nghiên cứu tác dụng diệt khuẩn in vitro và ứng dụng điều trị bệnh viêm tử cung trên chó của dịch chiết cây đơn đỏ excoecaria cochinchinensis lour

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM --- --- PHẠM THỊ DUNG NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG DIỆT KHUẨN IN VITRO VÀ ỨNG DỤNG ĐIỀU TRỊ BỆNH VIÊM TỬ CUNG TRÊN C

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

- -

PHẠM THỊ DUNG

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG DIỆT KHUẨN IN VITRO

VÀ ỨNG DỤNG ĐIỀU TRỊ BỆNH VIÊM TỬ CUNG TRÊN CHÓ CỦA DỊCH CHIẾT CÂY ĐƠN ĐỎ

“EXCOECARIA COCHINCHINENSIS LOUR”

LUẬN VĂN THẠC SĨ

HÀ NỘI, NĂM 2015

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

- -

PHẠM THỊ DUNG

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG DIỆT KHUẨN IN VITRO

VÀ ỨNG DỤNG ĐIỀU TRỊ BỆNH VIÊM TỬ CUNG TRÊN CHÓ CỦA DỊCH CHIẾT CÂY ĐƠN ĐỎ

“EXCOECARIA COCHINCHINENSIS LOUR”

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa hề được công bố trong bất cứ công trình nghiên cứu nào khác

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cảm

ơn và các thông tin trích dẫn, tài liệu tham khảo đều được chỉ rõ nguồn gốc trong danh mục tài liệu tham khảo của luận văn

Hà Nội, ngày tháng năm 2015

Tác giả luận văn

Phạm Thị Dung

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này, ngoài sự nỗ lực thực sự của bản thân, tôi đã luôn nhận được sự giúp đỡ, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo trong Khoa Thú y, Khoa

Công nghệ sinh học, Ban quản lý đào tạo - Học viện Nông nghiệp Việt Nam

Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới hai thầy hướng dẫn khoa học TS

Sử Thanh Long, TS Nguyễn Thanh Hải đã tận tình giúp đỡ, chỉ bảo và hướng dẫn tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thiện luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn sự quan tâm của ban lãnh đạo, các thầy cô giáo trong bộ môn Ngoại Sản - Khoa thú y, bộ môn Công nghệ sinh học thực vật – Khoa Công nghệ sinh học; tập thể cán bộ, kỹ thuật viên phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Sinh học Thú y đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu

Tôi xin được cảm ơn tập thể cán bộ, bác sĩ Bệnh xá thú y – Viện thú y Quốc gia

đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài tại cơ sở

Nhân dịp này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân, bạn

bè, những người luôn tạo điều kiện, động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Hà Nội, ngày tháng năm 2015

Tác giả luận văn

Phạm Thị Dung

1.2 Thú cưng (chó, mèo) – một trong những nguồn lây lan vi khuẩn kháng thuốc 51.3 Xu thế phát triển và sử dụng thuốc có nguồn gốc thiên nhiên ở Việt Nam 7

1.5.2 Nguyên nhân, cơ chế, hậu quả của viêm tử cung 18Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀPHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

3.1.2 Tình hình mắc bệnh viêm tử cung theo giống 333.1.3 Tình hình mắc bệnh viêm tử cung theo nhóm tuổi 363.1.4 Tình hình mắc bệnh viêm tử cung theo lứa đẻ 373.2 Kết quả phân lập và kháng sinh đồ của vi khuẩn phân lập từ dịch viêm tử

3.2.1 Kết quả phân lập vi khuẩn từ dịch viêm tử cung chó 39

3.2.2 Kiểm tra kháng sinh đồ vi khuẩn E coli và Staphylococcus spp phân

3.3 Hiệu suất chiết xuất lá cây Đơn đỏ trong các dung môi 413.4 Định tính xác định một số nhóm hoạt chất trong cao khô dịch chiết lá cây

3.5 Đánh giá khả năng kháng khuẩn in vitro của dịch chiết trong các dung môi

khác nhau với vi khuẩn phân lập từ dịch viêm tử cung chó 493.5.1 Khả năng diệt khuẩn in vitro của dịch chiết trong các dung môi khác

nhau trên vi khuẩn Staphylococcus spp phân lập từ dịch viêm tử cung 493.5.2 Khả năng diệt khuẩn in vitro của dịch chiết trong các dung môi khác

nhau trên vi khuẩn E coli phân lập từ dịch viêm tử cung chó 51

3.6 Đánh giá khả năng diệt khuẩn in vitro của dịch chiết lá cây Đơn đỏ trong

Đ/c DMSO Đối chứng Dimethyl sulfoxide

D1, D2, D3 Đường kính vòng vô khuẩn của các lần thử 1,2,3

Dtb Đường kính vòng vô khuẩn trung bình

MIC Nồng độ ức chế tối thiểu

WHO Tổ chức y tế thế giới

DANH MỤC BẢNG

STT Tên bảng Trang

2.1 Thành phần môi trường LB (Luria Bertani) lỏng 22

2.2 Thành phần môi trường LB (Luria Bertani) đặc 23

3.1 Tỷ lệ mắc các bệnh sản khoa thường gặp trên chó 32

3.2 Tình hình mắc bệnh viêm tử cung theo giống 35

3.3 Tình hình mắc bệnh viêm tử cung theo nhóm tuổi 36

3.4 Tình hình mắc viêm tử cung theo lứa đẻ 37

3.5 Kết quả phân lập vi khuẩn trong dịch viêm tử cung 39

3.6 Kết quả kiểm tra kháng sinh đồ của vi khuẩn phân lập 40

3.7 Hiệu suất chiết suất lá cây đơn đỏ trong các dung môi 44

3.8 Kết quả xác định hoạt chất của dịch chiết có trong các dung môi 46

3.9 Khả năng diệt khuẩn của dịch chiết trong các dung môi khác nhau với vi khuẩn Staphylococcus spp. 49

3.10 Khả năng diệt khuẩn của dịch chiết trong các dung môi khác nhau với vi khuẩn E coli 52

3.11 Khả năng diệt khuẩn in vitro của dịch chiết lá cây Đơn đỏ trong dung môi acetic acid pha loãng 53

3.12 Kết quả thử nghiệm điều trị chó mắc bệnh viêm tử cung 57

DANH MỤC HÌNH ẢNH

2.2 Lá Đơn đỏ tươi và bột lá đơn đỏ sau khi làm khô và nghiền nhỏ 242.3 Hệ nồng độ pha loãng cao đặc để xác định nồng độ tối thiểu tác

3.3 Dịch chiết lá đơn đỏ thu được từ các loại dung môi khác nhau 433.4 Một số phản ứng định tính các nhóm hoạt chất trong dịch chiết 483.5 Khả năng diệt khuẩn in vitro của dịch chiết lá cây Đơn đỏ trong

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

3.1 Tỷ lệ mắc bệnh sản khoa 33

3.2 Tỷ lệ mắc bệnh viêm tử cung theo nhóm tuổi 36

3.3 Tỷ lệ mắc bệnh viêm tử cung theo lứa đẻ 38

3.4 Hiệu suất chiết xuất lá đơn đỏ bởi các dung môi khác nhau 45

3.5 Khả năng diệt khuẩn của dịch chiết trong các dung môi khác nhau với vi khuẩn Staphylococcus spp. 50

3.6 Khả năng diệt khuẩn của dịch chiết trong các dung môi khác nhau với vi khuẩn E coli 52

3.7 Kết quả điều trị thử nghiệm trên chó mắc bệnh viêm tử cung 56

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Hiện nay trong số các bệnh thường gặp trên chó chúng tôi đặc biệt quan tâm đến bệnh viêm tử cung, bệnh đang diễn ra ngày càng phổ biến gây ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe, sức sinh sản, khả năng duy trì nòi giống, thậm chí gây chết cho động vật nếu không được điều trị kịp thời Tuy nhiên trong thực tế điều trị hiện nay, hiện tượng kháng thuốc kháng sinh diễn ra ngày càng phức tạp làm giảm hiệu quả điều trị Bên cạnh đó quyền lợi động vật trong những năm gần đây rất được chú trọng, đặc biệt đối với động vật cảnh như chó và mèo, sự chăm sóc gần gũi cũng như sử dụng các loại thuốc kháng sinh cho những đối tượng này

là một trong những nguyên nhân gây làm lây lan rộng rãi vi khuẩn kháng thuốc

(Luca et al., 2004) Theo WHO 2014, hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn và

tác dụng phụ của kháng sinh trong điều trị đang là những thách thức trong y học Khuynh hướng chung của thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng là quay

về với thiên nhiên, tìm cách giảm sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi gia súc, gia cầm, động vật thủy sinh và dần dần thay thế bằng kháng sinh có nguồn gốc thực vật (gọi là các phytocide) So với các loại kháng sinh tân dược, các phytocide có nhiều ưu điểm như không có hiện tượng kháng thuốc, không tồn dư trong thực phẩm, rất ít độc, dễ hòa tan trong nước, dễ sử dụng do hầu hết các loại cây thuốc

kháng sinh thường được dùng ở dạng bào chế rất đơn giản (Seyyednejad et al.,

2010) Tổ chức y tế thế giới WHO đã nhận định, nhiều hợp chất có nguồn gốc thực vật bản địa hoàn toàn có khả năng thay thế thuốc kháng sinh, đây được coi là lựa chọn thay thế hoàn hảo cho các loại kháng sinh tổng hợp

