Nghiên cứu phát triển cảm biến sinh học điện hóa trên cơ sở dây nano polypyrrole tích hợp hệ vi lưu

Nghiên cứu phát triển cảm biến sinh học điện hóa trên cơ sở dây nano polypyrrole tích hợp hệ vi lưu Nghiên cứu phát triển cảm biến sinh học điện hóa trên cơ sở dây nano polypyrrole tích hợp hệ vi lưu Nghiên cứu phát triển cảm biến sinh học điện hóa trên cơ sở dây nano polypyrrole tích hợp hệ vi lưu Nghiên cứu phát triển cảm biến sinh học điện hóa trên cơ sở dây nano polypyrrole tích hợp hệ vi lưu Nghiên cứu phát triển cảm biến sinh học điện hóa trên cơ sở dây nano polypyrrole tích hợp hệ vi lưu Nghiên cứu phát triển cảm biến sinh học điện hóa trên cơ sở dây nano polypyrrole tích hợp hệ vi lưu Nghiên cứu phát triển cảm biến sinh học điện hóa trên cơ sở dây nano polypyrrole tích hợp hệ vi lưu Nghiên cứu phát triển cảm biến sinh học điện hóa trên cơ sở dây nano polypyrrole tích hợp hệ vi lưu Nghiên cứu phát triển cảm biến sinh học điện hóa trên cơ sở dây nano polypyrrole tích hợp hệ vi lưu Nghiên cứu phát triển cảm biến sinh học điện hóa trên cơ sở dây nano polypyrrole tích hợp hệ vi lưu Nghiên cứu phát triển cảm biến sinh học điện hóa trên cơ sở dây nano polypyrrole tích hợp hệ vi lưu Nghiên cứu phát triển cảm biến sinh học điện hóa trên cơ sở dây nano polypyrrole tích hợp hệ vi lưu Nghiên cứu phát triển cảm biến sinh học điện hóa trên cơ sở dây nano polypyrrole tích hợp hệ vi lưu Nghiên cứu phát triển cảm biến sinh học điện hóa trên cơ sở dây nano polypyrrole tích hợp hệ vi lưu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT HÓA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1 PGS.TS MAI ANH TUẤN

2 PGS.TS HUỲNH ĐĂNG CHÍNH

HÀ NỘI - 2017

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn của tập thể giáo viên hướng dẫn Các số liệu, kết quả nghiên cứu là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tập thể hướng dẫn Tác giả luận án

PGS TS Mai Anh Tuấn PGS.TS Huỳnh Đăng Chính Trần Thị Luyến

LỜI CẢM ƠN

Với tấm lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới các Thầy, PGS.TS Mai Anh Tuấn và PGS.TS Huỳnh Đăng Chính, những người Thầy tâm huyết, yêu nghề đã giao đề tài và tận tình hướng dẫn tôi, động viên, khích lệ và hết lòng giúp

đỡ để tôi có thể hoàn thành công trình nghiên cứu này

Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ về mặt kinh phí từ nguồn kinh phí đào tạo nghiên cứu sinh của Bộ Giáo dục và Đào tạo (đề án 911 trong nước), đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ (mã số: B2015-01-102) và Quỹ Phát triển khoa học và công nghệ Quốc gia thông qua đề tài mã số 103.99-2013.58

Tôi xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc tới các lãnh đạo và các Thầy Cô, đồng nghiệp của tôi trong Bộ môn Hóa Vô cơ - Đại cương, Viện Kỹ thuật Hóa học, Viện ITIMS, Viện Đào tạo sau Đại học và Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội đã tạo tất cả những điều kiện thuận lợi nhất để tôi có thể thực hiện luận án

Tôi xin chân thành cảm ơn các anh, chị, em đã và đang là học viên cao học và nghiên cứu sinh tại PTN Vật liệu sinh học và Khoa học sự sống, Viện ITIMS, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội vì sự hỗ trợ nhiệt tình trong thời gian tôi thực hiện luận án

Tôi xin trân trọng cảm ơn TS Đỗ Phúc Quân, Trường Đại học Quốc gia Hà Nội; TS Phạm Đức Thành, TS Chu Thị Xuân, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội; GS Hiroaki Suzuki, Trường Đại học Tsukuba (Nhật Bản) vì sự giúp đỡ nhiệt tình và những đóng góp chuyên môn quý báu

Tôi xin trân trọng cảm ơn Công ty CP công nghệ sinh học thú y BTV (Biotech-Vet) đã cho phép tôi tiếp cận nguồn mẫu tại nhà máy trong quá trình thực hiện chương trình nghiên cứu sinh

Tôi xin chân thành cảm ơn người thân và bạn bè đã luôn động viên, khích lệ tôi Tôi cũng xin được dành những lời cảm ơn sâu nặng đến gia đình tôi: bố, mẹ, chồng, con đã yêu thương, cảm thông và chia sẻ với tôi công việc nhà, để tôi có thể tập trung học tập và nghiên cứu trong suốt những năm tháng gian khổ này

Nghiên cứu sinh

Trần Thị Luyến

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT i

DANH MỤC CÁC BẢNG iii

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ iv

MỞ ĐẦU 1

1 TỔNG QUAN 6

1.1 Cảm biến sinh học điện hóa 6

1.1.1 Phân tích điện hóa 6

1.1.2 Cảm biến sinh học điện hóa 7

1.1.2.1 Nhu cầu phát triển cảm biến sinh học 7

1.1.2.2 Khái niệm cảm biến sinh học và cảm biến sinh học điện hóa 8

1.1.2.3 Tình hình nghiên cứu cảm biến sinh học điện hóa trong và ngoài nước 9

1.1.2.4 Tiếp cận phát triển cảm biến sinh học điện hóa 11

1.2 Biến tính bề mặt cảm biến sinh học điện hóa sử dụng vật liệu polime dẫn polypyrrole 12

1.2.1 Vật liệu polime dẫn polypyrrole ứng dụng trong chế tạo cảm biến DNA điện hóa 12

1.2.2 Tổng hợp vật liệu polime dẫn polypyrrole sử dụng kỹ thuật điện hóa 13

1.2.2.1 Cơ chế của quá trình polime hóa pyrrole sử dụng kỹ thuật điện hóa 13

1.2.2.2 Một số kỹ thuật điện hóa được sử dụng để tổng hợp polime dẫn 14

1.2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình polime hóa điện hóa pyrrole 16

1.2.2.4 Quá trình doping polypyrrole 17

1.2.2.5 Vai trò của gelatin trong tổng hợp dây nano polypyrrole 20

1.3 Cố định phần tử cảm nhận sinh học lên cảm biến sinh học điện hóa 21

1.3.1 DNA và kháng nguyên, kháng thể 21

1.3.1.1 DNA 21

1.3.1.2 Kháng nguyên, kháng thể 22

1.3.2 Các phương pháp cố định phần tử cảm nhận sinh học 24

1.3.2.1 Hấp phụ vật lý 24

1.3.2.2 Liên kết cộng hóa trị 26

1.3.2.3 Ái lực sinh học 28

1.4 Tích hợp cảm biến sinh học điện hóa và bình phản ứng mini 32

1.5 Kỹ thuật điện hóa trong nhận biết các thành phần sinh học 34

1.5.1 Phương pháp phổ tổng trở điện hóa 34

1.5.1.1 Nguyên lý của phổ tổng trở điện hóa 34

1.5.1.2 Biểu diễn tổng trở trên mặt phẳng phức 35

1.5.1.3 Mạch điện tương đương trong phổ tổng trở 37

1.5.2 Phương pháp đo vi sai 39

1.5.3 Phương pháp quét thế vòng (Cyclic Voltammetry - CV) 41

1.5.3.1 Nguyên lý của phương pháp CV 41

1.5.3.2 Quét thế vòng trên điện cực phẳng 42

2 NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO CẢM BIẾN DNA ĐIỆN HÓA TRÊN CƠ SỞ DÂY NANO POLYPYRROLE 45

2.1 Mở đầu 45

2.2 Thực nghiệm 45

2.2.1 Hóa chất 45

2.2.2 Điện cực tích hợp 46

2.2.3 Tổng hợp dây nano PPy sử dụng kỹ thuật điện hóa 46

2.2.4 Cố định DNA dò trên điện cực Pt-PPy NWs 47

2.2.5 Đặc trưng phổ tổng trở của điện cực Pt-PPy NWs-DNA dò 47

2.3 Kết quả và thảo luận 48

2.3.1 Tổng hợp dây nano PPy trên điện cực Pt 48

2.3.1.1 Đặc tuyến điện hóa của hệ điện cực Pt tích hợp 48

2.3.1.2 Giá trị điện thế trong phản ứng polyme hóa pyrrole 48

2.3.1.3 Ảnh hưởng của gelatin – khuôn nano trong chế tạo dây polyme 50

2.3.1.4 Ảnh hưởng của nồng độ monome pyrrole 51

2.3.1.5 Thời gian polime hóa 53

2.3.1.6 Phổ FT-IR 54

2.3.1.7 Phổ Raman 55

2.3.2 Đặc trưng tín hiệu cố định DNA dò 56

2.3.3 Đặc trưng tín hiệu lai hóa DNA dò- DNA đích 57

2.4 Kết luận 60

3 NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO CẢM BIẾN DNA ĐIỆN HÓA TÍCH HỢP HỆ VI LƯU 61

3.1 Mở đầu 61

3.2 Thực nghiệm 62

3.2.1 Hóa chất 62

3.2.2 Hệ ba điện cực tích hợp kết nối với bình phản ứng mini 62

3.2.3 Tổng hợp dây nano PPy trong vi bi ̀nh phản ứng 65

3.2.4 Cố định DNA dò trên điện cực Pt-PPy NWs 66

3.2.5 Pha ́ t hiê ̣n tín hiê ̣u lai hóa DNA sử du ̣ng Lock-in Amplifier 66

3.3 Kết quả va ̀ thảo luâ ̣n 66

3.3.1 Kết qua ̉ chế ta ̣o hê ̣ vi kênh tích hơ ̣p với điê ̣n cực 66

3.3.1.1 Kết quả đo bề dày vi kênh PDMS 67

3.3.1.2 Kết quả gắn kết vi kênh PDMS và điê ̣n cực 68

3.3.2 Đặc tuyến điện hóa của hệ ba điện cực tích hợp trong vi bình phản ứng 70 3.3.3 Tổng hơ ̣p PPy NWs trong vi bình phản ứng 71

3.3.4 Phát hiện hiện tượng lai hóa DNA 74

3.4 Kết luận 77

4 NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO CẢM BIẾN MIỄN DỊCH ĐIỆN HÓA TÍCH HỢP BÌNH

PHẢN ỨNG MINI ỨNG DỤNG TRONG PHÁT HIỆN VIRUS NEWCASTLE 78

4.1 Mở đầu 78

4.2 Thực nghiệm 80

4.2.1 Hóa chất 80

4.2.2 Thiết kế và chế tạo hệ điện cực tích hợp bình phản ứng mini 81

4.2.3 Cố định kháng thể trên bề mặt cảm biến 82

4.2.4 Phát hiện virus (bất hoạt) sử dụng cảm biến miễn dịch điện hóa 83

4.2.5 Thống kê và xử lý số liệu 83

4.3 Kết quả va ̀ thảo luâ ̣n 84

4.3.1 Đặc tuyến điện hóa của hệ ba điện cực sử dụng điện cực so sánh thay thế đã chế tạo 84

4.3.2 Đặc trưng tín hiệu cố định kháng thể 87

4.3.3 Đặc trưng tín hiệu tương tác virus - kháng thể 91

4.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến tín hiệu ra của cảm biến miễn dịch 92

4.3.4.1 Ảnh hưởng của nồng độ kháng thể 92

4.3.4.2 Ảnh hưởng của thời gian bắt cặp kháng thể - virus 95

4.3.5 Độ nhạy của cảm biến miễn dịch 97

4.4 Kết luận 100

KẾT LUẬN CHUNG 101

DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN 103

TÀI LIỆU THAM KHẢO 104

i

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

TT Viết tắt Từ tiếng Anh đầy đủ Nghĩa tiếng Việt

6 BSA Bovine serum albumin Albumin huyết thanh bò

8 CV Cyclic Voltammetry Phương pháp Von-Ampe vòng

9 DPV Diffirential Pulse

Voltammetry

Vi sai xung Voltammetry

10 EID50 50 % Empryo infective dose Liều nhiễm trùng trên phôi (gà)

11 EIS Electrochemical impedance

spectroscopy

Phổ tổng trở điện hóa

12 FE-SEM Field Emision Scanning

Electron Microscope

Hiển vi điện tử quét phát xạ trường

13 ELISA Enzyme linked immuno

sorbent assay

Kỹ thuật miễn dịch hấp phụ gắn men

14 FTIR Fourier transform infrared

spectroscopy

Phổ hồng ngoại biến đổi Fourier

17 HIV Human immunodeficiency

virus

Virus gây suy giảm miễn dịch cho người

18 HPV Human papillomavirus Virus gây ung thư cổ tử cung

19 IUPAC International Union of Pure

and Applied Chemistry

Hiệp hội Hóa Tinh khiết và Ứng dụng Quốc tế

20 ISFET Ion sensitive field effect

transistor

Transistor hiệu ứng trường nhạy ion

21 ITO Indium tin oxide Oxit thiếc - Indi

23 MPTMS (3-Mercaptopropyl)

trimethoxysilane

(3-Mercaptopropyl) trimethoxysilane

24 NHS N-Hydroxysuccinimide N-Hydroxysuccinimide

26 PBS Phosphate buffered saline Dung dịch đệm phosphate

ii

27 PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi polymerase

28 PDMS Polydimethylsiloxane Polydimethylsiloxane

31 PRE Psuedo reference electrode Điện cực so sánh thay thế

32 RE Reference electrode Điện cực so sánh

33 SARS Severe acute respiratory

syndrome

Hội chứng hô hấp cấp tính nặng

34 SEM Scanning electron microscopy Hiển vi điện tử quét

35 SERS Surface Enhanced Raman

Spectroscopy

Phổ Raman Tăng cường bề mặt

36 SWV Square Wave Voltammetry Von-ampe sóng vuông

38 WE Working Electrode Điện cực làm việc

39 WHO World Health Organization Tổ chức y tế thế giới

iii

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Một số kết quả nghiên cứu về cảm biến sinh học điện hóa trên thế giới 9 Bảng 1.2: Một số kết quả nghiên cứu về cảm biến sinh học điện hóa tại Việt Nam 10 Bảng 1.3: Sự phụ thuộc của ∆Ep vào ψ tại nhiệt độ 25 ᵒC khi Eλ = Ep – 112,5/n mV và α =

