Nghiên cứu đặc điểm vi học, thành phần hóa học và tác dụng giải lo âu của cây trinh nữ móc ( mimosa diplotricha var diplotricha sauvalle)

Đánh giá độc tính cấp và tác dụng giải lo âu của dịch chiết nước toàn phần cây Trinh nữ móc.. Đánh giá độc tính cấp và tác dụng giải lo âu dịch chiết nước toàn phần phần trên mặt đất cây

MỤC LỤC 

ĐẶT VẤN ĐỀ 1 

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3 

1.1.2 Đặc điểm thực vật của loài Mimosa diplotricha C Wright ex Sauvalle 3 

1.1.2.1 Đặc điểm thực vật chi Mimosa L 3 

1.1.2.2 Đặc điểm thực vật loài Mimosa diplotricha C Wright ex Sauvalle (Mimosa invisa Mart ex Colla) [4][53][55] 4 

1.1.2.3 Đặc điểm thực vật thứ Mimosa diplotricha var diplotricha Sauvalle 5 

1.1.3 Bộ phận dùng, thu hái và chế biến 5 

1.1.4 Thành phần hóa học 5 

1.1.5 Một số nghiên cứu về tác dụng dược lý của loài Mimosa diplotricha var diplotricha Sauvalle 9 

1.1.6 Sử dụng loài Mimosa diplotricha C Wright ex Sauvalle trong y học cổ truyền 10 1.2 Tổng quan về lo âu và rối loạn lo âu 10 

1.2.1 Định nghĩa, phân loại 10 

1.2.2 Thuốc hóa dược sử dụng trong điều trị rối loạn lo âu 11 

1.2.3 Sử dụng dược liệu trong điều trị rối loạn lo âu 11 

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 

2.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu 15 

2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu 15 

2.1.2 Hóa chất 15 

2.1.3 Thiết bị 16 

2.1.4 Động vật thí nghiệm 16 

2.2 Nội dung nghiên cứu 17 

2.2.1 Nghiên cứu đặc điểm vi học phần trên mặt đất cây Trinh nữ móc 17 

Trang

2.2.2 Nghiên cứu thành phần hóa học phần trên mặt đất cây Trinh nữ móc 17 

2.2.3 Đánh giá độc tính cấp và tác dụng giải lo âu của dịch chiết nước toàn phần cây Trinh nữ móc 17 

2.3 Phương pháp nghiên cứu 17 

2.3.1 Nghiên cứu đặc điểm vi học phần trên mặt đất cây Trinh nữ móc 18 

2.3.2 Nghiên cứu thành phần hóa học phần trên mặt đất cây Trinh nữ móc 18 

2.3.3 Đánh giá độc tính cấp và tác dụng giải lo âu dịch chiết nước toàn phần phần trên mặt đất cây Trinh nữ móc 22 

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 29 

3.2 Nghiên cứu thành phần hóa học phần trên mặt đất cây Trinh nữ móc 31 

3.2.1 Định tính một số nhóm chất hữu cơ trong dược liệu 31 

3.2.4 Phân lập một số thành phần từ phân đoạn ethyl acetat 35 

3.3 Đánh giá độc tính cấp và tác dụng giải lo âu của dịch chiết nước toàn phần cây Trinh nữ móc 40 

3.3.1 Đánh giá độc tính cấp của cây Trinh nữ móc 40 

3.3.2 Đánh giá tác dụng giải lo âu của dịch chiết nước toàn phần Trinh nữ móc 42 

3.4 Đánh giá ảnh hưởng của dịch chiết nước toàn phần Trinh nữ móc đến hoạt động tự nhiên và hành vi khám phá của chuột trên thử nghiệm OFT 43 

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 46 

TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

APA Hiệp hội tâm thần Hoa Kì ( The American Psychiatric Association) BZD Benzodiazepin

BuOH Buthanol

DCM Dicloromethan

DSM-5TM Diagnostic and Statist manual of Mental disoreders ( Fifth edition)

EPM Mô hình chữ thập nâng cao (Elevated plus maze)

EtOAc Ethyl acetat

GABA Gamma amino butyric acid

GAD Rối loạn lo âu lan tỏa (Generalized anxiety disorder)

Gdl Gam dược liệu (Tính theo dược liệu khô tuyệt đối)

ICD-10 International Classification of Diseases, Tenth Revision

LD50 Lethal Dose (Liều 50% động vật thực nghiệm chết)

NMR Nuclear magnetic resonance (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân)

OFT Mô hình môi trường mở (Open frield test)

PD Rối loạn hoảng sợ (Panic disorder)

SIT Mô hình tương tác xã hội (Social interaction test)

SLTT Số lần ở trung tâm

SSRI Ức chế tái thu hồi chọn lọc serotonin (Serotonin selective reuptake

inhibitors) TGTT Thời gian ở trung tâm

DANH MỤC CÁC BẢNG

2.1 Các phản ứng hóa học áp dụng trong định tính loài Mimosa

diplotricha var diplotricha Sauvalle 18 3.1 Kết quả định tính sơ bộ các nhóm hợp chất trong loài Mimosa

diplotricha var diplotrichaSauvalle

31

3.2 Kết quả định tính flavonoid và alcaloid trong các phân đoạn của

loài Mimosa diplotricha var diplotricha Sauvalle

3.6 Kết quả khảo sát tác dụng giải lo âu của dịch chiết nước toàn

phần của dược liệu Trinh nữ móc theo mô EPM

42

3.7 Kết quả khảo sát tác dụng giải lo âu của dịch chiết nước toàn phần

Trinh nữ móc theo mô hình OFT

44

DANH MỤC CÁC HÌNH

1.1 Công thức một số flavonnoid phân lập từ loài

Mimosa diplotricha C Wright ex Sauvalle

8

2.1 Loài Mimosa diplotricha var diplotricha Sauvalle

thu hái ở Hải Dương

15

2.2 Sơ đồ chiết xuất phân đoạn phần trên mặt đất

Trinh nữ móc

21

3.1 Vi phẫu thân Mimosa diplotricha var diplotricha

Sauvalle

29

3.2 Một số đặc điểm bột phần trên mặt đất loài

Mimosa diplotricha var diplotrichaSauvalle

30

3.4 Sắc kí đồ của cắn ethyl acetat với hệ dung môi (II) 34

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Rối loạn lo âu là một bệnh lý nghiêm trọng, ảnh hưởng tới tâm sinh lý cũng như hành vi của người bệnh Bệnh có tỷ lệ mắc cao cũng như xu hướng ngày càng gia tăng [20] Hiện nay, phương pháp điều trị rối loạn lo âu chủ yếu là phối hợp liệu pháp tâm lý với thuốc giải lo âu (anxiolytics) Hạn chế lớn nhất của các thuốc có nguồn gốc hóa dược là tác dụng phụ, khả năng lệ thuộc thuốc

và phản ứng cai thuốc xảy ra khi dừng điều trị Vì vậy, sử dụng các thuốc và sản phẩm có nguồn gốc dược liệu hiện được coi là hướng tiếp cận bổ sung và thay thế cho các thuốc có nguồn gốc hóa dược trong điều trị rối loạn lo âu [42]