Việc nghiên cứu và chiết xuất các loại dược liệu có nguồn gốc tự nhiên ngày càng phát triển mạnh, được nhiều nước trên thế giới chú trọng và đưa vào ứng dụng rộng rãi Thảo dược đang ngày càng chứng minh vai trò quan trọng của mình trong nền công nghiệp dược phẩm như là một giải pháp an toàn thay thế cho

các thuốc hóa học tổng hợp (Mahesh, B., et al., 2008) Với nguồn thảo dược phong

để tách chiết một số hoạt chất bào chế thuốc thành phẩm (Viện dược liệu quốc gia, 2013), ngành dược liệu Việt Nam đã và đang có những bước tìm tòi nhằm sử dụng hiệu quả kho tài nguyên quý giá này Trong các loại thảo dược hiện nay phổ biến, chúng tôi đặc biệt quan tâm đến cây đơn đỏ (còn có những tên gọi khác như: đơn tía, đơn mặt trời, đơn tướng quân, cây lá liễu, hồng bối quế hoa, cây mặt quỷ ) là loài bản địa Đông Nam Á và Trung Quốc, cây được trồng nhiều ở làng hoa Ngọc Hà - Hà Nội để làm thuốc Các nghiên cứu dược lý trước đây đã tìm thấy trong dịch chiết cây Đơn đỏ có khả năng kháng nấm, kháng khuẩn rất

tốt (Nguyễn Thái An, 2003; Leelapornpisid et al., 2005) Trong dân gian lá cây

đơn đỏ được sử dụng nhiều để chữa mụn nhọt, mẩn ngứa, dị ứng, chữa tiêu chảy, đại tiện ra máu, kiết lỵ ở trẻ em (Đỗ Tất Lợi, 2011) Tuy nhiên tính đến nay tác dụng kháng khuẩn của lá cây đơn đỏ đối với các vi khuẩn gây viêm tử cung có rất ít các công trình nghiên cứu cụ thể

Căn cứ vào thực tế trên chúng tôi mạnh dạn tiến hành đề tài "Nghiên cứu tác dụng diệt khuẩn In vitro và ứng dụng điều trị bệnh viêm tử cung trên chó của dịch chiết cây đơn đỏ Excoecaria cochinchinensis Lour" nhằm mục tiêu

đánh giá tác dụng kháng khuẩn của dịch chiết lá đơn đỏ trên vi khuẩn phân lập từ dịch viêm tử cung, định tính phần xác định các thành phần có hoạt tính sinh học trong lá cây đơn đỏ, nghiên cứu phác đồ mới điều trị bệnh viêm tử cung trên chó

sử dụng kháng sinh có nguồn gốc thảo dược

2 Mục đích của đề tài

Điều tra, khảo sát tình hình mắc bệnh viêm tử cung trên chó

Phân lập và kiểm tra kháng sinh đồ các loài vi khuẩn có trong dịch viêm tử cung chó

Nghiên cứu tác dụng diệt khuẩn in vitro của cao khô dịch chiết lá cây đơn đỏ

Điều trị thử nghiệm chó bị viêm tử cung sử dụng cao khô dịch chiết lá cây đơn đỏ

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Kết quả nghiên cứu của đề tài nhằm bổ sung cơ sở lý luận về tác dụng dược lý và khả năng ứng dụng điều trị của dược liệu lá cây Đơn đỏ Sự thành

công của đề tài sẽ góp phần bổ sung thêm phương pháp điều trị bệnh viêm tử cung trên chó hiệu quả mà không cần sử dụng thuốc kháng sinh tân dược

Trên cơ sở của kết quả nghiên cứu có thể nghiên cứu điều trị thử nghiệm trên quy mô lớn, tiến tới ứng dụng trong chăn nuôi nói chung, góp phần hạn chế

sự kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn, góp phần bảo vệ môi trường và sức khỏe cộng đồng

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Hiện tượng đề kháng kháng sinh của vi khuẩn

Từ năm 1912 khi Penicillin được phát hiện là kháng sinh đầu tiên trên thế giới, đến nay kháng sinh đóng vai trò vô cùng quan trọng trong phòng và trị bệnh cho người và động vật, đem lại nhiều thành công và hiệu quả kinh tế Tuy nhiên, hiện tượng đề kháng kháng sinh đang xảy ra ngày càng gia tăng ở nhiều loài vi khuẩn gây bệnh cho người và gia súc đang là mối quan tâm lo lắng của toàn xã hội Vi khuẩn đề kháng kháng sinh làm giới hạn khả năng điều trị nhiễm trùng, một số trường hợp dẫn đến tử vong do vi khuẩn gây bệnh đề kháng với hầu hết các kháng sinh đang điều trị

Gần đây, các nhà nghiên cứu còn cho biết vi khuẩn có khả năng kháng với không chỉ những kháng sinh mới sử dụng mà còn kháng lại các kháng sinh trong tương lai Hơn thế nữa, các chủng vi khuẩn không gây bệnh nhưng đề kháng kháng sinh hay đa đề kháng còn là nơi tồn trữ tính kháng thuốc để truyền cho những vi khuẩn gây bệnh khác, ảnh hưởng đến việc sử dụng thuốc điều trị

(Prescott et al., 2002) Tại các nước phát triển, việc sử dụng kháng sinh như chất

tăng trưởng hay mục đích phòng bệnh đã bị cấm

Theo báo cáo mới nhất của Tổ chức Y tế thế giới (WHO) công bố ngày 30/4/2014 về tình hình kháng thuốc kháng sinh, hầu như tất cả các khu vực đều

xảy ra kháng cao với Methicillin trong điều trị Staphylococcus aureus (MRSA);

trong đó, Đông Nam Á hơn 25%, Đông Địa Trung Hải hơn 50%, châu Âu 60%, châu Phi 80%, Tây Thái Bình Dương 80%, châu Mỹ 90% Ngoài ra, 3 khu vực là châu Mỹ, Đông Địa Trung Hải, Đông Nam Á xảy ra kháng Cephalosporin thế hệ

thứ ba (trong điều trị nhiễm trùng K Pneumoniae và E.coli) và Fluoroquinolones (trong điều trị nhiễm trùng E.coli); khu vực châu Phi kháng với Cephalosporin thế hệ thứ ba và Fluoroquinolones trong điều trị nhiễm trùng E.coli; Tây Thái Bình Dương kháng với Fluoroquinolones (trong điều trị nhiễm trùng E.coli) và Cephalosporin thế hệ thứ ba (trong điều trị nhiễm trùng K Pneumoniae); khu vực

châu Âu xảy ra kháng với Cephalosporin thế hệ thứ ba trong điều trị K

Pneumoniae

Ở Việt Nam, theo nghiên cứu của Phạm Khắc Hiếu và Bùi Thị Tho (1999)

đã tìm thấy chủng vi khuẩn kháng lại 11 loại kháng sinh, đồng thời cũng chứng minh khả năng di truyền tính kháng thuốc giữa các vi khuẩn thông qua plasmid

Theo nghiên cứu của Cù Hữu Phú và cs (1999), 80 - 90% vi khuẩn Salmonella

phân lập được kháng mạnh với Penicillin và Ampicillin

Nghiên cứu tính kháng kháng sinh của 106 chủng vi khuẩn phân lập được

từ lợn con theo mẹ bị tiêu chảy ở một số tỉnh phía Bắc, Việt Nam Đỗ Ngọc Thúy

và cs (2002) đã thu được kết quả các chủng có xu hướng kháng mạnh với các loại kháng sinh thông thường dùng để điều trị đặc biệt với streptomycin lên tới 88,68% Hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn với trên 3 loại kháng sinh là khá phổ biến (chiếm 90,57%)

