Tình trạng nhiễm Norovirus ở trẻ khỏe mạnh dưới 3 tuổi tại một trường mầm non ở Hà Nam năm học 2014 – 2015

Kháng nguyên nhóm máu tương dung tổ chức HBGA và khả năng cảm nhiễm của NoV .... Mối tương quan giữa kháng nguyên nhóm máu tương dung tổ chức và khả năng cảm nhiễm NoV ở trẻ khỏe mạnh tạ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

KHOA SINH HỌC

-*** -

Đ T V ệt H n NGHIÊN CỨU

- 2015

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nộ – 2016

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

KHOA SINH HỌC

-*** -

Đ T V ệt H n

- 2015

Chuyên ngành : Vi sinh v t học

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

N ờ ớn dẫn k oa ọc:

PGS.TS N uyễn Vân Tran PGS.TS Bù T V ệt Hà

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Vân Trang,

người thầy đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn này

Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn PGS TS Bùi Thị Việt Hà cùng các

thầy giáo, cô giáo trong khoa Sinh học, đặc biệt là các thầy giáo, cô giáo trong bộ môn Vi sinh vật học đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, giảng dạy và dìu dắt tôi trong thời gian thực hiện luận văn cũng như trong suốt thời gian học tập tại trường

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Th.s Vũ Thị Bích Hậu,CN.Nguyễn

Phương Anh, CN.Nguyễn Thanh Tâm làm việc tại Phòng Miễn dịch Vắc xin –

Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương đã tận tình giúp đỡ và chỉ bảo tôi trong suốt

quá trình học tập và thực hiện luận văn tại phòng

Cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn gia đình và bạn bè đã luôn khích lệ động viên tôi trong suốt thời gian qua

Hà Nội, ngày tháng năm 2016

Học viên

Đỗ Thị Việt Hương

Primer

Thermus aquaticus DNA

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1.Giới thiệu chung về Viêm dạ dày ruột cấp ở trẻ em 3

1.1.1.Định nghĩa bệnh VDDRC 3

1.1.2.Phân loại 3

1.1.3.Tình hình bệnh VDDRC trên thế giới và Việt Nam 4

1.1.4.Dịch tễ học bệnh VDDRC 4

1.1.5.Các tác nhân gây VDDRC 7

1.2.Giới thiệu chung về NoV 7

1.2.1.Bệnh VDDRC do nhiễm NoV 7

1.2.2.Phân loại, hình thái và tổ chức bộ gen của NoV 8

1.2.3.Sự lây truyền, đặc điểm lâm sàng và sinh lý bệnh 12

1.2.4.Chẩn đoán 13

1.2.5.Phương pháp real time RT-PCR (Real time Reverse transcription polymerase chain reaction) 16

1.3.Tình hình nghiên cứu NoV trong và ngoài nước 16

1.3.1.Tình hình nghiên cứu trên thế giới 16

1.3.2.Tình hình nghiên cứu trong nước 17

1.4.Kiểu gen FUT-2 ở người và tính cảm nhiễm NoV 19

1.5 Kháng nguyên nhóm máu tương dung tổ chức (HBGA) và khả năng cảm nhiễm của NoV 21

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1.Đối tượng nghiên cứu 23

2.2.Địa điểm và thời gian nghiên cứu 23

2.3.V t liệu 24

2.3.1 Máy móc, dụng cụ 24

2.3.2 Sinh phẩm 24

2.4.Phương pháp nghiên cứu 25

2.4.1 Thu th p bệnh phẩm 25

2.4.2 Kỹ thu t real time-RT PCR phát hiện ARN của NoV 26

2.4.3 Kỹ thu t RT PCR khuếch đại đoạn gen vùng C của NoV 28

2.4.4 Phương pháp xác định kiểu gen FUT-2 31

2.4.5 Xác định kiểu hình HBGA (ABO và Lewis) trong mẫu nước bọt 33

2.5.Xử lý số liệu 34

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 36

3.1 Tỷ lệ lưu hành của NoV ở trẻ không triệu chứng tại trường mầm non ở Hà Nam 36

3.2.Biến động genotype của NoV lưu hành ở trẻ không triệu chứng tại trường mầm non ở Hà Nam 39