Cây Trinh nữ móc có tên khoa học là Mimosa diplotricha var diplotricha

Sauvalle (Họ Đậu Fabaceae) là một loài mọc hoang với sức sống mạnh mẽ, phát tán rộng rãi ở nhiều tỉnh nước ta Ở một số nước loài này được coi là loài xâm thưc có hại cần phải diệt bỏ Cây thường mọc lẫn với loài Trinh nữ (Xấu hổ)

Mimosa pudica L là một loài đã được sử dụng trong y học cổ truyền nhiều nước

để điều trị các trường hợp mất ngủ, suy nhược thần kinh Mặc dù ở Việt nam, Trinh nữ móc không được dùng làm thuốc nhưng trong y học cổ truyền của một

số nước, cây đã được sử dụng với tác dụng trấn an tinh thần Kết quả nghiên cứu

bước đầu của chúng tôi cho thấy cả 2 loài Mimosa pudica và Mimosa

diplotricha đều có tác dụng an thần, giải lo âu

Tuy nhiên cho đến nay trên thế giới mới có một số ít nghiên cứu về thành phần hóa học của Trinh nữ móc, chưa có nghiên cứu nào, đặc biệt tại Việt nam

về thành phần hóa học cũng như tác dụng làm thuốc của loại cây này Do đó để nghiên cứu sâu hơn theo định hướng tác dụng giải lo âu, nhằm mục đích có thể

đưa dược liệu này vào sử dụng, đề tài “Nghiên cứu đặc điểm vi học, thành

phần hóa học và tác dụng giải lo âu của cây Trinh nữ móc (Mimosa

diplotricha var diplotricha Sauvalle)” được thực hiện với các mục tiêu sau:

1 Mô tả được đặc điểm vi học phần trên mặt đất của loài Mimosa diplotricha

var diplotricha Sauvalle

2 Nghiên cứu thành phần hóa học phần trên mặt đất của loài Mimosa diplotricha var diplotricha Sauvalle

2

3 Đánh giá được độc tính cấp, tác dụng giải lo âu của dịch chiết toàn phần

phần trên mặt đất loài Mimosa diplotricha var diplotricha Sauvalle

3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về cây Trinh nữ móc

1.1.1 Tên gọi, vị trí phân loại của cây Trinh nữ móc

Tên khoa học: Mimosa diplotricha var diplotrichaSauvalle

Tên đồng nghĩa: Mimosa invisa [55]

Tên địa phương: Anathottawadi, padaincha (Ấn Độ), banla saet (Campuchia), duri semalu (Malaysia), makahiyang lalaki (Philippin), maiyaraap thao (Thailan), cogadrogadro (Fiji) [55]

Theo hệ thống phân loại Takhtajan 1987, Mimosa diplotricha C Wright

ex Sauvalle thuộc chi Mimosa L., phân họ Trinh nữ (Mimosoideae), Họ Đậu

(Fabaceae), bộ Đậu (Fabales), phân lớp Hoa Hồng (Rosidae), lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida), ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta), giới thực vật (Plantae) [3]

1.1.2 Đặc điểm thực vật của loài Mimosa diplotricha C Wright ex Sauvalle

1.1.2.1 Đặc điểm thực vật chi Mimosa L

Cây bụi hay cây cỏ, hiếm khi cây gỗ, thường có gai Lá kèm nhỏ, rụng sớm Lá kép lông chim, thường rất nhạy cảm Cụm hoa hình cầu hay hình trụ nhọn, đơn độc hay tụ lại thành bó, mọc ở nách lá, có cuống Hoa nhỏ, lưỡng tính, không cuống, thường 4 cánh, hình chuông, có răng cưa, tiền khai hoa van Tràng hợp ở gốc Nhị 4 - 8, rời, thò Bao phấn không có nắp Bầu nhụy chứa rất nhiều noãn, dạng sợi mảnh Quả loại đậu, hình thuôn dài hay thẳng, thường dạng phẳng - bẹt, có lông Quả thắt lại theo các hạt, có nhiều lông cứng, đốt mang một hạt Hạt hình elip hoặc hình cầu, phẳng [55]

Chi Mimosa L có khoảng 400 loài trên thế giới, phân bố chủ yếu ở khu

vực nhiệt đới châu Mỹ, Châu Phi và Châu Á [39] Ở Việt Nam có 4 loài, nguồn gốc và phân bố của 4 loài này được trình bày ở bảng 1.1[4][13][17]

4

Bảng 1.1: Các loài thuộc chi Mimosa L phân bố ở Việt Nam [13]

Tên khoa học Tên Việt Nam Nguồn gốc Phân bố ở

Vùng nhiệt đới châu Mỹ

Khắp nơi ở Việt Nam

M pigra L Mai dương,

Vĩnh Phúc, Hải Dương, Lâm Đồng

M pudica L

Trinh nữ, Trinh nữ móc, Mắc cỡ, Cỏ thẹn

Vùng nhiệt đới Châu Mỹ

Khắp nơi ở Việt Nam

M.scabrella

Benth

Trinh nữ nhám,

1.1.2.2 Đặc điểm thực vật loài Mimosa diplotricha C Wright ex Sauvalle (Mimosa invisa Mart ex Colla) [4][53][55]

Cây bụi thấp hay cây cỏ lâu năm Thường có dạng bụi dày đặc, hệ thống rễ phát triển mạnh mẽ, thường hóa gỗ ở phần gốc sát mặt đất Thân leo hoặc mọc bằng phẳng trên mặt đất, có thể cao đến 5m, 4 góc, nhiều lông, với nhiều gai uốn ngược lại mọc rải rác ngẫu nhiên dọc theo chiều dài thân, gai dài 3 - 6 mm

Lá kép lông chim, dài 10 - 15 cm, nhạy cảm khi chạm phải, có từ 4 - 9 cặp thứ diệp, dài 2 - 4,5 cm, lá mang 12 - 30 cặp lá chét, không cuống, hình thuôn dài, dài 12 mm, rộng 1,5 mm cụm hoa đầu, 1- 3 ở nách lá, dài 1 cm (có nhiều sợi

