng được quan tâm nghiên cứu xem

như là một vaccine an toàn hơn Li và cs (2009) đã sử dụng gen mã hóa cho protein GP5 và sử dụng S typhimurium nhược độc như là hệ thống mang vaccine ADN

chứa ORF 5 qua đường miệng Kết quả cho thấy lượng kháng thể trung hòa tronghuyết thanh của chuột tương đương như trong chuột được tiêm với plasmid ADN

mang ORF 5 Vaccine ADN dựa trên GP5 bị đột biến ở đầu N-glycosylation hoặc

đồng biểu hiện với các protein chức năng khác cũng cho thấy làm tăng miễn dịch

của các vaccine ADN (Li G, 2009) Chia và cs (2010) sử dụng gen mã hóa GP5 và

M đồng thời kết hợp với đoạn axit amin mã hóa cho glycine-proline-glycine-proline(GPGP) nhằm tạo mối liên kết giúp ổn định cấu trúc bậc ba Với ba cấu trúc:plasmid ADN mã hóa đồng thời protein GP5/M không có GPGP liên kết (pcADN-

56), plasmid ADN mã hóa GP5/M được gắn kết bởi một mối liên kết GPGP(pcADN-5L6), và plasmid ADN mã hóa M /GP5 protein phản ứng tổng hợp liênhợp bởi một GPGP là mối liên kết (pcADN-6L5) sử dụng như một vaccine ADN.Kết quả cho thấy, cả ba cấu trúc đều có khả năng kích thích sinh ra kháng thể Saukhi thử thách với virus PRRS, lợn được tiêm chủng với cấu trúc pcADN-5L6 vàpcADN-6L5 có virus trong máu ở mức độ thấp hơn và thời gian ngắn hơn và lượngvirus trong mô cũng thấp hơn so với lợn được tiêm chủng với pcADN-56 Điều nàycho thấy mối liên kết GPGP giúp cải thiện cấu tạo tự nhiên của protein virus PRRS

và vì thế có khả năng tăng cường đáp ứng miễn dịch

Trong những năm gần đây, sử dụng thực vật là hệ thống biểu hiện để sản xuấtvaccine tiểu đơn vị được đánh giá là có nhiều lợi thế như có thể sử dụng trực tiếp quađường miệng, rẻ tiền, dễ dàng trong sản xuất và mở rộng sản xuất, an toàn hơn so vớicác hệ thống truyền thống Sử dụng thực vật biểu hiện các kháng nguyên như GP5, Mcủa virus PRRS nhằm tạo vaccine cũng đã tạo được đáp ứng miễn dịch trên động vật

mô hình (Hu J, 2012; Chan HT, 2013) Tiến hành lây nhiễm virus nhận thấy sự giảmđáng kể lượng virus trong máu và mô so với lợn đối chứng (Chan HT, 2013) Có thểthấy, sản xuất và sử dụng protein của virus biểu hiện trong hệ thống thực vật là mộttrong những phương thức hiệu quả để phát triển vaccine PRRS thế hệ mới (Hu J,2012) Tuy nhiên, mức độ biểu hiện của các kháng nguyên của virus PRRS nói riêng

và các protein tái tổ hợp ở thực vật nói chung còn thấp được đánh giá là một trở ngạilớn nhằm hướng tới việc phát triển và thương mại hóa các sản phẩm này

1.2 CÁC HỆ THỐNG BIỂU HIỆN VÀ GIẢI PHÁP TĂNG CƯỜNG SỰ BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP Ở THỰC VẬT

1.2.1 Các hệ thống biểu hiện thực vật

Nhiều loại thực vật khác nhau đã được khai thác để sản suất protein tái tổ hợp,bao gồm các kháng nguyên làm vaccine (Mason HS, 2002; Fischer R, 2004) Chođến hiện nay, đã có nhiều hệ thống thực vật được sử dụng để sản xuất protein tái tổhợp Nguồn nguyên liệu trong thực vật để biển hiện protein có thể chia thành cácnhóm như cây lấy lá, quả, rễ, hạt và hệ thống nuôi cấy tế bào thực vật Tuy nhiên,

không có một hệ thống nào là tối ưu nhất để sản xuất tất cả các sản phẩm tái tổ hợp

mà phụ thuộc vào bản chất của các protein tái tổ hợp cần được tổng hợp và mụcđích sử dụng Vì thế, khi nghiên cứu cần quan tâm tới các yếu tố như loại protein tái

tổ hợp cần sản xuất, năng suất, sinh khối, khả năng mở rộng sản xuất… Mỗi hệthống biểu hiện đều có những ưu điểm và hạn chế nhất định Có thể chỉ ra các ưunhược điểm chính ở một số hệ thống biểu hiện nổi bật được sử dụng trong hướngnghiên cứu làm vaccine thực vật sau

1.2.1.1 Cây trồng cho lá

Những nghiên cứu thăm dò để tạo ra các cây chuyển gen ổn định biểu hiện

protein tái tổ hợp thường được tiến hành trên các cây mô hình như Arabidopsis

thaliana và thuốc lá Quy trình chuyển gen ở Arabidopsis đã được thiết lập và có

thể dễ dàng tiến hành Tuy nhiên, Arabidopsis khó có thể trở thành hệ thống sản

xuất thương mại vì có sinh khối thấp (Fischer R, 2004) Trong khí đó, thuốc lá sảnxuất sinh khối khá cao và không phải là cây thực phẩm, vì thế không có nguy cơchiếm chỗ của các cây cung cấp thực phẩm cho người và động vật (Fischer R,2004) Tuy nhiên, việc trồng cây thuốc lá chuyển gen ngoài tự nhiên lại đòi hỏiphải tuân theo pháp luật hiện hành về an toàn sinh học đối với sinh vật biến đổigen vì thế thời gian có được sẽ kéo dài Ngoài ra, cây thuốc lá chuyển gen lạikhông thể sử dụng trực tiếp mà phải chế biến vì lá thuốc lá chứa hàm lượngnicotine cao và các alkaloid độc phải loại bỏ trước khi sử dụng qua đường miệng

