Đa dạng sinh học của vi khuẩn kỵ khí ôxy hóa Fe(II), khử nitrate trong một số môi trường sinh thái và khả năng ứng dụng của chúng

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI BÁO CÁO KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI KHCN ĐẶC BIỆT CẤP ĐHQG Tên đề tài: Đa dạng sinh học của vi khuẩn kỵ khí ôxy hóa FeII, khử nitrate trong một số môi trường sinh

Trang 1

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

BÁO CÁO KẾT QUẢ THỰC HIỆN

ĐỀ TÀI KHCN ĐẶC BIỆT CẤP ĐHQG

Tên đề tài: Đa dạng sinh học của vi khuẩn kỵ khí ôxy hóa Fe(II), khử nitrate

trong một số môi trường sinh thái và khả năng ứng dụng của chúng

Chủ trì đề tài: TS Đinh Thúy Hằng

Cơ quan: Viện Vi sinh vật & Công nghệ Sinh học - ĐHQGHN

Hà Nội, tháng 1 năm 2010

Trang 2

BÁO CÁO KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI KHCN ĐẶC BIỆT CẤP DHQG

BÁO CÁO TÓM TẮT

1 Tên đề tài: Đa dạng sinh học của vi khuẩn kỵ khí ôxy hoá Fe(II), khử nitrate trongmột số môi

trường sinh thái và khả năng ứng dụng của chúng

2 Mã số: QG.07.23

3 Thời gian thực hiện: 2 năm (2007 - 2009)

4 Cấp quản lý: Đại học Quốc gia Hà nội

5 Chủ trì đề tài: TS Đinh Thuý Hằng

Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học - ĐHQGHN Điện thoại: 37547694; Fax: 37547407; Email: dthang@vnu.edu.vn

6 Cán bộ tham gia: CN Nguyễn Thị Tuyền

ThS Nguyễn Minh Giảng

7 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu

Mục tiêu:

- Nghiên cứu và so sánh đa dạng sinh học của vi khuẩn ôxy hoá Fe2+/khử NO3 

tại một số môi trường sinh thái khác nhau

- Phân lập các nhóm vi khuẩn đại diện, chiếm đa số trong mỗi loại môi trường sinh thái và nghiên cứu các đặc điểm phân loại, sinh lý, sinh hoá của chúng

- Nghiên cứu khả năng ứng dụng các chủng vi khuẩn phân lập được vào việc kết hợp loại bỏ

Fe2+, Mn2+, NO3 

trong môi trường ô nhiễm

Nội dung nghiên cứu:

- Mẫu trầm tích ở đáy hồ, mẫu đất ở ruộng lúa ngập nước và mẫu trầm tích ven biển sẽ được lấy theo yêu cầu đảm bảo kỵ khí (tránh tiếp xúc với ôxy), đưa về phòng thí nghiệm và giữ ở 4C cho đến khi tiến hành phân tích vi sinh vật

- Số lượng vi khuẩn ôxy hoá Fe(II)/khử NO3 sẽ được xác định theo phương pháp MPN (Most Propable Number) trong môi trường dịch thể chứa Fe(II) làm nguồn điện tử và NO3 

là chất nhận điện tử trong điều kiện kỵ khí hoàn toàn Thành phần khoáng của môi trường đảm bảo tương ứng với môi trường sinh thái tại địa điểm lấy mẫu

- Đa dạng về thành phần loài trong các mẫu khác nhau sẽ được xác định thông qua phương pháp sinh học phân tử, tách DNA tổng số trực tiếp từ các lô thí nghiệm ở nồng độ pha loãng khác nhau trong dãy MPN và phân tích tính đa dạng của một đoạn gen 16S rARN của tập đoàn vi sinh vật thu được trong mỗi lô bằng phương pháp PCR/DGGE

- Các chủng vi khuẩn ôxy hoá Fe(II)/khử NO3 

đại diện, chiếm đa số tại mỗi địa điểm lấy mẫu

sẽ được phân lập từ ống pha loãng cao nhất có vi sinh vật phát triển của dãy MPN bằng phương pháp ống thạch bán lỏng