0,5 43 Bảng 2.1: Trình tự chuỗi đơn DNA 45 Bảng 2.2: Các thông số tổng trở mô phỏng theo mạch tương đương Randles 59 Bảng 2.3: So sánh cảm biến DNA đã chế tạo với một số cảm biến DNA trong những công

bố khác 59 Bảng 3.1: So sánh cảm biến DNA tích hợp vi kênh PDMS chế tạo được với một số cảm biến

DNA trong những công bố khác 76 Bảng 4.1: Số lượng gia súc, gia cầm 01.10.2014 78 Bảng 4.2: Qui trình chế tạo điện cực vàng WE và CE tích hợp 81 Bảng 4.3: Các thông số điện hóa thu được từ kết quả đo CV sử dụng hệ ba điện cực với điện

cực so sánh tự chế tạo và điện cực so sánh thương mại 85 Bảng 4.4: Các giá trị Ip,a, Ip,c, Ipeak thu được từ kết quả đo CV đối với điện cực vàng (WE)

sau mỗi bước cố định kháng thể 89 Bảng 4.5: Các giá trị Ip,a, Ip,c, Ipeak và ∆Ipeak thu được từ kết quả đo CV đối với các điện cực

cảm biến miễn dịch và cảm biến miễn dịch/virus Newcastle khi thay đổi nồng độ kháng thể được cố định trên bề mặt cảm biến 93 Bảng 4.6: Các giá trị Ip,a, Ip,c, Ipeak và ∆Ipeak thu được từ kết quả đo CV đối với các điện cực

cảm biến miễn dịch và cảm biến miễn dịch/virus Newcastle khi thay đổi thời gian bắt cặp kháng thể - virus 96 Bảng 4.7: Các giá trị Ip,a, Ip,c, Ipeak và ∆Ipeak thu được từ kết quả đo CV đối với các điện cực

cảm biến miễn dịch và cảm biến miễn dịch/virus Newcastle khi thay đổi hàm lượng virus Newcastle 98 Bảng 4.8: So sánh kết quả dò tìm virus gây bệnh của một số loại cảm biến miễn dịch 99

iv

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1: a) Thống kê công bố khoa học sử dụng kỹ thuật “phân tích điện hóa”; (b) Thống

kê công bố theo thời gian Nguồn www.sciendirect.com 6

Hình 1.2: Thống kê công trình công bố về “phân tích điện hóa ứng dụng trong y sinh” từ năm 2010 trở lại đây Nguồn www.sciencedirect.com 7

Hình 1.3: Nguyên lý hoạt động của cảm biến sinh học 8

Hình 1.4: Đường chronoamperometric của quá trình tổng hợp dây nano PPy trên điện cực Ni (−) và điện cực ITO ( -) 15

Hình 1.5: Polaron, bipolaron và sự hình thành các dải năng lượng tương ứng 19

Hình 1.6: Cấu trúc của chuỗi geletin 20

Hình 1.7: Cấu trúc và sự lai hóa của phân tử DNA 22

Hình 1.8: (a) Cấu trúc kháng thể IgG;(b) tương tác kháng nguyên - kháng thể 23

Hình 1.9: Tương tác tĩnh điện giữa điện tích dương của PPy và điện tích âm của DNA… 25 Hình 1.10: Gắn kết kháng thể trên nền Si/SiO2 26

Hình 1.11: Cố định DNA trên nền CS/Fe3O4/SPE 27

Hình 1.12: Quy trình chế tạo điện cực dC-PPy-PVS/Pt 28

Hình 1.13: a) Công thức hóa học của biotin; b) Sơ đồ cấu trúc liên kết giữa biotin – avidin 29

Hình 1.14: Quy trình chế tạo điện cực BdC-avidin-PPy-PVS/Pt 29

Hình 1.15: Quy trình cố định kháng thể lên điện cực vàng và phát hiện kháng nguyên virus cúm A H5N1 30

Hình 1.16: Quy trình cố định kháng thể cho cảm biến miễn dịch điện hóa nhằm phát hiện kháng nguyên Carcinoembryonic (CEA) 31

Hình 1.17: (A): điện cực vàng tích hợp; (B): vi kênh 32

Hình 1.18: (A): cảm biến điện hóa ba điện cực trên PDMS sau khi AgCl (màu đen) hình thành; (B): hệ lab-on-a-chip tích hợp với cảm biến điện hóa ba điện cực 33

Hình 1.19: Sơ đồ khối mô phỏng nguyên lý đo tổng trở 34

Hình 1.20: Biểu diễn vector Fresnel trong mặt phẳng phức 35

Hình 1.21: Tập hợp các điểm M vẽ nên một đường phổ tổng trở (dạng Nyquist) đặc trưng cho hệ khảo sát 35

Hình 1.22: Đồ thị tổng trở ở vùng tần số thấp 36

Hình 1.23: Đồ thị tổng trở ở vùng tần số cao 37

Hình 1.24: Sơ đồ biểu diễn tổng trở trên mặt phẳng phức 37

Hình 1.25: Mạch điện tương đương Randles 38

Hình 1.26: Hê ̣ đo vi sai sử du ̣ng Lock-in Amplifier SR830 DSP 39

Hình 1.27: Dạng sóng từ bô ̣ khuếch đa ̣i Lock-in 39

Hình 1.28: Sơ đồ mạch tương đương của hệ đo vi sai 40

Hình 1.29: (a) Quét thế tuyến tính; (b) Quan hệ dòng thế trong phương pháp quét thế tuyến tính 41

v

Hình 1.30: Thời điểm và điện thế bắt đầu quét thế ngược lại (λ và Eλ) 42

Hình 1.31: Quan hệ giữa điện thế và dòng điện trong quét thế vòng tuần hoàn 42

Hình 2.1: (A): quy trình chế tạo rút gọn; (B): điện cực dùng làm cảm biến 46

Hình 2.2: Sơ đồ hệ điện hóa ba điện cực 47

Hình 2.3: Quy trình cố định trực tiếp DNA dò lên cảm biến sinh học trên cơ sở dây nano polypyrrole và phát hiện hiện tượng lai hóa DNA 47

Hình 2.4: Đường CV khảo sát đặc tuyến điện hóa của hệ điện cực Pt tích hợp trong dung dịch K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6 0,03 M, KCl 0,1 M, tốc độ quét 50 mV/s 48

Hình 2.5: Đường CV tổng hợp PPy trong LiClO4 0,1 M, PBS, 0,08 %wt gelatin và Py 0,1 M 49

Hình 2.6: Đường chronoamperometric tổng hợp PPy trong Py 0,1 M, LiClO4 0,1 M, PBS và: (a) 0 %wt gelatin; (b): 0,08 %wt gelatin 50

Hình 2.7: Ảnh FE-SEM của PPy được tổng hợp trong pyrrole 0,1 M, LiClO4 0,1 M, PBS và:(a) 0 %wt gelatin; (b): 0,08 %wt gelatin Thời gian tổng hợp PPy là 300s 51

Hình 2.8: Đường chronoamperometric tổng hợp PPy trong LiClO4 0,1 M, PBS, 0,08 %wt gelatin và Py: (a): 0,05 M; (b): 0,1 M và (c): 0.15 M 51

Hình 2.9: Ảnh FE-SEM của PPy được tổng hợp trong LiClO4 0,1 M, PBS, 0,08 %wt gelatin và Py: (a): 0,05 M; (b): 0,1 M và (c): 0.15 M Thời gian tổng hợp PPy là 300s 52

Hình 2.10: Ảnh FE-SEM của PPy được tổng hợp trong LiClO4 0,1 M, PBS, 0,08 %wt gelatin và Py 0,1 M: (a): 150 s; (b): 200 s; (c): 300 s; (d): 400 s 53

Hình 2.11: Phổ FT-IR của dây nano PPy được tổng hợp trong LiClO4 0,1 M, PBS, 0,08 %wt gelatin và Py 0,1 M 54

Hình 2.12: Phổ Raman tăng cường bề mặt của dây nano PPy hình thành trên điện cực Pt 55 Hình 2.13: Phổ tổng trở của điện cực: (a) Pt- PPy NWs; (b): Pt-PPy NWs-DNA dò 56

Hình 2.14: Phổ tổng trở của điện cực Pt-PPy NWs-DNA dò tại các nồng độ DNA đích khác nhau 57

Hình 2.15: Mô hình mạch tương đương Randles được sử dụng trong luận án 58

Hình 3.1: (a): mặt nạ cho chế tạo hệ ba điện cực tích hợp (Mask 1); (b): mặt nạ cho chế tạo khuôn SU-8 (Mask 2); 63

Hình 3.2: Polydimethylsiloxane 63

Hình 3.3: Quy trình chế ta ̣o khuôn SU-8 64

Hình 3.4: Quy trình gắn kết sử du ̣ng chất làm đông 65

Hình 3.5: Quy trình gắn kết sử du ̣ng băng dính 65

Hình 3.6: Hê ̣ đo vi sai sử du ̣ng Lock-in Amplifier SR830 DSP 66

Hình 3.7: Cảm biến ba điện tích hợp sử dụng PRE Pt trong bình phản ứng mini Kích thước của chip là 12 x 15 mm 67

Hình 3.8: Kết quả đo bề dày vi kênh PDMS phu ̣ thuô ̣c vào tốc đô ̣ quay phủ SU-8 3050 67

Hình 3.9: Kiểm tra kết quả gắn kết vi kênh PDMS và điê ̣n cực sử du ̣ng dung di ̣ch xanh metilen 68

vi

Hình 3.10: Kiểm tra chất lượng gắn kết vi kênh PDMS và điê ̣n cực bằng lực cơ ho ̣c: (a)-

phương pháp plasma oxi và phương pháp sử du ̣ng chất đóng rắn; (b)-phương pháp sử du ̣ng băng dính 69 Hình 3.11: Sự hình thành nhóm –OH trên bề mặt vi kênh PDMS sau khi được xử lý trong

buồng plasma oxy 69 Hình 3.12: Đường CV đo trong dung dịch: (a): K3Fe(CN)6 0,03 M; (b): K4Fe(CN)6 0,03 M;

(c): K3Fe(CN)6 /K4Fe(CN)6 0,03 M, trong KCl 0,1 M, tốc độ quét 25 mV/s củ a hê ̣

ba điê ̣n cực Pt tích hợp trong vi bình phản ứng 70 Hình 3.13: Ảnh FE-SEM của dây nano PPy đươ ̣c tổng hợp trong vi bình phản ứng sử dụng

kỹ thuâ ̣t điê ̣n hoá: (a) phân cực thế tĩnh (0,5 V, 1200 s);(b) quét thế vòng tuần hoàn (0-0,6V, 6 vòng, tốc đô ̣ quét 25 mV/s) 71 Hình 3.14: Ảnh FE-SEM của các sản phẩm được tổng hợp điện hóa sử dụng kỹ thuật phân

cực thế tĩnh (0,5 V, 150 s), dung dịch điện li gồm LiClO4 0,1 M, PBS, gelatin 0,08

% wt và: (a) không có Py; (b) Py 0.1 M trong vi bình phản ứng 72 Hình 3.15: Liên kết hidro giữa monome Py và gelatin 73 Hình 3.16: Đường CV của hệ ba điện tích hợp được đo trong vi bình phản ứng chứa dung

dịch K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6 0,03 M và KCl 0,1 M, tốc đô ̣ quét 25 mV/s: (a) trước

và (b) sau khi tổng hợp điện hóa PPy NWs trên điện cực làm việc 73 Hình 3.17: Phổ FT-IR của dây nano PPy được tổng hợp trong vi bình phản ứng, dung dịch

điện li gồm LiClO4 0,1 M, PBS, 0,08 % wt gelatin và Py 0,1 M 74 Hình 3.18: Tín hiệu lai hóa DNA, CDNA dò = 10 μM, T = 298K: (a) Chuỗi DNA đích 2 nM;