3.3.Mối liên hệ giữa tính cảm nhiễm NoV với kiểu gen của FUT-2 47

3.3.1 Tần số SNP tại vị trí 357, 385, 428, 571, 628, 685, 849 trên gen FUT-2 47

3.3.2 Mối quan hệ giữa alen đồng hợp lặn A385T và sự kháng nhiễm NoV 52 3.4 Mối tương quan giữa kháng nguyên nhóm máu tương dung tổ chức và khả năng cảm nhiễm NoV ở trẻ khỏe mạnh tại trường mầm non ở Hà Nam 53

3.4.1 Kiểu hình HBGA ở trẻ khỏe mạnh tại trường mầm non Hà Nam 53

3.4.2 Mối liên quan giữa kiểu hình của kháng nguyên HBGA với khả năng cảm nhiễm NoV 56

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59

TÀI LIỆU THAM KHẢO 60

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Thành phần kỹ thu t Realtime RT-PCR đơn cặp primer và probe phát hiện

NoV genotype G1 27

Bảng 2.2 Thành phần kỹ thu t Realtime RT-PCR đơn cặp primer và probe phát hiện NoV genotype G2 28

Bảng 2.3 Thành phần phản ứng RT-PCR đơn cặp primer đối với G1 29

Bảng 2.4 Thành phần phản ứng RT-PCR đơn cặp primer đối với G2 29

Bảng 2.5 Thành phần phản ứng PCR khuếch đại gen FUT-2 32

Bảng 3.1 Đặc điểm chủng NoV ở trẻ khỏe mạnh tại nhà trẻ Hà Nam 37

Bảng 3.2 Tỷ lệ nhiễm NoV ở trẻ khỏe mạnh 40

Bảng 3.3 Các genotypes NoV phát hiện ở trẻ khỏe mạnh tại nhà trẻ Hà Nam (T3/2014 - T5/2015) 41

Bảng 3.4 Đặc điểm genotypes NoV ở trẻ khỏe mạnh tại một số nhà trẻ ở Hà Nam vào một số tháng khác nhau 45

Bảng 3.5 Tần số các SNP tại vị trí 357, 385, 428, 571, 628, 685, 849 trên gen FUT-2 ở trẻ tại 01 trường mẫu giáo tại Hà Nam 50

Bảng 3.6 Các tần số đột biết ở FUT-s ở các quần thể Châu Á láng giềngvà Việt Nam 51

Bảng 3.7 Phân bố kiểu gen 385 trong 85 người có mẫu phân được xét nghiệm lây nhiễm NoV 52

Bảng 3.8 Phân bố kiểu hình kháng nguyên nhóm máu tương dung tổ chức Lewis a, b ở trẻ tại trường mầm non ở Hà Nam (n=119) 54

Bảng 3.9 Phân bố kiểu hình kháng nguyên nhóm máu tương dung tổ chức Lewis x, y ở trẻ tai trường mầm non ở Hà Nam (n=119) 54

Bảng 3.10 Tổ hợp kháng nguyên nhóm máu tương dung tổ chức Lewis ab và xy ở trẻ tại trường mầm non ở Hà Nam (n=119) 54

Bảng 3.11 Tỷ lệ kháng nguyên nhóm máu tương dung tổ chức ABO (n=119) 56

Bảng 3.12 Tần suất kháng nguyên Lewis theo tình trong nhiễm NoV (n=119) 57 Bảng 3.13 Mối liên quan giữa kiểu hình ABO và tình trạng đơn nhiễm NoV (n=119) 57

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 NoV dưới kính hiển vi điện tử 8

Hình 1.2 Biến đổi chủng NoV ở miền Bắc nước ta từ 2010-2013 10

Hình 1.3 Phân bố genotype khác nhau của NoV ở miền Bắc và miền Nam nước ta trong năm 2010 10

Hình 1.4 Cấu trúc của NoV 11

Hình 1.5 Cấu trúc bộ gen của NoV 11

Hình 2.1 Sơ đồ tóm tắt các loại mẫu thu th p sử dụng cho nghiên cứu 25

Hình 2.2 Sơ đồ tóm tắt nội dung nghiên cứu 35

Hình 3.2 Tỷ lệ lưu hành genotypes NoV ở trẻ khỏe mạnh tại nhà trẻ Hà Nam 42

Hình 3.3 Cây phát sinh chủng loài dựa trên đoạn gen vùng capsid của các chủng NoV phát hiện trong nghiên cứu này 44

