Nghiên cứu một số đặc điểm bệnh lý của dê được gây bệnh thực nghiệm bằng chủng virus đậu phân lập trên thực địa tại thị xã tam điệp, tỉnh ninh bình

33 2.6.6 Phương pháp làm tiêu bản vi thể và quan sát bệnh tích trên tiêu bản của dê được gây nhiễm chủng virus GPVNB1 .... Ở Việt Nam, bệnh mới chỉ xuất hiện từ đầu năm 2005, năm 2006-20

MỤC LỤC

Lời cam đoan ii

Lời cảm ơn iii

Mục lục iv

Danh mục chữ viết tắt vii

Danh mục bảng viii

Danh mục hình ix

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục đích nghiên cứu 2

Chương I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tình hình chăn nuôi dê trên Thế giới và Việt Nam 3

1.1.1 Trên Thế giới 3

1.1.2 Tại Việt Nam 4

1.2 Bệnh đậu dê 6

1.2.1 Giới thiệu chung về bệnh 6

1.2.2 Dịch tễ học 6

1.2.3 Phương thức truyền lây 7

1.2.4 Virus đậu dê 8

1.2.5 Sức đề kháng của virus 11

1.2.6 Đường truyền bệnh 12

1.2.7 Miễn dịch chống virus 12

1.2.8 Triệu chứng lâm sàng và bệnh tích 15

1.2.9 Chẩn đoán bệnh đậu dê 17

1.3 Phòng bệnh 22

Chương II NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 Đối tượng nghiên cứu 23

2.2 Địa điểm nghiên cứu 23

2.3 Thời gian nghiên cứu 23

2.4 Nội dung nghiên cứu 23

2.5 Vật liệu 23

2.5.1 Virus 23

2.5.2 Động vật thí nghiệm 24

2.5.3 Hóa chất 24

2.5.4 Thiết bị và dụng cụ 25

2.6 Phương pháp nghiên cứu 25

2.6.1 Gây bệnh thực nghiệm 25

2.6.2 Theo dõi triệu chứng lâm sàng của dê được gây nhiễm chủng virus GPVNB1 26

2.6.3 Phương pháp phân lập và giám định virus GPVNB1 26

2.6.4 Phương pháp chẩn đoán phòng thí nghiệm 28

2.6.5 Phương pháp mổ khám, quan sát bệnh tích đại thể của dê được gây nhiễm chủng virus GPVNB1 33

2.6.6 Phương pháp làm tiêu bản vi thể và quan sát bệnh tích trên tiêu bản của dê được gây nhiễm chủng virus GPVNB1 34

2.6.7 Phương pháp thống kê, xử lý số liệu 37

Chương III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38

3.1 Gây bệnh cho dê bằng chủng virus GPVNB1 38

3.1.1 Kết quả xét nghiệm kháng thể kháng virus đậu của dê trước khi gây nhiễm chủng virus GPVNB1 38

3.1.2 Kết quả theo dõi nhiệt độ, tần số hô hấp, tần số mạch của dê trước khi gây bệnh thực nghiệm 39

3.2 Kết quả gây bệnh thực nghiệm cho dê bằng chủng virus GPVNB1 42

3.2.1 Kết quả xét nghiệm virus GPVNB1 bằng phương pháp PCR 42

3.2.2 Triệu chứng lâm sàng chủ yếu của dê được gây nhiễm chủng virus GPVNB1 42

3.2.3 Thân nhiệt của dê được gây nhiễm chủng virus GPVNB1 44

3.2.4 Tần số mạch của dê sau khi gây nhiễm chủng virus GPVNB1 45

3.2.5 Tần số hô hấp của dê sau khi gây nhiễm chủng virus GPVNB1 47

3.2.6 Kết quả xác định một số chỉ tiêu huyết học của dê được gây nhiễm chủng virus GPVNB1 49

3.3 Kiểm tra một số bệnh tích của dê được gây nhiễm chủng virus GPVNB1 53

3.3.1 Bệnh tích đại thể của dê được gây nhiễm chủng virus GPVNB1 53

3.3.2 Bệnh tích vi thể 57

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 60

1 Kết luận 60

2 Đề nghị 60

TÀI LIỆU THAM KHẢO 61

PHỤ LỤC 63

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

3 ELISA Enzyme linked immuno-sorbent assay

4 EDTA Ethylene diamine tetra acetic acid

6 GPVNB1 Goat pox virus Ninh Bình 1

11 OIE The World Organisation for Animal Health

13 TCID 50 50% Tissue Culture Infective Dose

DANH MỤC BẢNG

1.1 Phát triển đàn dê trên thế giới 4 1.2 Số lượng đàn dê cả nước đến ngày 01/10/2014 5 3.1 Kết quả xét nghiệm kháng thể kháng virus đậu bằng phương pháp

ELISA 38 3.2 Kết quả xét nghiệm sự có mặt của virus đậu bằng phương pháp PCR 39 3.3 Kết quả nhiệt độ của dê kiểm tra trước khi gây nhiễm chủng virus

GPVNB1 (ºC) 40 3.4 Kết quả theo dõi tần số hô hấp của dê kiểm tra trước khi gây nhiễm

chủng virus GPVNB1 (lần/phút) 41 3.5 Kết quả theo dõi tần số mạch của dê kiểm tra trước khi gây nhiễm

chủng virus GPVNB1 (lần/phút) 41 3.6 Kết quả xét nghiệm virus GPVNB1 bằng phương pháp PCR 42 3.7 Triệu chứng lâm sàng chủ yếu của dê được gây nhiễm chủng virus

GPVNB1 (nTN=3, nĐC=2) 43 3.8 Thân nhiệt của dê được gây nhiễm chủng virus GPVNB1 (ºC) 44 3.9 Biến động tần số mạch sau khi gây nhiễm chủng virus GPVNB1