Vì thế, việc sử dụng các dòng tế bào thuốc lá nuôi cấy huyền phù, có hàm lượngalkaloid thấp có thể giảm thiểu các chất có thể gây độc và an toàn hơn trong việcsản xuất protein tái tổ hợp Ngoài thuốc lá, các cây trồng cho lá khác như cỏalfalfa, cỏ ba lá và rau diếp cũng đã được sử dụng để sản xuất protein tái tổ hợp(Fischer R, 2004) Lá của các cây này có thể ăn trưc tiếp không cần qua đun nấunên rất có lợi trong việc phát triển vaccine cho vật nuôi (Fischer R, 2004) Ngoài

ra, các loại lá này còn chứa hàm lượng protein cao và có năng suất sinh khối trênmột đợn vị diện tích lớn Cỏ alfalfa có thể được thu hoạch 9 lần/năm Kiểu biếnđổi sau dịch mã trong cỏ alfalfa khá đồng nhất (Fischer R, 2004) Quá trình N-

glycosyl hóa ổn định là một trong những tiêu chí quan trọng cho việc sản xuấtprotein làm thuốc vì chức năng sinh học của protein bị ảnh hưởng bởi cấu trúcglycan gắn tại đầu N Trong khi đó, N-glycosyl hóa trong cây thuốc lá lại khôngđồng nhất (Bardor M, 2003).

1.2.1.2 Cây trồng lấy quả và củ

Rau quả và củ như cà chua và khoai tây cũng là một trong những đối tượng đểbiểu hiện protein tái tổ hợp Khoai tây thường xuyên được sử dụng vì quy trìnhchuyển gen đã được chuẩn hóa Củ tách từ cây chuyển gen biểu hiện S1glycoprotein của virus gây bệnh viêm phế quản truyền nhiễm (IBV) đã cho thấy cókhả năng bảo vệ gà khỏi mắc các triệu chứng lâm sàng của bệnh và diệt được virustrong thí nghiệm công cường độc (Zhou JY, 2003) Bên cạnh đó, việc sản xuất củkhoai tây có thể dễ dàng cung cấp vật liệu cho thử nghiệm (Mason HS, 2002).Protein tái tổ hợp trong củ được dự trữ trong thời gian dài trong điều kiện bìnhthường (Fischer R, 2004) Nguy cơ trôi gen thấp vì khoai tây có thể được nhân

nhanh in vitro Ngoài ra, quá trình chế biến khoai tây ở mức công nghiệp là có sẵn

nên chi phí sau thu hoach được giảm đi đáng kể Tuy nhiên, khoai tây có hàm lượngprotein thấp (Mason HS, 2002) và có vị không ngon khi được ăn sống Vị của khoaitây được cải thiện sau khi đun nấu nhưng cấu trúc của protein tái tổ hợp lại bị mấtdẫn đến giảm khả năng đáp ứng miễn dịch nếu được dùng để sản xuất khángnguyên làm vaccine (Gunn S, 2012) Cà chua được coi là hệ thống biểu hiện tốt hơn(Mason HS, 2002) vì cà chua có vị ngon và có thể ăn sống không cần chế biến.Kháng nguyên biểu hiện trong quả không bị mất cấu trúc do nhiệt Glycoprotein củavirus gây bệnh dại là kháng nguyên đầu tiên được biểu hiện trong cà chua(McGarvey PB, 1995) Tiếp theo, các protein vỏ VP2 và VP6 của virus gây bệnhtiêu chảy biểu hiện trong cà chua đã thể hiện khả năng miễn dịch trong chuột đượctiêm qua màng bụng (Saldaña S, 2006) Đặc tính chứa hàm lượng vitamin A caovốn có của cà chua có thể đồng thời trợ giúp nâng cao đáp ứng miễn dịch của khángnguyên tái tổ hợp (Gunn S, 2012) Quy trình trồng và chế biến ở quy mô công

nghiệp của cà chua cũng sẵn có giống như khoai tây Tuy nhiên, cà chua cũng cóhàm lượng protein thấp và phải bảo quản lạnh sau thu hoạch để tránh bị hỏng (Gunn

S, 2012) Mặc dù kỹ thuật đông khô lạnh hiện nay có thể bảo quản quả nhưng sẽtăng chi phí

có thể thúc đẩy việc việc tích tụ và dự trữ ổn định của protein Thêm vào đó hoạt tínhcủa các enzyme phân hủy protein trong hạt thấp, vì thế nguy cơ mất hoạt tính củaprotein tái tổ hợp do phân hủy nội bào được giảm đi đáng kể (Fischer R, 2004) Nhiềunghiên cứu cho thấy rằng kháng thể và kháng nguyên biểu hiện trong hạt có hoạt tính

ổn định trong nhiều năm ở nhiệt độ phòng (Stöger E, 2000) Vì thế, hạt là hệ thống biểuhiện phù hợp cho tiêu thụ trực tiếp và đặc biệt thích hợp để phát triển vaccine cho vậtnuôi và các động vật khác Việc trồng, sản xuất, thu hoạch, cất giữ, phân phối và chếbiến hạt ở quy mô công nghiệp đã được thiết lập cho hầu hết các cây trồng phổ biến(Lau O & Sun S, 2009) Trong đó, nổi bật ở cây họ ngũ cốc (ngô, lúa ) và cây họ đậu.Đậu Hà lan và đậu tương là hai hệ thống thông dụng nhất để nghiên cứu việcphát triển trang trại phân tử trong thực vật (Lau O & Sun S, 2009) vì có thể tích tụhàm lượng protein cao trong hạt Hạt đậu tương đã được sử dụng để biểu hiện tiểu

đơn vị B của độc tố đường ruột không bền nhiệt (LTB) của E coli (Moravec T,

2007) Sau khi cho ăn, các hạt chuyển gen này đã tạo ra được cả miễn dịch dịch thể

và miễn dịch hệ thống ở chuột và giúp chuột chống chịu một phần khi tiến hànhcông cường độc Một trong những ưu thế của cây họ đậu so với cây ngũ cốc là hàm

lượng protein của hạt cao hơn chiếm đến 40% protein tổng số, trong khi ở ngũ cốcchỉ vào khoảng 8 đến 13% (Stoger E, 2005) Tuy nhiên, quá trình chuyển gen ở cây

họ đậu được cho lá khá khó khăn Ngoài ra, năng suất hạt không cao và chi phí sảnxuất cao hơn so với lúa và ngô Nhưng đậu Hà Lan và đậu tương đều là cây tự thụphấn nên nguy cơ trôi gen là rất thấp

