thu nhan bromelin tu dua bang song sieu am

Ảnh hưởng của công suất siêu âm đến hoạt tính tổng của bromelain trong dịch trích từ chồi dứa ...21 Hình 3.. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính tổng của bromelain trong dịch trích ...

MỤC LỤC i

DANH MỤC CÁC BẢNG iii

DANH MỤC CÁC HÌNH iv

DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC vi

MỤC LỤC Mở đầu 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Enzyme bromelain 3

1.1.1 Một số tính chất của enzyme bromelain 3

1.1.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly bromelain 4

1.1.3 Ứng dụng của enzyme bromelain trong công nghiệp thực phẩm 5

1.2 Sóng siêu âm và ứng dụng trong quá trình trích ly 6

1.2.1 Khái niệm 6

1.2.2 Cơ chế tác dụng của sóng siêu âm trong quá trình trích ly 6

1.2.3 Ứng dụng sóng siêu âm trong quá trình trích ly 9

1.2.4 Ảnh hưởng của sóng siêu âm đến hoạt tính enzyme 9

1.2.4.1.Ảnh hưởng của công suất siêu âm 10

1.2.4.2.Ảnh hưởng của nhiệt độ siêu âm 10

1.2.4.3.Ảnh hưởng của thời gian siêu âm 11

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 13

2.1 Nguyên liệu 13

2.2 Nội dung nghiên cứu 14

2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu 14

2.2.2 Cách thực hiện thí nghiệm 14

2.2.2.1.Ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu 14

2.2.2.2.Ảnh hưởng công suất siêu âm 15

2.2.2.3.Ảnh hưởng của pH 16

2.2.2.4.Ảnh hưởng của nhiệt độ 16

2.2.2.5 nh hưởng của thời gian xử lý 17

2.2.2.6 T i ưu hóa hai thông số công nghệ của quá trình xử lý siêu âm để trích ly bromelain 17

2.2.2.7 Xác định trọng lượng phân tử và hoạt tính bromelain từ qui trình trích ly có xử lý siêu âm

2.3 Phương pháp phân tích

2.3.1 Phương pháp xác định hàm lượng protein hòa tan theo Lowry

2.3.2 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme bromelain

2.3.3 Phương pháp xác định hoạt tính riêng

2.3.4 Phương pháp xác định trọng lượng phân tử protein 19

2.4 Phương pháp xử lý số liệu 19

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20

3.1 Khảo sát ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu 20

3.2 Khảo sát ảnh hưởng của công suất siêu âm 21

3.3 Khảo sát ảnh hưởng của pH 23

3.4 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ 26

3.5 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian siêu âm

3.6 Tối ưu hóa công suất và thời gian siêu âm 31

3.7 Xác định trọng lượng phân tử và hoạt tính bromelain từ qui trình trích ly có xử lý siêu âm 33

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 36

4.1 Kết luận 36

4.2 Kiến nghị 36

TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1 1 Đặc điểm của các cysteine protease trong dứa 3 Bảng 1.2 Giới thiệu một số ứng dụng của enzyme bromelain trong công nghiệp

thực phẩm 5 Bảng 3 1.Các biến độc lập và mức độ dao động của chúng trong thiết kế bề mặt đáp

ứng 31

Bảng 3 2 Bảng thí nghiệm qui hoạch thực nghiệm tối ưu hóa quá trình xử lý siêu

âm để trích ly enzyme bromelain và kết quả thực nghiệm 32 Bảng 3 3 Kết quả kiểm tra các hàm mục tiêu ở điều kiện tối ưu .34

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1 1 Các vùng tần số sóng siêu âm và lĩnh vực ứng dụng 6 Hình 1 2 Tác động của sóng siêu âm lên bề mặt tế bào thực vật 7 Hình 1 3 Sự nổ vỡ bong bóng khí và giải phóng các hợp chất trong quá trình trích

ly tinh dầu từ cây húng quế 7 Hình 1 4 Ảnh chụp TEM của cellulose từ thực vật sau khi xử lý siêu âm Hình 1 5 Trọng lượng phân tử trung bình của cellulose từ cây bông vải thay đổi

theo thời gian xử lý siêu âm .Hình 2 1 Quy trình thu nhận enzyme bromelain thô từ chồi dứa 13 Hình 2 2 Sơ đồ nghiên cứu 14 Hình 3 1 Ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu (thời gian xay thay đổi) đến hoạt

tính bromelain trong dịch trích từ chồi dứa 20 Hình 3 2 Ảnh hưởng của công suất siêu âm đến hoạt tính tổng của bromelain trong

dịch trích từ chồi dứa 21 Hình 3 3 Ảnh hưởng của công suất siêu âm đến hàm lượng protein trong dịch trích