5

lông nhỏ), cuống hoa dài 5 - 10 mm Hoa lưỡng tính Đài hoa hợp Tràng hình phễu, chia 4 thùy, có lông tơ ở ngoài Nhị 8, màu hồng tím nhạt có lông tơ Quả mọc thành cụm, hơi cong, thuôn dài, có nhiều lông cứng, màu vàng nâu, tách ngang thành nhiều đoạn, đoạn có chứa một hạt Hạt phẳng, hình trứng, dài 2 -

2,5 mm, màu nâu sáng Loài này gồm 2 thứ Mimosa diplotricha var diplotricha Sauvalle và Mimosa diplotricha var odibilis Barneby

1.1.2.3 Đặc điểm thực vật thứ Mimosa diplotricha var diplotricha Sauvalle

Cây bụi cao 2-6m, thân vuông bốn cạnh mang gai móc ngược, gai dài 2,6mm Lá kép lông chim, có từ 4-9 cặp thứ diệp, mỗi thứ diệp mang từ 12-30 đôi lá chép nhỏ, có hiện tượng cụp lá khi gặp tác động Cụm hoa hình cầu màu hồng, ở nách lá, cuống dài 0,5-0,6mm, hoa có 8 nhị, hoa nở vào cuối thu Quả dẹt co gai nhỏ, thắt lại giữa các hạt, có từ 3-5 hạt Hạt hình bầu dục hay hình trứng dẹt, nâu bóng, dài 2-,36mm, rộng 1,9-2,7mm[55]

1,3-1.1.2.4 Đặc điểm thực vật thứ Mimosa diplotricha var odibilis Barneby

Giống đặc điểm của thứ Mimosa diplotricha var diplotricha Sauvalle, tuy

nhiên ở thứ này thân không mang gai móc ngược [56]

1.1.3 Bộ phận dùng, thu hái và chế biến

1 Đối với loài Mimosa diplotricha var diplotricha, ở Việt Nam, loài này

chưa được sử dụng làm thuốc Tuy nhiên, y học cổ truyền ở một số nước sử dụng rễ, lá hoặc toàn cây cho một số tác dụng dược lý khác nhau [31]

1.1.4 Thành phần hóa học

Một số nhóm hợp chất đã được phân lập từ loài này, bao gồm:

- Flavonoid: Đây là nhóm hợp chất được tìm thấy nhiều nhất Cấu trúc một

số flavonoid phân lập từ loài Mimosa diplotricha C Wright ex Sauvalle được

trình bày ở hình 1.4 [31]

OH OH

H3C

O HO

O HO

quercetin - 3 - O – arabinofuranosid (3) quercetin - 3 - O – xylopyranosid (4)

O HO

7

O HO

OH O

OH OH

O

OH

O OH

OH HO

myricetin - 3 - O – xylopyranosid (7) myricetin - 3 - O – arabinofuranosid (8)

O HO

diplotrin B (3’ - hydroxy - 3, 7,

8, 4’ - tetramethoxy - flavon) (11)

diplotrin C (2’ - hydroxy - 7, 4’, 5’ - trimethoxy - flavon) (12)

O

O OH

HO

O O

CH2OH

OH OCH3

OCH3diplotasin (4 - hydroxy - 3, 10, 11 -

OH O

OH

Alpinumisoflavon (17)

Hình 1.1 Công thức cấu tạo một số flavonoid phân lập từ loài

Mimosa diplotricha C Wright ex Sauvalle

- Hợp chất phenol:

Các hợp chất phenol đã được tìm thấy trong dịch chiết clorofom của loài

Mimosa invisa Mart ex Colla: 4 - hydroxy - 3, 5 - dimethoxy benzaldehyd; acid

Hai hợp chất nhóm lignan (salicifoliol, pinoresinol), dẫn chất coumarin (acid p

- hydroxy coumaric) và sitosterol được phân lập từ thân loài Mimosa diplotricha

C Wright ex Sauvalle [16] Ngoài ra, một aldol ester của acid béo mới có tên là 17

- O - triacontanoyl heptadecanal cũng đã được phân lập từ loài này [31]

1.1.5 Một số nghiên cứu về tác dụng dược lý của loài Mimosa diplotricha C

Wright ex Sauvalle

Cho đến nay ở Việt Nam chưa có nghiên cứu nào về tác dụng dược lý của

loài Mimosa diplotricha C Wright ex Sauvalle Một số nghiên cứu trên thế giới

về tác dụng dược lý của loài Mimosa diplotricha C Wright ex Sauvalle bao

gồm: Tác dụng chống oxy hóa, tác dụng kháng khuẩn và tác dụng chống ung thư

 Tác dụng chống oxy hóa:

Các hợp chất trong Mimosa diplotricha C Wright ex Sauvalle có tác dụng

chống oxy hóa Tác dụng này được chứng minh là do sự có mặt của một số nhóm hợp chất: flavonoid và lignan Trong đó, quercetin glucosid có tác dụng

chống oxy hóa kém hơn quercetin, salicifoliol có tác dụng tốt hơn pinoresinol [18]

nồng độ ức chế tối thiểu từ 128 - 256 μg/ml Tác dụng này được chứng minh là

do sự có mặt của hợp chất 17 - O - triacontanoyl heptadecanal cùng với 8 hợp chất đã được biết đến (β-sitosterol, β - amyrin, lupeol, 4’- O -

1.1.6 Sử dụng loài Mimosa diplotricha C Wright ex Sauvalle trong y học cổ

truyền

Trên thế giới, một số nước đã sử dụng loài Mimosa diplotricha C Wright

ex Sauvalle làm thuốc Ở Formosan, rễ hoặc toàn cây của loài Mimosa

diplotricha C Wright ex Sauvalle được sử dụng như một loại thuốc truyền

thống với các tác dụng: giảm đau, chống ung thư, chống độc, cầm máu, trấn an tinh thần Ở Cameroon, Banglades trong Dược điển quốc gia đã sử dụng nước sắc của loài này phối hợp với một số thành phần khác để điều trị viêm phế quản và hen phế quản Dịch chiết nước được sử dụng như thuốc sát trùng để súc miệng, làm dịu cơn đau răng [31]

Ở nước ta, loài này chưa được sử dụng làm thuốc mà nó chỉ được biết đến như một loài thực vật xâm lấn có hại

1.2 Tổng quan về lo âu và rối loạn lo âu

1.2.1 Định nghĩa, phân loại

Lo âu bình thường là phản xạ tự nhiên của con người trước những khó khăn và các mối đe dọa của tự nhiên, xã hội mà con người phải tìm cách vượt qua, tồn tại, vươn tới Lo âu là một tín hiệu báo động, báo trước một nguy hiểm sắp xảy đến, cho phép con người sử dụng mọi biện pháp để đương đầu với sự đe dọa