Một trong những nhược điểm chung của hệ thống biểu hiện trong hạt là thờigian sản xuất hạt kéo dài (Boothe J, 2010) Việc đánh giá khả năng biểu hiện củaprotein chỉ được tiến hành khi hạt được hình thành Bên cạnh đó, việc trong các câychuyển gen có hoa đòi hỏi phải có điều kiện nghiêm ngặt để đảm bảo an toàn sinhhọc, giảm thiểu việc trôi gen Ngược lại, cây chuyển gen cho lá có thể thu hoạchtrước khi ra hoa và giảm được nguy cơ này

1.2.1.4 Hệ thống nuôi cấy tế bào

Một giải pháp khác tránh việc phải tạo cây chuyển gen là sử dụng hệ thốngnuôi cấy tế bào thực vật để sản xuất protein tái tổ hợp Tế bào thực vật được nuôigiữ trong môi trường lỏng và có thể được sử dụng để sản xuất dược phẩm có kíchthước phân tử nhỏ Tế bào chuyển gen được tạo ra bằng hầu hết phương pháp hiện

có trừ việc lây nhiễm bằng virus thực vật và có thể sản xuất protein tái tổ hợp mộtcách liên tục Hệ thống này cho phép sản xuất các protein tái tổ hợp dùng cho điềutrị bệnh trong điều kiện nuôi cấy vô trùng với các thông số thích hợp Tế bào thựcvật ở dạng huyền phù đã được sử dụng trong nhiều nghiên cứu nhằm tạo ra nhiềuprotein ngoại lại khác nhau, trong đó có khoảng 30 loại protein có tác dụng chữabệnh được sản xuất trong dòng tế bào thực vật, bao gồm kháng thể, interleukin,interferon, erythropoietin, yếu tố kích thích bạch cầu nhân lớn (hGM-CSF), khángthể của virus viêm gan B, glucocerebrosidase …(Santos RB, 2016) Năm 2012,FDA đã chấp nhận dược phẩm sinh học đầu tiên sản xuất trong tế bào huyền phù càrốt glucocerebrosidase điều trị bệnh Gaucher

Hệ thống nuôi cấy tế bào thực vật dùng phổ biến nhất để tổng hợp protein là

tế bào cây thuốc lá Dòng tế bào thuốc lá BY-2 là một trong những dòng có thể tạođược sinh khối lớn vì nhân lên khá nhanh và dễ dàng chuyển gen Dòng tế bào

thuốc lá BY-2 được các nhà khoa học Nhật Bản chọn lọc từ nuôi cấy mô lõi thân

cây thuốc lá Nicotiana tabacum L cv Bright Yellow No 2 vào năm 1968 Qua quá

trình chọn lọc lâu dài, dòng tế bào này đã có thể phát triển đồng nhất và ổn định trênmôi trường nuôi cấy đơn giản, rẻ tiền với tốc độ nhân dòng từ 80-100 lần trong vòngmột tuần Một đặc điểm ưu việt khác là BY-2 đáp ứng tốt với quy trình chuyển gen

bằng Agrobacterium Tế bào BY-2 là dòng tế bào thực vật được dùng rộng rãi nhất

cho việc sản xuất nhiều loại protein tái tổ hợp (Nagata T, 2004) Vào năm 2005, hệthống sản xuất vaccine trong các bioreactor truyền thống bằng tế bào thực vật BY-2của công ty Dow AgroSciences (Indianapolis, USA) đã được trao giải thưởng caonhất trong lĩnh vực công nghệ mới tại Lễ trao giải lần thứ nhất cho những đóng gópxuất sắc trong công nghiệp dược phẩm được tổ chức tại London

thực vật

Một trong những hạn chế sự phát triển sản xuất protein trong thực vật chính làmức độ biểu hiện gen trong phần lớn trường hợp còn rất thấp Việc lựa chọn hệthống biểu hiện, phương thức biểu hiện kết hợp với sử dụng promoter (đoạn điềukhiển phiên mã) biểu hiện mạnh và đặc hiệu ở các cơ quan chuyên biệt, giai đoạnhoặc điều kiện nhất định, cũng như tăng khả năng tích lũy của protein tái tổ hợpbằng các tín hiệu dẫn đến cơ quan đích hay sử dụng vector virus… là những giảipháp tăng cường mức độ biểu hiện gen được sử dụng hiệu quả trong nhiều nghiêncứu gần đây

1.2.2.1 Promoter

Promoter là thành phần quan trọng trong cấu trúc của tất cả các gen, khởi đầucho sự phiên mã, đóng vai trò then chốt trong việc biểu hiện gen Do vậy, kiểm soátbiểu hiện protein thông qua hoạt động của promoter là một trong những yếu tố đóngvai trò quan trọng trong quá trình sản xuất protein tái tổ hợp Điều hòa sinh tổnghợp protein ở thực vật có thể làm giảm chi phí sản xuất và tạo ra các ưu thế về sốlượng bằng cách quyết định thời điểm và nơi diễn ra quá trình sinh tổng hợp protein

đó Cho tới nay, hai dạng promoter thường sử dụng để điều khiển quá trình tổng

hợp protein là (i), constitutive promoter (promoter cơ định) là promoter được hoạthóa liên tục dẫn đến việc protein được biểu hiện ở toàn bộ mô/cơ quan thực vật; (ii),specific promoter là promoter đặc hiệu điều khiển sản xuất protein tại không gian,thời gian, vị trí (promoter đặc hiệu mô tế bào, đặc hiệu giai đoạn phát triển) và điềukiện cảm ứng nhất định (inducible promoter - promoter cảm ứng).