Ở nhiều nước trên thế giới đã phát hiện hiện tượng vi khuẩn kháng lại các loại thuốc kháng sinh, đặc biệt sự đa kháng (cùng một lúc kháng lại nhiều loại

kháng sinh đã xuất hiện Chủng Salmonella enterica serotype Newport đã kháng

lại ít nhất 9 loại kháng sinh (bao gồm cả Cephalosporins) gây bệnh trên cả động

vật và người ở Mỹ (Zhao S et al., 2003) Tại Vương Quốc Anh, nhiều tài liệu

khoa học đã cho thấy hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh tăng dần

theo thơi gian từ năm 1980 đến năm 2000 (Lloyd et al., 1996; Normand et al.,

2000) Ở Thụy Sỹ, Đức và một số nước tại Châu Âu đều phát hiện các chủng vi khuẩn nguy hiểm cùng một lúc kháng nhiều loại kháng sinh thông dụng (Wissing

et al , 2001; Wall et al., 1996; Low et al., 1996; Frech et al., 2003)

1.2 Thú cưng (chó, mèo) – một trong những nguồn lây lan vi khuẩn kháng thuốc

Trong những năm gần đây khi quyền lợi động vật được chú trọng, đặc biệt đối với động vật cảnh hay còn gọi là thú cưng như chó và mèo, kèm theo đó sự chăm sóc thú y được trú trọng hơn và sử dụng thuốc kháng sinh phòng và trị bệnh ở thú cưng ngày càng phổ biến Trong năm 2002, việc sử dụng thuốc ở thú cưng và động vật cảnh chiếm khoảng 36,5% doanh số bán thuốc thú y ở Châu

đến thuốc trị ký sinh trùng và phụ gia thức ăn Tuy nhiên, việc kiểm soát sử dụng các loại thuốc kháng sinh này trong điều trị cho thú cưng chưa được quan tâm đúng mức Nhiều nghiên cứu đã cho thấy các chủng vi khuẩn phân lập từ bệnh phẩm của thú cưng đã kháng nhiều loại thuốc kháng sinh Sự chăm sóc gần gũi cũng như sử dụng các loại thuốc kháng sinh của người cho những đối tượng này

cũng là một trong những nguyên nhân làm lây lan vi khuẩn kháng thuốc (Luca et

Tại Thụy Sỹ, vi khuẩn S.intermedius gây bệnh cho chó đã phát hiện

có hiện tượng tăng sự kháng thuốc với nhiều loại kháng sinh như Penicillin,

Neomycin, Sulphonamide, Co-trimoxazole và Erythromycin (Wissing et

al., 2001)

Vi khuẩn S.typhimurium (DT104) gây bệnh ở chó và mèo kháng đa thuốc

đã xuất hiện ở Anh (Wall et al., 1996; Low et al., 1996), ở Đức (Frech et al.,

2003) và tại Mỹ (Centers for Disease Control and Prevention, 2001) Các chủng này thường kháng với ít nhất năm loại kháng sinh, bao gồm Ampicillin, Chloramphenicol, Streptomycin, Sulphonamide và Tetracycline Chủng

Salmonella enterica serotype Newport đã kháng lại ít nhất 9 loại kháng sinh (bao

gồm cả Cephalosporins) gây bệnh trên cả động vật và người ở Mỹ (Zhao S., et

al., 2003)

Kết quả nghiên cứu của Sanchez S et al., (2002) ở bệnh viện Thú y Đại học Georgia đã phân lập được chủng vi khuẩn E.coli từ chó đã kháng 12 loại thuốc kháng sinh Vi khuẩn E.coli kháng chủ yếu với các nhóm Cephalosporins,

β-lactams, Tetracycline, Spectinomycin, Sulfonamides, Chloramphenicol và Gentamicin

Ở Việt Nam, theo tác giả Nguyễn Văn Thanh, Nguyễn Thanh Hải (2014)

cũng đã phát hiện vi khuẩn E coli và Salmonella spp phân lập từ chó đã kháng

cùng một lúc với 4 và 5 loại kháng sinh thông dụng

Sự kháng thuốc đang gia tăng nhanh chóng là một vấn đề nghiêm trọng,

do đó cần phải tìm những loại kháng sinh mới hiệu quả hơn Đặc biệt là những kháng sinh có nguồn gốc thực vật, vì nó ít tác dụng phụ và có khả năng điều trị

tốt (Sumitra Chanda et al., 2013)

1.3 Xu thế phát triển và sử dụng thuốc có nguồn gốc thiên nhiên ở Việt Nam

Hiện nay trên thế giới đã phát hiện được trên 265.000 loài thực vật, trong

đó có 150.000 loài được phân bố ở các vùng nhiệt đới, 35.000 loài có ở các nước ASEAN và trong số này có ít nhất 6.000 loài được dùng làm thuốc

Khu vực Đông Á, Trung Quốc, Nhật Bản, cùng với Ấn Độ, là các nước tiêu thụ đông dược nhiều nhất Tại Trung Quốc, đông dược chiếm khoảng 30% lượng dược phẩm tiêu thụ, doanh số đông dược sản xuất tại Trung Quốc để tiêu thụ nội địa và xuất khẩu năm 2003 ước đạt 20 tỉ đô la Tại Nhật Bản, đông dược được gọi với tên “Kampo”, cũng được chấp nhận và sử dụng rộng rãi, với doanh

số khoảng 1 tỉ đô la mỗi năm Ở khu vực Đông Nam Á, Indonesia là nước đứng thứ hai trên thế giới sau Brazil về đa dạng sinh học cây thuốc Theo số liệu năm

1995, có 40% dân số Indonesia sử dụng đông dược, trong đó có 70% sinh sống ở vùng nông thôn Theo đánh giá của Viện Dược liệu, Việt Nam năm 1995 nhu cầu dược liệu toàn quốc khoảng 30.000 tấn, cung cấp cho 145 bệnh viện y học cổ truyền, 242 khoa y học cổ truyền trong bệnh viên đa khoa, khoảng 30.000 lương

y đang hành nghề và trên 20.000 tấn cho nhu cầu xuất khẩu

Cho tới nay đã có trên 1.300 cây được nghiên cứu một cách có hệ thống

về thành phần hóa học và giá trị chữa bệnh Năm 1858, nhà bác học Pháp Louis Pasteur đã chứng minh được công dụng diệt khuẩn của tỏi Năm 1944, nhà khoa học Chester J Cavallito đã phân tích được hợp chất allicin trong tỏi có công dụng như thuốc kháng sinh Cũng nghiên cứu trên cây tỏi, năm 1948, Marchado cùng cộng sự đã chiết xuất từ tỏi được garcillin, ứng dụng tốt trong bệnh nhiễm trùng

Shigella , Salmonella hoặc các bệnh kí sinh trùng như giun kim, giun đũa, giun tóc

Một nghiên cứu khác tại Brazil năm 1982 đã chứng minh nước tinh chất của tỏi có

Năm 1934, Kondo và cộng sự tách chiết một alkaloid có tên cepharantin

từ củ của cây stephania cepharantha – Menispermaceae Chất này có tác dụng

với vi khuẩn lao ở nồng độ 10-20 mg/ml

Năm 1944, Gupta và Kahali đã chiết xuất từ cây berberis vulgaris chất

berberin, chất này có ảnh hưởng tốt với các kí sinh trùng do Leishmannia tropica,

Trypanosomanna equipendum gây ra

Từ 1950-1980 thế giới đã thử tác dụng chống ung thư như: taxol

(paclitaxe) của cây Taxus brevfolia Nutt, họ Taxaceae có tác dụng chữa ung thư

buồng trứng ở thời kỳ tiến triển Năm 1992 ở Mỹ, Canada và Pháp đã sử dụng taxol trên lâm sàng Hiện nay người ta đang nghiên cứu tổng hợp các dẫn chất mới từ taxol

Những hoạt chất có trong lá chè (Thea sinensis) ngoài những tác dụng

thông thường như giải cảm, tiêu độc, lợi tiểu người ta còn phát hiện thêm một giá trị đặc biệt đó là khả năng làm tăng sức đề kháng của trẻ em đối với vius gây bệnh viêm não Nhật Bản B

Gần đây các nhà khoa học trên thế giới phát hiện thêm nhiều đặc tính quý

của nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) trong việc chữa các bệnh về gan, mật,

ung thư… Thậm chí cả hiệu ứng ngăn ngừa và chống căn bệnh thế kỷ AIDS (Viện dược liệu, 2003)