22 Hình 3 4 Ảnh hưởng của công suất siêu âm đến hoạt tính riêng của bromelain 23 Hình 3 5 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính tổng của bromelain trong dịch trích 24 Hình 3 6.Ảnh hưởng của pH đến hàm lượng protein trong dịch trích 25 Hình 3 7 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính riêng của bromelain 25 Hình 3 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính tổng của bromelain trong dịch trích

26 Hình 3 9 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng protein trong dịch trích 27 Hình 3 10 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính riêng của bromelain Hình 3 11 Ảnh hưởng của thời gian xử lý siêu âm đến hoạt tính tổng của

bromelain trong dịch trích 29

Hình 3 13 Ảnh hưởng của thời gian xử lý siêu âm đến hoạt tính riêng của

bromelain 30 Hình 3 14 Đồ thị bề mặt đáp ứng của quá trình tối ưu hóa công suất và thời gian

siêu âm sau khi xử lý siêu âm 33 Hình 3 15 Kết quả chạy điện di trên SDS age 35

PL 6 Giá trị các hàm mục tiêu theo công suất siêu âm 45

PL 7 Giá trị các hàm mục tiêu theo pH của dung dịch enzyme bromelain khi không

xử lý siêu âm 45

PL Giá trị các hàm mục tiêu theo pH của dung dịch enzyme bromelain sau khi xử

lý siêu âm 46

PL 9 Giá trị các hàm mục tiêu theo nhiệt độ dung dịch xử lý 46

PL 10 Giá trị các hàm mục tiêu theo thời gian xử lý siêu âm 47

MỞ ĐẦU Tính cấp t ết của đề

Bromelain là enzym thuộc nhóm protease – xúc tác thủy phân protein thành các acid amin Enzyme này có nhiều ứng dụng trong sản xuất công nghiệp

Bromelain được tìm thấy trong tất cả các bộ phận của quả dứa, đặc biệt là ở chồi Ở qui mô công nghiệp, người ta đã sử dụng chồi dứa làm nguồn nguyên liệu

để sản xuất chế phẩm bromelain

Để thu được enzyme, các nhà sản xuất cần phải phá vỡ lớp thành tế bào, để giải phóng enzyme Các phương pháp truyền thống như nghiền xé, trích ly… không thu triệt để lượng enzyme có trong nguyên liệu

Kỹ thuật siêu âm có thể làm tăng hiệu suất thu hồi chất chiết với nhiều ưu điểm:

+ Kỹ thuật đơn giản, dễ vận hành, tự động hóa (Wang và Weller, 2006) + Sóng siêu âm gây ra hiện tượng xâm thực khí phá hủy thành tế bào và mô thực vật, làm tăng sự truyền khối của dung môi và chất tan, từ đó làm tăng tốc độ trích ly

+ Sóng siêu âm làm tăng mức độ phân tán, tăng khả năng khuấy trộn, giúp nguyên liệu phân bố đều trong dung môi, làm tăng khả năng tiếp xúc giữa dung môi

và nguyên liệu nên hiệu suất trích ly sẽ tăng theo (Shah và cộng sự, 2008)

+ Có thể trích ly được những hợp chất không bền nhiệt hay những hợp chất

dễ bay hơi, có thể sử dụng với bất kỳ dung môi nào (Wang và Weller, 2006)

Tuy nhiên, bên cạnh những ưu điểm trên, xử lý nguyên liệu bằng sóng siêu âm trong thời gian dài có thể làm thay đổi cấu hình trung tâm hoạt động enzyme (Huang và cộng sự, 2007), từ đó có thể làm giảm hoạt tính enzyme

Như vậy, việc sử dụng sóng siêu âm với công suất, nhiệt độ và thời gian thích hợp có thể giúp cho quá trình trích ly bromelain từ chồi dứa được triệt để hơn và không làm vô hoạt enzyme

− Ý nghĩa thực tiễn: làm tăng hiệu quả kinh tế của qui trình sản xuất đồ hộp dứa thông qua việc thu nhận chất có hoạt tính sinh học từ phụ phẩm của qui trình (chồi dứa)

CHƯƠNG 1 T NG QUAN TÀI LI U 1.1 Enzym brom la n

1.1.1 M t số tính chất của nzym brom n

Ananas comosus là một loại cây trồng ở vùng nhiệt đới thuộc họ Bromeliaceae Nó chứa các loại enzyme thuộc nhóm cysteine protease, bao gồm:

fruit bromelain, stem bromelain, ananain, và comosain (Feijoo-Siota và Villa, 2010)

