Xây dựng phương pháp phân tích đồng thời vitamin a, d, e trong sữa công thức và thực phẩm bổ sung vi chất dinh dưỡng bằng HPLC

Vitamin A, E đều có hàm lượng cao trong thực phẩm bổ sung, nên hiện nay có một số phương pháp thường qui định lượng đồng thời hai loại vitamin này; tuy nhiên chưa có phương pháp thường q

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

PHẦN 1 TỔNG QUAN 3

1 Tổng quan về đối tượng nghiên cứu 3

1.1 Vai trò của vitamin A, vitamin D, vitamin E đối với cơ thể 3

1.2 Đặc điểm lý, hóa của vitamin A, D, E 4

1.2.1 Đặc điểm lý, hóa của vitamin A 4

1.2.2 Đặc điểm lý, hóa của vitamin D 5

1.2.3 Đặc điểm lý, hóa của vitamin E 5

2 Tổng quan về phương pháp nghiên cứu 7

2.1 Phương pháp tách chiết vitamin A, D, E ra khỏi mẫu thực phẩm 7

2.1.1 Xử lý mẫu sơ bộ 7

2.1.2 Tách chiết vitamin ra khỏi nền mẫu 7

2.2 Một số kỹ thuật định lượng vitamin A, D, E 12

2.2.1 Quang phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến (UV-VIS) 12

2.2.2 Điện di mao quản 12

2.2.3 Sắc ký khí (GC) 13

2.2.4 Sắc ký lỏng hiệu năng cao 13

PHẦN 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Đối tượng và phương tiện nghiên cứu 16

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 16

2.1.2 Phương tiện nghiên cứu 16

2.2 Phương pháp nghiên cứu 18

2.2.1 Phương pháp phân tích dự kiến 18

2.2.2 Tối ưu hóa điều kiện chạy sắc ký 18

2.2.3 Tối ưu hóa điều kiện tách chiết 18

2.2.4 Thẩm định phương pháp phân tích 19

2.2.5 Định lượng hàm lượng vitamin A, D, E trong một số thực phẩm trên thị trường 21 2.3 Phương pháp xử lý số liệu 22

PHẦN 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 23

3.1 Tối ưu hóa các điều kiện chạy sắc ký 23

3.1.1 Lựa chọn bước sóng phân tích 23

3.1.2 Lựa chọn cột sắc ký 23

3.1.3 Lựa chọn dung môi pha động và thành phần pha động 23

3.1.4 Thể tích tiêm 25

3.1.5 Nhiệt độ buồng cột 25

3.1.6 Lựa chọn tốc độ pha động 26

3.2 Tối ưu hóa điều kiện xử lý mẫu phân tích 27

3.2.1 Ảnh hưởng của enzym đến quá trình thủy phân 27

3.2.2 Khảo sát thể tích KOH 20%/EtOH 28

3.2.3 Khảo sát nhiệt độ thủy phân 29

3.2.4 Khảo sát thời gian thủy phân 30

3.2.5 Khảo sát dung môi chiết và tỷ lệ dung môi chiết 31

3.3 Thẩm định phương pháp phân tích 33

3.3.1 Tính thích hợp của hệ thống 33

3.3.2 Độ đặc hiệu 34

3.3.3 Khoảng tuyến tính 35

3.3.4 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 36

3.3.5 Độ lặp lại 37

3.3.6 Độ thu hồi 38

3.4 Kết quả phân tích mẫu thực 40

PHẦN 4 BÀN LUẬN 41

4.1 Về điều kiện sắc ký 41

4.2 Về xử lý mẫu 41

4.3 Về thẩm định phương pháp phân tích 42

4.4 Kết quả phân tích mẫu thực 43

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AOAC: (Association of Official Analytical Chemists) - Hiệp hội các nhà

hóa học phân tích ACN: Acetonitril

BHT: Butylate hydroxytoluenen

EtOH: Ethanol

GC: Sắc ký khí

HPLC: Sắc ký lỏng hiệu năng cao

ISO: (International Organization for Standardization): Tổ chức tiêu

chuẩn hóa quốc tế LOD: (Limit of detection) - Giới hạn phát hiện

LOQ: (Limit of quantitation) – Giới hạn định lượng

MeOH: Methanol

PA: (Pure analysis) – tinh khiết phân tích

PDA: (Photo diod array) – mảng diod quang

ppm: (part per million) – phần triệu

RSD: (Relative standard deviation) – độ lệch chuẩn tương đối

SD: (Standard deviation) – độ lệch chuẩn

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang Bảng 1.1 Tóm tắt một số phương pháp xử lý mẫu phân tích vitamin A, D3, E

trong thực phẩm và thuốc 9

Bảng 1.2 Một số điều kiện sắc ký lỏng phân tích vitamin A, D3, E ở Việt Nam và trên thế giới 13

Bảng 3.3 Kết quả đánh giá tính thích hợp của hệ thống 33

Bảng 3.4 Kết quả xác định khoảng tuyến tính 36

Bảng 3.5 Kết quả xác định LOD, LOQ 37

Bảng 3.6 Kết quả tính độ lặp lại 37

Bảng 3.7 Kết quả đánh giá độ thu hồi của vitamin A 38

Bảng 3.8 Kết quả đánh giá độ thu hồi của vitamin D 39

Bảng 3.9 Kết quả đánh giá độ thu hồi của vitamin E 39

Bảng 3.10 Kết quả phân tích một số mẫu trên thị trường 40

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của vitamin A, D3, E 6

Hình 3.2 Kết quả khảo sát tỷ lệ dung môi pha động 24

Hình 3.3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ cột 25

Hình 3.4 Kết quả khảo sát tốc độ dòng 26

Hình 3.5 Kết quả khảo sát hiệu quả của enzym đến kết quả định lượng 28

Hình 3.6 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thể tích KOH 20%/EtOH 29

Hình 3.7 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân 30

Hình 3.8 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian thủy phân 31

Hình 3.9 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi chiết 32

Hình 3.10 Quy trình xử lý mẫu phân tích vitamin A, D, E 33

Hình 3.11 Kết quả đánh giá độ đặc hiệu 34

Hình 3.12 Kết quả đánh giá độ tinh khiết của pic trên phần mềm thiết bị HPLC 35

ĐẶT VẤN ĐỀ

Vitamin là những chất hữu cơ có phân tử lượng thấp, không cung cấp năng lượng nhưng có vai trò quan trọng trong các quá trình chuyển hóa của cơ thể, có ảnh hưởng đến sức khỏe và bệnh tật