Về lĩnh vực thú y, các nghiên cứu sử dụng các kháng sinh thực vật trong nuôi dưỡng và phòng trị bệnh cho lợn, đặc biệt bệnh lợn con phân trắng đạt hiệu quả cao (Bùi Thị Tho, 1996) Theo Trần Quang Hùng (1995) trong thuốc lá, thuốc lào có chứa alkaloid thực vật – nicotin và nornicotin trừ được ngoại ký sinh trùng và côn trùng hại rau, cây công nghiệp Theo Lê Thị Ngọc Diệp (1999) cây

Astiso (Cynara Scolymus L) chứa hoạt chất có tác dụng chống viêm, lợi tiểu,

thông mật, bổ gan

Nghiên cứu tác dụng phòng trị bệnh lợn con phân trắng của các cây tỏi, tô

mộc, hành, hẹ và hoàng đằng Đặc biệt, tác giả còn cho thấy vi khuẩn E.coli

kháng lại kháng sinh thực vật của tỏi, hẹ lại chậm hơn rất nhiều so với các thuốc hoá học trị liệu khác: tetracyclin, neomycin… Riêng mảng sử dụng các cây dược

liệu: lá thuốc lào, thuốc lá, hạt na, vỏ rễ xoan, hạt cau, củ bách bộ, dây thuốc cá, hạt củ đậu… dùng để trị nội, ngoại ký sinh trùng thú y cũng đã thu được những kết quả nhất định (Nguyễn Văn Tý, 2002)

Kết quả nghiên cứu của Bùi Thị Tho và Nguyễn Thành Trung (2010), khi

sử dụng dịch chiết cây Xuân hoa trong điều trị lợn con bị viêm ruột tiêu chảy tỷ

lệ khỏi theo các công thức khác nhau đạt từ 87,51% đến 100%, thời gian khỏi bình quân là 2,3 – 3,08 (ngày)

Bùi Thị Tho (2003) đã nghiên cứu tác dụng của rễ thuốc cá trong phòng trị bệnh ngoại ký sinh trùng thú y cho kết quả tốt Nhóm tác giả trên cũng đã sản xuất thuốc dạng mỡ từ hạt cây củ đậu để điều trị bệnh ghẻ chú và ve kí sinh (Bùi Thị Tho và Nguyễn Mạnh Hiển, 2006; Bùi Thị Tho, 2007) Hơn nữa, việc sử dụng thảo dược điều trị bệnh, hạn chế tồn dư kháng sinh trong sản phẩm chăn nuôi cũng đã được quan tâm từ lâu của nhóm nghiên cứu trên khi các tác giả trên

sử dụng bồ công anh (Lactuca indica L.) chống tồn dư kháng sinh enrofloxacin

trong điều trị tiêu chảy ở gà (Bùi Thị Tho và cs., 2009) Ở một nghiên cứu khác,

lá xuân hoa cho thấy có tác dụng điều trị bệnh tiêu chảy ở lợn con (Bùi Thị Tho

và Nguyễn Thành Trung, 2010) Trong định hướng tiến tới sử dụng kháng sinh thảo dược một cách rộng rãi trong chăn nuôi thì việc bảo quản sản phẩm kháng sinh thảo dược cũng có một vai trò then chốt, nhóm nghiên cứu trên cũng đã nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian và điều kiện bảo quản đến tác dụng dược lý của dịch chiết củ Bách Bộ (Bùi Thị Tho, 2004) Tác giả cho thấy nên thu dịch chiết trong vòng 24h sau khi thu hái Việc sử dụng kháng sinh thực vật từ tỏi và

hẹ để điều trị các bệnh trên gia súc gia cầm cho thấy nó vừa cho hiệu quả cao, vừa ít bị kháng thuốc, thời gian phát sinh kháng thuốc chậm hơn so với kháng sinh tổng hợp và từ nấm, hơn nữa vi khuẩn lại nhanh tái mẫn cảm với kháng sinh thực vật hơn các thuốc hóa học trị liệu (Bùi Thị Tho, 2001) Tác giả Vĩnh Định

và cs (2002) cho biết thành phần của flavanon của lá cây đơn đỏ có chứa liquiritigenin Cây đơn đỏ cũng đã được nghiên cứu sử dụng trong một số bài thuốc chống dị ứng, chống viêm và kháng khuẩn (Phạm Xuân Sinh và cs., 2000)

Nguyễn Hồng Loan (2010) công bố kết quả nghiên cứu sử dụng chất chiết

xuất từ cây hoàng kỳ (Astragalus membranaceus) để tăng cường khả năng đề kháng của cá tra với bệnh mủ gan do nhiễm vi khuẩn Edwardsiella ictaluri Nguyễn Thành Tâm và ctv (2012) nghiên cứu về tác dụng kháng khuẩn E

ictaluri của dịch chiết từ 3 loại thảo dược, đó là Diệp hạ châu đỏ, Diệp hạ châu xanh và Bạch hoa xà

Nguyễn Văn Thanh và Nguyễn Thanh Hải (2014) cho biết, dịch chiết cây

mò hoa trắng tiêu diệt vi khuẩn Salmonella in vitro và cho kết quả điều trị cao

đối với lợn con bị bệnh phân trắng Trong nghiên cứu trên, nhóm tác giả đã sử dụng ethanol ở các nồng độ 35%, 70%, acetic 5% và aceton 70% để chiết xuất phytoncid từ thân, lá và rễ cây mò hòa trắng Kết quả của nghiên cứu cho thấy rằng, chiết xuất bằng ethanol nồng độ 35% cho dịch chiết có hiệu quả tiêu diệt vi khuẩn và điều trị bệnh lợn con hoa trắng cao nhất Hơn nữa nhóm tác giả cũng cho biết dịch chiết từ thân của cây mò hoa trắng cho tác dụng diệt khuẩn cao còn dịch chiết từ lá cây mò hoa trắng không có tác dụng diệt khuẩn và dịch chiết từ rễ cây mò hoa trắng thì có tác dụng diệt khuẩn thấp hơn so với từ thân cây Nhóm tác giả cho biết hiệu quả điều trị bệnh lợn con phân trắng của dịch chiết từ thân cây mò hoa trắng cao hơn khi so sánh với kanamycin

Nhóm tác giả trên cũng thấy rằng dịch chiết từ quả lựu (Punica gramatum) cho kết quả cao khi điều trị các bệnh giun sán cho gia súc (Nguyen Thanh Hai và cs., 2014a,b) Nhóm tác giả sử dụng ethanol 5% để chiết xuất phytoncid từ quả lựu, dịch chiết được có thể tiêu diệt giun đũa lợn, sán dây ở lợn, giun đũa ở gà và sán lá ở gà

Các chiết xuất của tỏi gừng cũng được nhóm tác giả trên công bố có khả

năng tiêu diệt vi khuẩn E coli và Salmonella phân lập từ vịt bị tiêu chảy (Nguyen

Van Thanh và cs., 2014) Trong nghiên cứu này tác giả sử dụng ethanol 5% và acetic 5% để chiết xuất phytoncid từ tỏi và gừng Kết quả cho thấy phương pháp dùng acetic 5% cho dịch chiết có tính kháng khuẩn cao hơn dịch chiết thu được

từ phương pháp dùng ethanol 5%

Nhóm tác giả trên cũng nghiên cứu ảnh hưởng của dịch chiết của ngưu tất

(Achyranthes Bidentata Blume), muồng trâu (Cassia Alata L ), phi tử (Embelia

Ribes Burn ), bìm bìm ( Ipomoea Hederacea Jacq), keo dậu (Leucaena Glauca

Benth ) và cà gai leo (Solanumtorvum Swartz ) lên quá trình nở của trứng kí sinh trùng Haemonchus contortus phân lập từ dê (Nguyen Van Thanh và cs., 2015)

Các giả trên cho thấy muồng trâu và phi tử có tác dụng ức chế trứng nở của

Haemonchus contortus tốt nhất, trong khi ngưu tất có tác dụng tốt nhất lên sự chuyển động của ấu trùng Ở nồng độ 20%, chỉ có chất chiết bìm bìm, keo dậu là

có cả hai tác dụng vừa ức chế không cho trứng Haemonchus contortus nở và ức

chế sự chuyển động của ấu trùng

1.4 Cây Đơn đỏ

Nguồn gốc, phân loại

Tên khoa học: Excoecaria cochinchinensis Lour

Tên đồng nghĩa: Excoecaria bicolor Hask

Tên nước ngoài: Blinding tree (Anh)