Bromelain có trong dịch chiết từ thân và quả của cây dứa (loài Ananas comosus L merryl) Nó là một hỗn hợp gồm các protease như stem bromelain (80%), fruit bromelain (10%), ananain (5%) (Chobotova và cộng sự, 2010), và các enzyme khác như phosphatase, glucosidase, peroxidase, cellulase

Loại protease hiện diện chủ yếu trong phần chiết của thân (thân cây, cuống, lá, chồi), được gọi là stem bromelain (EC 3.4.22.32) và có ở hầu hết các loại dứa Loại enzyme được tìm thấy từ phần dịch ép của quả dứa, được gọi là fruit bromelain (EC 3.4.22.33) Chế phẩm bromelain được sử dụng phổ biến trong công nghiệp thực phẩm và dược phẩm (Maurer, 2001)

Bromelain được cấu thành từ 283 amino acid và có các đặc điểm sau:

Bảng 1 1 Đặc điểm của các cysteine protease trong dứa (Maurer, 2001; Siota và Villa, 2010)

phân tử (kDa)

Điểm đẳng điện

Bromelain là một cysteine protease thuộc nhóm endopeptidase, được hoạt hóa bởi cysteine, H2S, hoặc NaCN Vì tâm hoạt động có chứa nhóm –SH nên enzyme dễ

bị ức chế bởi chất oxi hóa H2O2 và mất hoạt tính bởi các kim loại nặng như Hg2+,

Ag+…

pH hoạt động tối thích cho stem bromelain từ 6.0 đến 8.5 (Polaina và MacCabe, 2007; Fileti và cộng sự, 2009), hoạt tính cao nhất trên cơ chất casein trong khoảng 6.0–7.0 (Shi và cộng sự, 2007) Nhiệt độ hoạt động tối thích trong khoảng 50–600C (Polaina và MacCabe, 2007; Gautam và cộng sự, 2010; Ketnawa

và cộng sự, 2010)

Hoạt tính của bromelain giảm dần ở môi trường acid (đệm 50mM Na-acetate

pH 4.0-5.0, 50mM glycine-HCl pH 3.0), và kiềm mạnh (đệm 50mM tris-HCl pH 8.0-10.0, 50mM Na-carbonate pH 11.0-12.0)

1.1.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly brom n

Ø Dung dịch đệm và pH

Hebbar và cộng sự (2008) đã khảo sát quá trình trích ly bromelain trong nước cất và trong dung dịch đệm phosphate pH 6.5 Kết quả cho thấy, hoạt tính của bromelain tăng 63% so với khi trích ly bromelain bằng nước cất Như vậy, dung dịch đệm pH 6.5 dùng để trích ly cho hoạt tính bromelain cao hơn so với trích ly bằng nước cất

Corzo và cộng sự (2011) cũng thu được kết quả tương tự: pH 6.5 là giá trị thích hợp để trích ly bromelain Khi tăng pH lên 6.8-7.2 thì hoạt tính bromelain trong dịch trích bị giảm đi 10% Nếu tiếp tục tăng pH dung môi đến 10.0 thì dịch trích không còn hoạt tính bromelain

Khi giảm pH xuống 4.0-6.0 thì hoạt tính bromelain trong dịch trích chỉ còn 27% Nếu tiếp tục giảm pH xuống đến 2.0 thì không phát hiện được hoạt tính bromelain trong dịch trích

Ø Nhiệt độ trích ly

25mM cystein) cho th y rằng, ở nhiệt độ dưới 400C, hoạt tính của bromelain không thay đổi Hoạt tính bromelain giảm 17% khi nhiệt độ lên 500C Khi nhiệt độ trên

600C, hoạt tính bromelain chỉ còn lại 51%

Ø Thời gian trích ly

Thời gian trích ly thích hợp là 5 phút khi nhiệt độ trích ly là 500C Nếu kéo dài thời gian trích ly thì hoạt tính bromelain sẽ giảm, hoạt tính tổng còn lại lần lượt là 98%, 95%, 90% và 86% khi thời gian trích ly tăng lên 10, 20, 40 và 60 phút (Jutamongkon và Charoenrein, 2010)

Khi trích ly trong thời gian dài và ở nhiệt độ cao, hoạt tính bromelain giảm mạnh Hoạt tính bromelain bị mất hoàn toàn trong thời gian 30 phút ở 600C (Mehrlich và cộng sự, 1978)

1.1.3 Ứng ụng của nzym brom n trong công ng ệp thực phẩm

Bảng 1.2 Giới thiệu một số ứng dụng của enzyme bromelain trong công nghiệp thực phẩm (Grzonka và cộng sự, 2007)