 Promoter cơ định

Promoter cơ định thường được sử dụng để sản xuất protein tái tổ hợp ở tất cảcác mô của thực vật Các promoter thuộc dạng này như CaMV35S, CaMV19S,nopaline synthase (NOS), Actin, Ubiquitin, Mac, C1(Sharma A & Sharma M, 2009).Trong đó, promoter CaMV35S (viết tắt 35S) và promoter Ubiquitin được đánh giá làhai promoter mạnh và được sử dụng phổ biến nhất Promoter 35S có thể sử dụng dướidạng một hoặc nhiều bản sao để tăng cường biểu hiện của gen đích Các nghiên cứubiểu hiện yếu tố tăng trưởng nhau thai người lactogen (hPL) và huyết thanh người(hTf) ở cây thuốc lá sử dụng promoter 35S (Urreta I, 2011; Brandsma ME, 2010) Sửdụng promoter 35S kép (dual 35S promoter) trong vector pZP200 cũng giúp tăng

cường biểu hiện kháng nguyên bề mặt SAG1 (vị trí 78-322) của Toxoplasma gondii

trong lá cây thuốc lá (Laguia-Becher M, 2010) Promoter 35S cũng được sử dụng đểsản xuất một số protein kháng nguyên trong thực vật như CTB (cholera toxin Bsubunit), LTB (heat-labile enterotoxin B subunit), HbsAg (hepatitis B surface antigen),kháng nguyên bảo vệ, glycoprotein G của virus gây bệnh dại, glycoprotein của virusgây bệnh SARS Mặc dù, promoter 35S được xem là một lựa chọn tốt nhưng ở một sốcây trồng lấy hạt thì promoter này lại hoạt động không mạnh do thiếu các yếu tố cisđiều hòa hoạt động đặc hiệu cho các promoter của các gen ở hạt chín và các yếu tố liênkết với các nhân tố đặc hiệu để kích hoạt hay kìm hãm phiên mã Thêm vào đó, hoạtđộng của promoter 35S ở cây hai lá mầm hiệu quả hơn so với cây một lá mầm có thể là

do sự khác nhau về chất lượng hoặc số lượng của các yếu tố điều hòa Vì thế, ở câymột lá mầm và cây lấy hạt thường sẽ lựa chọn các promoter khác để sử dụng(Makhzoum A, 2013)

Promoter Ubiquitin đã được phân lập và nghiên cứu đánh giá khả năng hoạtđộng từ nhiều đối tượng như lúa, ngô, khoai tây, hướng dương, thuốc lá (Wang J &

Oard J, 2003) Các nghiên cứu đã cho thấy khả năng hoạt động của promoter nàycao gấp mười lần hoạt động của promoter 35S khi điều khiển biểu hiện gen ngoạilai trên cây một lá mầm (Cornejo MJ, 1993) So sánh hoạt động của promoter 35S

và Ubiquitin ở các mô cây lúa khi chuyển gen scFvT84.66 cho thấy kháng thể tái tổhợp được biểu hiện ở mô lá và hạt khi sử dụng promoter Ubiquitin trong khi cácdòng được chuyển cấu trúc mang promoter 35S chỉ biểu hiện ở mô lá, không có ởhạt (Stoger E, 2005) Promoter Ubiquitin có hoạt tính mạnh trong các mô non cóhoạt động trao đổi chất mạnh và ở hạt phấn hoa

Các gen được điều khiển bởi các promoter cảm ứng (inducible promoter) sẽkích hoạt dưới sự có mặt/vắng mặt các nhân tố bên ngoài như hóa chất, các yếu tốvật lí, môi trường và hoặc sâu bệnh… Promoter cảm ứng là một công cụ hữu hiệutrong công nghệ gen vì có thể điều khiển gen đóng hay mở ở những giai đoạn nhấtđịnh và đồng thời ở các bộ phận nhất định Khi sự sinh trưởng của tế bào và sảnxuất protein không liên quan đến nhau thì việc sử dụng các yếu tố cảm ứng có thếđem lại nhiều lợi thế trong một số trường hợp, cho phép tối ưu hóa riêng biệt cả haiquá trình để đạt được mức biểu hiện cao của protein đích (Sharma A & Sharma M,2009) Promoter α-amylase Rice 3D (RAmy3D) cảm ứng bởi sự thiếu hụt sucrose làmột promoter cảm ứng phổ biến được sử dụng tăng cường sự biểu hiện của genngoại lai ở cây lúa và đã được sử dụng biểu hiện một loạt các protein chữa bệnh củangười bằng phương pháp nuôi cấy huyền phù tế bào cây lúa như α1-antitrypsin,albumin huyết thanh, lysozyme (Huang TK & McDonald KA, 2012), hormone tăngtrưởng (Kim T, 2008), interlukin-12 (Shin Y, 2010)

Nhiệt độ là một trong những tác nhân bất lợi phổ biến nhất và gây hại nhiềunhất cho cây trồng Do vậy, các protein cảm ứng nhiệt (heat shock protein) vàpromoter điểu khiển chúng (heat shock promoter) đóng vai trò quan trọng trong quátrình điều khiển quá trình sinh lý, hóa sinh ở thực vật nhằm giảm những tác độngbất lợi của nhiệt độ Promoter cảm ứng nhiệt hsp 18.2 được phân lập lần đầu tiên từ

cây Arabidopsis bởi nhóm tác giả Takahashi, 1989 Đoạn promoter này có chiều

dài 720 bp trong đó có 6 đoạn nucleotide có trình tự bảo thủ gồm (nGAAn) đượcgọi là nhân tố cảm ứng nhiệt (HSE: heat shock element) Promoter hsp 18.2 đượchoạt động ở nhiệt độ cảm ứng tối ưu khác nhau tùy thuộc vào từng đối tượng thựcvật và phương thức cảm ứng nhiệt Sử dụng promoter cảm ứng nhiệt hsp 18.2 phân

lập từ Arabidopsis thaliana, Yoshida et al., 1995 đã điều khiển thành công biểu hiện gen gus (beta glucuronidase) trên các tế bào BY-2 Sau 2h cảm ứng ở nhiệt độ