(b) Chuỗi DNA đích không kết cặp 2 nM 75 Hình 3.19: Tín hiệu lai hóa DNA tương ứng với các giá trị nồng độ DNA đích khác nhau 76Hình 4.1: Mô phỏng sơ lược hệ điện hóa mini đi kèm bình phản ứng mini và đầu đo tích hợp 80 Hình 4.2: Hai điện cực vàng tích hợp (WE và CE) 81 Hình 4.3: Bình phản ứng mini kết nối với hệ điện cực 82 Hình 4.4: Đặc tuyến Cyclic Voltammetry của hệ ba điện cực: WE Au, CE Au (tích hợp trên

một chip) và điện cực so sánh thay thế (Ag/AgCl) tự chế tạo bằng cách nhúng dây

Ag vào dung dịch FeCl3 0,1 M trong các khoảng thời gian: (a): 1 phút; (b): 3 phút;

và (c): 5 phút 84 Hình 4.5: Đặc tuyến Cyclic Voltammetry của hệ ba điện cực: WE Au, CE Au (tích hợp trên

một chip) và (a): điện cực so sánh thay thế (Ag/AgCl) tự chế tạo;(b): điện cực so sánh thương mại (Ag/AgCl trong dung dịch KCl bão hòa) 85 Hình 4.6: Đặc tuyến Cyclic Voltammetry của hệ ba điện cực sử dụng điện cực so sánh thay

thế Ag/AgCl và một chíp tích hợp (WE và CE) trong dung dịch

K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6 0,03 M, KCl 0,1 M, tốc độ quét 25 mV/s, thực hiện lặp lại

10 vòng quét 86

vii

Hình 4.7: Đặc tuyến Cyclic Voltammetry của hệ một điện cực so sánh Ag/AgCl và sáu chíp

tích hợp (WE và CE) trong dung dịch K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6 0,03 M, KCl 0,1 M, tốc độ quét 25 mV/s 87 Hình 4.8: Qui trình cố định kháng thể IgY từ trứng gà lên trên bề mặt cảm biến miễn

dịch 88 Hình 4.9: Sự hấp phụ của protein trên vàng 88 Hình 4.10: Đường CV của điện cực: (a): Au; (b): Au/PrA; (c): Au/PrA/GA/Ab và (d):

Au/PrA/GA/Ab/BSA (cảm biến miễn dịch) trong dung dịch

K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6 0,03 M, KCl 0,1 M, tốc độ quét 25 mV/s 89 Hình 4.11: Đường CV của các điện cực Au/PrA/GA/Ab/BSA (cảm biến miễn dịch) khác

nhau (cùng sử dụng một qui trình cố định kháng thể) trong dung dịch

K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6 0,03 M, KCl 0,1 M, tốc độ quét 25 mV/s 90 Hình 4.12: Đường CV của điện cực: (a): cảm biến miễn dịch và (b): cảm biến miễn dịch/virus

Newcastle trong dung dịch K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6 0,03 M, KCl 0,1 M, tốc độ quét

25 mV/s 91 Hình 4.13: Đường CV của điện cực: (a): cảm biến miễn dịch; (b): cảm biến miễn dịch/virus

VNNB trong dung dịch K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6 0,03 M, KCl 0,1 M, tốc độ quét 25 mV/s 92 Hình 4.14: Đường CV của điện cực: (a): cảm biến miễn dịch và (b): cảm biến miễn dịch/virus

Newcastle trong dung dịch K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6 0,03 M, KCl 0,1 M, tốc độ quét

25 mV/s khi thay đổi nồng độ kháng thể được cố định trên bề mặt cảm biến: (A):

20 µg/ml, (B): 30 µg/ml, (C): 40 µg/ml, (D): 50 µg/ml và (E): 60 µg/ml 93 Hình 4.15: Ảnh hưởng của nồng độ kháng thể (được cố định trên bề mặt cảm biến) đến giá

trị ∆Ipeak của cảm biến miễn dịch 94 Hình 4.16: Đường CV của điện cực: (a): cảm biến miễn dịch và (b-f): cảm biến miễn

dịch/virus Newcastle trong dung dịch K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6 0,03 M, KCl 0,1 M, tốc độ quét 25 mV/s khi thay đổi thời gian bắt cặp kháng thể - virus: (b): 15 phút, (c): 30 phút, (d): 45 phút, (e): 90 phút và (f): 60 phút 95 Hình 4.17: Ảnh hưởng của thời gian bắt cặp kháng thể - virus (trên bề mặt cảm biến) đến giá

trị ∆Ipeak của cảm biến miễn dịch 96 Hình 4.18: Đường CV của điện cực: (a): cảm biến miễn dịch và (b-f): cảm biến miễn

dịch/virus Newcastle trong dung dịch K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6 0,03 M, KCl 0,1 M, tốc độ quét 25 mV/s khi thay đổi hàm lượng virus Newcastle: (b):102 EID50/ml, (c):103 EID50/ml, (d):104 EID50/ml, (e):105 EID50/ml và (f):106 EID50/ml 97 Hình 4.19: Sự thay đổi tín hiệu đầu ra của cảm biến miễn dịch (∆Ipeak) phụ thuộc vào hàm

lượng virus Newcastle (log EID50/ml) 98

1

MỞ ĐẦU

Hiện nay, các phương pháp phân tích sinh học phân tử truyền thống (PCR, ELISA…) đang được sử dụng phổ biến, cho kết quả tốt và độ chính xác cao Dẫu vậy, mọi kỹ thuật phân tích tiên tiến đều có những điểm còn chưa hoàn thiện [8,47] cần có hoạt động R&D để nâng cấp hoặc thậm chí thay thế Các phương pháp trên đều phức tạp, yêu cầu kỹ thuật viên

có tay nghề cao, yêu cầu phòng thí nghiệm hiện đại tại những trung tâm nghiên cứu, phân tích trung ương hoặc các thành phố lớn, trong quá trình thực hiện cần phải sử dụng các sinh phẩm và hóa chất đặc hiệu Các phương pháp trên đều cần hàng giờ đến hàng ngày để thực hiện và đặc biệt, các thiết bị phân tích, chẩn đoán không thể dịch chuyển ra khỏi nơi lắp đặt ban đầu [123] Đây cũng là một trong những điểm tồn tại cần được giải quyết khi thực hiện các chiến dịch phân tích lưu động Việc nghiên cứu và phát triển những kỹ thuật phân tích

có khả năng bổ sung, thậm chí thay thế một phần những kỹ thuật phân tích truyền thống là thực sự cần thiết Trong số đó cảm biến sinh học là một trong những thiết bị được kỳ vọng thay thế một phần các kỹ thuật phân tích truyền thống nhờ khả năng ứng dụng rộng rãi trong phát hiện virus gây bệnh, chẩn đoán lâm sàng, giám sát môi trường, phân tích độc học trong thực phẩm…[60,92]

Hiệp hội quốc tế về hóa học ứng dụng – IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry) năm 1999 định nghĩa: Cảm biến sinh học (biosensor) là thiết bị tích hợp có khả năng cung cấp thông tin phân tích định lượng hoặc bán định lượng đặc trưng, bao gồm một phần tử nhận biết sinh học (bioreceptor) kết hợp trực tiếp với một phần tử chuyển đổi (transducer) Phần tử nhận biết sinh học có thể là DNA, tế bào, enzyme , giữ vai trò dò tìm đối tượng đích trong mẫu phân tích Mẫu phân tích có thể là mẫu máu, mẫu nước tiểu hay vi khuẩn, virus Nguyên lý hoạt động của cảm biến sinh học là dựa trên các phản ứng đặc hiệu: kháng nguyên- kháng thể (cảm biến miễn dịch), lai hóa DNA (cảm biến DNA) hoặc enzym- cơ chất (cảm biến enzym)… Khi diễn ra tương tác sinh học đặc hiệu giữa phần tử nhận biết sinh học và đối tượng đích, phần tử chuyển đổi giữ vai trò chuyển đổi tương tác sinh học thành tín hiệu điện hóa, quang, nhiệt… sau đó đưa qua bộ phận xử lý tín hiệu và hiển thị kết quả đo Có nhiều dạng chuyển đổi như chuyển đổi điện hóa, chuyển đổi quang, chuyển đổi nhiệt … Trong đó, cảm biến sinh học trên cơ sở chuyển đổi theo nguyên lý điện hóa có khả năng ứng dụng lớn trong phân tích các đối tượng y sinh vì những ưu điểm nổi bật như thời gian phân tích nhanh, độ nhạy và độ chọn lọc cao, thiết bị nhỏ gọn, sử dụng đơn giản, chi phí thấp

Cảm biến sinh học điện hóa hoạt động dựa trên kết quả khảo sát những thay đổi về đặc tính điện hóa khi diễn ra tương tác sinh học giữa phần tử dò và phần tử đích trên bề mặt cảm biến Tuy nhiên, khi nồng độ phần tử đích rất nhỏ, tương tác sinh học chỉ làm thay đổi một phần rất nhỏ tín hiệu điện hóa trên bề mặt của màng sinh học (nơi gắn kết phần tử dò) Vì vậy, để phát triển thành công một bộ cảm biến sinh học điện hóa không những phụ thuộc vào việc nghiên cứu thiết kế và chế tạo điện cực, phương pháp biến tính bề mặt điện cực

2

nhằm nâng cao hiệu quả của qui trình cố định phần tử cảm nhận sinh học lên trên bề mặt điện cực mà còn phụ thuộc vào việc xây dựng các qui trình đo lường điện hóa nhằm phát hiện phần tử đích trong mẫu phân tích Để có thể thực hiện được những nhiệm vụ trên, đòi hỏi sự kết hợp đa ngành giữa hóa học, sinh học, vật lý, khoa học vật liệu, điện tử và y

sinh Trong các nghiên cứu về cảm biến sinh học điện hóa ứng dụng trong phân tích y sinh,

vấn đề giảm thể tích mẫu phân tích, đồng thời cải thiện tỷ lệ tín hiệu/nhiễu luôn là thách thức đặt ra cho các nhóm nghiên cứu Cảm biến sinh học điện hóa được tích hợp với hệ vi lưu hay một vi bình phản ứng sẽ giúp thu nhỏ hệ thống phân tích Hơn nữa, cảm biến sinh học điện hóa tích hợp với bình phản ứng mini còn là bước khởi đầu quan trọng trong mục tiêu hướng tới chế tạo và phát triển một hệ thống phân tích điện hóa cầm tay, sẽ giúp giải quyết những nhược điểm của các phương pháp phân tích y sinh truyền thống và giữ vai trò quan trọng trong việc thực hiện các nhiệm vụ phân tích lưu động Đây là vấn đề nghiên cứu còn mới và đang thu hút được sự quan tâm của các nhóm nghiên cứu tại Việt Nam

Vì những lí do trên, chúng tôi quyết định thực hiện luận án: “Nghiên cứu phát triển

cảm biến sinh học điện hóa trên cơ sở dây nano polypyrrole tích hợp hệ vi lưu” Mục tiêu của luận án:

Mục tiêu của luận án là nghiên cứu chế tạo và tích hợp cảm biến sinh học điện hóa và vi bình phản ứng ứng dụng trong phát hiện các thành phần sinh học, bao gồm: 01) biến tính bề mặt cảm biến sử dụng vật liệu có cấu trúc nano nhằm nâng cao hiệu quả cố định các phần tử cảm nhận sinh học lên bề mặt cảm biến; 02) tích hợp hệ điện cực với vi bình phản ứng nhằm thu nhỏ hệ thống phân tích, giảm lượng mẫu tiêu thụ và 03) phát triển và tùy biến qui trình

đo lường điện hóa sử dụng cảm biến sinh học không đánh dấu nhằm phát hiện các thành phần sinh học

Cách tiếp cận, phương pháp nghiên cứu:

Phương pháp nghiên cứu của luận án là nghiên cứu thực nghiệm Cách tiếp cận trong quá trình nghiên cứu là từ các kết quả thực nghiệm, kết hợp với lý thuyết và các tài liệu tham khảo, giải thích, so sánh, đánh giá và tối ưu qui trình thực nghiệm

Nội dung của luận án:

Để giải quyết được mục tiêu của đề tài, luận án tập trung nghiên cứu 3 nội dung: Nội dung nghiên cứu 1: Nghiên cứu chế tạo cảm biến DNA điện hóa trên cơ sở dây nano polypyrrole Trong nội dung nghiên cứu 1, mục tiêu của NCS là làm quen với các kỹ thuật điện hóa được thực hiện trong một hệ đo mở, các phép đo điện hóa không sử dụng các điện cực thương mại mà trên cơ sở các điện cực tự thiết kế và phát triển, vật liệu thể mềm cấu trúc nano (dạng dây) được chế tạo giữ vai trò làm lớp vật liệu trung gian giữa bề mặt cảm biến và bộ chuyển đổi, giúp nâng cao hiệu quả cố định thành phần cảm nhận sinh học lên bề mặt cảm biến, DNA được lựa chọn làm đối tượng đo nhờ độ bền, độ ổn định cao và dễ đặt mua Nội dung nghiên cứu 1 bao gồm: nghiên cứu tổng hợp dây nano polypyrrole trên điện cực Pt sử dụng kỹ thuật điện hóa nhằm biến tính bề mặt cảm biến; nghiên cứu cố định DNA

là mẫu máu, vi khuẩn, virus… Nội dung nghiên cứu 2 bao gồm: nghiên cứu thiết kế, chế tạo

và gắn kết hệ ba điện cực tích hợp Pt và vi kênh PDMS; nghiên cứu tổng hợp điện hóa dây nano polypyrrole bên trong vi bình phản ứng nhằm cố định DNA trong chế tạo cảm biến DNA điện hóa tích hợp với hệ vi lưu; nghiên cứu đặc trưng tín hiệu lai hóa DNA dò – DNA đích của cảm biến DNA điện hóa tích hợp hệ vi lưu đã chế tạo với các phép đo điện hóa được thực hiện trong hệ đóng