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh viêm dạ dày ruột cấp (VDDRC) hay còn gọi là tiêu chảy ở trẻ em là một vấn đề sức khỏe đang được quan tâm trên toàn thế giới, đặc biệt thu hút được rất nhiều chú ý của các nhà khoa học, y học bởi đó là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây bệnh t t và tử vong cho trẻ em dưới 5 tuổi ở các nước đang phát triển Theo tổ chức y tế thế giới (WHO) và nhiều công trình nghiên cứu điều tra ở châu Á, châu Phi và châu Mỹ La Tinh cho thấy, ở các nước đang phát triển hàng năm có trên 750 triệu trường hợp VDDRC, trong đó 500 triệu là trẻ em dưới 5 tuổi Tử vong do VDDRC hàng năm lên tới 3-6 triệu trẻ em, có 80% trong số này là trẻ em dưới 2 tuổi Ở những nước đang phát triển như nước ta, đây là bệnh có tần suất mắc nhiều thứ 2 (sau các bệnh nhiễm trùng đường hô hấp) Tử vong do VDDRC thường không dược đánh giá đúng và kịp thời, tuy nhiên ước tính hàng năm có 6000-8000 trường hợp tử vong ở nước ta do VDDRC Tác nhân gây VDDRC khá đa dạng, các báo cáo cho thấy có ít nhất 26 loại tác nhân khác nhau có thể gây ra bệnh VDDRC ở trẻ em, trong đó có 60-70% của các trường hợp nguyên nhân là do các virus 7 nhóm virus thường gây VDDRC là rotavirus, NoV, sapovirus, adenovirus, astrovirus, parechovirus và aichivirus được coi là các tác nhân thường gặp của bệnh viêm dạ dày ruột cấp ở người NoV là tác nhân quan trọng nhất gây ra các vụ dịch VDDRC không do vi khuẩn ở người lớn và trẻ em Theo các báo cáo hàng năm trên toàn thế giới, có đến hơn 267 triệu trường hợp nhiễm do NoV NoV còn có khả năng gây nhiễm nhưng không có triệu chứng

NoV thuộc họ Caliciviridae là virus ARN sợi đơn, dương có khả năng lây

nhiễm cho người và động v t NoV khá đa dạng về kiểu gen và tính kháng nguyên, bao gồm 5 nhóm gen (từ GI đến GV) và 35 typ gen đã được phát hiện dựa vào trình

tự đoạn gen mã hóa protein VP1 NoV ở người thuộc GI, GII và GIV nhưng hầu hết các chủng gây bệnh ở người đều thuộc nhóm gen GI và GII Các virus thuộc họ

Caliviridae có khả năng lây nhiễm người ở mọi lứa tuổi và thường liên quan đến

các trường hợp tiêu chảy cấp lẻ tẻ và vụ dich tiêu chảy cấp trên toàn thế giới Các

vụ dịch này thường xảy ra ở điều kiện bán trú (semi-enclosed) như trường học, bệnh

viện, nhà dưỡng lão, nhà trẻ Ở nước ta, nhiều nghiên cứu giám sát bệnh tiêu chảy ở trẻ em dưới 3 tuổi tại bệnh viện cho thấy RV và NoV là hai tác nhân quan trọng nhất NoV không những gây tiêu chảy cấp cho trẻ, mà còn có khả năng nhiễm không triệu chứng, là tác nhân tiềm ẩn gây ra các vụ dịch và là nguồn lây lan mạnh trong cộng đồng đặc biệt ở nhà trẻ, lớp học

Mức độ cảm ứng của cơ thể đối với NoV có liên quan đến các trạng thái của gen FUT-2, mã hóa cho enzym fucosyltransferase α(1,2) để điều hòa sự biểu hiện của kháng nguyên H Đã có nhiều nghiên cứu về mối quan hệ giữa gen FUT- 2 và

sự nhiễm virus Nghiên cứu mới nhất trên gen tiết (secretor gene) ở các nhóm quần thể người khác nhau đã xác định được một vài đột biến của các gen này có thể làm mất hoặc giảm sự hoạt động của enzyme fucosyltransferase Trong khi đó, kháng nguyên nhóm máu tương dung tổ chức (HBGA) là thụ thể trong quá trình nhiễm NoV Những kháng nguyên này được tổng hợp do kết quả hoạt động của một số

enzyme glycosyltransferase được mã hóa chủ yếu bởi các họ gen ABO (FUT-1), Lewis (FUT-3) và secretor (FUT-2)

Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi tiến hành đề tài ―Nghiên cứu tình

trạng nhiễm NoV ở trẻ khỏe mạnh dưới 3 tuổi tại một trường mầm non ở Hà Nam năm học 2014 - 2015" với các mục tiêu như sau:

1 Xác định tỷ lệ nhiễm NoV và kiểu gen của các chủng NoV ở trẻ khỏe mạnh

2 Đánh giá mối liên quan giữa tính cảm nhiễm NoV và kiểu gen FUT-2

3 Đánh giá mối tương quan giữa kháng nguyên nhóm máu tương dung tổ chức và khả năng cảm nhiễm NoV ở trẻ khỏe mạnh

Đề tài được chúng tôi thực hiện tại phòng Miễn dịch Vắc xin, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng việt

1 Bộ môn Nhi (2003), Bài giảng nhi khoa tập 1, NXB trường đại học Y khoa Hà

Nội, Hà Nội

2 Nguyễn Thị Đào, Hồ Tân Tiến (1991), "Một số nh n xét về tiêu chảy và lỵ tại

khoa Nhi, bệnh viện tỉnh Đắc Lắc 1994-1995", Tạp chí y học thực hành, kỷ yếu

công trình nhi khoa- hội nghị nhi khoa khu vực miền trung lần thứ 4, pp 142-145

3 Phạm Thị Hà Giang, Nguyễn Vân Trang, Lê Thị Hồng Nhung, Phạm Xuân Ninh, Nguyễn Thị Hồng Hạnh, Nguyễn Trần Hiển (2013), "Phát hiện tác nhân

vi khuẩn và vi rút gây tiêu chảy ở trẻ em dưới 5 tuổi tại Thái Bình", Tạp chí

học dự phòng, T p XXIII, số 11(147), pp 34-42

4 Vũ Thị Bích H u, Đặng Đức Anh, Nguyễn Vân Trang (2013), "Biến động genotype của NoV lưu hành tại miền Bắc Việt Nam từ 2007 - 2013: Xuất hiện các subgenotype GII.4 mới nhưng vẫn duy trì tương tác kháng nguyên nhóm

máu", Tạp chí Y học dự phòng t p XXIII, số11 (147), pp 23-30

5 Nguyễn Minh Hiệp, Nguyễn Phương Anh, Vũ Thị Bích H u, Trần Đắc Tiến, Đặng Đình Thoảng, Phạm Ngọc Hùng, Phan Thị Ngà, Đặng Đức Anh, Nguyễn Vân Trang (2015), "Sự đa dạng kháng nguyên nhóm máu tương dung tổ chức ở

trẻ em Việt Nam và mối liên quan tới khả năng cảm nhiễm norovirus", Tạp chí

8 Hoàng Hữu Nam, Nguyễn Đình Sơn, Nguyễn Thái Hoà (1995), "Nh n xét về

bệnh lỵ trực trùng tại Thừa Thiên Huế trong 05 năm (1990-1994)", Tạp chí vệ

sinh phòng dịch, t p V, số 3 (21), pp 31-36

9 Nguyễn Đỗ Phúc, Nguyễn An Huy, Phạm Hùng Vân (2012), "Xây dựng quy

trình phát hiện Norovirus bằng kỹ thu t Realtime PCR", Tạp chí Y học thành

phố Hồ Chí Minh, 16(3)

10 Nguyễn Vân Trang (2013), "Mối liên hệ giữa nhiễm Norovirus và Rotavirus

với kháng nguyên nhóm máu ở trẻ em dưới tuổi, Thái Bình", Tạp chí Y tế dự

phòng, T p XXIII số 11(147), pp 70-76

11 Nguyễn Vân Trang (2013), "Tác nhân tiêu chảy do vi rút ở trẻ em: dự phân bố và

tính đa dạng ở Việt Nam", Tạp chí Y học dự phòng, t p 23, số 8 (144), pp 10-23

12 Nguyễn Vân Trang, Đặng Đình Thoảng (2014), "Một số tác nhân vi rút gây viêm dạ dày ruột cấp ở trẻ không có triệu chứng tại bệnh viện Đa khoa tỉnh Hà