(lần/phút) 46 3.10 Biến động tần số hô hấp sau khi gây nhiễm chủng virus GPVNB1

(lần/phút) 48 3.11 Một số chỉ tiêu huyết học của dê mắc bệnh đậu 50 3.12 Công thức bạch cầu của dê mắc bệnh đậu 51 3.13 Bệnh tích đại thể chủ yếu của dê được gây bệnh thực nghiệm bằng

chủng virus GPVNB1 56

DANH MỤC HÌNH

1.1 Cách nhân lên của virus đậu dê 8

1.2 Cấu trúc của virus Capripovirus 10

1.3 Bệnh tích đậu trên da mặt và trên da bụng của dê 16

3.1 Biểu đồ nhiệt độ của dê trước khi gây nhiễm thực nghiệm 40

3.2 Biểu đồ thân nhiệt của dê sau khi được gây nhiễm chủng virus GPVNB1 45

3.3 Biểu đồ tần số mạch của dê sau khi gây nhiễm chủng virus GPVNB1 46

3.4 Biểu đồ thể hiện tấn số hô hấp của dê trước và sau khi gây nhiễm chủng virus GPVNB1 48

3.5 Biểu đồ thể hiện công thức bạch cầu của dê được gây nhiễm chủng virus GPVNB1 (A) và dê đối chứng (B) 52

3.6 Hình ảnh bệnh tích mụn đậu trên phổi dê mắc bệnh 54

3.7 Hình ảnh vi thể da dê bình thường và da dê mắc bệnh đậu 57

3.8 Hình ảnh vi thể phổi dê bình thường và phổi dê mắc bệnh đậu 58

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Trong những năm đầu của thế kỷ 21 việc đẩy mạnh phát triển về số lượng gia súc đang được nhiều quốc gia quan tâm nhằm đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của con người về thịt, sữa và các sản phẩm khác của ngành chăn nuôi

Bên cạnh những đại gia súc như trâu, bò, ngựa, v.v thì người ta đang chú

ý tới việc phát triển chăn nuôi dê vì những lợi ích kinh tế của nó Hiện nay, dê được nuôi rộng rãi ở hầu hết các nước trên thế giới, nhất là các nước Châu Á có

359 triệu con, chiếm 60,6% tổng số dê trên thế giới Hơn 90% tổng số dê trên thế giới được chăn nuôi ở các nước đang phát triển và mang lại hiệu quả kinh tế cao cho người dân

Chăn nuôi dê cần ít vốn, quay vòng vốn nhanh, tận dụng được lao động và điều kiện tự nhiên ở mọi vùng sinh thái, là định hướng hợp lý cho phát triển chăn nuôi của nông dân nghèo Khuyến khích chăn nuôi gia súc nhai lại nhỏ, là cuộc cách mạng thích hợp để giải quyết các vấn đề đói nghèo cho nhân dân các tỉnh trung du và miền núi hơn các chương trình phát triển đại gia súc khác Trong khi

đó, đại gia súc cần vốn đầu tư vượt quá khả năng của đa số nông dân, thời gian thu hồi lâu hơn và tiềm ẩn nhiều nguy cơ về kinh tế Chăn nuôi dê phát triển góp phần đa dạng hóa sản phẩm nông nghiệp, ổn định kinh tế và xã hội, giảm đói nghèo, tăng tỷ trọng chăn nuôi trong nông nghiệp

Những năm gần đây, nhu cầu sử dụng thịt dê và sữa dê ở nước ta tăng lên

rõ rệt, nhiều tỉnh và thành phố đã có kế hoạch phát triển đàn dê địa phương Nghề nuôi dê phát triển góp phần giải quyết công ăn việc làm và xóa đói giảm nghèo cho nhân dân các tỉnh trung du và miền núi Nước ta có tiềm năng để phát triển chăn nuôi dê, đặc biệt là các tỉnh miền núi Số dê được nuôi ở miền núi chiếm gần 3/4 tổng đàn dê và được nuôi chủ yếu ở các hộ nông dân với quy mô nhỏ vài chục con Tuy nhiên dịch bệnh vẫn đang là lực cản lớn Ngoài các bệnh nguy hiểm như lở mồm long móng, viêm loét miệng truyền nhiễm, bệnh về đường hô hấp và tiêu hóa,…hiện nay còn xuất hiện bệnh đậu dê gây nhiều thiệt hại đáng

kể, làm giảm khả năng sinh sản và chất lượng của thịt, lông, da và thiệt hại lớn về kinh tế

Đậu dê là một bệnh truyền nhiễm nguy hiểm cho dê được tổ chức dịch tễ thế giới (OIE) xếp vào bảng A- bảng các bệnh truyền nhiễm cực kỳ nguy hiểm

Bệnh đậu dê do virus Capripoxvirus thuộc họ Poxvidae gây nên, bệnh lây lan rất

nhanh, có thể xảy ra ở dê và cừu mọi lứa tuổi, mọi giống, trên cả con đực và con cái (Phạm Thành Long và cs, 2006) Đậu dê là bệnh quan trọng nhất trong số các bệnh đậu của loài nhai lại, gây tỷ lệ chết cao trong dê con (Nguyễn Như Thanh

và cs, 2001)

Bệnh xuất hiện trên thế giới từ rất lâu khoảng năm 200 sau Công nguyên, nhưng đến năm 1879, Hansen ở Nauy thông báo phát hiện bệnh đậu dê Ở Việt Nam, bệnh mới chỉ xuất hiện từ đầu năm 2005, năm 2006-2007 bệnh bùng phát thành dịch ở nhiều địa phương, đã gây nhiều thiệt hại về kinh tế đặc biệt đối với

hộ chăn nuôi nghèo và ảnh hưởng đến các hoạt động

Xuất phát từ những thực tế trên và góp phần hiểu rõ hơn về một số triệu chứng lâm sàng và đặc điểm bệnh tích ở dê mắc bệnh đậu cho các nhà nghiên

cứu cũng như người chăn nuôi, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu một số đặc điểm bệnh lý của dê được gây bệnh thực nghiệm bằng chủng virus đậu phân lập trên thực địa tại Thị xã Tam Điệp, tỉnh Ninh Bình”

2 Mục đích nghiên cứu

Nghiên cứu triệu chứng lâm sàng và biến đổi bệnh lý đại thể, vi thể của

bệnh đậu dê do virus Capripoxvirus thuộc họ Poxvidae gây ra và phục vụ cho các

nghiên cứu tiếp theo như sản xuất vacxin, đánh giá hiệu lực của vacxin phòng

bệnh

Chương I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tình hình chăn nuôi dê trên Thế giới và Việt Nam

1.1.1 Trên Thế giới

Dê thuộc họ Trâu Bò (Bovidae), là loài động vật guốc chẵn, thuộc nhóm động vật nhai lại, thức ăn chủ yếu là các loại thực vật, khả năng kháng bệnh cao nên dễ nuôi