Chi: Excoecaria L

Họ: Thầu dầu – Euphorbiaceae

Chi Excoecaria L có 5 loài ở Việt Nam Loài đơn đỏ tồn tại ở 2 dưới loài:

E cochinchinensis Lour var cochichinensis và E cochinchinensis Lour var

viridis (Pax ex Hoffm) Merr

Cây đơn đỏ (còn có những tên gọi khác như: đơn tía, đơn mặt trời, đơn tướng quân, cây lá liễu, hồng bối quế hoa, cây mặt quỷ ) là loài bản địa Đông Nam Á và Trung Quốc Cây cũng có ở Lào và Campuchia Tại Việt Nam, Cây mọc hoang hay được trồng ở nhiều nơi như Long An, Tiền Giang, Hậu Giang, Đồng Tháp, An Giang, Thái Bình, Nam Định Cây được trồng nhiều ở làng hoa Ngọc Hà - Hà Nội để làm thuốc

Đơn mặt trời là cây ưa sáng, ưa ẩm, thường được trồng ở vườn gia đình hay các vườn thuốc của các cơ sở y tế để làm cảnh và làm thuốc Cây xanh tốt quanh năm Những cây không bị thu hái thường xuyên mới có quả

mm, rộng 1,5 mm

Cụm hoa cái là chùm mang 3 - 5 hoa cái ở nách lá hay ngọn cành Hoa đều, đơn tính khác gốc, mẫu 3 Hoa cái: Cuống hoa dài 2-3 mm, hình trụ, nhẵn, màu xanh Lá bắc dạng vẩy tam giác màu vàng xanh, đỉnh màu tía, bìa có lông màu nâu, dài 0,8-1 mm; 2 lá bắc con tương tự lá bắc, dài 0,5 mm; có 2 tuyến nhỏ dạng hạt màu vàng ở 2 bên lá bắc và lá bắc con Lá đài 3, đều, hơi dính ở gốc, dạng tam giác màu vàng tía, đỉnh nhọn, có một gân màu xanh; nổi rõ, rìa

có lông màu nâu, dài 1-1,2 mm, tiền khai van Hoa vô cánh Bầu hình cầu, màu vàng, mặt ngoài nhẵn, đường kính 1-1,2 mm; lá noãn 3, dính, bầu trên 3 ô, mỗi

ô 1 noãn, đính noãn trung trụ Vòi nhụy 3 ít khi là 4 hoặc 5, màu vàng đính trên

đỉnh bầu, dài 1,5-2 mm, tỏa ra 3 hướng tận cùng là đầu nhụy uốn cong có nhiều gai thịt

Bột lá đơn đỏ có màu xanh nâu, mùi hắc nhẹ Quan sát dưới kính hiển vi cho thấy có: mảnh mô mềm, mạch xoắn đứng riêng lẻ hay nằm trong các mô, bó sợi, mảnh mô mềm chứa chất màu, tinh thể calci oxalat có thể nằm riêng lẻ hay nằm trong biểu bì

Một số thành phần hóa học của cây Đơn đỏ

Lá đơn đỏ chứa flavonoid (15%), tanin, saponin, anthranoid, coumarin

Từ lá khô của cây Đơn đỏ, Nguyễn Thái An (2003) đã chiết và phân lập được 2 acid polyphenol là acid gallic và acid ellagic, 2 flavonol là kaempferol 7-O-glucosid và kaempferol

Hình 1.2 Tiêu bản đơn đỏ

Hoàng Thị Tuyết Nhung (2012) cũng đã chiết xuất và tinh chế được hợp chất kaempferol Sơ bộ xác định flavonoid có 6 chất trong đó một chất thuộc nhóm flavonoid (Phạm Xuân Sinh và cs., 1998)

Công dụng

Bộ phận có thể dùng được của cây đơn đỏ bao gồm lá và rễ, thu hái quanh năm Đơn đỏ có vị cay, hơi đắng, có tiểu độc, có tác dụng khư phong, thanh nhiệt, thông kinh hoạt lạc, chỉ thống Đơn đỏ thường được dùng trong dân gian

làm thuốc chữa mẫn ngứa, mụn nhọt, tiêu chảy lâu ngày không khỏi, lỵ, đái ra máu, ngày 10 – 20 gam sắc uống Ở Trung Quốc, đơn đỏ được dùng chữa sởi, quai bị, viêm amidan, đau thắt ngực, đau thận, đau cơ

Các nghiên cứu về tác dụng của cây đơn đỏ

Một số công trình nghiên cứu về hoạt tính sinh học và hoạt tính kháng

khuẩn của Cây đơn đỏ (Excoecaria cochinchinensis Lour.) được chúng tôi trích

dẫn sơ bộ kết quả dưới đây:

P Leelapornpisid và cộng sự (2005) đã nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn

của Excoecaria cochinchinensis Lour, Salvia officinalis Lour và Argyreia

nervosa (Burm.f) Bojer Lá của các thực vật này được chiết xuất bằng các dung môi khác nhau Chất chiết thu được, thử hoạt động kháng khuẩn đối với

Staphylococcus aureus (ATCC 25923) và Propionibacterium acnes phân lập từ

bệnh nhân Họ thu được 13 chiết xuất và sử dụng phương pháp khuếch tán trên

thạch, chiết xuất ethanol của E cochinchinensis và S officinalis đã được tìm thấy

có hiệu quả chống lại những vi sinh vật này trong khi tất cả các chất chiết xuất từ

A nervosa đã không có hoạt tính kháng khuẩn thử nghiệm Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) cho các chiết xuất có hoạt động kháng khuẩn đã được kiểm tra bằng phương pháp hệ nồng độ pha loãng Kết quả cho thấy MIC của chất chiết xuất

ethanol từ E cochinchinensis và S officinalis là 1.56 và 3.13 mg/ml cho S

aureus (ATCC 25923), tương ứng 1,56 và 6,25 mg/ml đối với P acnes Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) là 3,13 và 6,25 mg/ml cho S aureus (ATCC 25923), tương ứng 6,25 và 12,5 mg/ml đối với P acnes Những kết quả này đã được so

sánh với azelaic acid, tốt hơn so với benzoyl peroxide nhưng không tốt như

clindamycin phosphate Hơn nữa, chiết xuất ethanol từ E cochinchinensis trưng bày hoạt động có hiệu quả vượt trội so với clindamycin kháng S aureus (P31 và

Fl14) phân lập từ bệnh nhân Nồng độ MIC và MBC tương ứng là 0,78 và 3,13

mg/ml Nghiên cứu sơ bộ thành phần hóa học chiết xuất ethanol và nước của E

cochinchinensis cũng được thực hiện sàng lọc các thành phần hóa học Các hợp chất quan trọng đã được tìm thấy là tanin và phenolic

Các công trình nghiên cứu hoạt tính sinh học và tác dụng dược lý của Đơn

đỏ ở Việt Nam vẫn chưa được nghiên cứu nhiều Công trình nghiên cứu của Hồ Thị Thùy Dương và cộng sự (2005) đã tiến hành khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của 60 phân đoạn từ 20 cây thuốc ở Việt Nam, cho ra kết quả có 2 phân đoạn từ

cây Mua (Melastoma affine) và Đơn mặt trời (Excoecaria cochinchinensis) có

hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất

1.5 Bệnh viêm tử cung trên chó

1.5.1 Một số đặc điểm sinh học của chó cái

Đặc điểm hệ sinh dục

Theo Đặng Đình Tín (1986), cơ quan sinh dục của gia súc cái bao gồm bộ phận sinh dục bên ngoài và sinh dục bên trong Quá trình sinh lý của cơ quan sinh dục rất quan trọng và cơ bản cho gia súc trong việc duy trì nòi giống

Bộ phận sinh dục bên ngoài là cơ quan sinh dục người ta có thể nhìn thấy,

sờ thấy và quan sát được Bao gồm âm môn, âm vật và tiền đình

Âm môn (vulva) hay còn gọi là âm hộ, nằm phía dưới hậu môn Phía

ngoài âm môn có hai môi, nối liền hai môi bằng hai mép Trên hai môi của âm môn có sắc tố đen và nhiều tuyến tiết

Âm vật (clitoris) giống như dương vật được thu nhỏ lại, trong cấu tạo âm

vật cũng có các thể hổng như con đực Trên âm vật có nếp da tạo ra mũ âm vật

(Praeputium clitoridis), giữa âm vật bẻ gập xuống dưới

Tiền đình là giới hạn giữa âm môn và âm đạo, nghĩa là qua tiền đình mới vào âm đạo Trong tiền đình có màng trinh, phía trước màng trinh là âm đạo, phía sau là âm môn và lỗ niệu đạo Tiền đình có một số tuyến, tuyến này xếp theo hàng chéo hướng quay về âm vật