Tuy mỗi ngày cơ thể chỉ cần một lượng rất nhỏ tính bằng miligam, thậm chí microgam, tuy nhiên thiếu hoặc thừa các vitamin trong khẩu phần ăn gây ra nhiều xáo trộn cho hoạt động hàng ngày của cơ thể thậm chí có thể gây bệnh Do vậy vitamin có vai trò quan trọng góp phần duy trì cuộc sống, giúp

cơ thể khỏe mạnh

Trong công nghiệp thực phẩm, nghiên cứu phát triển các dạng thực phẩm bổ sung vitamin và các vi chất dinh dưỡng đã trở thành một lĩnh vực được quan tâm hàng đầu bởi những giá trị thiết yếu của sản phẩm góp phần đáp ứng nhu cầu của thị trường và hứa hẹn mang lại nhiều lợi nhuận cho các nhà kinh doanh thực phẩm Cũng vì lý do đó, lĩnh vực kiểm nghiệm thực phẩm ngày càng tiếp nhận kiểm nghiệm nhiều loại thực phẩm bổ sung vitamin nói chung, vitamin tan trong dầu (vitamin A, vitamin D, vitamin E) nói riêng để đánh giá chất lượng sản phẩm trên thị trường theo yêu cầu của khách hàng và cơ quan quản lý Vitamin A, E đều có hàm lượng cao trong thực phẩm bổ sung, nên hiện nay có một số phương pháp thường qui định lượng đồng thời hai loại vitamin này; tuy nhiên chưa có phương pháp thường qui nào phân tích đồng thời cả 3 loại vitamin A, D, E trong thực phẩm vì vitamin D có hoạt lực mạnh nên chỉ được bổ sung với hàm lượng nhỏ Nghiên cứu xây dựng phương pháp chiết tách và định lượng đồng thời các vitamin A,

D, E trong thực phẩm đặc biệt là các thực phẩm có nền mẫu phức tạp như sữa công thức và thực phẩm bổ sung vi chất dinh dưỡng giúp tiết kiệm thời gian, hóa chất phân tích, cho độ chính xác cao, đơn giản, dễ áp dụng trong điều kiện các phòng thí nghiệm trong nước là một nhu cầu thiết thực Vì vậy,

chúng tôi tập trung nghiên cứu đề tài “Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời vitamin A, D, E trong sữa công thức và thực phẩm bổ sung vi chất dinh dưỡng” với những mục tiêu sau:

- Xây dựng phương pháp chiết và phân tích đồng thời vitamin A, D, E trong sữa công thức và thực phẩm bổ sung vi chất dinh dưỡng

- Ứng dụng quy trình đã xây dựng cho phân tích vitamin A, D, E trong một

số mẫu sữa công thức, thực phẩm bổ sung vi chất dinh dưỡng trên thị trường Việt Nam

PHẦN 1 TỔNG QUAN

1 Tổng quan về đối tƣợng nghiên cứu

1.1 Vai trò của vitamin A, vitamin D, vitamin E đối với cơ thể

Vitamin A có vai trò tạo sắc tố võng mạc giúp điều tiết mắt, cần thiết cho quá trình biệt hóa các tế bào biểu mô ở da và niêm mạc, có vai trò bảo vệ

sự toàn vẹn của cơ cấu và chức năng của biểu mô khắp cơ thể, nhất là biểu mô trụ của nhu mô mắt Cùng với vitamin D, vitamin A có vai trò giúp cho sự phát triển xương và tham gia vào quá trình phát triển cơ thể, đặc biệt ở trẻ em Nếu thiếu vitamin A trẻ em sẽ còi xương, chậm lớn Trên hệ miễn dịch, vitamin A giúp phát triển lách và tuyến ức là hai cơ quan tạo ra lympho bào

có vai trò miễn dịch của cơ thể, tăng tổng hợp các protein miễn dịch Nhu cầu vitamin A hàng ngày ở người lớn khoảng 750 - 1000 µg, ở trẻ em là 300 µg Khi cơ thể dư thừa vitamin A gây ra tình trạng đau bụng, buồn nôn, bơ phờ, chậm chạp, phù gai thị, thóp phồng, vài ngày tiếp theo da bong toàn thân rồi hồi phục dần khi đã ngừng thuốc Ðối với phụ nữ có thai 3 tháng đầu, nếu dùng quá 10.000 đơn vị vitamin A mỗi ngày kéo dài dễ bị dị dạng thai nhi

Vitamin D có vai trò rất quan trọng trong quá trình tạo xương nhờ tác dụng trên chuyển hóa các chất vô cơ mà chủ yếu là calci và phosphat Vitamin D cũng giúp điều hòa nồng độ calci trong máu Khi thiếu vitmin D, ruột không hấp thu đủ calci và phospho làm calci máu giảm, khi đó calci bị huy động từ xương ra để ổn định calci máu nên gây hậu quả là trẻ em chậm lớn, còi xương, chân vòng kiềng, chậm biết đi, chậm kín thóp Người lớn sẽ bị loãng xương, xốp xương, xương thưa dễ gãy Phụ nữ mang thai thiếu vitamin

D có thể sinh ra trẻ khuyết tật ở xương Ngoài ra, vitamin D còn tham gia quá trình biệt hóa tế bào biểu mô và gần đây đang nghiên cứu về tác dụng ức chế tăng sinh tế bào ung thư như ung thư tuyến tiết melanin, ung thư vú…[8]

Nhu cầu vitamin D hàng ngày ở người lớn khoảng 2,5 µg, ở trẻ em khoảng 10

µg

Vitamin E có tác dụng chống oxy hóa (ngăn cản oxy hóa các thành phần thiết yếu trong tế bào, ngăn cản tạo thành các sản phẩm oxy hóa độc hại), bảo vệ màng tế bào khỏi sự tấn công của các gốc tự do, nhờ đó bảo vệ được tính toàn vẹn của màng tế bào Khi thiếu vitamin E có thể gặp các triệu chứng: rối loạn thần kinh, yếu cơ, rung giật nhãn cầu, giảm nhạy cảm về xúc giác, dễ tổn thương da, dễ vỡ hồng cầu, dễ tổn thương cơ và tim Đặc biệt trên

cơ quan sinh sản khi thiếu vitamin E thấy tổn thương cơ quan sinh dục, gây

vô sinh [8] Hàng ngày, người lớn cần khoảng 15 mg, ở trẻ em cần khoảng 7

mg vitamin E Khi cơ thể thừa vitamin E có thể gặp các tác dụng phụ do vitamin E thúc đẩy các tổn hại do quá trình ôxy hóa gây ra và khống chế các tác nhân chống lão hóa khác Biểu hiện dễ nhận thấy nhất khi dùng vitamin E quá liều là tiêu chảy, đau bụng, rối loạn tiêu hóa, mệt mỏi, suy nhược Những triệu chứng này sẽ nhanh chóng mất đi sau khi ngừng thuốc do vitamin E được đào thải nhanh ra khỏi cơ thể