Dê là một trong những động vật được con người thuần hóa sớm nhất trong lịch sử, theo các nhà nghiên cứu có thể từ thời đồ đá mới, khi con người bắt đầu sống định cư và nuôi trồng để có nguồn thực phẩm Hiện khắp các châu lục có

570 giống dê, thích nghi ở những nơi có điều kiện địa lý, khí hậu hoàn toàn khác nhau Trong đó, dê nuôi lấy sữa có 69 giống

Dê phục vụ cho nhu cầu đời sống con người qua nhiều lĩnh vực: thực phẩm (thịt, sữa, các sản phẩm chế biến từ sữa ), mỹ phẩm (sữa rửa mặt, sữa tắm, ), dệt may (lông, da làm túi xách, áo ấm, chăn, dép ), trang trí nội thất (da, sừng để trang trí trong nhà ), dược phẩm (cao dê,…) và nuôi làm cảnh

Sữa dê giàu dinh dưỡng không chỉ ở thành phần protein, khoáng chất, vitamin

mà trong sữa dê còn có rất nhiều acid amin thiết yếu mà cơ thể người không tự tổng hợp được như: tryptophan, lysine, valine, isoleucine, cystine, tyrosine…

Nuôi dê lấy sữa phát triển trong thời gian qua Lượng sữa dê toàn cầu năm

2000 là 12,8 triệu tấn, đến 2011 là 15,8 triệu tấn, tỷ lệ tăng trưởng 24% Năm

2011, châu Á dẫn đầu về sản lượng sữa dê với hơn 10 triệu tấn, chiếm 63% sản lượng thế giới, kế đến là châu Âu (17%) và châu Phi (16%) Có mức tăng sản lượng sữa dê nhiều là châu Đại Dương, tăng 50% trong 10 năm, kế đến là châu Á 44,2%, trong khi đó châu Phi giảm 5,7%

Ấn Độ là nước có sản lượng sữa dê dẫn đầu thế giới với 4,6 triệu tấn, chiếm 28,98% sản lượng thế giới, kế đến là Bangladesh với 2,5 triệu tấn (15,74% sản lượng thế giới) Ở Ấn Độ phần lớn sữa dê sản xuất ra được tiêu thụ tại chỗ, khác với Pháp - nơi sản xuất nhiều sữa dê châu Âu, có hơn 90% sản lượng sữa dê dùng chế biến phô mai để bán ra thị trường

Năm 2011, đàn dê thế giới có 875,5 triệu con, phần lớn ở châu Á chiếm 61,6% số lượng dê thế giới, kế đến là châu Phi chiếm 31,6% Mức tăng số lượng

dê nhiều nhất sau 10 năm là châu Đại Dương (105,2%), kế đến là châu Á (17,6%) và châu Phi là (16,9%), trong khi đó đàn dê châu Âu lại suy giảm 9,9% (B1) (FAO, 2013)

Bảng 1.1 Phát triển đàn dê trên thế giới

dê, cung cấp 94% tổng sản lượng thịt dê cho toàn thế giới Đàn dê châu Phi tăng, nhưng tổng lượng sữa giảm và sản lượng thịt tăng cho thấy xu hướng phát triển đàn dê hướng thịt ở khu vực này Mức tăng ấn tượng sản lượng thịt dê là châu Đại Dương, có tỷ lệ tăng trưởng 107,7% trong 10 năm, kế đến là châu Á 40,9%

Xu hướng sử dụng thịt dê trên thế giới sắp tới sẽ còn phát triển (FAO, 2013)

1.1.2 Tại Việt Nam

Nước ta có điều kiện khí hậu nóng ẩm, nhiều đồi núi, nơi có nhiều cây cỏ phát triển thích hợp với việc nuôi dê Chăn nuôi dê, cừu cần ít vốn, dê sinh sản nhanh nên nhanh quay vòng vốn Thời gian cho sữa nhanh (17 tháng tuổi) hơn bò (36 -48 tháng tuổi) Dê, cừu cho nhiều sản phẩm: thịt, sữa, da, lông Phân dê còn tận dụng nuôi giun nuôi thủy sản, phân bón rất hiệu quả Dê có khả năng thích

nghi cao, có thể phát triển ở cả những vùng khô cằn, đồi núi hoang hóa nên có thể phát triển ở những vùng không thể nuôi bò Nhiều thành tựu về nghiên cứu, đầu tư và phát triển thị trường đã phát huy hiệu quả rõ rệt, kể cả những vùng sâu,

xa như các huyện của Hà Giang, Nghệ An, …

Thịt dê, cừu là đặc sản và bổ dưỡng, đáp ứng nhu cầu và thị hiếu tiêu dùng ngày càng cao của nhân dân Định kiến về thịt dê, sữa dê hôi đã được xóa

bỏ, chuyển biến tích cực của người tiêu dùng với sản phẩm chăn nuôi dê, cừu đã

và đang là động lực mạnh mẽ cho chăn nuôi dê, cừu phát triển

Chăn nuôi dê, cừu ở nước ta đã và đang bắt đầu được đầu tư cả về chính sách, nguồn lực và có một hứa hẹn thị trường trong và ngoài nước không ngừng được phát triển Công tác nghiên cứu về giống, thức ăn, thú y, mô hình chuồng trại và sản xuất, kinh doanh đã và đang có nhiều thành tựu Đa số các tỉnh đều có kế hoạch tăng trưởng đàn dê Một số dự án nghiên cứu, điều tra, quy hoạch phục vụ chăn nuôi dê, cừu ở Việt Nam đã được hoàn thành Thu hút được nhiều tổ chức Quốc tế như FAO, DED (của Đức), ILRI, SAREC-SIDA Thụy Điển, Hà Lan, Hội đồng Anh… tham gia hiệu quả vào công tác nghiên cứu, đầu tư và phát triển sản xuất