37oC, hoạt tính của enzyme này đã tăng lên 1000 lần so với trước cảm ứng

 Promoter đặc hiệu

Gen chuyển điều khiển bằng dạng promoter biểu hiện đặc hiệu sẽ chỉ được biểuhiện trong phần mong muốn mà không làm thay đổi các bộ phận khác của cây Trênthực tế, việc lựa chọn các mô biểu hiện có ảnh hưởng đến sự tích lũy và ổn định củaprotein tái tổ hợp Các yếu tố như hàm lượng protein, hàm lượng nước, proteases vàchất ức chế proteases sẽ ảnh hưởng đến sự tích lũy của protein ngoại lai Đồng thời,việc lựa chọn mô biểu hiện cũng liên quan mật thiết tới hướng ứng dụng của các sảnphẩm protein đích Một số promoter đặc hiệu đã được phân lập để biểu hiện các phân

tử sinh học trong một số mô, cơ quan đặc hiệu như promoter zein (ở ngô), glutenin (ởlúa gạo và lúa mì), legumin (ở đậu) (Ma J, 2003) Các protein đặc hiệu mô đã được sửdụng biểu hiện nhiều protein làm được phẩm như vaccine kháng nguyên HBsAg M,interferon-α của người, LTB (De Jaeger G, 2002; He Z, 2008) Tuy nhiên, cùng mộtloại promoter nhưng mức độ tích lũy protein lại khác nhau ở các loài (Stoger E,2005) Để biểu hiện mạnh và đặc hiệu cho gen chuyển, thường các promoter đặc hiệucủa chính cây chủ hoặc họ hàng gần gũi sẽ được sử dụng

Biểu hiện đặc hiệu ở hạt và sử dụng các promoter biểu hiện đặc hiệu ở hạt cónhiều lợi thế vượt trội đặc biệt là các protein tái tổ hợp làm vaccine Một số promoterđặc hiệu ở hạt như promoter arcelin, globulin-1, zein, globulin 7S, glutelin, P-conglycinin (Sharma A & Sharma M, 2009) Các promoter đặc hiệu ở hạt đã được sửdụng để biểu hiện pro-insulin, laccase, epitope của tế bào lympho T của người,

provitamin A và phytase (Aluru M, 2008) Trong số các promoter đặc biệu ở hạt củacây hai lá mầm, các promoter của các cây họ đậu được đánh giá rất cao trong việctăng cường mức độ biểu hiện protein Phaseolin, một promoter được nghiên cứu đầutiên và đến nay vẫn là một trong những promoter biểu hiện mạnh nhất Promoterbeta-phaseolin được phân lập từ các cây họ đậu, điều khiển sự tổng hợp phaseolin -một trong những protein chiếm thành phần lớn trong hạt đậu Khi so sánh mức độ

biểu hiện của oleosin ở Arabidopsis sử dụng 6 promoter đặc hiệu ở hạt là phaseolin,

linin, oleosin, arcelin, cruciferin, USP đã cho thấy phaseolin đạt mức độ biểu hiện caohơn hẳn (Boothe J, 2010) Mức biểu hiện của scFv dưới sự điều khiển của beta-

phaseolin trong hạt đậu Phaseolus vulgaris có thể lên tới 36,5% TSP (De Jaeger G, 2002) Sử dụng cấu trúc tương tự, khi biểu hiện scFv-Fc ở hạt Arabidopsis thaliana

đạt mức 10% TSP (Van Droogenbroeck B, 2007) Đã có nhiều nghiên cứu sử dụngpromoter phaseolin để điều khiển sự biểu hiện của gen trong các cây đậu tương, nhưlàm tăng lượng sterol (Anjanasree K, 2012), dầu (Rao S & Hildebrand D, 2009),methionin và cystein (Dinkins RD, 2001)

1.2.2.2 Vector dựa trên virus thực vật

Sử dụng virus thực vật như là vector biểu hiện có nhiều lợi thế trong việc sản xuấtprotein tái tổ hợp vì genome của virus dễ dàng điều khiển hơn genome của thực vật vàquá trình lây nhiễm cũng đơn giản hơn so với việc tái sinh của cây chuyển gen Vectormang đặc tính virus là dạng vector trong đó các trình tự gen có ích được gắn vào virus

mà không làm mất đi khả năng lây nhiễm và nhân bản của nó (Gleba Y, 2007) Loạivector này có thể tạo ra việc biểu hiện tại chỗ của một protein nhất định trong thực vật

mà không gây bất cứ thay đổi nào về mặt di truyền của cây chủ

Thế hệ vector virus thực vật đầu tiên được công bố vào năm 1989 mang toàn bộ

hệ gen tự nhiên của virus TMV (Tobacco mosaic virus) cùng với các gen mã hóa chocác protein mong muốn Loại vector TMV này mang đầy đủ đặc điểm của virus TMVtức là có thể lây nhiễm, hình thành hạt virus và di chuyển một cách hệ thống trongcây chủ Hiện nay, vector TMV đã được cải tiến thành nhiều thế hệ khác nhau có thể

đáp ứng từng yêu cầu cụ thể đối với protein đích có kích thước khác nhau Khi đượctái tổ hợp lại thì các vector virus sẽ không có khả năng tự lây nhiễm, được chuyển

vào tế bào thực vật thông qua A tumefaciens (Gleba Y, 2007) Vector dựa trên MSV

(maize streak virus) mất gen MP (movement protein) chịu trách nhiệm về khả năng dichuyển giữa các tế bào đã được sử dụng thành công để sản xuất protein tái tổ hợptrong tế bào ngô (Palmer KE & Rybicki EP, 1998) Trong vector virus TMV manggen chống lại khả năng ức chế nhân bản của virus trong tế bào chủ, đoạn gen mã hóacho protein vỏ CP (coat protein) trở nên không cần thiết và có thể được loại bỏ(Kjemtrup V, 2005) Scholthof và cs (2006) đã thiết kế vector virus TBSV (Tomatobushy stunt virus) mà trong đó CP được thay thế bởi gen chỉ thị Tuy nhiên, thiếu CPcác vector này không chuyển dịch được sang các vùng xa nơi lây nhiễm Cho đến gầnđây, đã có trên 50 loại protein khác nhau dùng làm thuốc được biểu hiện thành công

trong thực vật từ virus TMV (Klimyuk V, 2005; Gleba Y, 2007).