- Các chủng vi khuẩn phân lập sẽ được nghiên cứu về đặc điểm sinh lý sinh hoá và phân loại dựa trên trình tự 16S rDNA Kết quả của nghiên cứu này sẽ làm cơ sở để tuyển chọn các

Trang 3

chủng có hoạt tính sinh học (khả năng chuyển hóa Fe(II) và NO3 ) cao và nghiên cứu khả năng ứng dụng của chúng vào việc kết hợp loại bỏ Fe(II), Mn(II), NO3 trong môi trường ô nhiễm

8 Các kết quả đạt được

- Ba dạng môi trường khác nhau gồm có ao nước ngọt, ruộng lúa ngập nước và trầm tích ven biển được chọn để tiến hành nghiên cứu sự đa dạng của vi khuẩn ôxy hoá Fe(II) khử NO3 Đây là những dạng môi trường trong đó vi khuẩn tham gia chu trình chuyển hoá sắt và nitơ đóng vai trò quan trọng Mẫu bùn đáy (dưới 10 cm bề mặt bùn) tại các môi trường sinh thái

kể trên được thu thập và sử dụng để phân tích nhóm vi khuẩn kỵ khí này

- Số lượng vi khuẩn ôxy hoá Fe(II), khử NO3 

đã được xác định bằng phương pháp MPN trong môi trường dịch thể nước ngọt (đối với mẫu ao và mẫu ruộng lúa) hoặc nước lợ (đối với mẫu trầm tích ven biển) chứa Fe(II) làm chất cho điện tử, NO3 làm chất nhận điện tử và acetate/CO2 làm nguồn cacbon Sự sinh trưởng của vi khuẩn trong các ống MPN được nhận biết thông qua thay đổi màu sắc của môi trường nuôi cấy sang màu vàng nâu do Fe(II) bị ôxy hoá thành Fe(III)

- DNA tổng số từ các ống MPN đại diện có vi sinh vật phát triển được tách chiết và sử dụng làm khuôn trong phản ứng PCR khuyếch đại đoạn gen 16S rDNA có độ dài 550 bp Phân tích điện di biến tính đoạn gen trên cho thấy tính đa dạng khá cao của vi khuẩn trong các ống MPN Một số băng điện di đại diện được cắt và thôi gel để đọc trình tự, qua đó đã xác định được các nhóm vi khuẩn chiếm ưu thế trong các môi trường nghiên cứu, cụ thể là

Anaeromyxobacter, Pseudomonas và Paracoccus

- Đã tiến hành nghiên cứu tính đa dạng của vi sinh vật sinh trưởng trong điều kiện oxy hoá Fe(II) khử NO3 

trong các dãy MPN thông qua phương pháp lai in situ sử dụng các đầu dò

huỳnh quang (FISH) đặc hiệu cho ba nhóm vi khuẩn -, - và -Proteobacteria

- 12 chủng vi khuẩn kỵ khí được phân lập và tinh sạch (4 chủng đối với mỗi dạng môi trường sinh thái) Tính đa dạng của các chủng này về mặt di truyền được xác định thông qua phân

tích ARDRA đoạn gen mã hoá cho 16S rRNA dài 1500 bp sử dụng hai enzyme MspI và

HaeIII Các chủng đại diện cho các nhóm ARDRA được giải trình tự để xác định vị trí phân

loại của cá nhóm vi khuẩn mà chúng đại diện

- Bằng phương pháp xác định lượng Fe(II) và NO3 

trong môi trường nuôi cấy theo thời gian, chủng vi khuẩn IN12 đã được chứng minh có khả năng chuyển hoá hai hợp chất này khá cao, như vậy chủng này có tiềm năng sử dụng trong lĩnh vực môi trường Bên cạnh đó khả năng sử dụng Mn(II) thay cho Fe(II) cũng đã được nghiên cứu, tuy nhiên chủng IN12 không thể hiện khả năng ứng dụng để loại bỏ Mn(II) trong môi trường

Trang 4

- Các kết quả nghiên cứu đã được công bố trong 02 bài báo khoa học, 01 báo cáo Poster tham gia hội nghị về sinh thái sinh vật và 02 trình tự gen đăng ký trong GenBank