Bảng 1.2 Số lượng đàn dê cả nước đến ngày 01/10/2014

chuồng

Sản lượng thịt hơi xuất chuồng

1.2 Bệnh đậu dê

1.2.1 Giới thiệu chung về bệnh

Đậu dê là một bệnh truyền nhiễm cấp tính xảy ra ở dê, được đặc trưng bởi

sự lây lan nhanh Bệnh được Tổ chức Thú y thế giới (OIE) xếp vào bảng A danh mục các bệnh cực kỳ nguy hiểm Bệnh do virus ở dê gây ra với đặc điểm gây sốt, chảy nước mắt, nước mũi Bệnh tích xuất hiện dễ thấy nhất là bệnh tích trên da, đường hô hấp, đường tiêu hóa Bệnh được miêu tả chi tiết khoảng 200 năm sau công nguyên trong một tài liệu về thú y cổ xưa và cũng bắt đầu lây lan từ thời đó Hansen đã đưa ra bản báo cáo về Bệnh đậu dê năm 1879 ở Nauy Trong suốt cuộc Đại chiến thế giới lần thứ nhất bệnh đã lây lan khắp Macedonia và được công bố dịch năm 1926 với tỷ lệ chết là 15%

Nguyên nhân gây bệnh chính là virus đậu đê (GPV), đôi khi có virus đậu cừu (SPV) Đây là một loại AND virus có vỏ bọc, được đặt tên là giống

Capripoxvirus , họ Poxviridae Bệnh gây ra những tổn thất rất lớn về kinh tế: gây

chết dê non với tỷ lệ cao, giảm khả năng sản xuất nói chung, giảm chất lượng lông và da, gây tổn thất cho những trang trại chăn nuôi tập trung, hạn chế thông thương quốc tế Bệnh đậu dê được xem như bệnh quan trọng nhất trong các bệnh đậu của ngành chăn nuôi gia súc

Virus đậu dê có khả năng chống chịu rất tốt, chúng sống được một thời gian dài ngoài môi trường: 6 tháng trong bóng râm của khu chăn thả, 3 tháng trong vảy khô trên lông, da cừu

1.2.2 Dịch tễ học

1.2.2.1 Sự phân bố

Bệnh đậu dê đã được phát hiện ở khắp Đông Nam Á, Ấn Độ, phía Bắc và trung tâm Nam Phi, bệnh gây thiệt hại rất lớn về kinh tế cho ngành chăn nuôi Năm 1886, nước Anh đã thanh toán được bệnh này, nhưng lục địa Châu Âu thì mãi gần đây mới xóa được nó Do việc nhập khẩu động vật từ nước ngoài ngày càng trở nên phổ biến nên bệnh hiện nay vẫn gây ra các ổ dịch ở Đông Âu, Địa Trung Hải

Ở Việt Nam bệnh xuất hiện đầu tiên vào năm 2005 tại một số tỉnh phía Bắc như Cao Bằng, Lạng Sơn, Bắc Giang, Hà Tây (Phạm Thành Long và cs) Sau đó bệnh nhanh chóng lan ra các tỉnh có chăn nuôi dê thuộc miền Trung (2006-2008) và miền Nam (2007-2008), gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến chăn nuôi dê ở nước ta Sự phân bố của dịch bệnh đậu dê phản ánh các hình thức chăn nuôi truyền thống nhỏ lẻ hay đã có những thay đổi trong cách quản lý và trong thông thương buôn bán Lý do chính là bệnh xảy ra bắt nguồn từ những động vật được đưa ra ngoài địa phương vào Nếu trong một vùng địa phương thì bệnh lây lan trong khoảng 3-6 tháng sau đó biến mất do không có thêm động vật cảm thụ

1.2.2.2 Động vật cảm nhiễm

Capripoxvirus chỉ gây nhiễm động vật có móng guốc, hầu hết virus hướng tới một loài động vật đặc trưng Trong điều kiện tự nhiên GPV gây nhiễm trên

dê, virus phân lập được ở Trung Đông, Ấn Độ cho thấy chúng chỉ đặc trưng trên

dê mà không gây nhiễm cho cừu Những virus này cũng được phân lập từ cả dê

và cừu ở vùng Oman của Yemen và Kenia Tuy nhiên, trên thực tế những xét nghiệm sinh hóa cũng khó phân biệt được virus gây bệnh đó là đặc trưng trên dê hay trên cừu

Dê ở tất cả các lứa tuổi, tính biệt đều có thể bị mắc bệnh này, đặc biệt là

dê non, dê già, dê nuôi lấy sữa

Dịch bệnh đậu dê không phát ra theo mùa rõ ràng

Mức độ trầm trọng của dịch bệnh phụ thuộc vào mật độ động vật mẫn cảm, độc lực của giống GPV và giống nhiễm bệnh Nói chung, với một đàn mẫn cảm thì tỉ lệ nhiễm có thể lên tới 75%, tỷ lệ chết cao tới 50%, đặc biệt có đàn gia súc non chết tới 100%

1.2.3 Phương thức truyền lây

1.2.3.1 Cách lây nhiễm

Virus này thường tập trung nhiều ở bộ máy hô hấp, bởi vậy sự lây nhiễm bệnh thường xảy ra do quá trình tiếp xúc với các chất bài tiết, bài xuất qua ăn uống Trong phòng thí nghiệm có thể gây bệnh cho động vật bằng nhiều cách khác nhau: cho côn trùng đốt, tiêm trong da, tiêm dưới da, tiêm tĩnh mạch, phun

khí dung virus nhân tạo Các cách này đều làm cho động vật thí nghiệm mắc bệnh Động vật thí nghiệm, rất nhanh, sẽ xuất hiện các nốt đậu, sau 10 ngày thì kháng thể trong máu đã tăng lên đáng kể Hiệu giá virus được kiểm tra từ các nốt nhú, niêm mạc, dịch mũi, miệng, nước mắt, sữa, niệu đạo, tinh dịch rất cao Các

cơ quan bộ phận này đều có đặc điểm có thể tạo ra chất bài xuất, bài tiết nên sẽ là nguồn lây lan bệnh rất nguy hiểm

1.2.3.2 Cách nhân lên của virus đậu dê

Quá trình nhân lên của virus diễn ra trong tế bào chất khi số lượng của virus trong tế bào đạt được mức độ cần thiết cho việc tái tạo gen Quá trình này cũng sử dụng một số nguyên liệu từ tế bào của vật chủ, nhưng những chất nào đã được sử dụng thì chưa rõ Thụ thể (receptor) của virus đậu, mặc dù chưa chắc chắn nhưng có thể nhận thấy có nhiều loại khác nhau