1.2 Đặc điểm lý hóa của vitamin A, vitamin D, vitamin E

1.2.1 Đặc điểm lý hóa của vitamin A

Vitamin A không phải là một chất mà là tên chung để chỉ nhiều chất có hoạt tính sinh học tương tự nhau Tất cả các dạng vitamin A đều có vòng beta – ionon và gắn vào nó là một chuỗi isoprenoid Trong thực phẩm có nguồn gốc động vật, dạng chính của vitamin A là retinol, nhưng cũng có thể tồn tại dưới dạng aldehyd là retinal hay dạng acid là acid retinoic Chất thường được gọi là vitamin A là retinol, có phân tử gam là 286,45 [3] Hiện nay, vitamin A còn được tạo ra bằng tổng hợp hóa học Hoạt tính của vitamin A được xác định bằng đơn vị quốc tế, 1 đơn vị quốc tế bằng 0,3 μg vitamin A hoặc 0,6 μg β-caroten

Vì retinol có hoạt tính sinh học quan trọng nhất và dạng chủ yếu chiếm

đa số nên trong phạm vi luận văn này chỉ nghiên cứu về retinol (sau đây gọi tắt là vitamin A)

Vitamin A là những tinh thể hoặc bản mỏng màu vàng nhạt, nóng chảy

ở 63 – 64ºC, không tan trong nước, tan trong methanol, ethanol và một số dung môi hữu cơ Do có hệ nối đôi liên hợp nên vitamin A dễ bị oxy hóa, không bền vững trong không khí, ánh sáng, nhiệt độ cao hay khi có mặt của các chất béo dễ bị hoặc đã bị oxy hóa Vì vậy, phải bảo quản vitamin A ở chỗ nhiệt độ thấp, tránh ánh sáng, trong chai lọ thủy tinh màu vàng, bao bì kín, thêm chất chống oxy hóa [4]

1.2.2 Đặc điểm lý hóa của vitamin D

Vitamin D là một nhóm gồm từ D2 đến D7, trong đó có 2 chất có hoạt tính mạnh nhất là D2 và D3 Nói chung, về hoạt tính không có sự khác nhau nhiều giữa vitamin D2 và D3 [7]

Đề tài này tập trung nghiên cứu về vitamin D3 (cholecalciferol) Hoạt tính của 0,025µg vitamin D3 bằng 1 đơn vị quốc tế vitamin D3

Vitamin D3 là những tinh thể trắng hoặc gần như trắng, dễ biến đổi khi tiếp xúc với không khí, nhiệt độ và ánh sáng Trong dung dịch, tùy thuộc vào nhiệt

độ và thời gian mà có thể xẩy ra hiện tượng đồng phân hóa thuận nghịch thành pre-cholecalciferol Vitamin D3 dễ tan trong chloroform, ethanol 96%

và ether, tan trong dầu béo; thực tế không tan trong nước Dung dịch trong các dung môi bay hơi không vững bền, nên dùng ngay

1.2.3 Đặc điểm lý hóa của vitamin E

Vitamin E là thuật ngữ chỉ một nhóm hợp chất có hoạt tính sinh học tương

tự nhau là α, β, γ, δ tocoferol, trong đó α-tocoferol có hoạt tính mạnh nhất Hoạt tính của 1 mg α-tocoferol bằng 1 đơn vị vitamin E

Các vitamin E và ester của chúng là chất lỏng sánh như dầu, màu vàng sáng, hầu như không mùi, không vị; không tan trong nước, tan trong ethanol,

các dung môi hữu cơ và các dầu béo (riêng dạng muối succinat là bột màu trắng) Do trong phân tử có các carbon bất đối nên vitamin E có các đồng phân quang học Các đồng phân hữu truyền (dạng D) thường có hoạt tính mạnh hơn các đồng phân tả truyền (dạng L) Các tocoferol trong tự nhiên ở dạng D, loại tổng hợp dạng racemic Các vitamin E dễ bị oxy hóa với các tác nhân: tia tử ngoại, chất béo đã bị ôi, một số kim loại nặng và môi trường kiềm

Vì vậy, cần phải bảo quản vitamin E trong chai lọ kín, đổ đầy, thủy tinh màu vàng, để chỗ nhiệt độ thấp, tránh sánh sáng [3], [4]

Vitamin E tự nhiên tồn tại dưới 8 dạng khác nhau, trong đó có 4 tocoferol

và 4 tocotrienol Các tocoferol và tocotrienol đều có dạng α, β, γ, δ; mỗi dạng

có hoạt tính sinh học khác nhau chút ít Dạng α-tocoferol có công thức phân

tử là C29H50O2 và phân tử lượng là 430,7 (g/mol) chiếm chủ yếu trong tự nhiên và có hoạt tính quan trọng nhất, vì vậy nó thường được lấy tên chung là vitamin E Ngày nay, vitamin E chủ yếu được điều chế bằng phương pháp tổng hợp hóa học [5], [6] Trong phạm vi luận văn này chỉ nghiên cứu dạng đồng phân α-tocoferol

Công thức cấu tạo

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của vitamin A, D 3 , E

Trong thực phẩm bổ sung vi chất dinh dưỡng và sữa công thức, vitamin

A thường được bổ sung với hàm lượng từ 400 - 600µg/100g, vitamin D thường được bổ sung với hàm lượng từ 4 – 11µg/100g; vitamin E thường

được bổ sung với hàm lượng từ 4,5 – 8mg/100g tùy vào từng loại thực phẩm với mục đích dành cho lứa tuổi, đối tượng, tình trạng sức khỏe khác nhau