11

Lo âu bệnh lý là lo âu quá mức hoặc dai dẳng không tương xứng với sự đe dọa được cảm thấy, ảnh hưởng đến hoạt động của người bệnh, có thể kèm theo những ý nghĩ hay hành động có vẻ như quá mức hay vô lý [8]

- Phân loại rối loạn lo âu:

Theo hệ thống phân loại bệnh tật quốc tế ICD – 10 của Tổ chức Y tế thế giới (WHO, 2003) và DSM-5TM của Hiệp Hội tâm thần Hoa Kỳ (APA, 2013) thì rối loạn lo âu về cơ bản được chia thành các dạng như sau [45]:

+ Ám ảnh sợ khoảng trống, bao gồm có hoặc không có rối loạn hoảng sợ + Ám ảnh xã hội (Social phobias)

+ Ám ảnh sợ đặc hiệu/riêng lẻ (Specific phobias)

+ Rối loạn hoảng sợ (Panic disorder, PD)

+ Rối loạn lo âu lan tỏa (Generalized anxiety disorder , GAD)

+ Rối loạn hỗn hợp lo âu và trầm cảm

+ Rối loạn stress sau chấn thương

1.2.2 Thuốc hóa dược sử dụng trong điều trị rối loạn lo âu

Trong điều trị rối loạn lo âu biện pháp trị liệu tâm lý luôn luôn đi kèm với liệu pháp hóa dược[8] Các nhóm thuốc hóa dược chính được sử dụng trong điều trị rối loạn lo âu bao gồm: thuốc chống trầm cảm, các benzodiazepin và các chất chủ vận receptor 5-HT1A của serotonin [11] Gồm có:

- Các thuốc chống trầm cảm ức chế chọn lọc tái thu hồi serotonin (SSRI): fluoxetin, paroxetin, fluvoxamin, sertralin, citalopram, escitalopram

- Các thuốc chống trầm cảm ba vòng: imipramin, clomipramin, doxepin

- Các benzodiazepin (BZD): diazepam, alprazolam, clorazepam

- Chất chủ vận từng phần receptor 5-HT1A (buspiron)

1.2.3 Sử dụng dược liệu trong điều trị rối loạn lo âu

Việc sử dụng các thuốc hóa dược trong điều trị rối loạn lo âu hiện nay khá phổ biến Ưu điểm của các thuốc này là đã được chứng minh hiệu quả rõ rệt trên

12

lâm sàng Tuy nhiên, hạn chế lớn nhất của các thuốc có nguồn gốc hóa dược là các tác dụng phụ, đặc biệt khi sử dụng kéo dài, khả năng lệ thuộc thuốc, hội chứng cai thuốc xảy ra khi dừng điều trị và nguy cơ tương tác thuốc bất lợi với nhiều nhóm thuốc khác

Vì vậy sử dụng các thuốc và sản phẩm có nguồn gốc dược liệu hiện được coi là hướng tiếp cận bổ sung và thay thế cho các thuốc có nguồn gốc hóa dược trong điều trị rối loạn lo âu, đồng thời khắc phục những hạn chế của thuốc hóa dược Nghiên cứu của Kessler (2001) cho thấy 57% trong số 2055 bệnh nhân có rối loạn lo âu được phỏng vấn cho biết họ đã sử dụng dược liệu trong vòng 12 tháng trở lại để điều trị các triệu chứng của rối loạn lo âu [40]

Một số dược liệu đã được sử dụng trong y học phương Tây cũng như các nghiên cứu đánh giá tác dụng điều trị rối loạn lo âu như:

- Kava Kava (Pipermethysticum G Forst) họ Piperaceae là một loại thực vật

sống ở Thái Bình Dương, rễ được sử dụng để điều trị lo âu, căng thẳng và bồn chồn

Ngoài ra Kava Kava còn có tác dụng chống co thắt và giãn cơ, có hiệu quả trong điều trị lo âu và mất ngủ [42], [43]

- Valerian (Valeriana officinalis L.), họ Valeriaceae, còn gọi là cây nữ lang

Thân và rễ được sử dụng rộng rãi để điều trị mất ngủ, giải lo âu, an thần Cơ chế tác dụng có thể là kết quả của sự tương tác của valerian với receptor GABAA Acid valerenic đã được chứng minh là có tác dụng ức chế enzym GABA-transaminase, dẫn đến tác dụng an thần [19]

- Cây Rau má (Centella asiatica (L.) Urban), họ Apiaceae, còn gọi là cây

Liên tiền thảo, đã được sử dụng từ hàng thế kỉ trước trong y học Ayurvedic với công dụng giải lo âu, làm tinh thần thoải mái, thư giãn [16], [51] Cao cồn ethylic Rau má được chứng minh có hoạt tính chống stress, trong đó có stress gây bởi sự tạo loét dạ dày ở chuột cống trắng, giống như hoạt tính của diazepam

- Hoa khô của cây Matricaria recutita L được sử dụng nhiều ở châu Âu

và Mỹ để làm trà có tác dụng chống co thắt và an thần Trong dịch chiết nước có

1 số hợp chất có tác dụng có ái lực đáng kể với các thụ thể benzodiazepin và trong số đó đã phân lập và nhận diện được một chất là 5,7,4-trihydroxyflavone (apigenin) Apigenin cũng đã được chứng minh có tác dụng giải lo âu trong thử nghiệm mô hình chữ thập trên chuột (EPM) [48]

- Lạc tiên (Passiflora spp.), họ Lạc tiên (Passifloraceae), được sử dụng trong y

học cổ truyền của nhiều nước với tác dụng an thần, giải lo âu, chống co giật và

mất ngủ Ở châu Âu thường sử dụng hai loài P coeruela và P.incarnata Ở Brasil loài P eldulis lại được sử dụng chủ yếu dưới dạng nước ép quả Việt Nam phổ biến với loài lạc tiên P foetieda [16] Trên thế giới, đã có rất nhiều nghiên

cứu chứng minh tác dụng an thần giải lo âu của các loài lạc tiên trên các mô hình thực nghiệm trên động vật [27] Trong số các thành phần chính của lạc tiên thì flavonoid được cho là thành phần có liên quan đến tác dụng trên thần kinh Theo Miguel Coleta và các cộng sự (2006), dịch chiết nước và các flavonoid của

lá loài P eldulis có tác dụng giải lo âu, trong số đó có rhamnosylglucoside) Một sự tương quan giữa hàm lượng flavonoid trong lá P

luteolin-7-O-(2-eldulis (gồm vitexin, isovitexin, orientin và isooreientin) với tác dụng trên thần

kinh cũng được De-Paris và các cộng sự chỉ ra[25] Chrysin được phân lập từ P

incarnata cũng được chứng minh là có tác dụng giải lo âu rõ rệt ở mức liều 1

mg/kg thể trọng chuột và cơ chế của nó có thể liên quan đến sự kích thích receptor GABAA [54]