Nguồn http://web.stanford.edu/group/virus/1999/reynafue/replication.html

Hình 1.1 Cách nhân lên của virus đậu dê

1.2.4 Virus đậu dê

1.2.4.1 Phân loại virus

Virus đậu dê là ADN virus 2 sợi có vỏ bọc, thuộc nhóm Capripoxvirus, họ Poxviridae (Pandey.A.K et al, 1969) Trong nhóm Capripoxvirus, ngoài virus

gây bệnh đậu dê còn có virus gây bệnh đậu cừu, virus gây bệnh u da ở bò

(Lumpy skin disease virus – LSDV) và một số virus gây bệnh đậu khác Tuy nhiên, trong điều kiện tự nhiên chỉ có virus đậu dê và đậu cừu có thể gây nhiễm chéo cho hai loài dê và cừu, còn virus gây bệnh u da ở bò không lây sang dê, cừu Khi giải trình tự hệ gen cho thấy bộ gen của virus đậu dê và virus đậu cừu

có chiều dài khoảng 150 kb và đáng chú ý là chúng rất giống nhau, biểu hiện 96% thành phần các nucleotid giống nhau trên toàn bộ chiều dài hệ gen giữa 2 chủng gây bệnh cho dê và cừu Đối với kiểu gen thông thường chúng có ít nhất

147 gen, bao gồm các gen bảo tồn sự nhân lên của virus và các cấu trúc gen có liên quan tới độc lực của virus và khả năng gây bệnh ở vật chủ Gen của virus đậu dê và đậu cừu rất giống nhau và giống với gen của virus gây bệnh u da ở bò,

có tới 97% thành phần nucleotide giống nhau (Sharma.S.N, 1972)

Tất cả các gen của virus đậu dê, cừu đều có mặt trong hệ gen của virus gây bệnh u da ở bò Điểm khác biệt là trong bộ gen của virus đậu dê, cừu không có mặt của 9 gen quy định độc lực và hệ vật chủ của LSDV bao gồm 1 gen cho LSDV là LSDV 132 và các gen tương tự như những gen mã hoá cho thụ thể Interleukin -1, Myxoma M003.2 và M004.1 (mỗi loại 2 gen) cùng các gen virus vaccine F11L , N2L, K7L Sự vắng mặt của những gen này trong hệ gen của virus đậu dê, cừu được phỏng đoán là chúng có vai trò quan trọng trong xác định phạm vi vật chủ là bò (Soma JP et al,1985) (Yazici Z et al, 2008)

Hệ gen của virus đậu dê, cừu có chứa các nucleotide đặc hiệu khác nhau, được cho là chúng thuộc về các loài riêng biệt Một số sự thay đổi nhỏ trong bộ gen của virus đậu dê và virus đậu cừu được giải thích là sự giảm độc của virus bởi vì chúng có chứa 7 và 71 gen thay đổi so với các chủng đậu dê, cừu ngoài thực địa Đáng chú ý là những thay đổi về gen bao gồm đột biến hoặc đứt gãy của các gen với những chức năng quy định về độc lực và hệ vật chủ, bao gồm protein Ankyrin được lặp lại trong virus đậu cừu và 3 protein dạng Kelch trong virus đậu dê Những số liệu so sánh về gen này chỉ ra mối quan hệ gần gũi giữa

các loại virus thuộc nhóm Capripoxvirus và chúng được phỏng đoán rằng virus

đậu cừu và virus đậu dê được tiến hoá từ một dạng virus LSDV cổ

1.2.4.2 Hình thái - cấu tạo

Hạt virus có dạng hình cầu, khi quan sát dưới kính hiển vi điện tử có kích thước hạt virus khoảng 300*270*200 nm, lõi hình dùi trống, hai thể bên chạy dọc theo lõi, bên ngoài hạt virus được bao bọc bởi lớp vỏ lipid kép bên trên có các sợi protein

Virus đậu dê chứa hệ gen cấu trúc ADN xoắn kép, trọng lượng phân tử khoảng 73-91 ĐvC Bộ gen của virus đậu dê có khoảng 150.000 đến 160.000 nucleotide

Phân tử ADN được hoà hợp với chất protein để tạo thành nucleocapsid kiểu xoắn, nó cuộn đều lại quanh một nhân trung tâm theo hình thấu kính hai mặt lõm vào, có nhiều lớp protein bao bọc xung quanh, lớp ngoài có cấu trúc hình sợi dây thừng xoắn cuộn, ngoài ra còn có một màng bao bọc ngoài cùng

Nếu cắt ngang hạt virus, thấy mặt cắt ngang có hình tròn, hình bầu dục, giữa có màng nhân hình chày, từ ngoài vào trong có cấu tạo:

- Ngoài cùng là lớp vỏ bọc ngoài của virus

- Sau lớp vỏ bọc ngoài là một lớp mịn chứa kháng nguyên hoà tan

- Tiếp đến là một lớp màng protein có cấu trúc sợi đều đặn và chặt chẽ bao quanh, hình thành một cái khuôn bảo vệ nhân ADN, khuôn protein này chính

là lớp vỏ capsid được cấu tạo bởi nhiều đơn vị capsome

- Sau lớp vỏ capsid là mặt bên virus và lớp màng nhân hình chày

- Trong cùng là phân tử ADN hình sợi xoắn lại theo chiều ngược nhau

Nguồn http://www.slideshare.net/lathajithin/poxviruses

Hình 1.2 Cấu trúc của virus Capripovirus

Về cấu trúc kháng nguyên của virus đậu có khác với virus có kích thước nhỏ, vì virus có thêm lớp vỏ bọc ngoài nên ngoài kháng nguyên nucleoprotein còn có kháng nguyên hoà tan, kháng nguyên này nằm trên bề mặt của virion Những nghiên cứu về cấu trúc chính của các polypeptide của virus đậu được xác định bằng sự phân tích điện di gel polyacrylamide (PAGE), kết quả cho thấy có hơn 20 vạch có thể phân biệt từ một virus đã được tinh khiết bao gồm một kháng nguyên kết tủa chính có trọng lượng phân tử 67kDa (Murphy.F.A et al, 1995) Những kháng nguyên kết tủa này được gọi là kháng nguyên hoà tan, loại kháng nguyên đại diện cho một công cụ chẩn đoán có giá trị đối với sự nhiễm virus đậu (Deshmukh.V.V et al, 1992) (Tô Long Thành, 2006)