Công nghiệp bánh Giảm lượng protein của bột mì trong sản xuất bánh biscuit,

giảm độ dính của bột nhào, tăng độ màu của sản phẩm

Công nghiệp bia Ngăn ngừa sự kết tủa protein trong quá trình bảo quản bia Công nghiệp bơ sữa Whey hydrolysate

Hải sản Sản xuất protein hydrolyzate

Thức ăn gia súc Tăng hệ số sử dụng và chuyển hóa protein cho gia súc

1.2 g ứ g ụ g g h h

1.2.1 Kh ệ

Sóng siêu âm là tên gọi của những sóng có tần số cao hơn 1 kHz

Từ năm 2000 đến nay, người ta đã ứng dụng siêu âm trong sản xuất công nghiệp nói chung và trong công nghiệp thực phẩm nói riêng ngày càng nhiều Phần lớn các nghiên cứu trong công nghệ thực phẩm đều áp dụng siêu âm với tần số sóng trong khoảng từ 20 kHz đến 100 kHz (O’Donnell và cộng sự, 2010)

h 1 1 Các vùng tần số sóng siêu âm và lĩnh vực ứng dụng

Khi sóng siêu âm được truyền vào môi trường chất lỏng, các chu trình kéo và nén liên tiếp được tạo thành Trong điều kiện bình thường, các phân tử chất lỏng ở rất gần nhau nhờ liên kết hóa học Khi có sóng siêu âm, trong chu trình nén, các phân tử ở gần nhau nhau hơn và trong chu trình kéo chúng bị tách ra xa Áp lực âm trong chu trình kéo đủ mạnh để thắng các lực liên kết giữa các phân tử và tạo thành những bọt khí nhỏ

Siêu âm tần số thấp (công suất 18-100 kHz) phát ra một lượng lớn các bong bóng khí Các bong bóng khí đó sinh ra, phát triển (gia tăng về kích cỡ), dao động

và vỡ ra Đây là một hiện tượng vật lý Hiện tượng xâm thực khí gây ăn mòn cơ học, phá hủy thành tế bào và mô thực vật, thúc đẩy các phản ứng phân cắt hoặc bẻ gãy các liên kết hóa học trong mạch cao phân tử như cellulose, pectin… tạo ra các phân tử có kích thước nhỏ, giúp giải phóng các phân tử có kích thước nhỏ hơn nằm bên trong mô và tế bào (như protein, enzyme)

Hình 1.2 giới thiệu tác động của sóng siêu âm trên thành tế bào thực vật do

b vỡ, từ đó làm phá vỡ thành tế bào thực vật, đồng thời tạo ra những lỗ hổng trên

bề mặt nguyên liệu (hình 1.3), giải phóng các hợp chất nội bào vào dung môi, làm tăng hiệu quả trích ly (Chemat và cộng sự, 2011)

h 1 2 Tác động của sóng siêu âm lên bề mặt tế bào thực vật

a) Bong bóng khí tiến gần đến bề mặt nguyên liệu thực vật

b) Bong bóng khí bị vỡ trong chu kỳ nén

c) Lỗ hổng trên bề mặt nguyên liệu

d) Nhiệt độ và áp suất cao do nổ bong bóng khí sẽ phá hủy thành tế bào thực vật và giải phóng ra môi trường

h 1 3 Sự nổ vỡ bong bóng khí và giải phóng các hợp chất trong quá trình trích

ly tinh dầu từ cây húng quế (Chemat và cộng sự, 2011)

Dưới tác động của sóng siêu âm, kích thước nguyên liệu (từ thực vật) sẽ giảm Dưới đây là hình biểu diễn kích thước nguyên liệu trước và sau khi xử lý siêu âm (hình 1.4)

h 1 4 Ảnh chụp TEM của cellulose từ thực vật sau khi xử lý siêu âm

a) Mẫu ban đầu b) Mẫu sau khi xử lý siêu âm 30 phút Trọng lượng phân tử cellulose trong cây bông vải giảm xuống một cách tuyến tính theo thời gian xử lý siêu âm (hình 1.5) (Wong và cộng sự, 2009)