Bộ phận sinh dục bên trong là cơ quan sinh dục phải bằng phương pháp gián tiếp người ta mói có thể quan sát hoặc sờ thấy được Bao gồm: âm đạo, tử cung, ống dẫn trứng, buồng trứng

Âm đạo (vagina), trước âm đạo là cổ tử cung, phía sau là tiền đình có

màng trinh che lỗ âm đạo Âm đạo là một cái ống tròn để chứa cơ quan sinh dục

trình sinh đẻ Cấu tạo âm đạo gồm 3 lớp: Lớp liên kết ngoài, lớp cơ trơn và lớp niêm mạc có nhiều tế bào thượng bì

Tử cung (uterus) có cấu tạo rất phù hợp với chức năng phát triển và dinh

dưỡng bào thai Trứng được thụ tinh ở ống dẫn trứng và trở về tử cung làm tổ, ở đây hợp tử phát triển nhờ chất dinh dưỡng từ cơ thể mẹ cung cấp cho thông qua lớp niêm mạc tử cung Tử cung còn có nhiệm vụ đẩy thai ra ngoài trong quá trình sinh đẻ nhờ vào các lớp cơ

Tử cung gia súc bao gồm các phần: cổ tử cung, thân tử cung, sừng tử cung Sừng tử cung thông với ống dẫn trứng, cổ tử cung thông với âm đạo, vị trí nằm trong xoang chậu, trên trực tràng, bên dưới là bàng quang

Buồng trứng (ovarium) gồm một đôi treo ở cạnh trước dây chằng rộng và

nằm trong xoang chậu Bên ngoài là một lớp màng liên kết, bên trong chia làm hai miền (miền vỏ và miền tủy) Buồng trứng như một tuyến nội tiết của con cái, làm nhiệm vụ nuôi dưỡng cho trứng chín và tiết ra những hormone sinh dục, tác động đến chức năng của tử cung và thay đổi tính biệt giữa con đực và con cái Bên dưới lớp màng của buồng trứng là các tế bào trứng

Ống dẫn trứng (ovidustus) còn gọi là vòi fallop, nằm ở màng treo buồng

trứng Một đầu của ống dẫn trứng thông với xoang bụng, gần sát buồng trứng có hình loa kèn, trên loa kèn hình thành một tán rộng và lô nhô không đều, đầu kia thông với mút sừng tử cung, là một ống nhỏ ngoằn ngoèo Cấu tạo ống dẫn trứng được chia làm ba lớp: bên ngoài là lớp sợi liên kết, giữa là lớp cơ, bên trong là lớp niêm mạc

Đặc điểm sinh lý sinh sản

Sự chín muồi sinh lý sinh dục của chó

Động dục lần đầu tiên ở chó cái là dấu hiệu thành thục về tính hay là sự

chín muồi sinh dục, khẳng định sự trưởng thành của nó Vào thời gian này,

buồng trứng bắt đầu hoạt động chức năng, trong đó các nang trứng (folliculi

ovarii) phát triển theo từng giai đoạn Khi trứng chín, chó cái sẵn sàng với sự giao phối ( Nguyễn Văn Thanh, Vũ Như Quán, Nguyễn Hoài Nam, 2012)

Thời hạn bắt đầu chín muồi sinh dục phụ thuộc vào giống chó, đặc tính cá thể, điều kiện sống và thức ăn Trung bình động dục lần đầu của chó cái vào lứa tuổi 8-10 tháng, ở các giống chó nhỏ đến sớm hơn (khoảng 6 tháng), chó lớn đến muộn hơn (12-14 tháng) Tuy nhiên vào thời gian này chó cái vẫn còn chưa kết thúc sự lớn và phát triển toàn bộ cơ thể, chỉ nên cho chó giao phối khi đã được 1,5-2 tuổi, lúc đó con cái đã đạt tới độ chín về sinh lý và tầm vóc Giao phối sớm

có tác động tiêu cực tới sự phát triển và hình thành cơ thể của chó cái và ngay cả thế hệ sau

Chu kỳ sinh dục

Hoạt động sinh dục của động vật cái nói chung, chó cái nói riêng từ tuổi

chín sinh dục được biểu hiện bằng chu kỳ sinh dục (oestrus) Chu kỳ sinh dục là

tổng hợp những thay đổi trong hệ thống sinh dục của con cái từ lần rụng trứng này đến lần rụng trứng khác Độ dài của 1 chu kỳ sinh dục ở những con chó cái phần lớn kéo dài 5-8 tháng Chu kỳ sinh dục được chia làm 4 thời kỳ thời kỳ trước động dục kéo dài 3-16 ngày, thời kỳ động dục kéo dài 3-12 ngày, thời kỳ

sau động dục kéo dài 60-90 ngày, thời kỳ đình dục dao động 2-6 tháng

Các hoocmon của chu kỳ sinh dục

Chức năng sinh sản của động vật được điều khuyển bằng hệ thống thần kinh - thể dịch Hệ thống này bao gồm: Hệ thống thần kinh trung ương, vùng

dưới đồi thị (hypothalamus), tuyến yên (hypophysis) và các tuyến nội tiết ngoại

vi Trong đó cơ quan điều tiết cơ bản là hypothalamus

Để đáp trả các xung động được đưa tới từ những cơ quan ngoại cảm thụ (thính giác, vị giác, xúc giác) và nội cảm thụ (tín hiệu hormon của những cơ quan sinh sản về những thay đổi xảy ra trong chúng), những tế bào của hypothalamus tiết ra hormon thần kinh gonadotropin rilizing hormone (hormon thúc đẩy tuyến yên), kích thích sự giải phóng từ thùy trước tuyến yên những gonadotropin hormone

Một trong những gonadotropin hormone đó là follicuto-stimulin hormone (FSH) thúc đẩy sự phát triển và thành thục của các nang trong những buồng

của gonadotropin hormone là luteino stimulin hormon (LH), kết hợp với FSH gây ra sự chín đến tận cùng của các nang trứng, kích thích sự động dục, hình thành thể vàng và tổng hợp progesterone trong thể vàng

Những hormone được tiết ra từ buồng trứng (oetrogen và progesterone) đi vào dòng chảy chung của máu, tác động đến những cơ quan chấp hành (ống dẫn trứng, tử cung, âm đạo, tuyến sữa…) đến hypothalamus và tuyến yên ức chế hay kích thích theo nguyên tắc của mối quan hệ thuận hay ức chế ngược sự tiết hormone gonadotropin (FSH và LS)

Oestrogen có trách nhiệm về sự xuất hiện ở con cái sự hấp dẫn, ham muốn sinh dục và chịu đực Progesteron ức chế sự động dục và rụng trứng, đảm bảo sự biến chuyển của những tuyến tử cung từ pha tăng sinh đến pha tiết dịch, tạo điều kiện thuận lợi nhất đối với sự làm tổ của phôi, sự nuôi dưỡng, phát triển của bào thai và thúc đẩy sự phát triển các nang của những tuyến sữa Sau khi đẻ, progesterone kích thích tiết sữa và đánh thức bản năng làm mẹ

Ảnh hưởng tới chức năng sinh dục ở chó nói riêng, động vật nói chung còn có hormone tuyến tùng, vỏ tuyến thượng thận và những tuyến nội tiết khác

1.5.2 Nguyên nhân, cơ chế, hậu quả của viêm tử cung

Do sự loạn chức năng của buồng trứng và sự tăng tiết Progesterone gây ra sau quá trình động dục hoặc do sử dụng thuốc ngừa thai của người là Depo-provera với thành phần là Medroxyprogesterone làm hàm lượng Progesterone tăng cao

Trong trường hợp chó mèo đẻ khó, phải can thiệp bằng tay hay dụng cụ hoặc phẫu thuật không đúng quy trình kỹ thuật làm niêm mạc tử cung bị sây sát,

vi khuẩn gây bệnh dễ dàng xâm nhập và gây ra viêm nội mạc tử cung

Do quá trình viêm lan tăng dần từ âm đạo, nhiễm trùng đường tiết niệu hoặc do nhiễm phân

Cơ chế

Bệnh viêm tử cung là hậu quả của sự tăng sinh nang nội mạc tử cung, tích dịch và bị nhiễm trùng sinh mủ Tùy theo tình trạng dịch viêm ở bên trong tử cung có chảy ra ngoài qua đường âm đạo hay không (cổ tử cung đóng hoặc mở)

mà người ta chia viêm tử cung làm hai dạng là viêm tử cung dạng mở và viêm tử cung dạng đóng