Các kháng nguyên hoà tan có khả năng kích thích virus tạo ra số lượng lớn kháng nguyên trong quá trình nhân lên của virus Kháng huyết thanh kháng lại chúng tăng lên có thể trung hoà đặc hiệu tính gây bệnh của virus vì có một số kháng nguyên hoà tan có cấu trúc là thành phần của virus (Deshmukh.V.V et al, 1992)

1.2.4.3 Đặc tính nuôi cấy và sự nhân lên của virus

Virus đậu dê thích hợp nuôi cấy trên các môi trường là mô tổ chức có nguồn gốc từ dê, cừu, đặc biệt trên môi trường tế bào thận cừu, dịch hoàn cừu sơ cấp hoặc thứ cấp Tuy nhiên, virus đậu dê chỉ gây bệnh tích tế bào sớm nhất 4 ngày sau khi gây nhiễm, vì vậy cần kiểm tra các môi trường tế bào đã nhiễm virus trong vòng 14 ngày

Có thể nuôi cấy virus đậu trên màng nhung niệu của phôi thai gà ấp 11 -

13 ngày, sau khi gây nhiễm 3 - 4 ngày, xuất hiện bệnh tích nốt đậu trên màng thai dưới dạng màu trắng, xám đục, màng thai phù nề và dày lên

1.2.5 Sức đề kháng của virus

Virus đề kháng yếu với nhiệt độ và tính nhạy cảm với nhiệt khác nhau giữa các chủng virus Các chủng virus đậu dê từ Iran và Ai Cập có sức đề kháng với nhiệt độ tốt hơn chủng Dushmbe Sau khi xử lý nhiệt 56ºC trong vòng 1h vẫn không làm giảm đáng kể hiệu giá virus Trong khi đó chủng virus đậu dê phân lập từ Ấn Độ dễ bị vô hoạt sau vài phút ở 60ºC virus (Carn.V.M, 1993) Các chất sát trùng thông thường như focmol, cồn, thuốc tím có thể diệt virus rất nhanh, sự

thối nát cũng dễ dàng diệt virus, ở dung dịch glycerin 50% có thể bảo quản virus không bị phá huỷ (Sharma.S.N and Dhanda.M.R, 1972)

Virus đậu dê đề kháng mạnh và duy trì sự tồn tại trong thời gian dài trong vật chủ hay ngoài môi trường Thực nghiệm cho thấy chúng có thể tồn tại 6 tháng trong các bãi quây nhốt động vật dưới bóng mát, trên nền chuồng, và ít nhất là 3 tháng trong vảy mụn khô trên da, lông của động vật bị nhiễm bệnh Virus có thể phát tán qua quần áo bảo hộ, dụng cụ chăn nuôi Chưa có bằng chứng về sự lây truyền virus đậu dê qua tinh dịch hoặc phôi thai

Những nghiên cứu về sức đề kháng của virus đậu dê cho thấy, các chủng virus đậu nói chung đề kháng với điều kiện khô, tồn tại được trong điều kiện đông lạnh và tan chảy và tồn tại nhiều tháng trong tình trạng đông khô

1.2.6 Đường truyền bệnh

Bệnh lây lan chủ yếu qua đường tiếp xúc trực tiếp giữa động vật mẫn cảm với động vật mang mầm bệnh qua không khí hoặc phối giống (Soman.J.P et al, 1985) Động vật mắc bệnh bài thải virus qua vảy đậu khô, nước mũi, nước bọt, trong sữa, nước tiểu và phân Thời gian bài thải virus có thể kéo dài từ 1 - 2 tháng Thêm nữa các vết xước trên da hay vết do côn trùng đốt cũng là nơi virus đậu dê thâm nhập vào cơ thể vật chủ (Murphy.F.A et al, 1995)

Có thể gây bệnh cho dê trong phòng thí nghiệm bằng cách sử dụng virus đậu dê cường độc tiêm vào vùng hạ bì, nội bì, cơ hoặc phun khí dung qua đường hô hấp Các virus đậu dê có sức đề kháng cao, có thể sống sót trong thời gian dài trên vật chủ hay ngoài môi trường, ví dụ chúng có thể tồn tại tới 6 tháng trên nền chuồng

và ít nhất là 3 tháng trên vẩy mụn khô nằm trên lông và trên da con vật bị bệnh Virus cũng có thể được phát tán qua quần áo bảo hộ và các dụng cụ chăn nuôi Chưa

có bằng chứng về sự truyền lây virus đậu dê qua tinh dịch hoặc phôi thai

1.2.7 Miễn dịch chống virus

1.2.7.1 Miễn dịch không đặc hiệu

- Cơ thể đáp lại sự xâm nhiễm của virus trước hết bằng cách tiết interferon (IFN) tại chỗ để ngăn cản sự nhân lên và phát triển lan tràn của virus IFN được xem

là yếu tố bảo vệ cơ thể không đặc hiệu vì chúng được sản ra để đáp lại một virus thì cũng có hiệu quả ngăn chặn sự nhân lên của nhiều loại virus khác

- Khi nhiễm virus, tế bào natural killer (NK) được hoạt hóa bởi IFN tăng cường phá hủy tế bào nhiễm Trên mặt tế bào NK có thụ thể KCIR (killer cell inhibitory receptor) dành cho MHC-1 của tế bào đích Khi KCIR gắn với MHC thì ức chế tín hiệu hoạt hóa Tế bào nhiễm virus có ít MHC nên không bị ức chế

- Miễn dịch chủ động tự nhiên: là các đáp ứng miễn dịch được hình thành sau khi cơ thể bị nhiễm mầm bệnh

- Miễn dịch chủ động nhân tạo: là các đáp ứng được hình thành sau khi dùng vaccine (Davies.F.G, 1976)

Đáp ứng miễn dịch chủ động thành công:

Để thu được một đáp ứng miễn dịch chủ động có kết quả, các tế bào có thẩm quyền miễn dịch phải có các khả năng sau:

- Khả năng nuốt và chế biến kháng nguyên

- Khả năng nhận biết và kết gắn với kháng nguyên đã được chế biến

- Khả năng đáp ứng để sản xuất kháng thể đặc hiệu và/hoặc các tế bào hoặc cả hai có khả năng loại bỏ kháng nguyên