Sử dụng virus thực vật có nhiều lợi thế trong việc sản xuất protein tái tổ hợp vì

hệ gen của virus dễ dàng điều khiển hơn hệ gen của thực vật, quy trình sản xuất sẽtốn ít công sức và thời gian hơn nhiều so như việc tạo ra cây chuyển gen Hàmlượng các protein tái tổ hợp được tạo ra do sử dụng vector virus thực vật thường daođộng từ 1 đến 10% protein hòa tan tổng số và có thể đạt mức 50-70% (Gleba Y,2007) Đối với cây chuyển gen thông thường, chỉ số này chỉ trong khoảng 0,1-1%

1.2.2.3 Các đoạn peptid tín hiệu và trình tự đặc hiệu giúp tăng năng suất protein tái tổ hợp

Bên cạnh vai trò quan trọng của promoter trong biểu hiện gen, giải pháp sửdụng các đoạn peptid tín hiệu bổ sung vào đầu N- và C- của protein cũng giúp nângcao năng suất của protein tái tổ hợp Những đoạn peptid này được hệ thống cây chủnhận diện và giúp tăng cường mức độ phiên mã và dịch mã của protein ngoại lai vớiviệc nâng cao sự ổn định và bảo vệ tránh sự tác động của protease bằng các tín hiệudẫn đến cơ quan đích (Moeller L, 2009) Tín hiệu peptid α-amylase ở cây ngũ cốc làmột tín hiệu phổ biến được dùng cho các vector biểu hiện đặc hiệu ở hạt Một tín

hiệu khác là peptid 2S2 có vai trò hướng đích việc dự trữ protein ở hạt đã sử dụngthành công trong các nghiên cứu biểu hiện các protein tái tổ hợp ở người ở cây

Arabidopsis, cây thuốc lá, cây dạ yến thảo (Boothe J, 2010; Loos A, 2011).

Nghiên cứu cơ chế định vị của protein trong tế bào thực vật có thể giúp việctăng cường mức độ tích tụ của protein tái tổ hợp trong cây Để đến được bào quanđích, protein thường phải được gắn với tín hiệu dẫn đường Các tín hiệu này đượcgọi là trình tự đích (signal sequence or uptake-targeting sequence) - là một trình tựacid amin đặc hiệu của protein Đặc điểm cấu trúc của protein tái tổ hợp sẽ là tiêuchí để lựa chọn vị trí tổng hơp và tích tụ của protein trong tế bào vì các biến đổi saudịch mã là cần thiết để bảo toàn chức năng và tính ổn định của protein (Faye L,2005) Ví dụ việc tích tụ yếu tố kích thích sinh trưởng của người trong dịch tế bào

(cytosol) hoăc dịch gian bào (apoplast) đã gây độc cho lá của cây thuốc lá N.

benthamiana Trong khi tác động tiêu cực này hoàn toàn biến mất khi protein được

đưa đến lục lạp (Gils M, 2005)

Hướng đích cho protein là rất quan trọng trong trang trại phân tử vì ba lý do.Trước hết, nơi tập kết của protein ảnh hưởng đến tính ổn định và kéo theo là năngsuất cuối cùng của protein vì năng suất thể hiện không chỉ qua tốc độ sản xuất màcòn là tốc độ phân hủy Tiếp đến, nơi đến của protein cũng hết sức quan trọng nếucần phải biến đổi protein sau dịch mã Có nhiều nghiên cứu cho thấy việc hướngprotein tái tổ hợp đến mạng lưới nội chất (ER) có thể giảm thiểu việc protein bịphân hủy bởi dịch bào (Benchabane M, 2008) Việc này đồng thời cũng đi kèm theokhả năng tăng cường đáng kể lượng protein được tổng hợp Một trong những lý do

có thể là do có mặt của các protein chaperone (các protein trợ giúp cho việc hìnhthành cấu trúc bậc cao của protein khác) và isomerase disulfide (thúc đẩy sự hìnhthành cầu disulfide trong cấu trúc protein) trong ER và hàm lượng protease thấp(Rice J, 2005) Tuy nhiên, ER lại chứa các proteolytic protease có thể thay đổi tínhthống nhất trong cấu trúc hoặc tính đa chiều của protein Nhiều nghiên cứu đã chothấy việc định vị protein tái tổ hợp tại ER giúp năng suất của protein tăng từ 10-100

lần (Hellwig S, 2004) Đặc tính của protein chuyển quyết định sự thích hợp để đượctích tụ trong ER vì quá trình hoàn thiện sau dịch mã được tiến hành chủ yếu ở ER

và trong quá trình xuất tiết ở bộ máy Golgi (Doran PM, 2006)

Trình tự axit amin đặc biệt cần thiết để dẫn protein đến các bào quan đặc biệt

và lưu giữ các protein trong các bào quan đã được xác định Các trình tự tín hiệu cóthể được gắn thêm vào trực tiếp hướng các protein vào con đường xuất bào hoặctích lũy trong các cơ quan tử của tế bào (như ER, lục lạp, không bào) Ví dụ, để đưacác protein vào ER, đoạn trình tự chuỗi KDEL (Lys-Asp-Glu-Leu) được thêm vào ởđầu 3’ giúp tế bào xác định protein cần được giữa ở ER, ở đấy các glycoprotein mớiđược tổng hợp sẽ được giữ lại ở dạng có số lượng các gốc mannose cao, dạng giốngnhau giữa thực vật và động vật có vú Protein hướng đích để xuất tiết vào các gianbào bên ngoài màng tế bào có ưu điểm trong quá trình hoàn thiện và đồng thời dẫntới việc biểu hiện với mức độ cao Tuy nhiên, đối với các protein được xuất tiết mộtcách tự nhiên thì việc giữ lại ở ER có thể làm tăng năng suất lên 10-100 lần nếu môitrường phân tử trong các phiến ER là thích hợp và có mặt các phân tử chaperone.Trong điều kiện này, các protein có thể hình thành nên cấu trúc cuộn gấp một cáchchính xác Một ví dụ điển hình để chứng minh cho cách thức này đó là khi hướngđích cho việc tổng hợp các yếu tố tăng trưởng biểu bì của người thì mức độ biểuhiện trong cây thuốc lá đã tăng đến mức độ đến 104lần so với không hướng đích

(Wirth S, 2004).