2 Tổng quan về phương pháp nghiên cứu

2.1 Phương pháp tách chiết vitamin A, D, E ra khỏi mẫu thực phẩm

2.1.2 Tách chiết vitamin ra khỏi nền mẫu

Tỷ lệ chất béo trong các thực phẩm chứa vitamin tan trong dầu chủ yếu gồm các triglycerid, một lượng rất ít các sterol, carotenoid, phospholipid và một lượng nhỏ các thành phần gần giống mỡ Tất cả các chất này ức chế khả năng hòa tan của các loại vitamin tan trong dầu Một phần các vitamin này liên kết với phức hợp lipoprotein do đó cần phải phá vỡ liên kết để giải phóng vitamin ra khỏi các phức hợp Như vậy cần có phương pháp chiết tách phù hợp để chiết các vitamin ra khỏi nền mẫu trước khi tiến hành định lượng [35]

Có một số phương pháp chiết vitamin tan trong dầu ra khỏi nền mẫu thực phẩm như: xà phòng hóa, chiết bằng cồn, sử dụng enzym, chiết bằng dung môi hữu cơ, chiết bằng dung môi siêu tới hạn [28,41,45,38,57,]

để giải phóng các liên kết hoặc phá vỡ dạng ester của vitamin A, D, E [23]

Quá trình xà phòng hóa được tiến hành trong môi trường kiềm mạnh; điều này giúp giảm sự có mặt của các chất khác trong nền mẫu hòa tan vào dung môi hữu cơ trong quá trình chiết sau này Quá trình xà phòng hóa được tiến hành bằng cách thêm dung dịch NaOH hoặc KOH ở nhiệt độ môi trường hoặc nhiệt độ cao với sự có mặt của chất chống oxy hóa và môi trường khí trơ Ngay sau quá trình xà phòng hóa luôn luôn là quá trình chiết bằng dung môi hữu cơ như diethyl ether, diisopropyl ether, chloroform, n-hexan hoặc các hỗn

hợp của chúng [2, 1, 36]

* Thủy phân bằng enzym

Nhiều loại enzym thường được sử dụng trong công nghệ thực phẩm để thủy phân nhiều liên kết hóa học đặc hiệu khác nhau như enzym amylase xúc tác thủy phân tinh bột, lipase, protease xúc tác phản ứng thủy phân triglycerid thành axit béo và glycerol Đối với phân tích vitamin trong thực phẩm, các enzym thường được sử dụng trong phân tích vitamin K vì vitamin này không bền trong môi trường kiềm, sau đó chiết trực tiếp bằng dung môi hữu cơ Phương pháp này đã phát triển thành phương pháp thường qui [14], chứng tỏ enzym có hoạt lực thủy phân thực phẩm tốt, giúp giải phóng vitamin ra khỏi nền mẫu, giúp quá trình chiết diễn ra thuận lợi Tác giả Xiuping và cộng sự đã

có nghiên cứu bổ sung enzym protease trong môi trường kiềm (dung dịch amoniac) để thủy phân mẫu thức ăn chăn nuôi, sau đó chiết bằng ethanol [56]

* Chiết bằng dung môi hữu cơ

Chiết lỏng – lỏng là một kỹ thuật rất phổ biến trong định lượng các vitamin Sau quá trình xà phòng hóa, các vitamin tan trong dầu luôn được tách ra khỏi nền mẫu bằng cách chiết lặp lỏng – lỏng nhiều lần bằng các dung môi hữu cơ không phân cực (petroleum ether, n-hexan, n-heptan) Pha hữu cơ được cô lại bằng thiết bị cất quay hoặc thổi khô, sau đó hòa tan chất phân tích bằng dung môi pha động [23]

* Chiết lỏng siêu tới hạn

Chiết lỏng siêu tới hạn sử dụng CO2 siêu tới hạn đã được mô tả trong

một số bài báo và cũng đưa ra một số kết quả khả quan vì CO2 siêu tới hạn có

khả năng hòa tan mạnh các chất không phân cực Kỹ thuật này giúp tách các

vitamin ra khỏi nền mẫu thực phẩm, huyết thanh, kem, sữa công thức, thuốc

mỡ [53, 47] Phương pháp chiết lỏng siêu tới hạn có ưu điểm nhanh, hạn chế

công sức, tốn ít dung môi nhưng chi phí trang bị đắt, hầu hết các phòng kiểm

nghiệm thực phẩm tại Việt Nam chưa ứng dụng được kỹ thuật này

* Chiết pha rắn

Chiết pha rắn là phương pháp chiết dựa vào sự phân bố của chất phân

tích giữa hai pha lỏng và rắn Pha rắn thường là các hạt nhỏ, xốp được nhồi

vào các ống nhỏ Pha lỏng chảy qua ống, các chất phân tích tương tác với pha

rắn sẽ được giữ lại trên ống Các chất này được rửa giải khỏi pha rắn bằng

một dung môi khác phù hợp Thông thường thể tích dung môi rửa giải nhỏ

hơn nhiều so với thể tích dung dịch mẫu Kỹ thuật này tiến hành khá nhanh,

độ thu hồi tốt, tốn ít dung môi hơn so với chiết lỏng – lỏng Trong nhiều

nghiên cứu trước, các tác giả đã ứng dụng được kỹ thuật chiết pha rắn trong

phân tích vitamin D và các dạng chuyển hóa của nó trong máu, dịch cơ thể,

thức ăn chăn nuôi [41, 50, 58]

Bảng 1.1 Tóm tắt một số phương pháp xử lý mẫu phân tích vitamin A, D 3 , E

Dược điển Việt

Nam IV [6]

X

Chế phẩm phức tạp hoặc chứa vitamin

hóa cho trẻ nhỏ

Xà phòng hóa mẫu, chiết bằng dung môi n-hexan, sau đó làm bay hơi dung môi, rồi sử dụng chiết pha rắn, dịch chiết đem định lượng

thực phẩm khác)

Xà phòng hóa bằng KOH/ethanol (hoặc methanol) + chất chống oxy hóa, sau đó chiết bằng n-hexan

X X Sữa (bột, lỏng) Xà phòng hóa bằng KOH/EtOH sau

đó chiết bằng dung môi n-henxan

TFA:methanol (80:20), ly tâm thu

Qua tóm tắt một số phương pháp tiêu chuẩn và bài báo nghiên cứu về phân tích vitamin A, D, E trong thuốc và thực phẩm, chúng tôi có nhận xét sau:

- Chưa có phương pháp kiểm nghiệm thường qui (TCVN, AOAC, EN, ISO ) hướng dẫn định lượng đồng thời vitamin A, D, E trong thực phẩm nói chung và sữa công thức, thực phẩm bổ sung vi chất dinh dưỡng nói riêng

- Đối với các chế phẩm thuốc, thành phần chế phẩm và dạng bào chế tương đối đơn giản như viên nang, viên nén, dung dịch…với hàm lượng vitamin thường cao hơn trong các sản phẩm thực phẩm, phương pháp xử lý mẫu không quá phức tạp: có thể xà phòng hóa hoặc không, sau đó chiết bằng dung môi ít phân cực [6,18,51,55] Trong khi đó, thực phẩm bổ sung vi chất dinh dưỡng, sữa công thức thường có thành phần nền mẫu phức tạp, thường

có thêm nhiều thành phần dinh dưỡng khác, đặc biệt là các loại lipid, peptid, phospholipid, hàm lượng từng loại vitamin trong đó không cao, đòi hỏi quá trình xử lý mẫu phức tạp hơn để chiết tách được vitamin đem định lượng Nếu nền mẫu chưa được xử lý triệt để sẽ ảnh hưởng nhiều đến kết quả phân tích, đặc biệt với những chất phân tích có mặt với hàm lượng nhỏ trong mẫu như vitamin D3

Trong nghiên cứu này lựa chọn phương pháp xà phòng hóa vì phương pháp này phù hợp với việc chiết tách vitamin A, D, E, loại trừ chất béo và lipid hiệu quả, chi phí thấp Hơn nữa, nếu như trong các chế phẩm thuốc, dạng tồn tại của các loại vitamin đã biết trước thì trong sữa công thức sử dụng nguyên liệu từ tự nhiên nên các vitamin tồn tại ở nhiều dạng khác nhau; trong thực phẩm bổ sung vi chất dinh dưỡng các vitamin A, E thường tồn tại ở dạng ester để hạn chế sự oxy hóa Ở khía cạnh đánh giá mức độ dinh dưỡng chỉ quan tâm đến hoạt lực tổng của từng loại vitamin, do đó, phương pháp xà phòng hóa không chỉ giúp giải phóng các vitamin ra khỏi liên kết với các thành phần khác trong thực phẩm mà còn giúp chuyển vitamin từ dạng ester

sang dạng ancol, giúp tiết kiệm chi phí sử dụng chuẩn làm việc trong quá trình phân tích, thuận tiện trong quá trình tính toán kết quả Tuy nhiên, việc

bổ sung thêm enzym trong quá trình xà phòng hóa vừa giúp phá vỡ các liên kết ester, vừa phá vỡ các liên kết peptid trong nền mẫu, do đó quá trình chiết vitamin tiếp theo bằng dung môi diễn ra thuận lợi hơn [41, 54]

Các sterol, carotenoid, vitamin tan trong dầu không bị xà phòng hóa nên được chiết ra khỏi hỗn hợp sau khi thủy phân bằng dung môi hữu cơ, sử dụng kỹ thuật chiết lỏng – lỏng, tiến hành chiết lặp lại nhiều lần để chuyển tối

đa lượng vitamin có trong mẫu phân tích sang pha dung môi hữu cơ Quá trình chiết thực hiện trong các dụng cụ thủy tinh tối màu, loại khí oxy bằng cách sục nitơ, thêm chất chống oxy hóa để hạn chế tối đa các vitamin bị oxy hóa Dịch chiết được đem cất quay chân không để bay hơi dung môi Quá trình cất cần tiến hành trong bình cất quay luôn được làm đầy bởi dung môi cất quay hoặc sục khí nitơ để hạn chế tối đa sự oxy hóa [48] Cắn được hòa tan bằng dung môi pha động với thể tích thích hợp để tiến hành chạy HPLC

2.2 Một số kỹ thuật định lƣợng vitamin A, D, E

2.2.1 Quang phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến (UV-VIS)

UV-VIS là phương pháp định lượng nhanh, thao tác tiến hành đơn giản,

do đó phương pháp cũng được dùng để định lượng độc lập hoặc đồng thời các vitamin A, D, E trong một số chế phẩm thuốc và thực phẩm [23, 24]

Tuy nhiên phương pháp UV-VIS có nhược điểm là tính đặc hiệu không cao, nhất là khi có mặt của các tạp chất khác, nhất là các sản phẩm phân hủy của vitamin Trong thực tế, các mẫu thực phẩm sau quá trình lưu thông trên thị trường không tránh khỏi tình trạng thoái hóa, biến chất, đặc biệt là các vitamin A, D, E vốn rất dễ bị oxy hóa

2.2.2 Điện di mao quản

Điện di mao quản từng được sử dụng rộng rãi trong thập kỷ trước để phân tách và xác định nhiều hoạt chất sinh học quan trọng, ưu điểm của

phương pháp này là có độ phân giải cao, chi phí thấp, có thể tiến hành định

lượng nhiều mẫu trong khoảng thời gian ngắn Điện di mao quản cũng được

áp dụng để định lượng các loại vitamin tan trong nước và trong dầu [30, 34,

48] Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp này là độ nhạy kém, lượng mẫu

sử dụng nhỏ dẫn đến sai số lớn khi phân tích hàm lượng lớn do hệ số pha

loãng cao

2.2.3 Sắc ký khí (GC)

Trong những năm 1960, trước khi HPLC phát triển, GC đã được ứng

dụng rộng rãi để xác định các vitamin tan trong dầu trong thực phẩm Sau đó,

với việc chuyển từ công nghệ cột nhồi sang cột mao quản thì hiệu quả ứng

dụng của kỹ thuật GC phát triển mạnh mẽ Kỹ thuật này đòi hỏi quá trình

chuẩn bị mẫu phức tạp để loại bỏ lipid, sterol và một số tạp chất khác ra khỏi

nền mẫu Đồng thời, phải dẫn xuất các vitamin này để tăng khả năng bay hơi

và tăng độ bền vững của chúng trong nhiệt độ cao [7, 27, 51]

2.2.4 Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

HPLC có một lợi thế quan trọng hơn so với GC và các kỹ thuật sắc ký

khác khi phân tích vitamin trong thực phẩm nói chung, vì HPLC có thể phát

hiện khá chọn lọc các loại vitamin, quá trình xử lý mẫu không quá phức tạp, ít

khi cần dẫn xuất hóa Với lý do trên, để xác định các vitamin tan trong dầu

nói chung với một độ chính xác và độ lặp lại chấp nhận được thì HPLC là một

phương pháp được lựa chọn hiện nay [1,2,10-18]