Điều đó có nghĩa là cơ thể phải vừa có khả năng hình thành đáp ứng miễn dịch dịch thể, vừa có khả năng hình thành đáp ứng miễn dịch tế bào (Davies.F.G, 1976) (Bakos.K and Brag.S, 1957)

* Miễn dịch thụ động

Miễn dịch thụ động là miễn dịch thu được bằng cách truyền kháng thể đặc hiệu hoặc là các tế bào của hệ thống miễn dịch Có hai loại miễn dịch thụ động:

tự nhiên và nhân tạo

- Miễn dịch thụ động tự nhiên: là một yếu tố rất quan trọng trong việc tạo cho vật nuôi non sống sót được trong môi trường nhiều mầm bệnh Đây là sự miễn dịch tạm thời truyền từ mẹ sang con con

- Miễn dịch thụ động nhân tạo: truyền từ vật chủ khác Là các thành phần khác nhau của đáp ứng miễn dịch có thể được thu thập lại từ con vật đã được miễn dịch và truyền bị động cho một động vật khác với mục đích là truyền sự bảo hộ

Sự nhiễm với các virus đậu gây ra cả đáp ứng miễn dịch dịch thể và miễn dịch qua trung gian tế bào (Nandi.S and Rao.T.V.S, 1997), (Kitching.R.P, 1986), (Tô Long Thành, 2006) Sự liên quan quan trọng của kháng thể lưu hành chống lại tế bào lympho T gây độc trong việc ngăn chặn sự nhiễm bệnh vẫn chưa được hiểu đầy đủ, rõ ràng Tuy nhiên, rõ ràng là với sự có mặt cả kháng thể lưu hành chống lại virus, sự nhiễm v ào vật chủ đã giảm xuống (Soman.J.P et al, 1985) Kháng thể lưu hành được tạo ra do nhiễm tự nhiên hay do tiêm vaccine có thể hạn chế sự lan truyền của virus trong động vật, nhưng chính đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào mới loại trừ được sự nhiễm (Singh.R.P et al, 1998) Tuy nhiên, tình trạng miễn dịch của động vật do bị nhiễm tự nhiên hay do tiêm vaccine không liên quan đến kháng thể trung hòa (Pandey.A.K et al, 1969) và các phản ứng huyết thanh học hiện nay không thể phân biệt rõ ràng giữa động vật miễn dịch và động vật cảm nhiễm

Ở những khu vực có dịch địa phương, cả vaccine sống giảm độc và vaccine chết đều hữu hiệu trong việc phòng chống bệnh đậu dê, đậu cừu, nhưng vaccine chết chỉ gây miễn dịch trong thời gian ngắn Vaccine sống giảm độc gây miễn dịch cao nhưng có nhược điểm là tạo ra nốt đậu hoặc có thể gây chết một số động vật được tiêm vaccine do sự phát triển của bệnh Thông thường, việc sử dụng vaccine gồm các chủng đang được lưu hành tại địa phương rất thành công trong việc bảo vệ đàn dê chống lại bệnh đậu dê

Ở những nước khác nhau và những vùng khác nhau trong một nước, có rất nhiều loại vaccine sống giảm độc tồn tại để chống lại bệnh đậu dê, cừu với nhiều mức độ hiệu quả bảo hộ khác nhau Một loại vaccine dưới đơn vị cũng dường như được sử dụng trong việc kiểm soát bệnh vì nó tạo ra kháng thể trung hòa cao hơn ở những dê đã miễn dịch Hơn nữa, một loại vaccine đơn được sản xuất từ một chủng gây nhiễm cho cả dê và cừu có hiệu quả trong việc kiểm soát

cả đậu dê và đậu cừu ít nhất từ 6 - 12 tháng (Singh.R.P et al, 1998)

Tuy nhiên, các báo cáo về sự bảo hộ chéo giữa dê và cừu chống lại bệnh đậu dê và đậu cừu và các bệnh liên quan khác như bệnh nổi u cục ở bò thường trái ngược và bỏ lửng (không kết luận); những cố gắng để bảo vệ dê bằng vaccine đậu cừu hoặc bảo vệ cừu bằng vaccine đậu dê phần lớn không thành công Yêu cầu thông thường là nên sử dụng vaccine đồng chủng để bảo vệ dê chống lại bệnh đậu dê, bảo vệ cừu chống lại bệnh đậu cừu

1.2.8 Triệu chứng lâm sàng và bệnh tích

1.2.8.1 Triệu chứng lâm sàng

Thời gian ủ bệnh trung bình khoảng 5 đến 14 ngày, biểu hiện của bệnh tùy thuộc vào chủng virus Con vật sốt kéo dài từ 4 đến 7 ngày sau khi mắc bệnh Một vài giống cừu Châu Âu như giống Soay, có thể mắc bệnh ở thể cấp tính và chết trước khi các nốt tổn thương xuất hiện trên da Thường thì sau khi sốt cao trên 40oC, một số vùng da xuất hiện những nốt đỏ và những đốm xuất huyết (đường kính 2-3 cm) rất dễ thấy trên các vùng da trắng của dê, đặc biệt là dưới bụng 24 giờ sau các nốt sưng lớn thành các nốt sần cứng Các nốt này bao phủ khắp cơ thể, nhưng tập trung nhiều ở đầu, cổ, màng ngoài của mắt, mũi, lách, bụng, bộ phận sinh dục (bao quy đầu, âm hộ), hậu môn Các nốt sần ở phần niêm mạc miệng nhanh bị loét Khi chúng kết hợp với chất tiết của mũi, mắt thì trở thành màng mủ nhầy Các hạch lympho đều sưng Nếu động vật sống sót sau quá trình cấp tính của bệnh thì các nốt đậu bắt đầu hoại tử trở thành các vẩy khô sau 5-10 ngày Vảy này tồn tại dai dẳng hàng tháng Có trường hợp virus gây ra dạng tổn thương mụn nước trên da, nhưng trường hợp này rất hiếm Tổng thời gian của quá trình diễn biến bệnh là khoảng 1-2 tháng

Hình 1.3 Bệnh tích đậu trên da mặt và trên da bụng của dê

- Mổ khám thấy bệnh tích ăn sâu dưới da, biểu bì và ăn vào tận gần lớp cơ

- Khí quản xung huyết, có vết đốm màu trắng hình hạt đậu trên phổi Bệnh tích này lan tràn trên khắp phổi mà không có khu vực nào rõ ràng