Bên cạnh đó, sóng siêu âm còn làm tăng cường sự khuấy trộn, giúp cho quá trình xử lý nguyên liệu được đồng đều hơn, giúp tăng hiệu suất quá trình trích ly

h 1 5 Trọng lượng phân tử trung bình của cellulose từ cây bông vải thay đổi

theo thời gian xử lý siêu âm

1.2.3 Ứ g ụ g g h h

Sóng siêu âm đã được sử dụng phổ biến cho quá trình trích ly các thành phần trong thực phẩm như polysaccharide, lipid, protein, chất mùi, và các chất có hoạt tính sinh học (các flavonoid, caroteinoid) (Sun và cộng sự, 2010) Ngoài ra, sóng siêu âm còn hỗ trợ trích ly các dược chất như helicid, berberine hydrochloride, và berberine từ các loại thảo dược (Zhao và cộng sự, 1991)

Từ trước đến nay, có rất ít công trình khoa học nghiên cứu sử dụng sóng siêu

âm để trích ly enzyme từ tế bào vi sinh vật Chúng tôi không tìm thấy tài liệu tham khảo về quá trình trích ly bromelain từ dứa có sử dụng sóng siêu âm

Trích ly với sự hỗ trợ của sóng siêu âm là một kỹ thuật nổi trội hiện nay trong công nghiệp hóa học và thực phẩm vì nó làm giảm đáng kể thời gian trích ly và làm tăng hiệu suất thu hồi chất chiết

Ví dụ như khi sử dụng sóng siêu âm để trích ly dầu từ quả hạnh ở tần số 20 kHz và công suất 50 W thì thời gian trích ly giảm 30%, hiệu suất trích ly tăng lên 20% so với kỹ thuật trích ly bằng lưu chất siêu tới hạn ở 280 bar và nhiệt độ 550C (Riera và cộng sự, 2004)

Ngoài ra, sử dụng sóng siêu âm trong quá trình trích ly còn làm giảm lượng dung môi hữu cơ cần sử dụng Do đó mức độ tinh sạch của sản phẩm cuối sẽ cao hơn

1.2.4 Ả h hưở g ủa g đế ạ h e

Theo Mason và cộng sự (1996), công suất siêu âm thấp và thời gian xử lý ngắn kích thích hoạt động xúc tác của enzyme Ví dụ như O’Donnell và cộng sự (2010) nhận thấy khi xử lý siêu âm công suất thấp làm tăng hoạt tính của enzyme, tăng khả năng thủy phân của α-amylase, invertase, và amyloglucosidase trên tinh bột, sucrose, và glycogen

Ngược lại, nếu công suất siêu âm cao và thời gian xử lý kéo dài thì hoạt tính enzyme bị giảm đi Trong công nghiệp thực phẩm, người ta sử dụng sóng siêu âm công suất cao như là một phương pháp để vô hoạt enzyme

Hoạt tính enzyme peroxidase trong cà chua giảm khi công suất siêu âm tăng từ

3 , 6.0, 7.5 và 11.3 W/ml (tần số 23 kHz) trong thời gian từ 0 đến 150 giây Khi công suất tăng đến 11.3 W/ml, peroxidase bị vô hoạt khi xử lý trong thời gian 90 giây, trong khi các mẫu xử lý ở công suất siêu âm thấp hơn hoạt tính peroxidase vẫn còn trên 50% (Ercan và cộng sự, 2011)

1.2.4.1 Ả h hưở g ủa g ấ

Để nghiên cứu ảnh hưởng của công suất siêu âm, Özbek và Ülgen (2000) đã tiến hành thí nghiệm trên dung dịch enzyme alkaline phosphatase ở các mức công suất khác nhau từ 7 W đến 40 W trong 2x30 giây Kết quả cho thấy hoạt tính của alkaline phosphatase không thay đổi khi tăng công suất siêu âm

Theo khảo sát của O’Donnell và cộng sự (2010), pectinmethylesterase trong nước ép cam sau 10 phút xử lý siêu âm ở công suất 1.05 W/ml bị giảm hoạt tính 62% Tuy nhiên, hoạt tính của polyphenoloxydase trong các loại nước quả khi xử lý siêu âm 0.3 W/ml trong 30 phút lại tăng lên (Cheng và cộng sự, 2007) Kết quả tương tự đối với alkaline phosphatase và lactoperoxidase trong sữa gầy Hai loại enzyme này không bị giảm hoạt tính khi xử lý siêu âm với công suất 0.95 W/ml ở tần số 20 kHz trong 102.3 giây ở 610C (Villamiel và Jong, 2000)

Sóng siêu âm tạo ra hiện tượng khuấy trộn mạnh và sinh ra các gốc tự do nên

có thể làm thay đổi cấu hình không gian của các phân tử protein enzyme Tùy theo mức độ thay đổi này mà hoạt tính enzyme có thể tăng lên hoặc giảm đi Sự vô hoạt enzyme ngoài ảnh hưởng của công suất siêu âm còn phụ thuộc vào giá trị pH và nhiệt độ trong quá trình siêu âm