1.2.2.4 Cải biến mã di truyền

Ở trong cây, giống như ở các sinh vật nhân thật khác, tần số của các bộ bacùng mã hóa cho một axit amin là không giống nhau ở các loài khác nhau MứctARN sẵn có của các axit amin tương quan với tỉ lệ axit amin được tổng hợp (Liu Q

& Xue Q, 2005) Các bộ ba (codon) ưu tiên là khác nhau giữa thực vật và động vật,giữa thực vật một lá mầm và hai lá mầm (Jabeen R, 2010) Vì thế, sử dụng các bộ

ba thích hợp với cây chủ và loại bỏ các bộ ba hiếm có thể nâng cao mức độ biểubiện của protein tái tổ hợp Hiện có nhiều phần mềm khác nhau phục vụ cho mục

đích này như DNAWorker, Gene Designe, GeneDesign, và OPTIMIZER Bằngchiến lược này, acetylcholinestarase của người (EC 3.1.1.7) biểu hiện trong thuốc lá

đã tăng mức độ biểu hiện lên 5-10 lần (Wolin SL & Walter P, 1988); sự biểu hiện

của gen cryIA (b) của vi khuẩn Bacillus thuringiensis trong cây thuốc lá và cây cà chua chuyển gen tăng gấp 100 lần (Perlak F, 1991) Các thực nghiệm trên cây thuốc

lá được biểu hiện protein phát huỳnh quang (GFP) cũng đã chứng minh lợi ích của

việc tối ưu hóa bộ ba trong thực vật (Rouwendal G, 1997).

Việc lựa chọn các bộ ba có thể ảnh hưởng đến tốc độ dịch mã và phân hủymARN Cơ chế mà số lượng các bộ ba hiếm ảnh hưởng đến tốc độ dịch mã là doribosome có thể ngừng khi đi vào bộ ba hiếm do việc tARN mang bộ ba phù hợp với

bộ ba hiếm đi vào vị trí A của ribosome bị kéo dài hơn (Murray EE, 1989) Việc thiếuhụt tARN đặc hiệu trong vi khuẩn có thể làm ribosome ngừng làm việc tại bộ ba đó.Đặc biệt trong trường hợp bộ ba hiếm có mặt ở đầu 5 của mARN hoặc tại vùng có mức

độ biểu hiện thấp và sản phẩm protein bị thiếu hụt đã được phát hiện Thêm vào đó,kiểu sử dụng các bộ ba nhất định là khác nhau giữa có nhóm phân loại, chủ yếu làtrong việc có mặt của GC ở ví trí thứ 3 trong mã (Murray EE, 1989) Ví du, các gencủa người có số lượng GC là 52,5%, gen của khoai tây GC chỉ chiếm 42,9%, thuốc lá

là 43,5% và lúa mì là 55,6% Các bộ ba ưu tiên là khác nhau giữa thực vật một lámầm và thực vật hai lá mầm, thậm chí là rất khác nhau giữa hệ di truyền nhân và lạpthể của thực vật (Liu Q & Xue Q, 2005) Trong một số trường hợp, thay vì thay đổitoàn bộ trình tự, có thể sử dụng đột biến định hướng (Site directed mutagenesis) Độtbiến định hướng được sử dụng để loại bỏ các bộ ba hiếm một cách thay thế một basenitơ Tuy nhiên, trong khi tối ưu với bộ ba được sử dụng, cần tránh việc mở rộng hoặctập trung lại các bộ ba đặc hiệu, để không ảnh hưởng đến tốc độ tARN Khi sửa đổitrình tự để tối ưu bộ ba, cũng cần chú ý đến cấu trúc thứ cấp của phân tử mARN

1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP TRONG THỰC VẬT PHÒNG CHỐNG PRRS

1.3.1 Phát triển protein tái tổ hợp trong thực vật làm vaccine

Từ đầu những năm 1990, thực vật đã được bổ sung thêm chức năng mới là trởthành các nhà máy sản xuất thuốc mới và vaccine cho người và động vật (Liew PS

& Hair-Bejo M, 2015) Vaccine thực vật là vaccine tiểu đơn vị trong đó khángnguyên đích được sản xuất trong các mô của thực vật Giống như các loại vaccinetiểu đơn vị tái tổ hợp khác, yêu cầu trước tiên cho việc phát triển vaccine là xácđịnh được kháng nguyên thích hợp, có khả năng tạo ra đáp ứng miễn dịch bảo vệ cơthể (hoặc ít nhất là có tiềm năng tạo ra đáp ứng miễn dịch của vật chủ) Ngoài ra,kháng nguyên phải biểu hiện ở mức cao trong thực vật để có thể dùng qua đườngmiệng với một liều hiệu quả tạo ra cơ chế bảo vệ Về phía thực vật, cần phải chọnloại tế bào hoặc cây chủ có khả năng nhân gen và biểu biểu hiện kháng nguyên cao,giúp sản xuất vaccine với giá thành hạ và có thể trở thành dạng vaccine qua đượcmiệng một cách hiệu quả Các vaccine dạng này đồng thời phải được thử nghiệm độhiệu quả và an toàn trên động vật thí nghiệm Khả năng ổn định về chất lượng củavaccine trong điều kiện dự trữ và phân phối đồng thời cần phải xem xét đánh giá.Hướng biểu hiện các protein kháng nguyên trong hệ thống thực vật được đánhgiá có nhiều ưu điểm so với các hệ thống biểu hiện khác Trước hết, chi phí sản xuấtprotein tái tổ hợp trong thực vật chỉ bằng một phần so với hệ thống tế bào động vật

có vú và giảm 10 đến 50% so với hệ thống vi sinh vật như lên men E coli (Mett V,

2008) Việc sản xuất cây trồng chuyển gen chỉ đòi hỏi đầu tư tương tự như trồng cáccây trồng bình thường Việc thu hoạch và chế biến các cây chuyển gen lại thườngkhông đòi hỏi công nghệ phức tạp và việc tăng quy mô cũng khá đơn giản chỉ bằng

cách tăng diện tích trồng trọt (Daniell H, 2009)