Khi cổ tử cung mở trong các giai đoạn động dục, giao phối, sinh đẻ nghĩa

là hàng rào vật lý bảo vệ đã bị phá vỡ, vi khuẩn qua cổ tử cung đi vào bên trong

tử cung Khi hết giai đoạn, cổ tử cung đóng lại giữ vi khuẩn ở bên trong, sinh sôi phát triển gây viêm

Khi nồng độ hormone progesterone tăng cao bất thường, khi đó lớp nội mạc tử cung rất nhạy cảm với progesterone sẽ hình thành các nang, tăng tiết dịch, nhất là ở thời điểm sau động dục, làm cho dịch tích lại trong tử cung và tế bào trở nên dễ bị cảm nhiễm Khi cổ tử cung mở, những vi khuẩn có sẵn ở cơ quan sinh dục sẽ dễ dàng đi vào bên trong qua cổ tử cung Nếu tử cung bình thường, môi trường bên trong tử cung sẽ chống lại được sự sinh tồn của vi khuẩn Ngược lại, khi lớp nội mạc tử cung dày lên, có chứa nhiều tế bào dễ bị cảm nhiễm, cơ tử cung giảm co bóp nên không tống được vi khuẩn ra ngoài, đó là điều kiện tốt cho

vi khuẩn sinh mủ tồn tại và phát triển gây viêm E.coli, Staphylococcus, Streptococcus là những vi sinh vật có liên hệ phổ biến nhất Theo Nguyễn Văn Thanh (1999), có 3 thể viêm tử cung:

Viêm nội mạc tử cung (Endometritis): là quá trình viêm xảy ra trong lớp niêm mạc của tử cung, là thể viêm nhẹ nhất trong các thể viêm Có hai dạng viêm

là viêm nội mạc tử cung thể cata cấp tính có mủ và viêm nội mạc tử cung thể màng giả

Viêm cơ tử cung: là quá trình viêm xảy ra ở lớp cơ tử cung, nghĩa là quá trình viêm đã được xuyên qua lớp niêm mạc của tử cung đi vào phá huỷ tầng

giữa (lớp cơ vòng và cơ dọc của tử cung) Thường do kế phát từ viêm nội mạc tử cung thể màng giả, là thể viêm tương đối nặng trong các thể viêm tử cung

Viêm tương mạc tử cung: là quá trình viêm xảy ra ở lớp ngoài cùng (lớp tương mạc của tử cung) do quá trình viêm lan từ viêm cơ và viêm nội mạc tử cung Đây là thể viêm nặng nhất và khó điều trị nhất

Hậu quả

Bệnh viêm tử cung gây ra hiện tượng rối loạn sinh sản ở cơ thể cái làm ảnh hưởng lớn đến sức khỏe, thậm trí làm mất khả năng sinh sản, gây vô sinh ở chó cái Nếu không được điều trị kịp thời bệnh súc có thể dẫn đến chết do dịch viêm, mủ tích lại quá nhiều tiết độc tố gây nhễm trùng máu

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng, thời gian và địa điểm

Đối tượng

Lá cây đơn đỏ được thu hái tại vườn Dược liệu, khoa Thú Y – Học Viện

Nông nghiệp Việt Nam

Chó bị viêm tử cung được mang tới khám và điều trị tại Bệnh xá thú y –

Viện thú y Quốc gia

Vi khuẩn Staphylococus spp và E.coli phân lập từ dịch viêm tử cung chó

được cung cấp từ phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Sinh học Thú y, Học

viện Nông nghiệp Việt Nam (LAS – NN54; ISO 17025:2005)

Thời gian và địa điểm

Thời gian: Từ tháng 10/2014 đến tháng 8/2015

Địa điểm: Phòng thí nghiệm bộ môn Ngoại Sản Khoa thú y, Phòng thí

nghiệm bộ môn Công nghệ sinh học thực vật – Khoa Công Nghệ Sinh Học – Học

viện Nông Nghiệp Việt Nam và Bệnh xá thú y – Viện thú y Quốc gia

2.2 Nội dung nghiên cứu

Nhằm thực hiện mục tiêu của đề tài, chúng tôi tiến hành các nội dung sau:

Khảo sát bệnh viêm tử cung trên chó

Phân lập các loài vi khuẩn có trong dịch viêm tử cung chó

Kiểm tra kháng sinh đồ của vi khuẩn phân lập từ dịch viêm tử cung với

một số loại kháng sinh được khuyến cáo trong điều trị

Nghiên cứu tác dụng diệt khuẩn in vitro của cao khô dịch chiết lá cây đơn đỏ:

+ Chọn dung môi thích hợp để tách chiết các hoạt chất từ lá cây Đơn đỏ

+ Xác định một số nhóm hoạt chất hòa tan trong dịch chiết lá cây Đơn đỏ

+ Đánh giá tác dụng kháng khuẩn in vitro của cao khô dịch chiết lá cây

Đơn đỏ với vi khuẩn phân lập từ dịch viêm tử cung

+ Đánh giá tác dụng kháng khuẩn in vitro của cao khô dịch chiết lá cây

Dựa trên kết quả nghiên cứu khả năng kháng khuẩn in vitro điều trị thử

nghiệm chó bị viêm tử cung

2.3 Vật liệu nghiên cứu

Dụng cụ khác: Giấy lọc, vải màn, phễu lọc

Hóa chất

Dung môi chiết: Chloroform, Aceton, Ethanol, Methanol, Acetic acid và nước cất

Giấy lọc Whatman No.1

Dung môi pha chất tan : Dimethyl Sulphoxide (DMSO)

Các hóa chất định tính một số thành phần hóa học có trong dịch chiết lá cây đơn đỏ: FeCl3 5%, Fehling A, B, H2SO4, Mayer, Bouchardat, chì axetate, NH3

Bảng 2.2 Thành phần môi trường LB (Luria Bertani) đặc

2.4 Phương pháp nghiên cứu

Để thực hiện nội dung của đề tài, chúng tôi tiến hành thí nghiệm theo sơ

đồ sau

Thu lá cây đơn đỏ, phơi, sấy khô

Nghiền thành bột mịn (<0,5mm)

Ngâm lạnh trong dung môi

Lọc dịch chiết, cô quay loại bỏ dung môi

Thu dịch chiết

Xác định một số nhóm hoạt chất hòa tan trong dịch chiết

Kiểm tra tác dụng diệt khuẩn

In vitro của dịch chiết trên vi khuẩn phân lập

Pha loãng, xác định nồng độ ức chế tối thiểu của dịch chiết

Sử dụng dịch chiết lá Đơn đỏ thử nghiệm điều trị trên chó bị viêm tử cung

Kiểm tra kháng sinh đồ của VK phân lập với một

số kháng sinh

Đánh giá hiệu

xuất chiết của

các dung môi

Điều tra khảo sát các bệnh sinh sản trên đàn chó

Thống kê số liệu, tỷ lệ các bệnh liên quan đến sinh sản trên đàn chó gián tiếp dựa vào hồ sơ bệnh án của Bệnh xá Thú y, kết hợp với phỏng vấn trực tiếp chủ bệnh súc

Phương pháp chẩn đoán lâm sàng, lấy mẫu dịch viêm tử cung

Bệnh súc đưa tới được bác sĩ thú y tại phòng khám hỏi một số thông tin như giống, tuổi, lứa đẻ, tình trạng sức khỏe, ăn uống… Sau đó bằng các phương pháp sờ, nắn, gõ, nghe, căn cứ vào các triệu chứng điển hình như có dịch viêm chảy ra từ âm đạo, sốt, bụng chướng to, uống nước nhiều… kết hợp siêu âm ổ bụng để đưa ra kết luận chẩn đoán Tiến hành lấy mẫu dịch viêm tử cung, đưa về bảo quản, phân tích tại phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Sinh học Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam

Thu hái và xử lý lá cây đơn đỏ

Mẫu lá cây đơn đỏ được thu hái tại vườn dược liệu khoa Thú Y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam Lá cây đơn đỏ được chọn là những lá lành lặn, bánh tẻ, không bị sâu Lá tươi thu hái về được rửa dưới vòi nước sạch (2-3 lần), phơi khô trong bóng râm trong 3 ngày, sấy khô ở 400C đến khối lượng không đổi, sau đó nghiền thành bột mịn (<0,5mm) Bột lá đơn đỏ có màu xanh nâu, mùi hắc nhẹ Bột lá đựng trong túi nilon bảo quản trong bình hút ẩm