1.2.4.2 Ả h hưở g ủa hiệ độ

Kuldiloke và cộng sự (2002) đã có những công bố về ảnh hưởng của sóng siêu

âm đến sự tăng nhiệt độ và áp suất Theo đó, quá trình xử lý siêu âm sẽ sinh ra các bong bóng khí, khi các bóng khí này vỡ ra tại các chu kỳ nén sẽ làm tăng nhiệt độ

và áp suất trong mẫu xử lý

Xử lý siêu âm không th làm mất hoạt tính của enzyme bền nhiệt pectinesterase có trong chanh và các loại cam quít Hoạt tính của enzyme này chỉ giảm nhẹ khi kết hợp xử lý siêu âm với xử lý nhiệt

Ở nhiệt độ phòng, hoạt tính của pectinesterase không bị ảnh hưởng khi xử lý siêu âm (công suất 0.5 W/ml, tần số 20 kHz) sau 1 giờ tại pH 7 Khi chiếu siêu âm trong khoảng nhiệt độ 40-500C, hoạt tính của enzyme này chỉ giảm nhẹ

Özbek và Ülgen (2000) đã nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ và các thông số khác như công suất siêu âm (0-40 W) và thời gian xử lý (2x30 giây) đến độ bền của một số enzyme: alcohol dehydrogenase (ADH), malate dehydrogenase (MDH), glucose-6-phosphat dehydrogenase (G6PDH), L-lactic dehydrogenase (LDH), alkaline phosphatase (AP) và β-galactosidase (βG) (các chế phẩm enzyme trên đã được tinh sạch và thương mại hóa bởi hãng Sigma Chemical) Nhóm nghiên cứu đã tiến hành thí nghiệm trong điều kiện dung dịch đệm phosphat 20mM, pH 7.5, sử dụng sóng siêu âm với công suất 40 W ở tần số 20 kHz

Kết quả cho thấy, ở 27 W, nhiệt độ dung dịch mẫu xử lý tăng 15.80C (từ 23.70C đến 39.50C) trong 2x30 giây Nếu tăng thời gian xử lý lên 3x30 giây thì nhiệt độ tăng đến 360C

Do đó, để hạn chế sự tăng nhiệt độ trong quá trình xử lý siêu âm, người ta cần làm lạnh mẫu hoặc xử lý siêu âm ở các mức năng lượng xung khác nhau để hạn chế

sự gia tăng nhiệt độ

1.2.4.3 Ả h hưở g ủa ời gia

Hoạt tính của các enzyme alkaline phosphatase (AP), γ-glutamyltranspeptidase (GGTP), lactoperoxidase (LPO) không bị giảm nhiều trong quá trình xử lý siêu âm sữa nguyên chất và sữa gầy sau 102.3 giây ở công suất 20 kHz Kết quả thực nghiệm cho thấy hoạt tính của ba enzyme trên còn lại lần lượt là 98.2% AP, 77.9% GGTP, và 85.6% LPO trong sữa nguyên chất; và 100.0%, 82.8%, 100.0% trong sữa gầy sau khi xử lý siêu âm Điều đáng lưu ý là AP và LPO (trong sữa gầy) không bị giảm hoạt tính sau 102.3 giây xử lý siêu âm (O’Donnell và cộng sự, 2010)

Theo nghiên cứu của Nabarlatz và cộng sự (2010) thu được khi trích ly protease từ bùn hoạt tính, kết quả cho thấy nếu xử lý bằng sóng siêu âm (công suất siêu âm 3.9 W/cm2) thì thời gian trích ly chỉ mất 10 phút, trong khi trích ly protease bằng phương pháp khuấy trộn phải mất 60 phút

Tuy nhiên, nếu tăng thời gian xử lý siêu âm thì hoạt tính enzyme sẽ giảm mạnh Nghiên cứu của Özbek và Ülgen (2000) cho thấy hoạt tính enzyme alcohol dehydrogenase và malate dehydrogenase tỉ lệ nghịch với thời gian xử lý (từ 0-240 giây) khi xử lý siêu âm dưới điều kiện công suất siêu âm 15 và 27 W

Sóng siêu âm ngoài tác động lên phân tử enzyme còn làm tăng nhiệt độ mẫu lỏng khi thời gian siêu âm kéo dài (Ercan và cộng sự, 2011), từ đó tạo nên tác động kép ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme Vì vậy, cần phải kiểm soát thời gian siêu