Nội dung nghiên cứu 3: Nghiên cứu chế tạo cảm biến miễn dịch điện hóa tích hợp bình phản ứng mini ứng dụng trong phát hiện virus Newcastle Sau khi hoàn thành nội dung nghiên cứu 2 với các qui trình đo lường điện hóa được thực hiện trong một bình điện hóa thu nhỏ, trong nội dung nghiên cứu 3 luận án sẽ tiến gần thêm một bước đến ứng dụng thực tiễn Các kết quả đạt được của luận án dự kiến sẽ không chỉ dừng lại ở các bài báo khoa học

mà còn có khả năng hướng đến sự hợp tác với các công ty, các nhà sản xuất Trong nội dung nghiên cứu 3, thay vì sử dụng DNA làm phần tử dò cho cảm biến với qui trình tách chiết phức tạp, đòi hỏi chi phí cao và thời gian dài, luận án sẽ sử dụng kháng thể IgY kháng virus Newcastle chiết xuất trực tiếp từ trứng gà – một sản phẩm đã được bán trên thị trường do công ty cổ phần công nghệ sinh học thú y BTV (Biotech-Vet) cung cấp, tương lai hướng đến việc đánh giá chất lượng kháng thể theo đơn đặt hàng Nội dung nghiên cứu 3 bao gồm: nghiên cứu thiết kế, chế tạo và ghép nối hệ ba điện cực sử dụng điện cực so sánh thay thế Ag/AgCl và một bình phản ứng mini; nghiên cứu qui trình cố định kháng thể IgY kháng virus Newcastle chiết xuất trực tiếp từ trứng gà lên trên bề mặt cảm biến sinh học; nghiên cứu ứng dụng cảm biến miễn dịch điện hóa tích hợp bình phản ứng mini đã chế tạo trong phát hiện virus Newcastle

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án:

Nhận thấy các phương pháp phân tích truyền thống đang được áp dụng rộng rãi, có phổ kết quả rộng, độ chính xác cao nhưng đồng thời cũng có nhiều bất cập khi triển khai sử dụng như đòi hỏi đội ngũ kỹ thuật viên có tay nghề cao, thiết bị và sinh phẩm, hóa chất đắt tiền, chỉ tập trung ở các cơ sở phân tích tại các thành phố lớn, trung ương , luận án hướng tới việc phát triển một kỹ thuật phân tích mới trong đó tập trung vào việc làm tăng độ nhạy, độ chọn lọc, làm giảm lượng mẫu phân tích và thời gian phân tích

Luận án tập trung vào phát triển cảm biến sinh học dựa trên cơ sở thông tin di truyền (DNA) và kháng thể của vật chủ, sử dụng kỹ thuật đo lường điện hóa Để phát triển cảm biến sinh học điện hóa, trước tiên, luận án đã tập trung nghiên cứu thiết kế và chế tạo các điện

4

cực khác với điện cực truyền thống Bề mặt điện cực sau đó được biến tính trên cơ sở lớp vật liệu trung gian với cấu trúc nano Trên bề mặt phân cách giữa dung dịch chứa mẫu phân tích và màng sinh học có cấu trúc nano, các tính chất hóa lý diễn ra có phần khác so với những tính chất đó ở các điện cực truyền thống Các kỹ thuật quét thế vòng, thế không đổi, tổng trở và kỹ thuật đo vi sai đã được triển khai để nghiên cứu các tính chất điện hóa tại đây Đối với việc phát triển cảm biến sinh học điện hóa ứng dụng trong phát hiện các thành phần sinh học, vấn đề giảm thể tích mẫu phân tích, thu nhỏ hệ thống phân tích có ý nghĩa quan trọng Luận án đã tập trung nghiên cứu các kỹ thuật đo lường điện hóa trong một vi bình phản ứng có thể tích rất nhỏ thay vì thực hiện các phép đo trong hệ mở

Những đóng góp mới của luận án:

Một trong những đóng góp mới của luận án là đã tổng hợp được vật liệu polime dẫn polypyrrole (PPy) với cấu trúc dây nano nhằm mục đích biến tính bề mặt cảm biến, nâng cao hiệu quả cố định thành phần cảm nhận sinh học Dây nano PPy được tổng hợp trực tiếp trên điện cực làm việc (WE), sử dụng kỹ thuật polime hóa điện hóa, khắc phục được tình trạng vật liệu PPy được tạo thành dưới dạng đảo, có cấu trúc hoa súp lơ Đặc biệt, việc tổng hợp thành công vật liệu PPy có cấu trúc nano tại chính xác một vị trí mong muốn bên trong vi bình phản ứng (thể tích 4 µl) là một thách thức mà cho đến thời điểm hiện tại, rất ít nhóm nghiên cứu trên thế giới làm được Hiện nay, số lượng công trình công bố quốc tế liên quan đến việc tổng hợp cấu trúc nano bên trong hệ tích hợp vẫn còn rất hạn chế

Bên cạnh đó, việc sử dụng kháng thể IgY kháng virus Newcastle chiết xuất trực tiếp từ trứng gà làm phần tử dò cho cảm biến miễn dịch cũng là một trong những đóng góp mới của luận án

Luận án cũng đã góp phần quan trọng trong việc thiết kế, chế tạo và gắn kết bình phản ứng kích thước nhỏ tích hợp hệ điện cực có khả năng ghép nối với mạch đo, trên cơ sở đó làm giảm lượng mẫu phân tích, làm tăng tỷ lệ tín hiệu/nhiễu khi đo lường Hiện tại, đây là vấn đề nghiên cứu còn mới tại Việt Nam

Thêm một đóng góp mới của luận án, đó là việc phát triển và tùy biến các qui trình đo lường điện hóa được thực hiện trong một bình điện hóa thu nhỏ sử dụng cảm biến sinh học không đánh dấu nhằm phát hiện các phần tử sinh học: DNA và virus Newcastle

Ngoài ra, việc làm chủ công nghệ chế tạo cảm biến điện hóa ba điện cực theo phương pháp planar với chất lượng tương đương sản phẩm thương mại hiện nay cũng là một trong những đóng góp thuyết phục của luận án

2 Nghiên cứu chế tạo cảm biến DNA điện hóa trên cơ sở dây nano polypyrrole

3 Nghiên cứu chế tạo cảm biến DNA điện hóa tích hợp hệ vi lưu

5

4 Nghiên cứu chế tạo cảm biến miễn dịch điện hóa tích hợp bình phản ứng mini ứng dụng trong phát hiện virus Newcastle

Kết luận

Các kết quả chính của luận án đã được công bố trong 09 công trình khoa học, trong đó

có 02 bài báo được đăng trên tạp chí chuyên ngành quốc tế ISI, 04 bài báo được đăng trên tạp chí chuyên ngành trong nước và 03 báo cáo tại các hội nghị trong nước và quốc tế

6

1 TỔNG QUAN

1.1 Cảm biến sinh học điện hóa

1.1.1 Phân tích điện hóa

Đứng trước nhu cầu rất cao của xã hội, việc phát triển một hệ thống phân tích đáp ứng được đầy đủ các yêu cầu như thời gian phân tích nhanh, độ chính xác, độ chọn lọc, độ nhạy cao, thiết bị đơn giản, chi phí thấp là hết sức cần thiết Các phương pháp phân tích truyền thống như phân tích thể tích, phân tích khối lượng sử dụng thiết bị đơn giản, có sẵn ở các phòng thí nghiệm, chi phí phân tích hợp lý nhưng hạn chế của các phương pháp trên là chỉ

áp dụng được với hàm lượng mẫu lớn, thời gian phân tích kéo dài, độ nhạy, độ chọn lọc không cao, nhiều yếu tố gây nhiễu, sai số [3] Một bước tiến quan trọng của các phương pháp phân tích hiện đại như phương pháp quang phổ [4], phương pháp sắc kí [3], phương pháp phân tích điện hóa (độ dẫn điện, điện thế, cực phổ, điện lượng, vol ampe…) [11] là cho phép phân tích những lượng mẫu nhỏ với độ nhạy, độ lặp, độ chọn lọc, độ chính xác, độ tin cậy cao và thời gian phân tích nhanh [3]

Trong các phương pháp phân tích hiện đại, phân tích điện hóa luôn là đề tài hấp dẫn các nhà khoa học trong nhiều thập kỷ liên tiếp Phương pháp phân tích điện hóa đã được hình thành từ thế kỉ 19 và cho đến nay vẫn không ngừng phát triển và hoàn thiện Ưu điểm lớn của phương pháp là ở chỗ khi hệ đo chịu tác động điện (dòng, thế) thì đáp ứng nhận được cũng là tín hiệu điện Đặc điểm nổi bật của phương pháp phân tích điện hóa là độ nhạy và

độ chọn lọc cao, không đòi hỏi thể tích dung dịch lớn (nhỏ hơn 1 ml) [11] Thành công của

kỹ thuật điện hóa được thể hiện trong nhiều lĩnh vực như hóa học, sinh học, thực phẩm, dược phẩm, y học, quốc phòng, khoa học vật liệu, hàng không, môi trường [28,127,130]…Đà tăng trưởng trong nghiên cứu cơ bản, nghiên cứu và phát triển các sản phẩm ứng dụng cho phân tích điện hóa đã phản ánh sự quan tâm sâu sắc của các trung tâm nghiên cứu khoa học hàng đầu, các tập đoàn công nghệ quốc tế

(a) (b)

Hình 1.1: a) Thống kê công bố khoa học sử dụng kỹ thuật “phân tích điện hóa”; (b)

Thống kê công bố theo thời gian Nguồn www.sciendirect.com

Thống kê trên hệ thống sciencedirect.com, hệ thống công bố khoa học lớn nhất hiện nay, với từ khóa “Electrochemical Analysis” (phân tích điện hóa) trong giai đoạn 2010-2016,

7

chúng ta thu được 100.859 công trình công bố trên các tạp chí, 5.308 đầu sách và 1242 sách tham khảo, hình 1.1 (a) Theo thời gian, số lượng và chất lượng công trình công bố tăng rất nhanh, hình 1.1 (b) Tìm hiểu trong thời gian từ 2010 đến tháng 3/2016 tác giả nhận thấy có

sự gia tăng liên tục về số công bố bao gồm tạp chí, sách và sách tham khảo, trong đó có gần 10.000 bài báo trên hệ thống ISI công bố kết quả nghiên cứu kỹ thuật điện hóa dành cho y sinh Đồng thời số sách xuất bản đạt xấp xỉ 1000 cùng với trên 300 sách tham khảo cho riêng phân tích điện hóa trong y sinh, hình 1.2

(a) (b)

Hình 1.2: Thống kê công trình công bố về “phân tích điện hóa ứng dụng trong y sinh” từ

năm 2010 trở lại đây Nguồn www.sciencedirect.com

Trải qua gần một thế kỷ nghiên cứu và phát triển, phân tích điện hóa đã có rất nhiều cải tiến Tuy nhiên, kỹ thuật phân tích điện hóa giờ đây vẫn cần sự hoàn thiện và điều chỉnh cho phù hợp với sự phát triển của khoa học, công nghệ, đặc biệt là công nghệ nano nơi mà kích thước vật liệu, điều kiện biên của bài toán điện hóa thay đổi Nghiên cứu và phát triển kỹ thuật phân tích điện hóa cần được thực hiện ở khâu tối ưu hóa phần mềm, tính toán, thu thập

và xử lý số liệu; phát triển phần cứng: xử lý nhanh hơn, mạnh hơn, tích hợp công nghệ truyền tải dữ liệu; chế tạo đầu đo tích hợp cho phép thu được nhiều thông số; thu nhỏ thể tích mẫu đo; chế tạo hệ thống điện hóa cầm tay

1.1.2 Cảm biến sinh học điện hóa

1.1.2.1 Nhu cầu phát triển cảm biến sinh học

Hiện nay, các phương pháp phân tích sinh học phân tử truyền thống (PCR, ELISA…) đang được sử dụng phổ biến, cho kết quả tốt và độ chính xác cao, tuy nhiên bên cạnh những

ưu điểm cũng thể hiện những nhược điểm [8,40] Các phương pháp trên đều phức tạp, yêu cầu kỹ thuật viên có tay nghề cao, yêu cầu phòng thí nghiệm hiện đại tại những trung tâm nghiên cứu, phân tích trung ương hoặc các thành phố lớn, trong quá trình thực hiện cần phải

sử dụng các sinh phẩm và hóa chất đặc hiệu Các phương pháp trên đều cần hàng giờ đến hàng ngày để thực hiện và đặc biệt, các thiết bị phân tích, chẩn đoán không thể dịch chuyển

ra khỏi nơi lắp đặt ban đầu [123] Đây cũng là một trong những điểm tồn tại cần được giải quyết khi thực hiện các chiến dịch phân tích lưu động Vì vậy, việc nghiên cứu và phát triển những kỹ thuật phân tích có khả năng bổ sung, thậm chí thay thế một phần những kỹ thuật phân tích truyền thống là thực sự cần thiết Cảm biến sinh học là một trong những thiết bị

8

được kỳ vọng có khả năng thay thế một phần các kỹ thuật phân tích truyền thống nhờ những

ưu điểm vượt trội như thời gian phân tích nhanh, độ nhạy tương đối cao, quy trình đơn giản, chi phí thấp [22,24,91] Trong thời gian gần đây, cảm biến sinh học đã và đang thu hút được

sự quan tâm nghiên cứu của nhiều nhà khoa học vì khả năng ứng dụng trong phát hiện virus gây bệnh, chẩn đoán lâm sàng, giám sát môi trường, phân tích độc học trong thực phẩm…