Bảng 1.2 Một số điều kiện sắc ký lỏng phân tích vitamin A, D, E ở Việt Nam

Dược điển Việt

Nam IV [6]

X

Chế phẩm phức tạp hoặc chứa vitamin A hàm

lượng thấp

Pha động: Methanol - ethyl acetat – nước (90 : 7 : 3); tốc độ dòng: 1,5 - 2,0

ml/phút; thể tích tiêm: 20 l; Cột C18 (25 cm  4 mm) hạt 5-10µm

X viên nén/ thuốc Pha động: Hexan-n-pentanol (997 : 3)

nhỏ

Pha động ACN + MeOH + ethyl acetat chạy gradient, tốc độ dòng thay đổi từ 0,7 đến 2,5ml/ phút, thể tích tiêm 250µm, cột

C18 25cm * 4,6mm, cỡ hạt 5µm

AOAC 992.03

Sữa công thức cho trẻ

Pha động n-hexan + isopropyl alcohol (99,92 + 0,08%), cột 25cm *4.6mm cỡ

Pha động MeOH : nước = 95 :5 (hoặc

93 :7), có sử dụng nội chuẩn D 2 ; cột pha đảo C18 đường kính 4-4,6mm,dài 25-

mỡ, margarin, các loại thực

Cao Công Khánh

(2010) [8] X X

Sữa (bột, lỏng) Pha động MeOH : nước theo gradient,

cột sắc ký pha đảo C 18 , tốc độ dòng 1ml/ phút, nhiệt độ cột 40ºC

Dược điển Mỹ 36

[55] X X X Viên nang

Pha động: n-hexan; cột 4,6mm*15mm, hạt nhồi 3µm L8; tốc độ dòng 1ml/ phút, detector UV 325nm

Pha động: n-hexan + isopropyl alcohol (99+1); cột 4,6mm*15mm, hạt nhồi 3µm L8; tốc độ dòng 1ml/ phút, detector UV

4 phút đầu pha động TFA:MeOH (95:5),

6 phút sau giảm dần TFA và duy trì đến

20 phút tỷ lệ TFA:MeOH (5:95), cuối cùng lại tăng dần TFA đến tỷ lệ

Từ bảng tóm tắt trên cho thấy, sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp rất phổ biến để định lượng các vitamin tan trong dầu, tuy nhiên một số phương pháp phân tích thường qui hướng dẫn phân tích độc lập vitamin A, D, E thì lại sử dụng cột sắc ký pha thuận, dung môi pha động là các dung môi không phân cực như n-hexan, isooctan, có thể bổ sung thêm butanol, diethylether [1, 2, 13, 15, 17] Nhược điểm của phương pháp này là dung môi độc hại, độ lặp lại của hệ thống khi sử dụng cột pha thuận thường kém hơn pha đảo, thời gian lưu thường không ổn định

Do đó, đề tài đã nghiên cứu phương pháp xử lý mẫu bằng kỹ thuật xà phòng hóa có bổ sung enzym, chiết tách vitamin bằng dung môi hữu cơ và tối

ưu hóa thông số sắc ký giúp định lượng đồng thời 3 loại vitamin A, vitamin D, vitamin E trong thực phẩm bằng HPLC, sử dụng cột phân tích pha đảo

PHẦN 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng và phương tiện nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu kiểm tra đánh giá nồng độ vitamin A, D, E bao gồm :

- Sữa công thức có vitamin A, D, E

- Thực phẩm bổ sung vi chất dinh dưỡng

2.1.2 Phương tiện nghiên cứu

2.1.2.1 Trang thiết bị, vật tư nghiên cứu

- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao UFLC với detector PDA (Shidmazu, Nhật)

- Máy cất quay chân không Eyela (Tokyorikarika, Nhật)

- Máy quang phổ hấp thụ UV-VIS UV1800 (Shidmazu, Nhật)

- Bếp cách thủy (WNB22, Memmert)

- Cân phân tích độ chính xác 0,1mg và 0,01mg AL204 (Mettler Toledo, Thụy Sĩ)

- Cân kỹ thuật độ chính xác 0,01g ML802 (Mettler Toledo, Thụy Sĩ)

- Tủ sấy Shellab (Sheldon, Mỹ)

- Pipet các loại (Hirschmanm, Đức)

- Bình định mức các loại Isolab (Đức)

- Phễu chiết (Isolab, Đức)

- Bình cất quay chân không (Schott Duran, Đức)

- Ống nghiệm thủy tinh loại 15ml (Isolab, Đức)

2.1.2.2 Hóa chất, thuốc thử

- Chuẩn Retinol 99,5% (Sigma, Mỹ)

- Chuẩn cholecalciferol 99,5% (Sigma, Mỹ)

- Chuẩn D,L-α-tocoferol 99,5% (Sigma, Mỹ)

- Methanol ≥ 99,9% (Merck, Đức)

- Tetrahydrofuran (THF) ≥ 99,9% (Merck, Đức)

- Dicloromethan ≥ 99,9% (Merck, Đức)

- N-hexan (PA, Trung Quốc)

- Petroleum ether 30:60 (PA, Trung Quốc)

- Ethanol (EtOH, PA, Trung Quốc)

- Butyl Hydroxy Toluen (BHT, PA, Trung Quốc)

- Kali hydroxid (KOH), (PA, Trung Quốc)

- Enzym alkaline protease > 500 U/g (PA, Sigma, Mỹ)

* Pha các dung dịch chuẩn

- Dung dịch chuẩn gốc: cân chính xác 20 mg chất chuẩn vitamin A, 25 mg chất chuẩn vitamin D, 500mg chất chuẩn vitamin E bằng cân phân tích hoà tan và chuyển vào 03 bình định mức 100ml, định mức bằng methanol ở nhiệt

độ phòng, lắc kỹ được các dung dịch chuẩn gốc vitamin A 200 ppm, vitamin

D 250 ppm, vitamin E 5000ppm

Các dung dịch chuẩn gốc bảo quản ở 4ºC, sử dụng ổn định được trong

6 tháng, kiểm tra lại nồng độ khi cần thiết

- Dung dịch chuẩn trung gian: Lấy chính xác 1 ml mỗi loại dung dịch chuẩn gốc vitamin A, D, E bằng pipet vào trong bình định mức 5ml, định mức tới vạch bằng methanol ở nhiệt độ phòng, lắc đều hỗn hợp, pha mới dung dịch này hàng ngày