14

- Cao lá Ginkgo biloba L (bạch quả) cũng được chứng minh là có tác dụng

làm giảm triệu chứng ở những bệnh nhân rối loạn lo âu lan tỏa (GAD) [52] Hướng nghiên cứu tác dụng dược lý hướng giải lo âu trên các mô hình thực nghiệm cũng đã bước đầu được triển khai bởi một số nhóm nghiên cứu trên các dược liệu hoặc một số công thức phối hợp dược liệu và chế phẩm có nguồn gốc dược liệu tại Việt Nam Nguyễn Thị Thu Hương và cộng sự đã xác định được majonosid R2 là hoạt chất quan trọng quyết định tác dụng giải lo âu và chống trầm cảm của nhân sâm do nguyên nhân stress trên chuột [5] Nhóm nghiên cứu của Nguyễn Ngọc Khôi, Võ Phùng Nguyên đã áp dụng thành công các mô hình: môi trường mở, chữ thập nâng cao và ngăn sáng/ tối để đánh giá tác dụng giải lo

âu của các tinh dầu từ vỏ quả cây chi Citrus [1], của phối hợp các dược liệu Rau

má, quế và nhân sâm [16] Nhóm nghiên cứu Bộ môn Dược lực trường Đại học Dược Hà Nội cũng đã triển khai mô hình đánh giá tác dụng giải lo âu trên mô hình chữ thập nâng cao ở chuột bình thường và ở chuột stress do cô lập và đã áp dụng để đánh giá tác dụng của chế phẩm Sleepy care [9]

15

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG

PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu

* Mẫu nghiên cứu

Phần trên mặt đất của Trinh nữ móc được thu hái ở huyện Cẩm Giàng, tỉnh Hải Dương vào tháng 10 năm 2015 Mẫu đã được ThS Nghiêm Đức Trọng bộ

môn Thực vật trường Đại học Dược Hà Nội giám định tên khoa học là Mimosa

diplotricha var.diplotricha Sauvalle Tiêu bản Trinh nữ móc có mã số

HNIP/18161/16 được lưu tại phòng tiêu bản bộ môn Thực vật trường Đại học Dược Hà Nội

Hình 2.1 Mimosa diplotricha var diplotricha Sauvalle thu hái ở Hải

- Bản mỏng silicagel GF254 (Merck) pha thường tráng sẵn

- Bột silicagel pha thường cỡ hạt 40 - 60µm

- Mô hình chữ thập nâng cao, bộ môn Dược lực, trường Đại học Dược Hà Nội

- Mô hình môi trường mở (OFT), bộ môn Dược lực, Đại học Dược Hà Nội

- Các dụng cụ bắt giữ động vật, bơm và kim đầu tù để cho động vật uống mẫu thử

- Đồng hồ bấm giây, camera quan sát

2.1.4 Động vật thí nghiệm

Chuột nhắt trắng, chủng Swiss albino khỏe mạnh, 4 tuần tuổi, trọng lượng 20 ± 2g được cung cấp bởi Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương Chuột được chia lô ngẫu nhiên 9-10 con/lô, nuôi ổn định trong điều kiện thí nghiệm ít nhất 5 ngày trước khi tiến

17

hành nghiên cứu, uống nước tự do, nuôi bằng thức ăn tiêu chuẩn do Viện vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Nghiên cứu đặc điểm vi học phần trên mặt đất cây Trinh nữ móc

- Nghiên cứu đặc điểm vi phẫu thân cây Trinh nữ móc

- Nghiên cứu đặc điểm bột dược liệu phần trên mặt đất cây Trinh nữ móc

2.2.2 Nghiên cứu thành phần hóa học phần trên mặt đất cây Trinh nữ móc

- Định tính sơ bộ các nhóm chất trong dược liệu bằng các phản ứng hóa học[6][10]

- Định tính các nhóm chất trong dược liệu bằng sắc ký lớp mỏng

- Phân lập và nhận dạng một số thành phần từ phân đoạn ethyl acetat dựa trên các dữ liệu phổ khối (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) một chiều và hai chiều

2.2.3 Đánh giá độc tính cấp và tác dụng giải lo âu của dịch chiết nước toàn phần cây Trinh nữ móc

- Đánh giá độc tính cấp của dịch chiết nước toàn phần cây Trinh nữ móc

- Đánh giá tác dụng giải lo âu của dịch chiết toàn phần phần trên mặt đất cây Trinh nữ móc

2.3 Phương pháp nghiên cứu

* Thu mẫu, xử lý và bảo quản mẫu

- Mẫu dược liệu được thu hái vào thời kỳ cây đã ra hoa và kết quả Mẫu được định danh khoa học và lưu tiêu bản tại phòng tiêu bản bộ môn Thực vật, trường Đại học Dược Hà Nội

- Mẫu dược liệu cắt vi phẫu dùng mẫu tươi hoặc mẫu khô bảo quản trong hỗn hợp cồn : nước (1:1)

2.3.1 Nghiên cứu đặc điểm vi học phần trên mặt đất cây Trinh nữ móc

2.3.1.1 Nghiên cứu đặc điểm vi phẫu thân cây

- Quan sát, mô tả đặc điểm hình thái, cắt vi phẫu tẩy, nhuộm và chụp ảnh các đặc điểm vi phẫu thân dược liệu

2.3.1.2 Nghiên cứu đặc điểm bột dược liệu

- Quan sát, mô tả đặc điểm cảm quan bột, làm tiêu bản bột và chụp ảnh các đặc điểm bột phần trên mặt đất cây Trinh nữ móc

2.3.2 Nghiên cứu thành phần hóa học phần trên mặt đất cây Trinh nữ móc

2.3.2.1 Định tính sơ bộ các nhóm chất trong dược liệu bằng các phản ứng hóa học [6][10]

Bằng các phản ứng hóa học các phản ứng định tính được trình bày trong bảng 2.1

Bảng 2.1 Các phản ứng hóa học áp dụng trong định tính loài Mimosa

diplotricha var diplotricha Sauvalle

19

2 Glycosid tim

+ Phản ứng Liebermann + Phản ứng Baljet

+ Phản ứng Legal + Phản ứng Keller – Killiani

+ Phản ứng Cyanidin + Phản ứng với dung dịch natri hydroxyd 10% + Phản ứng với hơi ammoniac