1.1.2.2 Khái niệm cảm biến sinh học và cảm biến sinh học điện hóa

Hiệp hội quốc tế về hóa học ứng dụng – IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry) năm 1999 đã định nghĩa: Cảm biến sinh học (biosensor) là một thiết bị tích hợp

có khả năng cung cấp thông tin phân tích định lượng hoặc bán định lượng đặc trưng, bao gồm một phần tử nhận biết sinh học (bioreceptor) kết hợp trực tiếp với một phần tử chuyển đổi tín hiệu (transducer) Chất được gắn trên bộ phận chuyển đổi được gọi là “phần tử dò/phần tử nhận biết sinh học”, chất cần phân tích trong mẫu được gọi là “phần tử đích” Nguyên lý hoạt động của cảm biến sinh học là dựa trên các phản ứng đặc hiệu: kháng nguyên- kháng thể (cảm biến miễn dịch), lai hóa DNA (cảm biến DNA) hoặc enzym- cơ chất (cảm biến enzym)… Trên cơ sở các phản ứng đặc hiệu này, phần tử nhận biết sinh học giữ vai trò

dò tìm đối tượng đích trong mẫu phân tích và phần tử chuyển đổi giữ vai trò chuyển đổi tương tác sinh học thành tín hiệu điện hóa, quang, nhiệt… sau đó đưa qua bộ phận xử lý tín hiệu và hiển thị kết quả đo, hình 1.3

Hình 1.3: Nguyên lý hoạt động của cảm biến sinh học

Có nhiều dạng chuyển đổi tín hiệu như chuyển đổi điện hóa, chuyển đổi quang, chuyển đổi nhiệt, chuyển đổi bằng tinh thể áp điện hoặc chuyển đổi bằng các hệ vi cơ… Trong đó, cảm biến sinh học trên cơ sở chuyển đổi theo nguyên lý điện hóa có nhiều khả năng ứng dụng trong phân tích các đối tượng y sinh Nguyên lý hoạt động của cảm biến sinh học điện hóa là chuyển các tín hiệu của phản ứng sinh hóa giữa phần tử nhận biết sinh học và phần tử đích trong dung dịch điện ly thành các tín hiệu được nhận biết bởi kỹ thuật điện hóa Các kỹ thuật điện hóa có thể được sử dụng để đánh giá một cách định lượng (theo nồng độ) hoặc định tính (âm tính/dương tính) sự có mặt của các thành phần sinh học (DNA hoặc kháng nguyên/kháng thể…) trong dung dịch Có nhiều phương pháp để đo tín hiệu điện hóa khi có

9

sự tương tác giữa đầu thu sinh học và chất cần phân tích như đo dòng, đo thế, đo độ dẫn và

đo phổ tổng trở…[54]

1.1.2.3 Tình hình nghiên cứu cảm biến sinh học điện hóa trong và ngoài nước

Cảm biến sinh học điện hóa đang là hướng nghiên cứu ưu tiên của nhiều trung tâm nghiên cứu khoa học trong và ngoài nước Với sự phát triển của công nghệ vi điện tử, công nghệ nano và các loại vật liệu mới, khả năng chế tạo và ứng dụng cảm biến sinh học điện hóa đáp ứng nhu cầu của xã hội đang trở nên hiện thực hơn

Bảng 1.1 trình bày một số kết quả nghiên cứu về cảm biến sinh học điện hóa trên thế giới Theo đó, đối tượng phát hiện của cảm biến sinh học điện hóa khá phong phú, có thể là DNA, vi khuẩn, virus, kháng nguyên, kháng thể… Khả năng của cảm biến thể hiện ở giới hạn phát hiện và thời gian đáp ứng (thời gian đáp ứng có thể thay đổi ở các công bố khác nhau nhưng đều chưa đến 1 giờ) So với các phương pháp phân tích truyền thống (PCR, ELISA…), rõ ràng, thời gian phân tích nhanh hơn khi sử dụng cảm biến sinh học là một lợi thế

Bảng 1.1: Một số kết quả nghiên cứu về cảm biến sinh học điện hóa trên thế giới

ĐỐI TƯỢNG

PHÁT HIỆN

KỸ THUẬT PHÁT HIỆN

BIẾN TÍNH BỀ MẶT CẢM BIẾN

KHẢ NĂNG PHÁT HIỆN

THAM KHẢO

GIỚI HẠN PHÁT HIỆN

THỜI GIAN ĐÁP ỨNG

E.Coli

O157:H7 EIS Hyaluronic Acid (HA) 7 cfu/mL - [32] AFP

Bidirectional Stripping Voltammetry

Envision/CdS, Envision/PbS, Envision/Au nanolabels

0,02 pg/mL-0,3 pg/mL

phút [112] Anti-

103

EID50/ml 2 giờ [106]

10

Khoảng hơn mười năm trở lại đây, Việt Nam mới tiếp cận công nghệ cảm biến sinh học nhưng đã đạt được những tiến bộ đáng ghi nhận, bảng 1.2 Đầu tiên là nhóm nghiên cứu cảm biến sinh học của Đại học Bách khoa Hà Nội với những bộ cảm biến để phát hiện dư lượng thuốc trừ sâu, thuốc diệt cỏ và kim loại nặng trong môi trường [119,120] Các chíp sinh học này chủ yếu dựa trên các loại điện cực răng lược, được chức năng hóa bề mặt bằng các loại men (enzyme) có khả năng xúc tác cho các phản ứng thủy phân Trong môi trường có dư lượng thuốc trừ sâu hoặc thuốc diệt cỏ, hoạt tính xúc tác của men sẽ bị suy giảm và sự suy giảm này tỷ lệ với nồng độ của chất gây ô nhiễm Với sự phối hợp với Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, các nhóm nghiên cứu tại Đại học Bách khoa Hà Nội đã phát triển một số chip sinh học phát hiện vật liệu di truyền của virus cúm A [93,95], virus Herpes [94] Những công trình nghiên cứu này được đánh giá cao thông qua số lượng trích dẫn trên các công trình công bố quốc tế Cảm biến dùng trong các công trình này là các điện cực răng lược với kích thước giới hạn phụ thuộc vào khả năng của thiết bị khắc quang có sẵn tại Việt Nam và sử dụng các kỹ thuật đo Lock-in từ Standford Research (USA) Tại Đại học Bách khoa Hà Nội

đã có bốn luận án tiến sĩ được thực hiện liên quan đến lĩnh vực cảm biến sinh học trên cơ sở điện cực, DNA hoặc kháng nguyên/kháng thể và ISFET, DNA ứng dụng phát hiện nhanh virus gây bệnh [1,7,10,12]

Bảng 1.2: Một số kết quả nghiên cứu về cảm biến sinh học điện hóa tại Việt Nam

LOẠI

CẢM BIẾN

ĐỐI TƯỢNG PHÁT HIỆN

BIẾN TÍNH BỀ MẶT CẢM BIẾN

KHẢ NĂNG PHÁT

KHẢO GIỚI HẠN

PHÁT HIỆN

THỜI GIAN ĐÁP ỨNG

DNA điện

hóa Virus cúm A

triethoxy-silance (APTS)

3-aminopropyl-0,5 nM < 4 phút [93] DNA điện

Miễn dịch

điện hóa

Kháng nguyên JEV (Japanese encephalitis virus)

APTES-GA-PrA N/A 5-20 phút [12] DNA điện

Miễn dịch

điện hóa

Kháng nguyên JEV Dây nano polyaniline 10 ng/ml N/A [1] Enzyme

Miễn dịch

điện hóa

Virus HPV (Human papilloma virus)

Polyaniline/MWCNTs 490 pM N/A [76] Enzyme

điện hóa Cholesterol Polyaniline/MWCNTs 0,02 mM N/A [78]

11

Bên cạnh nhóm nghiên cứu tại Đại học Bách Khoa Hà Nội, việc chế tạo cảm biến sinh học ứng dụng trong y sinh cũng thu hút được sự quan tâm của các nhóm nghiên cứu tại các Trung tâm nghiên cứu hàng đầu trong cả nước: nhóm cảm biến sinh học của phòng thí nghiệm nano, Trường Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh với cảm biến sinh học để phát hiện nồng độ glucozơ và axit uric trong máu [39]; nhóm nghiên cứu nano y sinh của Viện Khoa học vật liệu, Viện Khoa học Việt Nam với các cảm biến ezyme xác định nhanh cholesterol trong huyết thanh [78] và cảm biễn miễn dịch xác định sớm ung thư cổ tử cung [76], HIV [75], độc chất aflatoxin trong sản phẩm sữa [23]; Trung tâm Khoa học Vật liệu, Trường Đại học Tự nhiên cùng với các nhóm nghiên cứu về điện tử y sinh tại Trường Đại học Công nghệ, Đại học Quốc Gia Hà Nội cũng đã thực hiện các nội dung nghiên cứu liên quan tới lĩnh vực cảm biến sinh học

1.1.2.4 Tiếp cận phát triển cảm biến sinh học điện hóa

Trên cơ sở tổng quan tình hình nghiên cứu cảm biến sinh học điện hóa trên thế giới và tại Việt Nam, tác giả nhận thấy, đối với việc tiếp cận phát triển cảm biến sinh học điện hóa, các vấn đề được đặt ra có thể là:

Lựa chọn, thiết kế và chế tạo hệ điện cực cho cảm biến sinh học điện hóa có ý nghĩa quyết định tới độ nhạy, chi phí của phép phân tích và khả năng tương thích với các quy trình

cố định Các điện cực được sử dụng cho phát triển cảm biến sinh học điện hóa thường là các kim loại quý như Pt [19], vàng [103,111,115] và một vài dạng của cacbon bao gồm sợi cacbon [41], graphit epoxi [16,114], graphene [72] hoặc cacbon thủy tinh [142]…Việc lựa chọn, thiết kế và chế tạo điện cực phụ thuộc vào năng lực của đội ngũ nghiên cứu và điều kiện cơ sở vật chất kỹ thuật của phòng sạch

Vấn đề thứ hai được quan tâm nghiên cứu là nhằm mục đích tối ưu hóa quy trình cố định phần tử cảm nhận sinh học (DNA hoặc kháng nguyên/kháng thể…) trên bề mặt của cảm biến Để nâng cao hiệu quả cố định phần tử cảm nhận sinh học, bề mặt cảm biến cần được biến tính nhằm tạo ra những nhóm chức có khả năng hình thành các liên kết cộng hóa trị, liên kết hyđrô, hoặc các liên kết yếu Van der Waals [57,75,121,137] Có nhiều phương pháp để biến tính bề mặt cảm biến, một trong những phương pháp đó là sử dụng vật liệu polime dẫn Trong các vật liệu polime dẫn, PPy thường được lựa chọn làm lớp vật liệu trung gian giữa bề mặt cảm biến và bộ chuyển đổi vì polime dẫn PPy đáp ứng được những yêu cầu sau: 1) bám dính tốt với bề mặt bộ chuyển đổi; 2) có độ tương thích sinh học cao, không làm thay đổi cấu trúc và biến tính các phần tử cảm nhận sinh học; và 3) có khả năng truyền tải thông tin tốt từ tương tác sinh học xuống bộ chuyển đổi

Vấn đề thứ ba cũng đang thu hút được sự quan tâm của nhiều nhà khoa học trên thế giới

là nghiên cứu thiết kế, chế tạo và tích hợp hệ vi lưu, vi bình phản ứng với cảm biến sinh học điện hóa nhằm thu nhỏ hệ thống phân tích, giảm lượng mẫu tiêu thụ, đồng thời nâng cao tỉ

lệ tín hiệu/nhiễu của phép đo Sự kết hợp giữa cảm biến sinh học điện hóa và hệ vi lưu được coi là một bước đệm để tiến tới chế tạo các bộ vi phân tích điện hóa cầm tay, giữ vai trò quan

1.2 Biến tính bề mặt cảm biến sinh học điện hóa sử dụng vật liệu polime dẫn polypyrrole

1.2.1 Vật liệu polime dẫn polypyrrole ứng dụng trong chế tạo cảm biến DNA điện hóa

Cảm biến DNA điện hóa hoạt động dựa trên kết quả khảo sát những thay đổi về đặc tính điện hóa khi xuất hiện sự lai hóa đặc hiệu giữa các chuỗi DNA dò và DNA đích Khi nồng

độ chuỗi DNA rất nhỏ, tương tác giữa hai chuỗi DNA chỉ làm thay đổi một phần rất nhỏ tín hiệu điện hóa trên bề mặt của màng sinh học (nơi gắn kết DNA dò), vì vậy hiệu quả truyền tải thông tin điện hóa từ bề mặt cảm biến đến bộ chuyển đổi quyết định độ nhạy của cảm biến DNA Trong đó, kỹ thuật cố định DNA dò lên trên bề mặt cảm biến là một yếu tố quan trọng góp phần cải thiện tỷ lệ tín hiệu/nhiễu Hiện tại chưa có kỹ thuật ổn định để cố định trực tiếp chuỗi DNA dò lên trên bề mặt của điện cực kim loại Nói cách khác, người ta thường phải biến tính bề mặt điện cực bằng cách sử dụng một lớp vật liệu trung gian giữa bề mặt cảm biến và chuỗi DNA Lớp vật liệu trung gian này cần đáp ứng những yêu cầu sau: 1) bám dính tốt với cả bề mặt bộ chuyển đổi và sợi DNA; 2) có độ tương thích sinh học, không làm thay đổi cấu trúc và biến tính sợi DNA; và 3) làm tăng hiệu quả quá trình truyền tải thông tin từ tương tác sinh học xuống bộ chuyển đổi Trong các công trình đã công bố của Trường Đại học Bách khoa Hà Nội, một số kỹ thuật cố định sợi DNA lên trên bề mặt cảm biến sau khi thực hiện quá trình chức năng hóa bề mặt [88,89] đã góp phần cải thiện rất nhiều độ nhạy của cảm biến sinh học Tuy nhiên, những kết quả này vẫn cần được tiếp tục nghiên cứu để đơn giản hóa quy trình cố định, cải thiện tính năng của cảm biến