- Đã tham gia đào tạo 01 học viên cao học

9 Tình hình sử dụng kinh phí

- Tổng kinh phí của đề tài được duyệt: 60.000.000 VNĐ

- Tổng kinh phí của đề tài đã chi: 60.027.400, bao gồm các mục:

+ Chi phí thuê mướn: 24.000.000

+ Chi phí nghiệp vụ chuyên môn: 29.522.400

+ Văn phòng phẩm: 505.000

+ Chi khác (lệ phí của đơn vị DT): 6.000.000

Xác nhận của Đại học Quốc gia

Trang 5

SUMMARY

1 Project title: Diversity of anaerobic ferrous iron-oxidizing, nitrate-reducing bacteria in

some ecological environments and their potential use

2 Code: QG.07.23

3 Duration: 2007 – 2009

4 Organizer: Vietnam National University Hanoi (VNUH)

5 Project leader: Dr Dinh Thuy Hang

Institute of Microbiology and Biotechnology, VNUH

6 Key participants: BSc Nguyen Thi Tuyen

MSc Nguyen Minh Giang

7 Objectives and study contents

Objectives

- Comparatively study biodiversity of Fe(II) oxidizing – nitrate reducing bacteria in some ecological environments in Vietnam

- Isolate representative strains that dominate in each environment and study their physiological, and phylogenetic characteristics

- Study the application potential of the isolates in elumination of Fe(II), Mn(II) and NO3 in contaminated water sources

Study contents

- Collect anaerobic mud samples from representative environments in Vietnam and keep at 4C

as the sources for microbiological studies

- Determine the number of Fe(II) oxidizing-nitrate reducing bacteria in these environments by using MPN method carried out in anoxic liquid media containing Fe(II) as electron donor,

NO3 

as electron acceptor and trace acetate as corbo source Mineral content of the media would respect to the natural conditions where the samples have been collected

- Species composition of the microbial communities in these environments would be analyzed via PCR-DGGE method applied for 16S rDNA of the samples of the MPN series

- Isolate representative strains from the MPN tube of the highest dilution by performing dilution series in semi-liquid agar tubes

- Study physiology and phylogeny of the isolated strains, afterward select strains for the study

of application potential in elimination of Fe(II), Mn(II) and NO3 in contaminated waters

8 The obtained results

- Samples from three ecological environments, namely mud sediment freshwater pond, flooded paddy soil and sediment from estuarine environment were collected for studying Fe(II) oxidizing, nitrate reducing bacteria These environments are known for significant

Trang 6

involvement of bacteria in Fe and nitrogen cycles Samples at 10 cm depth below the sediment surface were used for this study

- Number of Fe(II) oxidizing, nitrate reducing bacteria was enumerated via MPN method carried out in anoxic media with freshwater mineral content (for the samples from freshwater pond and paddy soil) or brackish water mineral content (for the sample from estuarine environment) These media contained Fe(II) as electron donor, NO3 as electron acceptor and trace acetate as carbon source Growth of bacteria in the MPN series was recognized by colour changing in the media, from white (FeII precipitation) to dark brown (FeIII precipitation)

- Total DNA from representative MPN samples was purified and used in the PCR experiments

to amplify 550 bp fragments of the V3 region of the 16S rDNA and used for analyzing diversity of bacteria in the communities with DGGE method Most prominent DGGE bands were excised, reamlified and sequenced to determine the phylogenetic affiliation of the respective baterial groups

- Diversity of the bacterial communities in the samples was also analyzed by using in situ

hybridization (FISH) with fluorescent probes specific for the -, - and -Proteobacteria

- 12 bacterial strains were isolated and purified (4 strains for each studied environment) Genetic diversity of these isolates was studied via ARDRA analyzes of 16S rDNA with two

endonucleases MspI and HaeIII 16S rDNA of the strains represented for the RFLP groups

were sequenced and comparatively aligned with the database to identify the phylogenetic affiliation of the ARDRA groups

- Quantitative analyzes of the amount of Fe(II) and NO3 in growth media of the isolated strains allowed to select strain IN12 as a candidate for application for simultaneous elimination of Fe(II) and NO3 

in contaminated waters Besides that, the ability of strain IN12

in oxidation of Mn(II) with nitrate was also studied, however it was revealed that tis strain did not growth with Mn(II) as electron donor for nitrate reduction

Trang 7