+ Phản ứng với dung dịch sắt (III) clorid

+ Phản ứng đóng mở vòng lacton + Phản ứng diazo hóa

+ Phản ứng quan sát huỳnh quang

5 Saponin + Phản ứng quan sát hiện tượng tạo bọt

+ Phản ứng với dung dịch chì acetat 10%

+ Phản ứng với dung dịch sắt (III) clorid 5% + Phản ứng với dung dịch gelatin 1%

8 Acid hữu cơ + Phản ứng với bột natri cacbonat

9 Acid amin + Phản ứng với thuốc thử ninhydrin 3%

10 Đường khử + Phản ứng với thuốc thử Fehling A + B

11 Polysaccharid + Phản ứng với thuốc thử Lugol

12 Caroten + Phản ứng với thuốc thử acid sulfuric đậm đặc

14 Chất béo + Hơ nóng và quan sát vết mờ trên giấy lọc

21

Chiết phân đoạn theo sơ đồ sau:

+ Nước (đun sôi 3 lần x 60 phút)

Cô

+ n-hexan

Cất thu hồi dung môi + EtOAc

Hình 2.2: Sơ đồ chiêt xuất phân đoạn phần trên mặt đất cây Trinh nữ móc

Dược liệu Trinh nữ móc

Dịch chiết nước toàn phần

Cắn nước Lớp EtOAc

Cất thu hồi dung môi Cô

22

* Định tính các phân đoạn bằng phản ứng hóa học

Các phân đoạn được xác định sự có mặt của các nhóm chất dựa trên kết quả định tính sơ bộ các nhóm chất trong dược liệu

* Định tính phân đoạn bằng SKLM

Phân đoạn chứa nhóm chất chính được định tính bằng SKLM

+ Dịch chấm sắc kí: Mẫu phân tích được hòa tan trong methanol

+ Bản mỏng silicagel GF254 (Merk) tráng sẵn được hoạt hóa ở 110oC trong 1h + Khai triển với hệ dung môi thích hợp

+ Hiện màu bằng thuốc thử đặc hiệu

+ Tiến hành: Chấm dich phân tích lên bản mỏng đã hoạt hóa và để nguội, sấy nhẹ cho khô, đặt bản mỏng vào bình sắc kí đã bão hòa dung môi Sau khi triển khai lấy bản mỏng ra khỏi bình, sấy nhẹ cho bay hơi hết dung môi Quan sát tại các điều kiện: ánh sáng thường, UV254nm, UV365nm Sau đó phun thuốc thử Sau khi phun thuốc thử, sấy bản mỏng ở nhiệt độ thích hợp và quan sát dưới ánh sáng thường và UV254nm, UV365 nm

2.3.2.3 Phân lập và nhận dạng một số thành phần từ phân đoạn chứa nhóm chất chính

Phân lập bằng phương pháp sắc ký cột với chất nhồi cột là silicagel Nhận dạng các chất phân lập được dựa trên các dữ liệu phổ khối (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) một chiều và hai chiều

2.3.3 Đánh giá độc tính cấp và tác dụng giải lo âu dịch chiết nước toàn phần phần trên mặt đất cây Trinh nữ móc

23

500g trinh nữ móc sau khi phơi khô, thái nhỏ đem đi chiết bằng phương pháp sắc với nước 3 lần (60 phút/lần) Lọc nóng, gộp dịch chiết Cô dịch chiết đến cao 10: 1 để làm mẫu thử cho chuột uống

- Chuột nhắt trắng được nhịn ăn 3 giờ trước khi thử nghiệm, nước uống theo nhu cầu Kiểm tra cân nặng trước khi thử nghiệm

- Cách dùng: đưa mẫu thử theo đường uống Lấy thể tích mẫu thử theo dự kiến đưa thẳng vào dạ dày chuột bằng kim cong đầu tù

- Thể tích mẫu thử dùng theo đường uống: 0,2ml/10 g chuột

- Số lần cho động vật uống: 2 lần/ 24 giờ, mỗi lần cách nhau 2 giờ

- Sau khi uống thuốc 2 giờ, chuột được cho ăn trở lại

- Sau khi thăm dò trên một số chuột hạn chế (thử nghiệm thăm dò), động vật thí nghiệm được chia thành từng lô, mỗi lô 10 động vật (thử nghiệm chính thức) Tùy theo kết quả của thử nghiệm thăm dò để lựa chọn các mức liều cho thử nghiệm chính thức Thông thường, thiết kế thí nghiệm với lô đầu uống liều tối đa không gây chết động vật nào và lô cuối cùng uống liều tối thiểu gây chết toàn bộ động vật

- Theo dõi động vật trong vòng 14 ngày sau khi dùng mẫu thử (theo dõi chuột liên tục trong vòng 4 giờ, theo dõi thường xuyên trong vòng 72 giờ sau lần uống chế phẩm thử cuối cùng)

 Theo dõi, đánh giá

- Theo dõi động vật trong vòng 72 giờ sau khi uống thuốc, ghi chép lại các thông số sau:

+ Tình trạng chung của chuột: hoạt động tự nhiên, tư thế, màu sắc (mũi, tai, đuôi), lông, phân, nước tiểu

+ Sự tiêu thụ thức ăn, nước uống

24

+ Số động vật chết: Xác định tỷ lệ động vật chết ở các lô trong vòng 72 giờ để tính toán LD50

+ Khi có động vật chết, mổ để quan sát đại thể các cơ quan phủ tạng Nếu cần, làm thêm vi thể để xác định nguyên nhân

- Tiếp tục theo dõi động vật trong cho đến 14 ngày sau khi uống chế

phẩm thử

2.3.3.2 Đánh giá tác dụng giải lo âu của dịch chiết nước toàn phần của trinh

nữ móc

* Chuẩn bị mẫu thử

- Chuẩn bị dịch chiết: Dịch chiết nước toàn phần của Trinh nữ móc

(Mimosa diplotricha var diplotricha) thu được bằng phương pháp sắc với dung

môi là nước, bay hơi bớt dung môi đến dạng cao lỏng 1 : 1 (1 g/ml)

- Chuột nhắt trắng đã được nuôi ổn định, có trọng lượng tương đối đều nhau

- Điều kiện thí nghiệm:

Tất cả các thí nghiệm đều được tiến hành trong phòng riêng biệt, yên tĩnh tại khu chăn nuôi động vật thí nghiệm của trường Đại học Dược Hà Nội Thời gian tiến hành thí nghiệm trong khoảng từ 8h - 17h Cường độ chiếu sáng trong thời gian làm thực nghiệm được duy trì bằng 1 bóng đèn 60W