Vật liệu polime dẫn, như polypyrrole (PPy), polythiophene và polyanilin thường được lựa chọn trong chế tạo cảm biến sinh học điện hóa [81,85], với vai trò làm lớp vật liệu trung gian giữa cảm biến và bộ chuyển đổi vì vật liệu polime dẫn này đáp ứng đủ ba yêu cầu kể trên, do đó góp phần làm tăng độ nhạy, độ chính xác, độ ổn định của cảm biến sinh học [86] Trong các vật liệu polime dẫn, PPy được nhận định là thích hợp ứng dụng trong cảm biến sinh học điện hóa nhờ khả năng tạo ra cấu trúc nano với diện tích bề mặt lớn, khả năng tạo liên kết tốt với đối tượng sinh học, khả năng biến tính để điều khiển độ dẫn [55], do đó góp

1.2.2 Tổng hợp vật liệu polime dẫn polypyrrole sử dụng kỹ thuật điện hóa

Năm 1916, PPy lần đầu tiên được tổng hợp bởi sự oxi hóa pyrrole bằng H2O2, cho sản phẩm dạng bột vô định hình gọi là “pyrrole đen”, sản phẩm này không tan trong nước và các dung môi hữu cơ Pyrrole đen có thể được điều chế với sự có mặt của nhiều tác nhân oxi hóa khác nhau như hiđro peoxit trong dung môi axit axetic, chì đioxit, sắt (III) clorua, bạc nitrat, (NH4)2S2O8 trong dung dịch axit HCl 0,1 M, quinolin hay ô-zôn [26,51,59,82,83,135] Các phương pháp điều chế hóa học sử dụng tác nhân oxi hóa là axit hay peoxit chủ yếu cho ra sản phẩm là các vật liệu cách điện ở nhiệt độ phòng (có độ dẫn điện khoảng 10-10 - 10-11 S/cm) Khi

sử dụng tác nhân oxi hóa là các muối của ion kim loại chuyển tiếp có tính oxi hóa như FeCl3, Fe(NO3)3, Fe(ClO4)3, Fe2(SO4)3, CuCl2… PPy thu được có độ dẫn điện khoảng 10-5 - 200 S/cm

NH

NH

nn

Phương pháp hoá học dùng để tổng hợp PPy có ưu điểm là đơn giản, phản ứng cho hiệu suất cao Tuy nhiên, hạn chế của phương pháp này là có rất ít chất oxi hoá vừa có khả năng oxi hóa monome, vừa có khả năng đóng vai trò là chất pha tạp thích hợp Polime thu được bằng phương pháp tổng hợp này thường dưới dạng bột và có độ dẫn điện không cao [51,59,83]

Đối với nghiên cứu chế tạo cảm biến, chíp sinh học trên cơ sở vật liệu polime dẫn, tổng hợp điện hóa được đánh giá là phương pháp hiệu quả trong chế tạo cảm biến thông qua việc vật liệu polime dẫn được tổng hợp trực tiếp lên trên bề mặt của điện cực [36] Phương pháp điện hóa cho phép điều khiển được tốc độ phản ứng, có khả năng tạo sản phẩm là các sợi nano polime dẫn với kích thước đồng đều, và được cho là sẽ dễ dàng hơn trong cố định thành phần sinh học và khâu tính toán, xử lý số liệu so với khi sử dụng vật liệu polime dạng bột hay màng mỏng Tổng hợp vật liệu polime dẫn bằng phương pháp điện hóa cho phép phát triển những cảm biến sinh học nhỏ gọn, độ đồng nhất cao, với các tính năng như độ nhạy,

độ đáp ứng, độ lặp lại vượt trội so với với các cảm biến sử dụng loại polime khối truyền thống hay màng mỏng thông thường Trong khuôn khổ luận án này, tác giả tập trung bàn luận về lý thuyết cơ bản và một số kỹ thuật điện hóa trong tổng hợp vật liệu polime dẫn cấu trúc dây nano, phục vụ nghiên cứu và phát triển cảm biến y sinh

1.2.2.1 Cơ chế của quá trình polime hóa pyrrole sử dụng kỹ thuật điện hóa

Quá trình polime hóa pyrrole tuân theo cơ chế sau [146]:

Sự oxi hóa monome, hình thành cation gốc:

14

Cation gốc cặp đôi với một cation gốc khác cho ra một đi-cation Đi-cation này trải qua

phản ứng đề proton hóa (loại bỏ H+) để cho ra một đi-me trung hòa:

Đime trung hòa này bị oxi hóa thành một cation gốc, sau đó cặp đôi với các cation gốc

khác dẫn đến sự phát triển mạch:

1.2.2.2 Một số kỹ thuật điện hóa được sử dụng để tổng hợp polime dẫn

Kỹ thuật điện hóa thường được sử dụng để tổng hợp vật liệu polime dẫn có thể là kỹ

thuật quét thế vòng, phân cực dòng tĩnh và phân cực thế tĩnh

a Kỹ thuật quét thế vòng (CV - Cyclic Voltammetry)

Nguyên lý cơ bản của kỹ thuật CV là đặt một điện thế biến đổi tuần hoàn vào điện cực

làm việc (working electrode) và đo sự biến đổi (mật độ) dòng điện tương ứng Điện thế đặt

vào điện cực làm việc được so sánh với một điện cực chuẩn (reference electrode), phụ thuộc

vào điện thế E1 (initial potential), điện thế E2 (final potential) và vận tốc quét v (V/s) Điện

thế phân cực được quét tuyến tính theo thời gian một cách tuần hoàn từ E1 đến E2 và quay

lại với vận tốc quét không đổi Dòng điện hồi đáp I được ghi lại, từ điện thế quét và dòng

điện thu được có thể xây dựng đồ thị I - E

Khi sử dụng kỹ thuật CV để tổng hợp vật liệu, đặc điểm, hình dáng của đường cong CV

cũng như sự thay đổi của nó khi có những biến đổi của các thông số nhiệt động học liên

quan: tốc độ quét, nồng độ chất điện li, pH dung dịch … cho phép thu được nhiều thông số

hữu ích về quá trình hình thành của vật liệu, quá trình oxi hóa khử, các chất trung gian và

các phản ứng phụ được tạo thành trong quá trình tổng hợp điện hóa Kỹ thuật CV còn được

sử dụng để nghiên cứu tính chất điện hóa cũng như động học và cơ chế phản ứng của chất

nghiên cứu trên điện cực khác nhau

b Kỹ thuật phân cực dòng tĩnh (kỹ thuật áp dòng; GS - Galvanostatic)

15

Dòng điện không đổi được áp lên hệ phản ứng, điện thế phân cực E được đo theo thời gian và thiết lập đồ thị E - t Ưu điểm của phương pháp phân cực dòng tĩnh là có thể ấn

định giá trị điện lượng Q sử dụng trong quá trình tổng hợp polime Trong báo cáo của

Dongtao Ge và cộng sự [38], dây nano PPy đã được tổng hợp trên điện cực Ni và điện cực ITO sử dụng kỹ thuật điện hóa phân cực dòng tĩnh Mật độ dòng điện không đổi được áp lên hệ phản ứng là 1,5 mA.cm−2 và thời gian phản ứng là 150 giây Dung dịch điện ly gồm pyrrole 0,15 M, gelatin 0,02 wt%, PBS (phosphate buffer solution) (pH = 6,86) và LiClO4

0,07 M

Bên cạnh những điểm mạnh của kỹ thuật GS, các nghiên cứu cũng cho thấy việc khống chế các quá trình điện hóa diễn ra trong hệ là không dễ dàng Bên cạnh phản ứng chính tạo thành polime trên điện cực, rất có thể còn diễn ra các quá trình phụ không mong muốn Để

khắc phục nhược điểm này, người ta có thể sử dụng kỹ thuật phân cực thế tĩnh

c Kỹ thuật phân cực thế tĩnh (Kỹ thuật áp thế; PS - Potentiostatic)

Áp điện thế không đổi lên hệ phản ứng và đo dòng phản hồi I theo thời gian, từ những

dữ kiện thu được, xây dựng đồ thị I - t Ưu điểm của phương pháp phân cực thế tĩnh là có thể lựa chọn và giữ không đổi một giá trị điện thế thuận lợi nhất cho quá trình oxi hóa monome để tạo thành polime Trong kỹ thuật này, chúng ta cần lựa chọn giá trị điện thế phù hợp cho quá trình tổng hợp polime dẫn thông qua việc khảo sát đường cong CV của quá trình tổng hợp polime dẫn để tìm ra giá trị điện thế tương ứng với pic oxi hóa monome Bên cạnh giá trị điện thế đặt vào, nồng độ monome, hàm lượng chất pha tạp và thời gian tiến hành phản ứng cũng đồng thời là những yếu tố quyết định đến tính chất của vật liệu polime dẫn được tổng hợp

Hình 1.4: Đường chronoamperometric của quá trình tổng hợp dây nano PPy trên điện cực

Ni (−) và điện cực ITO ( -) [38]

Dongtao Ge và cộng sự [38] đã tổng hợp dây nano PPy trực tiếp trên điện cực Ni và điện cực ITO sử dụng kỹ thuật điện hóa phân cực thế tĩnh, hình 1.4 Giá trị điện thế đặt vào là 0,75 V và thời gian phản ứng là 200 giây Dung dịch điện ly gồm pyrrole 0,15 M, gelatin 0,02 wt%, PBS (phosphate buffer solution) (pH = 6,86) và LiClO4 0,07 M Kết quả cho thấy, dây nano PPy được hình thành trên cả điện cực Ni và ITO

do đó vật liệu làm điện cực phải được lựa chọn đảm bảo không tham gia vào quá trình dẫn tới thay đổi tín hiệu của hệ thống Thêm vào đó, vật liệu làm điện cực cũng phải đảm bảo bền trong cả dung dịch điện ly có môi trường axit, hoặc bazơ; 02) Tương thích sinh học: khác với những cảm biến được ứng dụng trong nghiên cứu môi trường, ngoài yêu cầu trơ hóa học, điện cực dành cho các ứng dụng y sinh cần phải tương thích sinh học, nghĩa là điện cực cần được thiết kế và chế tạo sao cho không làm ảnh hưởng hay biến tính các thành phần sinh học gắn trên đó và; 03) Phải đáp ứng các yêu cầu kỹ thuật trong khâu thu thập và xử lý tín hiệu

Chúng ta có thể sử dụng một hệ hai điện cực bao gồm điện cực làm việc (Working Electrode - WE) và điện cực đối (Counter Electrode - CE) hoặc một hệ ba điện cực bao gồm điện cực làm việc (WE), điện cực đối (CE), và điện cực so sánh (Reference Electrode - RE) Vật liệu được dùng để chế tạo điện cực có thể là các kim loại quý (Au, Pt, ), bán dẫn hoặc phi kim (Si) Điện cực Calomen và điện cực Ag/AgCl thường được sử dụng làm điện cực so

sánh

b Mật độ dòng điện và điện thế

Để tổng hợp PPy, người ta có thể sử dụng phương pháp áp dòng hoặc phương pháp áp thế Giá trị thế hoặc dòng áp đặt ảnh hưởng đến quá trình polime hóa, cấu trúc và các đặc tính của polime Nếu sử dụng phương pháp áp dòng, dòng điện áp đặt thường có mật độ từ

1 đến 70 mA.cm-2 Khi áp dòng có mật độ nhỏ thì PPy tạo ra thường có độ đồng nhất cao hơn khi áp dòng có mật độ lớn Tuy nhiên, tốc độ mọc dây chậm hơn Nếu sử dụng phương pháp áp thế, nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng, đối với quá trình tổng hợp PPy trong dung môi nước điện thế áp đặt nên được lựa chọn trong khoảng từ 0,7 đến 1 V để đảm bảo về tốc độ polime hóa, độ dẫn điện và các đặc tính vật lý, hóa học của polime được tổng hợp [38,42,56] Khi giá trị thế áp đặt lớn hơn 1,1 V, cấu trúc liên kết π liên hợp của polime tổng hợp được có thể bị phá hủy một phần do hiện tượng quá oxy hóa [124,138] dẫn đến làm giảm độ dẫn điện của polime Tuy nhiên, khi giá trị thế áp đặt nhỏ hơn 0,6 V, hiệu quả của quá trình polime hóa sẽ giảm

c Tạp chất doping

Tạp chất doping có mặt trong dung dịch khi tổng hợp polime có thể sẽ trở thành nguồn pha tạp trong sản phẩm polime và ảnh hưởng đến cấu trúc, đặc tính điện hóa của polime dẫn được hình thành Nếu nguồn pha tạp là tác nhân oxi hóa (chất nhận điện tử - doping acceptor) thì polime dẫn được tổng hợp là bán dẫn loại p, ngược lại, nếu nguồn pha tạp là tác nhân khử

17

(chất cho điện tử - doping donor) thì polime dẫn được tổng hợp là bán dẫn loại n Vì vậy việc lựa chọn dung dịch chất điện li là một yếu tố quan trọng trong quá trình tổng hợp polime dẫn sử dụng phương pháp điện hóa

Bên cạnh những yếu tố trên, thời gian phản ứng, nồng độ monome pyrrole, pH của dung dịch điện ly cũng đồng thời ảnh hưởng đến khả năng polime hóa và cấu trúc của sản phẩm polime được hình thành trên bề mặt điện cực