- Dung dịch chuẩn làm việc: Từ các dung dịch chuẩn trung gian, tiến hành pha loãng vào các bình định mức sao cho được dãy chuẩn dung dịch vitamin

A, D, E có nồng độ loãng 20; 50; 100; 500; 1000, 4000 lần so với các dung dịch chuẩn gốc

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp phân tích dự kiến [11-16]

Dựa trên những phân tích trong phần Tổng quan ở trên, chúng tôi dự kiến xây dựng phương pháp phân tích đồng thời vitamin A, vitamin D, vitamin E trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC với detector PDA bao gồm các giai đoạn sau:

- Thủy phân các mẫu thực phẩm bằng KOH 20% trong ethanol với sự có mặt của enzym protease

- Chiết mẫu bằng dung môi hữu cơ thích hợp để thu dịch chiết chứa vitamin cần phân tích

- Phân tích đồng thời vitamin A, vitamin D, vitamin E bằng hệ thống HPLC

2.2.2 Tối ưu hóa điều kiện chạy sắc ký

Khảo sát các thông số sắc ký lỏng để có thể phân tích được đồng thời

cả 3 loại vitamin A, D, E cho sắc đồ cân đối, các pic tách nhau rõ ràng, thời gian phân tích phù hợp

- Cột sắc ký: Sử dụng cột sắc ký pha đảo Shodex C18M 4E (4,6mm * 250mm, kích cỡ hạt 5µm); Column No: K1590663, hãng sản xuất: Snowa Denko

- Pha động: Khảo sát thành phần và tỷ lệ pha động

- Tốc độ dòng: Khảo sát tốc độ dòng từ 0,8ml/ phút đến 2ml/ phút với các điều kiện nhiệt độ cột, thể tích tiêm cố định để lựa chọn tốc độ dòng phù hợp

- Nhiệt độ cột: Khảo sát kết quả sắc ký với sự thay đổi nhiệt độ cột từ 25ºC đến 40ºC

2.2.3 Tối ưu hóa các điều kiện tách chiết

- Khảo sát ảnh hưởng của enzym

- Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân

- Khảo sát ảnh hưởng của thời gian thủy phân

- Khảo sát ảnh hưởng của dung dịch KOH 20%

- Khảo sát ảnh hưởng của dung môi chiết

2.2.4 Thẩm định phương pháp phân tích [10, 17]

2.2.4.1 Tính chọn lọc

Tính chọn lọc cho biết sự có mặt của chất phân tích có thể phân biệt được với các chất khác trong mẫu phân tích Xác định tính chọn lọc bằng cách phân tích các mẫu trắng, mẫu trắng có thêm chất chuẩn, mẫu thử thêm chuẩn Với mẫu trắng phải không được cho tín hiệu phân tích So sánh sắc ký đồ của các mẫu để đánh giá tính chọn lọc dựa theo các tiêu chí: sự khác biệt thời gian lưu của chất phân tích giữa mẫu chuẩn và mẫu trắng thêm chuẩn không có ý nghĩa thống kê, so sánh phổ tại các điểm khác nhau trên pic sắc ký (đỉnh pic,

2 điểm tại 2/3 độ rộng của pic) để xác định độ tinh khiết của pic Độ tinh khiết pic được tính toán bằng phần mềm tích hợp sẵn với thiết bị HPLC

2.2.4.2 Khoảng tuyến tính

Xây dựng đường chuẩn tuyến tính bằng cách chạy dãy dung dịch chuẩn

có nồng độ khác nhau pha từ chuẩn gốc và chuẩn trung gian cho phù hợp để xác định khoảng nồng độ của chất phân tích trong đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa tỷ lệ diện tích pic chất phân tích/diện tích pic chất chuẩn với nồng

độ của chất đó

Phương trình hồi quy tuyến tính y = ax + b

Trong đó : y là tỷ lệ diện tích pic chất phân tích/diện tích chất chuẩn

x là nồng độ chất khảo sát Đường chuẩn xây dựng được phải có hệ số tương quan R ≥ 0,995, và

độ chệch thỏa mãn

2.2.4.3 Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)

- Giới hạn phát hiện LOD (Limit of detection) là nồng độ thấp nhất của chất phân tích có thể phát hiện được trong điều kiện thí nghiệm cụ thể Trong sắc

ký LOD có thể được xác định bằng cách thêm chuẩn có nồng độ thấp dần vào nền mẫu trắng cho đến khi thu được pic có chiều cao đáp ứng tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu nền (S/N ≈ 3) thì mức nồng độ chuẩn đó chính là LOD

- Giới hạn định lượng LOQ (Limit of quantification) là nồng độ thấp nhất của chất phân tích có trong mẫu thử có thể phát hiện được về mặt định lượng với

độ đúng và độ chụm nhận được Trong sắc ký LOQ có thể được xác định là nồng độ của chất phân tích mà tại đó tỉ lệ giữa tín hiệu của chất phân tích và tín hiệu nền bằng 10 (S/N =10) Có thể tính LOQ theo LOD theo công thức: LOQ = 10/3 * LOD

2.2.4.4 Độ lặp lại

Độ lặp lại thể hiện sự gần nhau của các kết quả đo, là mức độ thống nhất của các kết quả thử riêng biệt khi quy trình phân tích được áp dụng lặp lại trên cùng một mẫu Độ lặp lại được thể hiện bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD Tiến hành thí nghiệm lặp lại 6 lần Tính độ lệch chuẩn tương đối RSD% của hàm lượng chất phân tích Các công thức tính toán như sau:

Tiến hành thí nghiệm n lần lặp lại

x n

) x x ( SD

2 n

1 i i





x SD RSD

Thực hiện phân tích lặp lại tối thiểu 6 lần với các nền mẫu khác nhau như sữa công thức, thực phẩm bổ sung , thời gian thực hiện thí nghiệm phân tích ngắn (với cùng một người, trong cùng một ngày, trên cùng một thiết bị )

để xác định độ lặp lại của phương pháp

2.2.4.5 Độ đúng

Độ đúng đánh giá sự phù hợp của kết quả thực nghiệm so với giá trị thực (true value) hoặc được chấp nhận thực (accepted value) Độ đúng có thể được đánh giá thông qua độ thu hồi