độ chiếu sáng trong thời gian làm thực nghiệm được duy trì bằng hai bóng đèn 60W

25

Hình 2.3: Mô hình chữ thập nâng cao

* Triển khai mô hình

Tiến hành: chuột được chia ngẫu nhiên thành các lô và cho uống thuốc thử tương ứng trong 5 ngày, mỗi ngày 1 lần vào 8h:

+ Lô 1: uống natri clorid 0,9%

+ Lô 2: uống diazepam với liều 2 mg/kg chuột

+ Lô 3: uống dịch chiết nước Trinh nữ móc với liều 4,8 g dược liệu/kg thể trọng chuột ( tính theo dược liệu khô tuyệt đối)

+ Lô 4: uống dịch chiết nước Trinh nữ móc với liều 9,6 g dược liệu/kg thể trọng chuột (tính theo dược liệu khô tuyệt đối)

+ Lô 5: Uống dịch chiết nước Trinh nữ móc với liều 14,4 g dược liệu/kg thể trọng chuột (tính theo dược liệu khô tuyệt đối)

Ngày thứ 5 sau khi uống thuốc 1h, chuột được đặt nhẹ nhàng vào vùng trung tâm, mặt hướng về cánh tay hở, sau đó chuột được tự do di chuyển khám phá trong 5 phút Sử dụng camera ghi nhận các hoạt động của chuột Sau khi tiến hành thí nghiệm với mỗi chuột, dụng cụ thí nghiệm được lau sạch bằng khăn tẩm cồn trước khi tiến hành với chuột tiếp theo để tránh lưu giữ mùi Kết quả được ghi nhận dựa trên phân tích video sau thí nghiệm

26

- Chỉ tiêu đánh giá: Thời gian lưu lại tay hở, số lần vào tay hở, và/ hoặc tay kín của chuột Trong đó, chuột được coi là ở trong 1 cánh tay khi cả 4 chân đều nằm trong cánh tay đó

Thuốc được coi là có tác dụng giảm lo âu khi làm tăng có ý nghĩa thời gian lưu lại tay hở hoặc số lần đi vào tay hở đồng thời không ảnh hưởng tới hoạt động tự nhiên so với lô chứng

* Đánh giá ảnh hưởng trên vận động tự nhiên trên mô hình OFT

Hình 2.4: Mô hình môi trường mở

27

*Phương pháp tiến hành

Chuột được chia ngẫu nhiên thành các lô Trong các ngày làm thí nghiệm, chuột được đặt nhẹ nhàng vào chính giữa vùng trung tâm hướng về phía 1 cạnh của môi trường mở, sau đó chuột được tự do di chuyển khám phá trong 5 phút

Sử dụng camera ghi nhận các hoạt động của chuột Sau khi tiến hành thí nghiệm với mỗi chuột, dụng cụ thí nghiệm được lau sạch bằng khăn tẩm cồn trước khi tiến hành với chuột tiếp theo để tránh lưu giữ mùi Kết quả được ghi nhận dựa trên phân tích video sau thí nghiệm Chuột được coi là không bị ảnh hưởng tới hoạt động tự nhiên khi không tăng/giảm có ý nghĩa tới các chỉ tiêu đánh giá của

* Phương pháp xử lý số liệu và tính toán kết quả

Dữ liệu được lưu trữ, phân tích bằng phần mềm SPSS 20.0

Tiến hành kiểm chuẩn mẫu trước khi xử lý Trường hợp mẫu không tuân theo phân bố chuẩn kết quả được biểu diễn dưới dạng m(a;b) trong đó m là trung

vị, a và b lần lượt là 2 khoảng tứ phân vị 25% và 75% Mẫu không tuân theo

28

phân bố chuẩn và các mẫu không liên tục được kiểm định bằng test phi tham số Kruskal – Wallis, sau đó là Mann – Whitney U test để so sánh sự khác biệt giữa các lô, p < 0,05 là sự khác biệt được coi là có ý nghĩa thống kê

29

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 Nghiên cứu đặc điểm vi học phần trên mặt đất loài M diplotricha var

diplotricha Sauvalle

3.1.1 Đặc điểm vi phẫu thân Mimosa diplotricha var diplotricha Sauvalle

Mặt cắt ngang thân có tiết diện vuông, lồi nhiều ở bốn góc thân Quan sát

từ ngoài vào trong thấy: Ngoài cùng là lớp biểu bì (1) gồm một hàng tế bào hình chữ nhật xếp xít nhau mang lông che chở đơn bào (2) Tiếp đến là mô dày (3)

gồm 7 - 8 hàng tế bào hình bầu dục, có thành dày và phát triển ở những chỗ lồi

của thân Sát trong lớp mô dày là mô mềm vỏ (4) gồm 1 - 2 hàng tế bào thành

mỏng hơn hình bầu dục, thuôn dài Ở các chỗ lồi lớp mô mềm bị ép bẹp hầu như

không nhìn thấy Tiếp theo là mô cứng (5) xếp thành vòng liên tục, dày hơn ở

những chỗ lồi và mỏng hơn ở các phần còn lại Sát trong mô cứng là vòng libe

cấp 2 xếp liên tục (6) Tầng phát sinh libe - gỗ (7) Gỗ cấp 2 (8) và Mô mềm ruột

(9) (10) chiếm phần lớn vi phẫu gồm những tế bào hình bầu dục, thành mỏng

Hình 3.1 Vi phẫu thân Mimosa diplotricha var diplotricha Sauvalle

30

3.1.2 Đăc điểm bột phần trên mặt đất loài Mimosa diplotricha var

diplotricha Sauvalle

Bột màu vàng xanh, mùi hắc, vị đắng Quan sát dưới kính hiển vi thấy:

Lông che chở đơn bào (1) Mảnh biểu bì mang lông che chở (2) Mảnh biểu bì

(3) các tế bào hơi dẹt Mảnh mạch xoắn (4) Mảnh mạch điểm (5) Lỗ khí (6), (7) thường nằm trong các mảng biểu bì lá.Mảnh gai (8) Mảnh mô dày (9) các tế

bào có thành dày lên Mô mềm (10) các tế bào có thành mỏng, có thể không còn nguyên vẹn Hạt phấn (11) và tinh thể calci oxalat hình khối(12)

Hình 3.2 Một số đặc điểm bột dược liệu phần trên mặt đất loài M diplotricha var.diplotricha Sauvalle