1.2.2.4 Quá trình doping polypyrrole

Thuyết vùng năng lượng có thể giải thích tính dẫn điện của các vật liệu nói chung và các polime dẫn nói riêng [9] Thuyết vùng dựa trên cơ sở của phương pháp MO-LCAO (Molecular Orbitals - Linear Combination of Atomic Orbitals) Các MO được tạo thành bằng sự tổ hợp tuyến tính các AO theo nguyên tắc: 2 AO khi tổ hợp sẽ cho 2 MO (1 MO phản liên kết có năng lượng cao hơn và 1 MO liên kết có năng lượng thấp hơn so với năng lượng của các AO ban đầu) Như vậy, khi có sự tổ hợp của n AO sẽ tạo ra n MO và số AO tham gia tổ hợp càng lớn sẽ tạo thành số MO càng lớn Trong chất rắn, các nguyên tử nằm rất gần nhau, số nguyên tử trong một đơn vị thể tích rất lớn, trong 1 cm3 chất rắn có chứa khoảng 1022 nguyên tử, do đó, số AO tham gia tổ hợp rất lớn tạo thành một số rất lớn các

MO Các MO được sắp xếp rất gần nhau, các mức năng lượng rất gần nhau tạo thành các

“vùng năng lượng” Vùng có năng lượng thấp được gọi là vùng hóa trị và vùng có năng lượng cao được gọi là vùng dẫn Vùng nằm giữa vùng dẫn và vùng hóa trị gọi là vùng cấm

Sự điền điện tử vào các MO trong vùng năng lượng theo chiều năng lượng tăng dần và mỗi

MO được chiếm tối đa bởi 2 điện tử có spin đối song Giá trị E cho biết khả năng di chuyển của các điện tử trong chất rắn từ vùng hóa trị lên vùng dẫn và điều này sẽ quyết định tính dẫn điện của vật liệu Những vật liệu có E > 3 eV như kim cương, polyethylene…

là những vật liệu cách điện do khi được đặt trong điện trường, điện tử không thể chuyển từ vùng hóa trị lên vùng dẫn để tham gia vào quá trình dẫn điện Những vật liệu với E < 0,1

eV có khả năng dẫn điện, khi được đặt trong điện trường điện tử dễ dàng chuyển từ vùng hóa trị lên vùng dẫn và tham gia vào quá trình dẫn điện Những vật liệu có E từ 0,1 - 3 eV

là những vật liệu bán dẫn [6]

Khả năng dẫn điện của polime được giải thích do đặc điểm thứ nhất của polime dẫn là

có hệ liên kết π liên hợp nằm dọc theo chuỗi polime (conjugation bond), - C = C – C = C -, đây là sự nối tiếp của nối đơn C – C và nối đôi C = C; và do đặc điểm thứ hai của polime dẫn là sự hiện diện của chất pha tạp [17] Các polime thuần, chỉ được tạo bởi các monome thuần túy, thường có năng lượng vùng cấm cao, ví dụ polyacetylen, PPy, polyaniline, polythiophene… có ΔE = 1,4 -3,6 eV do đó chúng được xếp vào các vật liệu bán dẫn hoặc vật liệu cách điện Độ dẫn của chúng có thể được cải thiện, làm giảm E, nhờ việc pha tạp các đơn chất hoặc hợp chất trong quá trình tổng hợp

Vật liệu polime dẫn đầu tiên được tổng hợp là polyacetylen (PA) pha tạp I2.Quá trình pha tạp đã làm tăng độ dẫn điện của PA từ 10-5 lên 103 S/cm [14]:

do trong kim loại, khi có một điện thế áp đặt vào thì polaron hay bipolaron sẽ chuyển động Như vậy, polaron và bipolaron là hạt tải điện cho sự truyền điện trong polime dẫn

Sau đó, các nhà khoa học đã nghiên cứu và tìm ra nhiều vật liệu polime dẫn khác như polypyrrole, polyaniline, polythiophene, polyphenyline, poly 2-5 dithienyl pyride Chất pha tạp được lựa chọn tùy thuộc vào từng loại vật liệu polime dẫn cần chế tạo Ví dụ với polyacetylen chất pha tạp có thể là muối halogen của các kim loại: TiCl4, HgCl4, NbCl5, TaCl5, TaBr5, MoCl5, WCl3, TeCl4, TeCl5, TeI4, SnCl4 Với poly (p-phenylene) chất pha tạp

có thể là AuCl3, CuCl2 Với polypyrrole nói riêng và polime dẫn nói chung, các chất pha tạp thường được sử dụng bao gồm:

- Doping acceptor: tạo polime bán dẫn loại p

Halogen: Cl2, Br2, I2, IBr, IF

Lewis axit: PF5, AsF5, SbF5, BF3, BBr3, SO3

Proton axit: HNO3, H2SO4

Hợp chất kim loại chuyển tiếp: FeOCl, TiCl4, TaCl5, MoF5, WF6

Các ion: Cl-, Br-, ClO4-, PF6-, BF4

Doping donor: tạo polime bán dẫn loại n

Kim loại kiềm, kiềm thổ: Li, Na, K, Rb, Ca, Sr, Ba

Các ion: R4N+, R4P+, R4As+

H Chitte và cộng sự [53] đã tổng hợp bột polypyrrole sử dụng phương pháp hóa học, sau đó khảo sát độ dẫn điện của polypyrrole thuần và polypyrrole pha tạp LiClO4 ở nhiệt độ phòng Kết quả cho thấy, độ dẫn điện của polypyrrole thuần là 2,14.10−3 S.cm-1, trong khi

đó, độ dẫn điện của polypyrrole pha tạp LiClO4 là 28,74.10−3 S.cm-1 Mặc dù polypyrrole dạng bột thu được bằng phương pháp tổng hợp hóa học có độ dẫn điện không cao nhưng kết quả trên đã chứng minh rằng sự hiện diện của chất pha tạp LiClO4 giúp tăng độ dẫn điện của polypyrrole

H Chitte và cộng sự [53] cũng đã đề xuất cơ chế của quá trình doping PPy với chất pha tạp A (aceptor), hình 1.5: Khi PPy tiếp cận với A, PPy sẽ nhường một điện tử π cho A dẫn đến trên mạch PPy xuất hiện một lỗ trống mang điện tích dương (+1), đồng thời do sự lôi cuốn điện tử π linh động về phía điện tích +1 dẫn đến xuất hiện một điện tử độc thân có spin

½ cách lỗ trống 3 hoặc 4 đơn vị mắt xích pyrrole được ký hiệu là một dấu chấm (•) A nhận điện tửtrở thành A- Cặp (+ •) được gọi là polaron Sự thành hình của polaron dẫn đến sự thay đổi vị trí của các liên kết π còn lại trong mạch polime, vì vậy làm thay đổi cấu trúc của

19

vòng pyrrole đồng thời tạo ra hai mức năng lượng mới trên vùng cấm Khi số phân tử A xâm nhập vào mạng polime tăng lên, lượng polaron (+ •) cũng tăng lên Khi hai polaron gần nhau (+ •) (+ •), hai điện tử (• •) ghép đôi trở thành liên kết π, còn lại cặp điện tích dương (+ +) được gọi là bipolaron Khi mạch PPy xuất hiện nhiều bipolaron, các mức năng lượng được hình thành của các bipolaron sẽ chồng chập vào nhau tạo thành hai dải năng lượng bipolaron Các dải năng lượng mới được hình thành nằm giữa vùng hóa trị và vùng dẫn, giống như những bậc thang giúp điện tử di chuyển từ vùng hóa trị lên vùng dẫn một cách thuận lợi hơn, khi đó vật liệu trở thành vật liệu dẫn điện Như vậy, khi biến tính polypyrrole sử dụng chất pha tạp aceptor,

sự mất các điện tử trong chuỗi polime sẽ dẫn đến sự hình thành các lỗ trống, do đó polypyrrole được tổng hợp là chất bán dẫn loại p

Hình 1.5: Polaron, bipolaron và sự hình thành các dải năng lượng tương ứng [53]

Quá trình doping polime dẫn có thể được tiến hành theo kỹ thuật pha tạp (doping) điện hóa Polime dẫn được tổng hợp sử dụng kỹ thuật trùng hợp điện hóa, trong đó chất điện li đóng vai trò chất pha tạp (dopant) được đưa vào dung dịch phản ứng Sau quá trình trùng hợp điện hoá, chất pha tạp được phân bố trong mạng polyme nhờ các liên kết hóa, lý Phản

20

ứng theo cơ chế biến tính (hay pha tạp) acceptor sẽ diễn ra ở điện cực dương còn phản ứng theo cơ chế biến tính donor sẽ diễn ra ở điện cực âm Như vậy, quá trình doping loại p (lỗ trống) sẽ diễn ra ở điện cực dương, còn quá trình doping loại n (điện tử) sẽ diễn ra ở điện cực âm:

1.2.2.5 Vai trò của gelatin trong tổng hợp dây nano polypyrrole

Gần đây, để tổng hợp vật liệu dây nano, các nhà khoa học đã nghiên cứu thay thế phương pháp sử dụng “khuôn cứng” bằng một phương pháp mới: phương pháp sử dụng “khuôn mềm”, trong đó một số phân tử hoặc cụm phân tử đóng vai trò là “khuôn mềm” để định hướng sự phát triển của vật liệu cấu trúc nano 1D Ưu điểm của việc sử dụng “khuôn mềm” trong quá trình tổng hợp vật liệu dây nano là sau quá trình tổng hợp có thể dễ dàng loại bỏ

“khuôn mềm”, không cần sử dụng nhiều hóa chất và quy trình phức tạp như khi loại bỏ

“khuôn cứng” [38]

Hình 1.6: Cấu trúc của chuỗi geletin [140]

Gelatin là chất rắn màu trắng đục, không mùi, dễ gãy (khi khô), chứa 84 - 90 % protein,

1 - 2 % muối khoáng và 8 - 15 % nước Gelatin là một polypeptide hòa tan có nguồn gốc từ collagen trong da và xương động vật Gelatin đã được sử dụng rộng rãi trong thực phẩm, dược phẩm và y tế Do sự hiện diện của các nhóm chức đặc trưng như: -NH2, -SH và -COOH, gelatin thể hiện tính tương thích sinh học cao và có thể tạo được liên kết với các phần tử sinh học [140]

21

Trong công bố [38] của D Ge và cộng sự, gelatin đã được sử dụng như một "khuôn mềm" có vai trò định hướng sự hình thành của vật liệu polime dẫn polypyrrole theo cấu trúc nano 1D Gelatin có cấu trúc chuỗi dài gồm nhiều axit amin khác nhau với các nhóm chức -

NH2 và -COOH Các nhóm -NH của monome pyrrole có thể tạo thành liên kết hidro với các nhóm -COOH của gelatin Kết quả là, monome pyrrole được hấp phụ trên bề mặt của chuỗi gelatin và tiếp tục được polime hóa để phát triển thành các dây nano PPy Như vậy, gelatin đóng vai trò như khuôn mềm định hướng cho sự hình thành vật liệu PPy cấu trúc dây nano [38]

Tóm lại, khả năng ứng dụng vật liệu polime dẫn nói chung và PPy nói riêng trong chế tạo cảm biến sinh học điện hóa với vai trò làm lớp vật liệu trung gian giữa bề mặt bộ chuyển đổi và thành phần cảm nhận sinh học đã được chứng minh qua nhiều công trình công bố quốc tế Tuy nhiên, cho đến thời điểm hiện tại, trong nhiều công trình đã công bố, vật liệu polime dẫn PPy chủ yếu được tổng hợp với cấu trúc hoa súp lơ (màng PPy) Số lượng các công trình công bố quốc tế liên quan đến việc tổng hợp và ứng dụng vật liệu PPy cấu trúc dây nano trong chế tạo cảm biến sinh học điện hóa vẫn còn hạn chế Bên cạnh đó, cơ chế của quá trình hình thành dây nano PPy khi có mặt gelatin vẫn đang dừng lại ở mức độ suy luận từ kết quả thực nghiệm [38] Vì vậy, cần được tiếp tục nghiên cứu nhằm thu được những kết quả minh chứng có tính thuyết phục cao hơn Trong luận án này, vật liệu polime dẫn PPy với cấu trúc dây nano được tổng hợp tại chính xác một vị trí mong muốn (trên WE) bằng kỹ thuật điện hóa sử dụng gelatin làm “khuôn mềm” định hướng cho sự phát triển dây nano So sánh với vật liệu PPy cấu trúc hoa súp lơ, vật liệu PPy cấu trúc dây nano với diện tích bề mặt riêng lớn hơn giúp nâng cao hiệu quả cố định các phần tử cảm nhận sinh học lên bề mặt cảm biến, góp phần cải thiện tỷ lệ tín hiệu/nhiễu, nâng cao độ nhạy, độ ổn định của cảm biến sinh học Mặt khác, bên cạnh các nhóm chức có sẵn trong PPy, sự có mặt các nhóm chức có sẵn trong gelatin được cho là cũng góp phần giúp việc gắn kết một số phần tử sinh học (cũng có những nhóm chức sẵn sàng phản ứng với các nhóm chức trên gelatin) sẽ diễn ra dễ dàng hơn Cũng trong luận án này, cơ chế của quá trình hình thành dây nano PPy khi có mặt gelatin sẽ bước đầu được giải thích trên cơ sở một số kết quả minh chứng thu được

1.3 Cố định phần tử cảm nhận sinh học lên cảm biến sinh học điện hóa

1.3.1 DNA và kháng nguyên, kháng thể

1.3.1.1 DNA

Axit deoxyribonucleic (DNA) là đại phân tử mang thông tin di truyền của các tổ chức sống [5] Đơn vị cấu tạo cơ bản của DNA là các nucleotit, mỗi nucleotit bao gồm ba thành phần: gốc phốt phát của axit phôtphoric (H3PO4), phân tử đường deoxyriboza (C5H10O4) và các bazơ nitơ: Purine gồm Adenine (A) và Guanine (G); Pyrimidine gồm Cytosine (C) và Thymine (T), hình 1.7