Nam", Tạp chí Y học dự phòng, XXIV, Số 4 (153), pp 90-96

13 Nguyễn Vân Trang, Vũ Thị Bích H u, Lê Thị Hồng Nhung, Trần Trọng Kiểm, Nguyễn Minh Hiệp, Tetsu Yamashiro, Đặng Đức Anh (2012), "Đặc điểm của Norovirus và một số tác nhân gây bệnh tiêu chảy ở trẻ em tại bệnh viện Nhi Thái

Bình năm 2010-2011", Tạp chí Y học dự phòng, XXII, Số 5 (132), pp 17-24

14 Trung tâm tuyên truyền bảo vệ sức khỏe (1984), Vì sức khỏe trẻ em, Bộ Y tế

Tiếng anh

15 Ando T., Monroe S.S., Gentsch J.R., Jin Q., Lewis D.C., Glass R.I (1995),

"Detection and differentiation of antigenically distinct small round-structured viruses (Norwalk-like viruses) by reverse transcription-PCR and southern

hybridization", Journal of Clinical Microbiology, 33(1), pp 64-71

16 Anh D.D., Thiem V.D., Fischer T.K., Canh D.G., Minh T.T., Tho L.H., Van M.N., Luan L.T., Kilgore P., Von S.L., Glass R.I (2006), "The burden of rotavirus diarrhea in Khanh Hoa Province, Vietnam: baseline assessment for a rotavirus

vaccine trial", The Pediatric infectious disease journal, 25(1), pp 37-40

18 Ayukekbong J., Lindh M., Nenonen N., Tah F., Nkuo-Akenji T., Bergström T (2011), "Enteric viruses in healthy children in Cameroon: viral load and genotyping

of norovirus strains", Journal of medical virology, 83(12), pp 2135-2142

19 Beuret C (2004), "Simultaneous detection of enteric viruses by multiplex

real-time RT-PCR", Journal of virological methods, 115(1), pp 1-8

20 Bucardo F., Kindberg E., Paniagua M., Grahn A., Larson G., Vildevall M., Svensson L (2009), "Genetic susceptibility to symptomatic norovirus infection

in Nicaragua", Journal of medical virology, 81(4), pp 728-735

21 Buesa J., Montava R., Abu-Mallouh R., Fos M., Ribes J.M., Bartolomé R., Vanaclocha H., Torner N., Domínguez A (2008), "Sequential evolution of genotype GII 4 norovirus variants causing gastroenteritis outbreaks from 2001

to 2006 in Eastern Spain", Journal of medical virology, 80(7), pp 1288-1295

22 Bull R.A., Eden J.S., Rawlinson W.D., White P.A (2010), "Rapid evolution of

pandemic noroviruses of the GII 4 lineage", PLoS Pathog, 6(3), p e1000831

23 Carlsson B., Kindberg E., Buesa J., Rydell G.E., Lido M.F., Montava R., Mallouh R.A.,Grahn A., Rodrı´guez-Dı´az J., Bellido J., Arnedo A., Larson G., Svensson L (2009), "The G428A nonsense mutation in FUT2 provides strong

but not absolute protection against symptomatic GII 4 Norovirus infection",

PloS one, 4(5), p e5593

24 Castilho J.G., Munford V., Resque H.R.,Fagundes-Neto U.,Vinjé J., Rácz M.L (2006), "Genetic diversity of norovirus among children with gastroenteritis in Sao

Paulo State, Brazil", Journal of clinical microbiology, 44(11), pp 3947-3953

25 Chang J.G., Ko Y.C., Lee J.C., Chang S.J., Liu T.C., Shih M.C., Peng C.T (2002), "Molecular analysis of mutations and polymorphisms of the Lewis secretor type α (1, 2)-fucosyltransferase gene reveals that Taiwan aborigines

are of Austronesian derivation", Journal of human genetics, 47(2), pp 60-65

26 Chen H., Qian F., Xu J., Chan M., Shen Z., Zai S., Shan M., Cai J., Zhang W.,

He J (2015), "A novel norovirus GII 17 lineage contributed to adult

gastroenteritis in Shanghai, China, during the winter of 2014–2015", Emerging

microbes & infections, 4(11), p e67