Hệ biểu hiện thực vật có tính an toàn cao hơn vì ít có khả năng bị nhiễm các visinh vật gây bệnh cho người và động vật (Kwon KC, 2013) Vaccine truyền thốngthường được sản xuất trong phôi gà hay hệ thống nuôi cấy tế bào động vật Nhữngvaccine này chủ yếu là các chủng virus giảm độc lực nhưng vẫn có thể tái bản vàthể hiện đầy đủ hoạt tính tạo kháng nguyên Mặc dù độc tính đã bị giảm đi so vớivaccine sống nhưng vẫn tồn tại nguy cơ phục hồi độc tính gây bệnh thay vì phòngngừa (Clarke JL, 2013) Ngoài ra, phôi gà và hệ thống tế bào mang theo nguy cơ

nhiễm những bệnh nguy hiểm vì môi trường giàu dinh dưỡng Virus gây bệnh máutrắng leukosis trên gia cầm đã tìm thấy trong vaccine thương mại phòng bệnhMarek (một dạng ung thư) của gia cầm (Zavala G & Cheng S, 2006) Mặc dù, cácvaccine bị nhiễm đã được cấm sử dụng nhưng cho thấy là việc kiểm tra an toànvaccine thường xuyên đôi khi đã không phát hiện được việc bị nhiễm Đây là mộttrong những báo động về độ an toàn của vaccine được sản xuất trên các hệ thống cónguồn gốc động vật Về khía cạnh này, môi trường thực vật có thể làm giảm tối đanguy cơ nhiễm khuẩn gây bệnh cho người và động vật.

Ngoài những ưu điểm về chi phí, quy mô và an toàn, hệ thống biểu hiện trongthực vật còn cho phép tiến hành các biến đổi protein sau dịch mã như hình thànhcác cầu disulfide và quá tình glycosyl hóa (Streatfield SJ & Howard JA, 2003).Protein tái tổ hợp có thể hướng đích và được giữ lại trong mạng lưới nội chất của tếbào để tiến hành quá trình glycosyl hóa ở đầu N và tránh được việc bị biến đổithành các gốc glycan do bộ máy Golgi tiến hành (Mett V, 2008) Hệ thống biểu hiệntrong vi sinh vật rẻ hơn trong tế bào động vật có vú nhưng protein tái tổ hợp lại

không được glycosyl hóa sau phiên mã như trong E coli hoặc bị glycosyl hóa quá

mức như trong nấm men, vì thế ảnh hưởng đến khả năng tạo đáp ứng miễn dịch củakháng nguyên (Streatfield SJ & Howard JA, 2003)

1.3.2 Nghiên cứu phát triển vaccine thú y trong thực vật

Trong hơn hai thập kỷ qua, hướng nghiên cứu phát triển vaccine thực vật đãđạt được nhiều thành tựu Năm 2006, công ty Dow AgroSciences đã trở thành công

ty đầu tiên trên thế giới được USAD (Trung tâm Nông nghiệp Quốc gia Mỹ) về Thú

y chính thức cấp giấy phép để sản xuất vaccine chống lại virus gây bệnh Newcastletrong hệ thống nuôi cấy tế bào thực vật Sự thành công này đã mở ra cánh cửa choviệc thương mại hóa các sản phẩm vaccine thực vật Đến nay đã có gần 200 proteinsản xuất trong thực vật và hứa hẹn là đối thủ cạnh tranh trong lĩnh vực sản xuấtprotein tái tổ hợp ở các hệ thống khác Trong lĩnh vực vaccine thú y trong thực vật,những phát triển vượt bậc được thể hiện qua khả năng các vaccine này vượt qua các thí

nghiệm công cường độc trên những động vật đích và một số vaccine đã tiến hành cácthử nghiệm lâm sàng giai đoạn I và II (Shahid N & Daniel H, 2016)

Một trong những thử nghiệm cho thấy hiệu quả bảo vệ của vaccine thực vật làđoạn protein quyết định kháng nguyên từ protein vỏ VP2 của virus gây dịch tả ở chồn(MEV) được biểu hiện trong cây đậu mắt đen Trước hết, đoạn quyết định khángnguyên được gắn vào protein vỏ của protetein bề mặt của virus gây khảm trên đậucowpea và được nhân lên trong cây Khi được tiêm 1 mg hạt virus tái tổ hợp mangquyết định kháng nguyên của virus MEV đã giúp chồn chống lại được bệnh gây ra doMEV trong thí nghiệm công cường độc Tiêm chủng với protein VP60 của virus gâyxuất huyết thỏ được sản xuất trong khoai tây chuyển gen đã giúp thỏ phòng chống lạibệnh Thỏ tạo được kháng thể và đồng thời giảm số lượng virus gây xuất huyết khiđược dùng vaccine qua đường miệng (Martín-Alonso JM, 2003)

Bệnh dại, một bệnh nghiêm trọng đe dọa tính mạng người và động vật Theo

tổ chức y tế thế giới (WHO) ước tính có khoảng 55000 người tử vong và hàngnghìn động vật bị chết vì bệnh này (Loza-Rubio E, 2012) Để có được vaccinekhống chế bệnh dại ở người và động vật dùng qua đường uống, an toàn và rẻ,McGarvey và cs (1995) đã tạo cây cà chua biểu hiện protein G của virus dại Proteinđược tạo ra trong lá và quả đã có phản ứng miễn dịch với kháng thể G Bằngphương pháp biểu hiện tạm thời, nucleoprotein của virus gây bệnh dại đã đạt mứcbiểu hiện cao, tạo được đáp ứng miễn dịch trên chuột và có khả năng chống lại côngcường độc với virus dại (Arango IP, 2008) Vaccine thực vật phòng bệnh dại biểuhiện tạm thời ở rau bina đang trong giai đoạn I của thử nghiệm lâm sàng 5 ngườitrong chín người tình nguyện viên đã thể hiện đáp ứng kháng thể rõ rệt với khángnguyên (Takeyama N, 2015)

Một trong những bằng chứng có sức thuyết phục về tác dụng của vaccine thựcvật dùng qua đường miệng đối với vật nuôi là vaccine chống lại virus TGEV gâybệnh ở lợn (Lamphear BJ, 2004) Protein S của virus TGEV biểu hiện trong hạtngô và cho lợn con 10 ngày tuổi ăn (Streatfield SJ, 2003) Kết quả thí nghiệm côngcường độc với chủng TGEV có độc lực cao đã cho thấy hạt ngô chuyển gen biểu