Độ thu hồi được xác định dựa trên kĩ thuật thêm chuẩn Lượng chất chuẩn thêm vào mẫu thử phải đảm bảo sao cho nồng độ của chất cần nghiên cứu sau khi thêm chuẩn nằm trong khoảng đã khảo sát Độ thu hồi (R%) được tính như sau:

C

C C

R

Trong đó: Cm+c : Nồng độ trong mẫu thử thêm chuẩn

Cm: Nồng độ trong mẫu thử

Cc: Nồng độ chuẩn thêm Tiến hành phân tích thực nghiệm 3 lô mẫu: mẫu thử thêm chuẩn ở nồng

độ thấp, mẫu thử thêm chuẩn ở nồng độ trung bình, mẫu thử thêm chuẩn ở nồng độ cao (các mức nồng độ chuẩn thấp, trung bình, cao đều nằm trong khoảng nồng độ tuyến tính đã xác định được) Tiến hành phân tích lặp lại mỗi mẫu 6 lần và tính độ thu hồi chung là trung bình của độ thu hồi các lần làm lặp lại

2.2.5 Định lượng hàm lượng vitamin A, D, E trong một số đối tượng thực phẩm trên thị trường

Sử dụng kỹ thuật xử lý mẫu thông thường và kỹ thuật xử lý mẫu mà đề tài đã lựa chọn và tối ưu hóa để phân tích và đánh giá, so sánh kết quả

- Phân tích trên các mẫu thực phẩm bổ sung vi chất dinh dưỡng

- Phân tích trên các mẫu sữa công thức

PHẦN 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Tối ƣu hóa các điều kiện chạy sắc ký

3.1.1 Lựa chọn bước sóng phân tích

Tham khảo một số tài liệu: TCVN 8276:2010 hướng dẫn xác định vitamin E trong thực phẩm; TCVN 7081-2:2010 hướng dẫn xác định vitamin

A trong sữa bột gầy; TCVN 8973:2011 hướng dẫn xác định vitamin D trong thực phẩm và một số phương pháp thường qui khác, đề tài đã lựa chọn bước sóng phân tích vitamin A ở 325nm, vitamin D ở 265nm, vitamin E ở 292 nm [1, 2, 3] Kết quả phân tích với detector PDA ở nhiều bước sóng khác nhau cũng cho thấy vitamin A, D, E đều có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng đã chọn (Phổ hấp thụ UV của các vitamin A, D, E được thể hiện ở Phụ lục 1)

3.1.2 Lựa chọn cột sắc ký

Trong điều kiện phòng thí nghiệm, chúng tôi chọn cột sắc ký pha đảo Shodex C18, kích thước cột 4,6mm* 250mm, cỡ hạt 5µm để đánh giá Cột cho tín hiệu phân tích tốt, kết quả thu được giữa các lần tiêm lặp lại có sự sai lệch về thời gian lưu và diện tích pic không đáng kể (RSD ≤ 2%)

3.1.3 Lựa chọn dung môi pha động và thành phần pha động

Trong nhiều tài liệu nghiên cứu, MeOH, acetonitril (ACN) thường được chọn là thành phần chính của pha động trong phân tích các vitamin tan trong dầu bằng sắc ký pha đảo Tuy nhiên nếu sử dụng pha động là ACN sẽ hòa tan nhiều thành phần khác có trong dịch chiết, khi phân tích sẽ gây nhiều tạp Điều này có thể gây sai số lớn trong phân tích vitamin A, D vì hàm lượng của vitamin D trong mẫu thấp, pic của vitamin A thường xuất hiện cùng với tạp mẫu vì thời gian lưu ngắn Do đó chúng tôi quyết định chọn MeOH là thành phần chính của pha động, có khảo sát tỷ lệ bổ sung H2O và THF để xây dựng được thành phần và tỷ lệ pha động thích hợp

Khảo sát sắc ký đồ của mẫu phân tích khi thay đổi pha động theo các tỷ lệ MeOH : H2O : THF lần lượt là 95: 5: 0; 94: 5: 1; 92: 5: 3; 90: 5: 5; 85: 5: 10

Hình 3.2 Kết quả khảo sát tỷ lệ dung môi pha động MeOH : H 2 O : THF

(a) 95: 5: 0; (b) 94: 5: 1; (c) 92: 5: 3; (d) 90: 5: 5; (e) 85: 5: 10

Nhận xét: Tăng nồng độ THF trong pha động làm giảm độ nhớt và độ phân cực của pha động, rút ngắn thời gian phân tích của các chất Tuy nhiên không nên sử dụng THF ở nồng độ quá cao gây tốn dung môi, tăng độc hại với môi trường, thời gian lưu quá ngắn không đảm bảo các pic tách rời nhau hoàn toàn Quan sát các

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 min -5

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 mAU

Ch3-325nm4nm (1.00) Ch1-265nm4nm (1.00)

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 mAU

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55

60mAUCh3-325nm4nm (1.00) Ch1-265nm4nm (1.00)

sắc ký đồ trên cho thấy nồng độ THF 3-5% là thích hợp, vì các pic thu được nhọn, không doãng chân, thời gian phân tích phù hợp (chưa đầy 16 phút) Với lý do tiết kiệm dung môi phân tích, chúng tôi chọn tỷ lệ pha động cho phân tích là MeOH :

H2O : THF = 92 : 5 : 3

3.1.4 Thể tích tiêm

Thông thường chọn thể tích mẫu bơm mẫu trong khoảng 10µl đến 50 μl tùy thuộc vào hàm lượng chất phân tích trong mẫu Qua khảo sát, đề tài đã chọn thể tích tiêm mẫu là 20µl đã đảm bảo thu được tín hiệu phân tích tốt, pic cân đối, rõ nét, tạp không quá lớn

cố định giúp tăng sự ổn định của kết quả sắc ký giữa các ngày khác nhau do không ảnh hưởng bởi sự biến thiên nhiệt độ môi trường Do vậy, chúng tôi chọn nhiệt độ cột là 40ºC

Hình 3.3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ cột

(a) Pic sắc đồ ở nhiệt độ phòng (b) Pic sắc đồ ở 40ºC

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 min -5

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 mAU

Ch3-325nm4nm (1.00) Ch1-265nm4nm (1.00)