âm để không làm vô hoạt enzyme

ƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Nguy ệ

Dứa (Ananas comosus): sử dụng giống dứa Queen

Chồi dứa được mua tại Chợ đầu mối nông sản thực phẩm Thủ Đức

h 2 1 Quy trình thu nhận enzyme bromelain thô từ chồi dứa

Chồi dứa sau khi loại bỏ phần lá được đem phối trộn với dung dịch đệm phosphate pH 6.5 rồi xay nhuyễn trong một khoảng thời gian xác định ở nhiệt độ phòng Tỷ lệ khối lượng chồi dứa và dung dịch đệm là 1:1 Sau đó đem hỗn hợp thu được đi xử lý siêu âm (công suất, pH, nhiệt độ và thời gian xử lý siêu âm sẽ thay đổi theo từng thí nghiệm) Cuối cùng đem hỗn hợp lọc qua giấy lọc thô để thu lấy dịch

Dịch enzyme thô

xơ, chúng tôi thu được dung dịch enzyme bromelain thô và xác định các hàm mục tiêu:

+ Hàm lượng protein hòa tan

+ Hoạt tính tổng của enzyme bromelain

Sử dụng thanh siêu âm của hãng Sonic & Materials có tần số cố định

là 20 kHz, công suất tối đa là 750 W

2.2.2.1 Ả h hưở g ủa h ướ g ệ

Xác định kích thước nguyên liệu để trích ly bromelain (Xác định thời gian xay nhuyễn nguyên liệu)

Tối ưu hóa hai thông số công nghệ của quá trình xử lý siêu âm để trích

¯ Cách thực hiện:

− Thông số thay đổi:

• Thời gian xay nhuyễn nguyên liệu: 3, 6, 9 phút (chúng tôi cho rằng thời gian xay nguyên liệu càng lâu thì kích thước nguyên liệu sẽ càng nhỏ)

Thông số cố định:

• Tỉ lệ khối lượng nguyên liệu : dung dịch đệm pH 6.5 = 1:1

• Công suất siêu âm: 4.7 W/g nguyên liệu

• Nhiệt độ xử lý siêu âm: nhiệt độ phòng

• Thời gian siêu âm: 60 giây

− Thông số thay đổi:

• Công suất siêu âm: 0, 3.8, 4.7, 5.6, 6.6, 7.5 W/g nguyên liệu Thông số cố định:

• Thời gian xay: sử dụng kết quả tìm được ở thí nghiệm 2.2.2.1

• Tỉ lệ khối lượng nguyên liệu : dung dịch đệm pH 6.5 = 1:1

• Thời gian xử lý siêu âm: 60 giây

• Nhiệt độ xử lý siêu âm: nhiệt độ phòng

¯ Hàm mục tiêu

− Hoạt tính tổng của enzyme bromelain

Hàm lượng protein hòa tan

Hoạt tính riêng

• Kích thước: sử dụng kết quả tìm được ở thí nghiệm 2.2.2.1

• Công suất: sử dụng kết quả tìm được ở thí nghiệm 2.2.2.2

• Thời gian xử lý siêu âm: 60 giây

• Nhiệt độ xử lý siêu âm: nhiệt độ phòng

¯ Hàm mục tiêu:

− Hoạt tính tổng của enzyme bromelain

Hàm lượng protein hòa tan

Hoạt tính riêng

2.2.2.4 Ả h hưở g ủa hiệ độ

¯ Mục đích: xác định nhiệt độ thích hợp cho quá trình trích ly bromelain

¯ Cách thực hiện

− Thông số thay đổi:

• Nhiệt độ dung dịch mẫu: 10, 20, 30, 40, 500C

Thông số cố định:

• Kích thước: sử dụng kết quả tìm được ở thí nghiệm 2.2.2.1

• Công suất: sử dụng kết quả tìm được ở thí nghiệm 2.2.2.2

• pH: sử dụng kết quả tìm được ở thí nghiệm 2.2.2.3

• Thời gian xử lý siêu âm: 60 giây

¯ Hàm mục tiêu:

Hoạt tính riêng

2.2.2.5 Ả h hưở g ủa ời gia ử

¯ Mục đích: xác định thời gian thích hợp cho quá trình trích ly bromelain

¯ Cách thực hiện

− Thông số thay đổi:

• Thời gian xử lý: 0, 30, 60, 90, 120, 150, 180 giây

Thông số cố định:

• Kích thước: sử dụng kết quả tìm được ở thí nghiệm 2.2.2.1

• Công suất: sử dụng kết quả tìm được ở thí nghiệm 2.2.2.2

• pH: sử dụng kết quả tìm được ở thí nghiệm 2.2.2.3

• Nhiệt độ: sử dụng kết quả tìm được ở thí nghiệm 2.2.2.4

¯ Hàm mục tiêu:

Hoạt tính tổng của enzyme bromelain

Hàm lượng protein hòa tan

Chúng tôi sử dụng phương pháp qui hoạch thực nghiệm trực giao bậc hai, hai yếu tố, cấu trúc có tâm để thực hiện thí nghiệm tối ưu hóa Chúng tôi dùng phần mềm Mode 5.0 để thiết kế thí nghiệm, mỗi yếu tố được khảo sát ở 5 mức Hàm mục tiêu là hoạt tính tổng của enzyme bromelain trong dịch trích

− Hầu hết các protein đều chứa hai amino acid là tyrosin và tryptophan, hàm

lượng của những amino này tùy thuộc vào loại protein, vì vậy những protein của cùng một loại với nhau sẽ chứa hàm lượng amino acid như nhau

Khi cho protein tác dụng với thuốc thử folin sẽ tạo thành một phức chất có

màu, màu này tỉ lệ thuận với hàm lượng tyrosin và tryptophan (hàm lượng protein) Vì thế có thể dùng phương pháp so màu và xác định được hàm lượng protein khi đo độ hấp thụ ở bước sóng 550 nm

2.3.2 Phương pháp xác định hoạt tính nzym brom n

¯ Nguyên tắc:

− Dùng protein “casein” làm cơ chất, xác định hoạt tính phân giải protein của

enzyme bromelain (protease) trên cơ sở định lượng sản phẩm tạo thành trong phản ứng bằng phản ứng màu với thuốc thử folin Dựa vào đồ thị chuẩn để tính lượng tyrosin tương ứng với lượng sản phẩm thủy phân dưới tác dụng của enzyme

Một đơn vị hoạt tính (ĐVHT) enzyme bromelain là lượng enzyme cần xúc

tác để tạo ra lượng amino acid tương đương với 100 µg Tyrosin trong 1 ml mẫu ban đầu dưới điều kiện thí nghiệm

2.3.3 Phương pháp xác định hoạt tính g

− Từ kết quả định lượng ở mục 2.3.1 và 2.3.2, hoạt tính riêng của enzyme

2.3.4 Phương pháp xác định trọng lượng phân tử pro n

¯ Nguyên tắc:

SDS-PAGE (sodium dodecyl sulphate – polyacrylamide gel) là một kỹ thuật điện di trên gel polyacrymide với SDS là tác nhân làm biến tính và tích điện âm các phân tử Phương pháp này dùng để xác định trọng lượng phân tử protein, thành phần và độ sạch chế phẩm protein trong quá trình tinh sạch Trong kỹ thuật này protein được xử lý với SDS và tác nhân khử cầu nối disulfit là mercaptoethanol hoặc dithithreitol (DDT) làm cấu trúc bậc 2, 3, 4 của protein bị biến đổi thành bậc 1 và tích điện âm Do đó, khi điện di, các phân tử protein chỉ phụ thuộc vào kích thước để di chuyển trong gel, những phân tử có kích thước lớn sẽ di chuyển chậm hơn những phân tử có kích thước nhỏ

ƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Khảo sát ảnh hưởng của kích thước nguy ệ

Ch i dứa sau khi bỏ lá được đem xay trong thời gian 3, 6, 9 phút với tỉ lệ khối lượng chồi dứa : dung dịch đệm pH 6.5 (w/w) là 1:1 Sau đó đem mẫu xử lý siêu âm

ở công suất 4.7 W/g nguyên liệu trong thời gian 60 giây ở nhiệt độ phòng Mẫu đối chứng không qua xử lý siêu âm Kết quả khảo sát được biểu diễn trên hình 3.1 Kết quả xử lý ANOVA cho thấy, đối với các mẫu không qua xử lý siêu âm, tổng hoạt tính bromelain trong dịch trích sẽ tăng lên khi tăng thời gian xay từ 3 lên

6 và 9 phút Tuy nhiên, mức độ tăng hoạt tính là không nhiều khi tăng thời gian xay

từ 6 phút lên 9 phút

Nếu cố định thời gian xay nguyên liệu, các mẫu có qua xử lý siêu âm có hoạt tính bromelain cao hơn so với các mẫu không qua xử lý siêu âm Khi tăng thời gian xay từ 3 phút lên 6 phút, hoạt tính bromelain trong dịch trích của mẫu có qua xử lý siêu âm cũng tăng lên Tuy nhiên, đối với hai mẫu xay trong thời gian 6 và 9 phút thì hoạt tính enzyme không có sự khác biệt