22

Các bazơ purine và pyrimidine có cấu trúc phẳng, vuông góc với trục dài của chuỗi polynucleotit, khoảng cách trung bình giữa hai bazơ kề nhau là 3,4 Aᵒ Chuỗi polynucleotit xoắn quanh một trục ở giữa, đường kính vòng xoắn là 20 Aᵒ và chiều dài mỗi vòng xoắn là

34 Aᵒ [5] Chuỗi xoắn kép DNA gồm hai chuỗi đơn gắn kết với nhau thông qua các liên kết hyđrô được hình thành giữa các bazơ bổ sung, tạo nên cấu trúc không gian ổn định và bền vững Bazơ A liên kết với T bằng hai liên kết hyđrô và bazơ C liên kết với G bằng ba liên kết hyđrô [5] Trình tự mỗi chuỗi đơn DNA có định hướng với một đầu là 5’ phôtphat tự do

và một đầu là 3’ hydroxit tự do (hướng qui ước là 5’→ 3’) Hướng của hai chuỗi đơn trong chuỗi xoắn kép là ngược nhau và hai chuỗi đơn liên kết với nhau bởi quan hệ bổ sung Chuỗi xoắn kép DNA bị biến tính khi nhiệt độ tăng Nhiệt độ tại đó hai chuỗi đơn DNA tách nhau

ra gọi là nhiệt độ biến tính Tm Sự phụ thuộc của Tm vào số lượng cặp G - C được thể hiện qua công thức [2,145]:

Tm = 69,3 + 0,41(G +C) (1.1)

Hình 1.7: Cấu trúc và sự lai hóa của phân tử DNA

Như vậy Tm tỷ lệ thuận với số lượng cặp G - C có trong phân tử DNA, giá trị Tm thường gặp dao động ở khoảng 85 oC  95 oC Từ nhiệt độ biến tính, hai chuỗi đơn DNA sẽ liên kết lại với nhau để tạo lại chuỗi xoắn kép khi giảm dần nhiệt độ đến một giới hạn nhất định Nói một cách khác, DNA có sự hồi tính Sự hồi tính sẽ không diễn ra nếu giảm nhiệt độ một cách đột ngột từ giá trị Tm do các chuỗi đơn DNA không đủ thời gian để liên kết lại với nhau

1.3.1.2 Kháng nguyên, kháng thể

Kháng thể (antibody) là phân tử globulin miễn dịch (immunoglobulin, có bản chất glycoprotein) có khả năng nhận biết và vô hiệu hóa các tác nhân lạ (kháng nguyên) [48] Kháng nguyên (antigen) là những tác nhân lạ như: virus, vi khuẩn, protein khi xâm nhập vào cơ thể vật chủ có khả năng kích thích cơ thể vật chủ tạo ra sự đáp ứng miễn dịch

CH2, CH3 và CH4 Các vùng hằng định không có vai trò nhận diện kháng nguyên, chúng giữ vai trò như cầu nối với tế bào miễn dịch Phần "chân" của globulin miễn dịch hình chữ “Y” còn được gọi là Fc (vùng không đổi) Các kháng thể được phân thành năm lớp, tùy theo cấu tạo của vùng hằng định của các chuỗi nặng: chuỗi γ, α, μ, ε và δ lần lượt tương ứng với các immunoglobulin (Ig) thuộc các lớp IgG, IgA, IgM, IgE và IgD Phân tử globulin miễn dịch

G (IgG) chiếm phần lớn (75%) trong tổng số kháng thể có trong huyết thanh

Hình 1.8: (a) Cấu trúc kháng thể IgG;(b) tương tác kháng nguyên - kháng thể [110]

Mỗi kháng thể có bốn vùng biến thiên (V) trên hai đỉnh của hình chữ “Y”, vùng biến thiên bao gồm 110 đến 130 amino axit Với các loại kháng thể khác nhau, các đoạn amino axit trên hai đỉnh của hình chữ “Y” là khác nhau Sự kết hợp giữa một vùng biến thiên trên chuỗi nặng (VH) và một vùng biến thiên trên chuỗi nhẹ (VL) tạo nên vị trí nhận diện kháng nguyên Mỗi loại kháng thể có một cấu trúc riêng biệt để có thể gắn đặc hiệu với một kháng nguyên theo kiểu “khóa - chìa”

Trong tương tác kháng nguyên - kháng thể, ái lực của kháng thể đối với kháng nguyên

là tổng hợp của các lực liên kết như liên kết hydro, lực van der Waals, liên kết ion, tương tác

kỵ nước Vì những lực liên kết trên chỉ có tác dụng trong một bán kính nhỏ nên tính đặc hiệu trong cấu trúc không gian ba chiều của hai vùng biến thiên có vai trò quyết định đối với

ái lực của kháng thể và kháng nguyên [104]

24

1.3.2 Các phương pháp cố định phần tử cảm nhận sinh học

Các đặc tuyến của cảm biến sinh học điện hóa phụ thuộc vào nhiều yếu tố trong đó có khả năng gắn kết, số lượng và sự định hướng của các phần tử cảm nhận sinh học (DNA hoặc kháng nguyên, kháng thể) trên bề mặt điện cực Vì vậy, việc tối ưu quá trình cố định phần

tử cảm nhận sinh học lên bề mặt điện cực giữ vai trò rất quan trọng trong việc nghiên cứu chế tạo bộ cảm biến sinh học điện hóa ứng dụng trong phân tích y sinh Các phần tử cảm nhận sinh học được cố định cần gắn kết tốt với bề mặt cảm biến, duy trì được hoạt tính sinh học và có sự định hướng phù hợp trên bề mặt điện cực, sẵn sàng cho các tương tác sinh học diễn ra nhằm dò tìm các đối tượng đích với nồng độ thấp trong dung dịch Quá trình cố định các phần tử cảm nhận sinh học lên bề mặt điện cực thường được thực hiện đi kèm các bước rửa, lọc để loại bỏ những phần tử gắn kết yếu và khóa phủ các vị trí gắn kết không đặc hiệu Đến nay, đã có nhiều công bố về các kỹ thuật khác nhau nhằm cố định các phần tử cảm nhận sinh học lên bề mặt điện cực, chủ yếu dựa trên ba phương pháp là hấp phụ vật lý, liên kết cộng hóa trị và ái lực sinh học [52,126,132,137]

1.3.2.1 Hấp phụ vật lý

Khi cố định phần tử cảm nhận sinh học sử dụng phương pháp hấp phụ vật lý, dung dịch

có chứa DNA hoặc kháng thể được phủ trực tiếp lên trên bề mặt cảm biến ở điều kiện xác định (nhiệt độ, pH ), trong một khoảng thời gian Sau đó, điện cực được rửa với nước khử ion để loại bỏ những phần tử sinh học không liên kết hoặc liên kết yếu với bề mặt cảm biến

Ưu điểm của phương pháp hấp phụ vật lý là qui trình thực hiện đơn giản, không đòi hỏi nhiều hóa chất, thiết bị, thời gian thực hiện nhanh, tiết kiệm chi phí, hơn nữa còn đảm bảo duy trì tốt hoạt tính sinh học của DNA hoặc kháng thể do ít chịu ảnh hưởng trực tiếp của các tác nhân hóa học Tuy nhiên, phương pháp này có nhược điểm là DNA hoặc kháng thể có thể được định hướng ngẫu nhiên trên bề mặt cảm biến và một phần DNA hoặc kháng thể nếu chưa được gắn kết hoặc gắn kết yếu thì sẽ bị mất mát qua các bước rửa trong quá trình thí nghiệm

M Yousef Elahi và cộng sự [86] đã nghiên cứu chế tạo cảm biến sinh học điện hóa trên

cơ sở màng polime dẫn PPy được tổng hợp trên điện cực Pt sử dụng kỹ thuật điện hóa trong

đó, chuỗi đơn DNA được cố định trên màng PPy bằng phương pháp hấp phụ vật lý Sự hấp phụ của chuỗi đơn DNA dò trên bề mặt cảm biến được giải thích là do tương tác tĩnh điện giữa điện tích dương của PPy và điện tích âm của DNA, hình 1.9

25

Hình 1.9: Tương tác tĩnh điện giữa điện tích dương của PPy và điện tích âm của DNA [44]

B Saoudi và cộng sự [26] đã nghiên cứu sự hấp phụ của chuỗi DNA lên trên bề mặt polime dẫn PPy sử dụng phương pháp đo phổ UV 10 mg bột PPy được khuấy trong 10 ml dung dịch đệm PBS trong 24 giờ, sau đó hỗn hợp được ly tâm, chiết lấy 3 ml phần dịch nổi trên mặt để ghi lại đường cơ sở cho phép đo UV (Varian DMS 200 spectrometer) Thêm dung dịch DNA nồng độ xác định vào phần dịch PPy còn lại (7 ml), khuấy đều cho đến khi hỗn hợp trở thành đồng nhất, ly tâm và chiết lấy phần dịch nổi trên mặt để đo phổ UV Các thí nghiệm được thực hiện ở nhiệt độ phòng và áp suất khí quyển Lượng DNA đã hấp phụ được tính theo công thức [26]:

𝑏 =(𝑎0− 𝑎)𝑉𝐶

𝑚𝑠 (1.2) Trong đó: b là lượng DNA đã hấp phụ (mg.m-2); V là tổng thể tích dung dịch; a0 là mật độ quang (optical density) của dung dịch DNA ban đầu; a là mật độ quang của dung dịch DNA sau khi đã bị hấp phụ bởi PPy; m và s lần lượt là khối lượng và diện tích bề mặt riêng của bột PPy; C là hằng số, 50 µg.ml-1 đối với chuỗi kép DNA Kết quả đo phổ UV cho thấy chuỗi DNA hấp phụ mạnh nhất lên trên bề mặt polime dẫn PPy ở khoảng pH = 5 đến pH = 7 tại nhiệt độ phòng; lượng DNA hấp phụ lớn nhất trên bề mặt PPy là 0,23 mg.m-2 với nồng độ DNA ban đầu trong dung dịch là 19,8 mg.l-1; và hơn 85 % DNA đã được hấp phụ sau 10 phút Quá trình hấp phụ được giải thích là do tương tác tĩnh điện giữa điện tích âm của nhóm phôtphat của DNA và điện tích dương của chuỗi polime

Trong một số công bố [18,54,62], chuỗi đơn DNA dò có thể được cố định lên trên bề mặt cảm biến thông qua quá trình polime hóa điện hóa đồng thời monome Py và DNA Theo báo cáo của J P Tosar và cộng sự [62], 45 µL dung dịch Py 20 mM được trộn với 5 µL dung dịch DNA 8,3 mg/mL, sau đó thực hiện phản ứng polime hóa điện hóa đồng thời PPy và DNA trên bề mặt điện cực sử dụng phương pháp Von-ampe vòng (CV-Cyclic Voltammetry) (20 vòng, khoảng thế quét -700 đến 700 mV, tốc độ quét 50 mV.s-1) hoặc phân cực thế tĩnh (áp điện thế không đổi 700 mV) Sự gắn kết giữa chuỗi đơn DNA và PPy được giải thích là

do tương tác tĩnh điện giữa điện tích dương của PPy và điện tích âm của DNA

26

1.3.2.2 Liên kết cộng hóa trị

Khi cố định phần tử cảm nhận sinh học sử dụng phương pháp liên kết cộng hóa trị, bề mặt điện cực cần được chức năng hóa thông qua các bước xử lý hóa học nhằm tạo ra các nhóm chức thích hợp, sẵn sàng cho việc hình thành liên kết cộng hóa trị với các nhóm chức đặc trưng của DNA hoặc kháng thể

Tác giả Trần Quang Huy và cộng sự đã trình bày những kết quả nghiên cứu về các phương pháp cố định kháng thể kháng virus viêm não Nhật Bản từ huyết thanh bệnh nhân lên trên bề mặt vi điện cực răng lược Pt nhằm phát triển bộ cảm biến miễn dịch điện hóa [121] Bốn kỹ thuật cố định kháng thể được nghiên cứu bao gồm: cố định trực tiếp lên bề mặt điện cực silan hóa (APTES-serum); cố định cộng hóa trị thông qua liên kết chéo với glutaraldehyde (APTES-GA-serum); cố định cộng hóa trị với glutaraldehyde và phần tử kháng thể trung gian (APTES-GA-antiHIgG-serum); cố định cộng hóa trị với glutaraldehyde

và protein A (APTES-GA-PrA-serum, hình 1.10 Kết quả nghiên cứu cho thấy việc gắn kết kháng thể lên trên bề mặt điện cực đạt hiệu quả cao nhất khi sử dụng APTES–GA–PrA–serum với nồng độ huyết thanh chứa kháng thể kháng virus là 1 mg/ml Nghiên cứu này đã

mở ra một hướng mới cho việc phát triển bộ cảm biến miễn dịch sử dụng trực tiếp kháng thể

từ huyết thanh của bệnh nhân làm phần tử dò để phát hiện virus gây bệnh [121]

Hình 1.10: Gắn kết kháng thể trên nền Si/SiO 2 [121]

Trong một nghiên cứu khác [75], nhóm của tác giả Trần Đại Lâm đã trình bày các kết quả nghiên cứu chế tạo cảm biến DNA điện hóa trên cơ sở điện cực in lưới (Screen printed electrode - SPE) được chức năng hóa bề mặt bởi vật liệu nanocomposite chitosan/Fe3O4