Hình 2.2 Lá Đơn đỏ tươi và bột lá đơn đỏ sau khi làm khô và nghiền nhỏ

Phương pháp thu dịch chiết và đánh giá hiệu suất chiết

Bột lá đơn đỏ được chiết với các dung môi bằng phương pháp ngâm chiết ở nhiệt độ phòng với cùng một tỷ lệ (20g bột lá khô/200ml dung môi), mỗi ngày được lắc đảo 2 lần Sau 72 giờ thu dịch chiết lọc qua vải màn và giấy lọc Whatman No.1 để loại bỏ bột bã Thu dịch chiết đem cô quay hút chân không để loại bỏ hoàn toàn dung môi Tới khi khối lượng của bình cô quay không đổi đem cân để tính hiệu suất tách chiết của các dung môi Cao cô toàn phần đã loại bỏ hết dung môi bảo quản trong tủ mát 40C để thử hoạt tính và khả năng diệt khuẩn

Hiệu suất chiết được tính theo công thức: h (%) = m c /m M x 100

Trong đó: h (%) là hiệu suất chiết

m c là khối lượng cặn khô (sau khi cô quay) tính theo gam

m M là khối lượng mẫu dược liệu khô tính theo gam

Phương pháp định tính xác định một số hợp chất có trong dịch chiết

Phần lớn các dược liệu đều có các thành phần hoạt chất xác định Các hoạt chất này có thể cho các phản ứng màu đặc trưng, dựa vào đó dược liệu có thể được định tính và định lượng Trong khuôn khổ đề tài nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành định tính một số hợp chất bằng phương pháp hóa học để xác định sự có mặt của chúng trong dịch chiết lá cây đơn đỏ thu được từ các loại dung môi khác nhau Đây là phương pháp định tính xác định đơn giản, nhanh chóng, dễ dàng thực hiện ngay trong phòng thí nghiệm Các thuốc thử cũng dễ kiếm, ít độc cho người thí nghiệm, cho kết quả nhanh và tương đối chính xác

Định tính saponin

Định tính Saponin trong dược liệu bằng cách quan sát hiện tượng tạo bọt: Cho vào ống nghiệm 5 giọt dịch chiết, thêm 5ml nước, lắc mạnh trong 5 phút, để yên và quan sát hiện tượng tạo bọt Nếu bọt còn bền vững sau 15 phút thì sơ bộ kết luận dược liệu có chứa saponin

Định tính flavonoid

Phản ứng với kiềm: Nhỏ một giọt dịch chiết lên giấy lọc Hơ khô rồi để lên miệng lọ Amoniac đặc đã được mở nút, sẽ thấy màu vàng của vết dịch chiết

Phản ứng với FeCl3: Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết, thêm vài giọt dung dịch FeCl3 5% Nếu xuất hiện kết tủa xanh đen thì kết luận có flavonoid

Định tính tanin

Tác dụng với dung dịch FeCl3 5%: Lấy 2ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 2 giọt dung dịch FeCl3 5% Nếu xuất hiện màu hoặc kết tủa màu xanh đen hoặc xanh nâu nhạt thì kết luận có tanin trong dịch chiết

Tác dụng với dung dịch gelatin 1%: Lấy 2ml dịch chiết cho vào ống nghiệm chứa 5ml dung dịch gelatin 1% Nếu xuất hiện tủa bông trắng thì kết luận

có tanin

Định tính alkaloid bằng thuốc thử chung

Tác dụng với thuốc thử Mayer (100ml nước cất, 1.36g HgCl2, 5g KI): Dịch chiết (5ml) cho vào ống nghiệm rồi nhỏ vào từ từ thuốc thử Mayer vào, nếu

có alkaloid sẽ cho tủa màu từ trắng đến vàng

Tác dụng với thuốc thử Bouchardat (100ml nước, 2.5g I2, 5g KI): Dịch chiết (5ml) cho vào ống nghiệm rồi nhỏ từ từ thuốc thử Bouchardat vào, nếu có alkaloid sẽ cho tủa nâu đến đỏ nâu

Tác dụng với thuốc thử Dragendorff: Dịch chiết (5ml) cho vào ống nghiệm rồi nhỏ vào từ từ thuốc thử Dragendorff vào, nếu có alkaloid sẽ cho tủa vàng cam đến đỏ

Định tính đường khử

Cho vào mỗi ống nghiệm một ít cao khô mỗi loại dịch chiết Cho 2 ml nước cất vào mỗi ống, hòa tan, lắc đều Nhỏ 2 - 3 giọt thuốc thử Fehling vào mỗi ống, nếu có kết tủa đỏ gạch chứng tỏ có đường khử

Phương pháp pha dịch chiết nồng độ 100mg/ml

Lấy 1g cao cô toàn phần pha với 10ml Dimethyl sulfoxide (DMSO), dùng đũa thủy tinh khuấy tan hoàn toàn ta được dung dịch có nồng độ 100mg/ml

Phương pháp pha loãng dịch chiết

Chuẩn bị sẵn 10 ống nghiệm sạch, vô trùng, cho vào mỗi ống 5 ml DMSO, đánh số thứ tự từ 1 đến 10 Ống nghiệm 1, được cho thêm 5ml dung dịch cao lỏng nồng độ 100mg/ml

Trộn đều dịch chiết trong ống nghiệm 1, sau đó hút 5 ml chuyển sang ống nghiệm 2, trộn đều; chuyển tiếp 5 ml từ ống nghiệm 2 sang ống nghiệm 3, trộn đều;… đến ống nghiệm thứ 10, trộn đều và bỏ đi 5 ml

Hình 2.3 Hệ nồng độ pha loãng cao đặc để xác định nồng độ tối thiểu tác

Phương pháp nuôi cấy, xác định mật độ vi khuẩn

Các mẫu vi khuẩn được nuôi cấy vạch trên môi trường LB đặc ở nhiệt độ

370C, sau 24 giờ để lấy khuẩn lạc đơn Dựa vào kích thước, mùa sắc, hình dạnh các khuẩn lạc đơn riêng rẽ mà tiến hành nuôi cấy và dùng các phương pháp nhuộm Gram, Ziehl neelsen… , quan sát trên kính hiển vi hình thái, kích thước, cách sắp xếp, tính chất bắt màu để xác định vi khuẩn

Chọn khuẩn lạc đơn điển hình mang đi nuôi cấy trong bình tam giác với môi trường LB lỏng, ủ ở 370C, lắc 200 vòng/phút Sau 12-14 giờ mang dịch khuẩn nuôi đi xác định mật độ vi khuẩn

Mật độ vi khuẩn được xác định theo phương pháp đo quang phổ ở bước sóng λ=600 nm, theo công thức:

[Số tế bào/ml] = OD600 x (Hệ số chuyển đổi) x (Hệ số pha loãng)

Trong đó: OD600 là giá trị đo được ở bước sóng: λ = 600 nm

Hệ số chuyển đổi được mặc định là: 5 x 108

Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết bằng phương pháp kháng

sinh đồ khuếch tán trên đĩa thạch của Kirby-Bauer

Các thao tác được thực hiện trong tủ cấy vô trùng Khi mật độ vi khuẩn đạt 108 tế bào/ml, lắc đều bình chứa vi khuẩn, dùng pipetman hút 100µl canh khuẩn nhỏ vào giữa đĩa thạch, dùng que thủy tinh tráng đều cho đến khi mặt thạch khô Sau 15 phút đục lỗ trên mặt thạch với đường kính 6mm/lỗ, đục cách nhau khoảng 30mm Mỗi lỗ thạch, nhỏ 100µl dịch chiết nồng độ 100 mg/ml, đặt đĩa vào tủ ấm ở 370C/24 giờ đọc kết quả bằng cách đo đường kính vòng vô khuẩn Thí nghiệm được bố trí lặp lại 3 lần, đọc kết quả bằng cách đo đường kính vòng vô khuẩn, rồi tính số bình quân

Kiểm tra tính mẫm cảm của vi khuẩn đối với kháng sinh bằng phương pháp khuyếch tán trên đĩa thạch sử dụng giấy tẩm kháng sinh

Lấy khoanh giấy kháng sinh ra khỏi tủ lạnh hoặc tủ âm, không được mở nắp, để ở nhiệt độ phòng khoảng 1 giờ để ổn định và làm giảm hơi nước tích tụ trên khoanh giấy kháng sinh Dùng kẹp nhọn đặt nhẹ nhàng khoanh giấy kháng sinh lên bề mặt đĩa thạch, đặt càng sớm càng tốt, trong vòng 15 phút sau khi