Chú thích: 1 Lông che chở, 2 Mảnh biểu bì mang lông che chở, 3

Mảnh biểu bì, 4,5 Mảnh mạch, 6,7 Lỗ khí, 8 Gai, 9 Mảnh

mô dày, 10 Mảnh mô mềm, 11 Hạt phấn, 12 Tinh thể calci oxalat

31

3.2 Nghiên cứu thành phần hóa học phần trên mặt đất cây Trinh nữ móc 3.2.1 Định tính một số nhóm chất hữu cơ trong dược liệu

Kết quả định tính sơ bộ các nhóm chất hữu cơ trong loài M diplotricha var

diplotricha Sauvalle được trình bày ở phụ lục 3 và được tóm tắt tại bảng 3.1

Bảng 3.1: Kết quả định tính sơ bộ các nhóm chất hữu cơ trong loài M

diplotricha var diplotricha Sauvalle

+ Phản ứng với thuốc thử Dragendorff + + Phản ứng với thuốc thử Bouchardat +

+ Phản ứng với dung dịch sắt (III)

8 Acid hữu cơ + Phản ứng với bột natri cacbonat -

9 Acid amin + Phản ứng với thuốc thử ninhydrin 3% +

10 Đường khử + Phản ứng với thuốc thử Fehling A, B +

11 Polysaccharid + Phản ứng với thuốc thử Lugol -

12 Caroten + Phản ứng với thuốc thử acid sulfuric

- Phần trên mặt đất loài M diplotricha C Wright ex Sa có chứa alcaloid,

flavonoid, acid amin, đường khử, sterol

3.2.2 Định tính cắn các phân đoạn bằng phản ứng hóa học

Từ dịch chiết nước toàn phần mang chiết phân đoạn với các dung môi có

độ phân cực tăng dần n-hexan, ethyl acetat theo phương pháp chiết lỏng – lỏng Cắn các phân đoạn được sử dụng làm định tính phân đoạn bằng phản ứng hóa học và SKLM

33

Từ kết quả định tính sơ bộ ở mục 3.2.1, tiến hành định tính 2 nhóm hoạt chất

flavonoid và alcaloid trong 3 phân đoạn n-hexan, ethyl acetat và phân đoạn nước

còn lại sau khi chiết với dung môi hữu cơ Kết quả được trình bày ở bảng 3.2

Bảng 3.2: Kết quả định tính flavonoid và alcaloid trong các phân đoạn của

loài M diplotricha var diplotricha Sauvalle

Nhóm chất Phản ứng với thuốc

thử

Kết quả Phân đoạn

n-hexan

Phân đoạn ethyl acetat

Phân đoạn nước

Bằng các phản ứng hóa học thường quy, kết quả cho thấy phân đoạn

n-hexan không có mặt hai nhóm chất flavonoid và alcaloid, phân đoạn ethyl acetat

chứa flavonoid, phân đoạn nước còn lại chứa alcaloid Trong khuôn khổ luận

văn này chúng tôi tập trung nghiên cứu thành phần flavonoid trong phân đoạn

ethyl acetat

34

3.2.3 Định tính phân đoạn ethyl acetat bằng sắc kí lớp mỏng

- Chuẩn bị dịch chấm sắc kí: Cắn ethyl acetat được hòa tan trong methanol

- Bản mỏng: Bản mỏng tráng sẵn silicagel GF254 được hoạt hóa ở 110oC trong 1giờ Khảo sát một số hệ dung môi pha động:

I Cloroform-ethyl acetat: (6:4)

II Dicloromethan- methanol-acid formic: (30:4:0,2)

III n-hexan – ethyl acetat: (5:5)

- Tiến hành : Chấm dịch sắc kí bằng máy Linomat V, khai triển trong bình sắc kí đã bão hòa dung môi Sau khi khai triển, lấy bản mỏng ra, sấy khô, quan sát dưới ánh sáng thường, ánh sáng tử ngoại ở 2 bước sóng =254nm, =365nm

và hiện màu bằng thuốc thử NP/PEG, sấy nhẹ bản mỏng cho khô, quan sát dưới ánh sáng thường và ánh sáng tử ngoại

Kết quả cho thấy hệ dung môi Dicloromethan- methanol-acid formic: (30:4:0,2) cho khả năng tách tốt nhất Hình ảnh sắc ký đồ được trình bày ở hình 3.4

Hình 3.4 Sắc kí đồ của cắn ethyl acetat với hệ dung môi (II)

Chú thích:

1 Không phun TT, AST; 3 Không phun TT,UV 254 nm ; 5 Không phun TT, UV 365nm ;

2 Phun TT, AST; 4 Phun TT, UV 254 nm ; 6 Phun TT, UV 365nm

35

Hình ảnh sắc ký đồ dịch chiết phân đoạn ethyl acetat cho thấy khi chưa phun thuốc thử NP/PEG có 3 vết màu vàng khi quan sát dưới ánh sáng thường, 6 vết chất khi quan sát ở UV254 nm và 7 vết có huỳnh quang tím, xanh lơ khi quan sát

đặc biệt là trên hình ảnh sắc ký đồ còn xuất hiện thêm 2 vết vàng tươi đậm (Rf=0,518; 0,627), 3 vết màu da cam (Rf= 0,084; 0,152; 0,230)

Như vậy kết quả SKLM một lần nữa khẳng định sự có mặt của các flavonoid trong phân đoạn ethyl acetat

3.2.4 Phân lập một số thành phần từ phân đoạn ethyl acetat

* Chiết xuất:

Từ 700g dược liệu khô (độ ẩm 8,37%) sau khi chiết với nước đến cao lỏng 1:1, tiến hành chiết phân đoạn với các dung môi n-hexan, ethyl acetat Kết quả thu được 3,50 g cắn phân đoạn n-hexan, 7,60 g cắn phân đoạn ethyl acetat

và 22,54 g cắn phân đoạn nước

* Phân lập:

Từ 7,60g cắn ethyl acetat thu được từ chiết phân đoạn, chạy cột sắc ký pha thuận Chất nhồi cột 200g silicagel 60 Hệ dung môi dicloromethan-methanol-acid formic (30:4:0,5)

- Phân đoạn ống 42-48, trên sắc ký đồ cho 1 vết chất có huỳnh quang màu vàng tươi sau khi phun thuốc thử NP/PEG Kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng với các hệ dung môi

+ dicloromethan-methanol-acid formic (30:4:0,5)

+ cloroform-methanol (7:1)

+ ethyl acetat- acid formic- nước (8:1:1)

Gộp các phân đoạn trên, bay hơi dung môi thu được 4,2mg một chất bột màu vàng tươi ký hiệu MD03