- Bệnh tích có thể phát triển làm phổi cứng lại

- Màng phổi tích dịch và xung huyết

Lớp tế bào hạt và tế bào gai trương phồng, tan rữa do thoái hoá không bào, tế bào vỡ ra tạo thành bọc nước lẫn với mảnh tế bào đội lớp sừng lên Khi có

bạch cầu xâm nhiễm sẽ tạo thành mụn mủ rồi sau đó khô dần thành vẩy bong đi Nếu đơn thuần chỉ do virus đậu tác động thì nốt loét nông, tế bào tầng phát sinh chỉ bị tổn thương rất nhẹ, chỗ tổn thương nhanh hồi phục do tế bào tầng tái phát sinh rất nhanh và không hình thành sẹo Khi vi khuẩn tác động kế phát gây tổn thương sâu xuống dưới tầng phát sinh và hạ niêm mạc, tổn thương sẽ lâu khỏi và

để lại sẹo như đậu mùa

Khi virus đậu xâm nhập vào tế bào sẽ hình thành các tiểu thể và thể bao hàm ở tế bào da và niêm mạc Quá trình bệnh lý diễn ra kéo theo sự tác động của các tế bào bạch cầu Tế bào bạch cầu xuyên mạch để tập trung tới nhưng nơi bị virus tấn công Lymphocyte, neutrophils, eosinophils và histiocytes được tìm thấy rất nhiều trong máu và trong tổ chức (Phạm Thành Long và cs, 2006)

1.2.9 Chẩn đoán bệnh đậu dê

1.2.9.1 Chẩn đoán lâm sàng

Tại khu vực chăn nuôi dê chúng ta có thể nghi ngờ gia súc mắc bệnh đậu

dê khi con vật có các biểu hiện như:

- Sốt cao, ủ rũ, bỏ ăn, đứng với dáng điệu lưng cong, nằm co quắp

- Thở nhanh, mí mắt sưng, tiết dịch nhày ở mũi

- Trên da có những nốt phát ban, đặc biệt là vùng da không có lông

- Bệnh tích phát triển thành những nốt sần

1.2.9.2 Bệnh tích mổ khám

Bệnh tích trên da: sung huyết, xuất huyết, phù nề, viêm mạch máu và hoại tử Thường gặp hai dạng bệnh tích đậu trên da là dạng mụn nước và dạng nốt đậu Với dạng mụn nước lúc đầu mụn đậu chuyển sang màu trắng nâu, khô dần, cứng lại thành vảy dễ bong ra Với dạng nốt đậu, mụn đậu sưng to dần thành nốt sần ăn sâu vào da, tạo thành các nốt hoại tử và khi lành biến thành sẹo không có lông

Bệnh tích đậu trên niêm mạc mắt, miệng, mũi, hầu, nắp thanh quản, khí quản; trên niêm mạc dạ cỏ và dạ múi khế, trong âm hộ, bao quy đầu, nếp gấp âm vật, tinh hoàn, vú, núm vú

Bệnh tích ở phổi: tổn thương đậu nghiêm trọng và lan rộng, phân bố tập

trung và đồng dạng khắp lá phổi

1.2.9.3 Chẩn đoán phân biệt

Cần chẩn đoán phân biệt bệnh đậu dê với các bệnh sau:

* Bệnh lưỡi xanh

Bệnh thường xảy ra ở cừu, xuất hiện không điển hình ở trâu, bò, dê Là một căn bệnh nguy hiểm không kém chứng lở mồm long móng Tỷ lệ chết khoảng: 2% - 10%

Giống: viêm loét niêm mạc, viêm loét da chân, viêm phổi, sảy thai Khác: không tạo thành các nốt đậu cứng trên da và trong nội tạng

* Bệnh lở mồm long móng

Giống: có bệnh tích dạng mụn ở da và niêm mạc Ban đầu con vật sốt, sau

đó khi qua giai đoạn cấp tính con vật hết sốt, nhiệt độ trở lại gần như bình thường

Khác: tổn thương dạng mụn nước và không có tổn thương dạng mụn trong nội tạng Trong khi tổn thương của bệnh đậu dê là tổn thương dạng tăng sinh và tổn thương đến tận nội tạng

* Bệnh viêm loét da truyền nhiễm

Giống: có bệnh tích là các vết sần, mụn mủ, mụn nước trên da, môi, mũi, các vùng da không có lông

Khác: không tạo ra các nốt sần trong nội tạng

* Bệnh viêm phế quản phổi

Giống: con vật sốt cao, chảy nước mắt, nước mũi, ho kéo dài, bệnh tích đại thể thấy phế quản, phổi viêm, xung huyết từng đám, bên trong có dịch như keo nhầy

Khác: ở giai đoạn muộn con vật cũng không có những tổn thương dạng mụn đậu trên da và niêm mạc

* Bệnh viêm loét miệng truyền nhiễm (contagious ecthyma)

- Giống: Dê bị mắc bệnh chủ yếu có bệnh tích ở môi, mép , mũi, trong miệng, đôi khi có các đám loét trên niêm mạc phế quản, khí quản, phế nang

- Khác: Các tổn thương không xuất hiện trên toàn thân như trong bệnh đậu

dê Các nốt hoại tử cũng không xuất hiện trong niêm mạc nội tạng của con vật mắc bệnh

Căn cứ vào các đám mụn nước trên môi, miệng, mép của dê để đoán bệnh Kết hợp làm các xét nghiệm về virus và các phản ứng huyết thanh để chẩn đoán chính xác, chẩn đoán phân biệt với một số bệnh khác

* Bệnh giun phổi

Giống: con vật ho kéo dài, chảy nước mắt, nước mũi, mổ khám thấy bệnh tích trên phế quản, thanh quản có những đám tụ huyết, trong lòng phế quản có nhiều dịch nhầy và mủ

Khác: Ngoài bệnh tích tại đường hô hấp ra thì con vật không xuất hiện bệnh tích khác đặc biệt trên các cơ quan nội tạng

1.2.9.4 Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

Trong một số trường hợp, gia súc không biểu hiện triệu chứng lâm sàng, cần lấy mẫu bệnh phẩm của các con vật bị bệnh để xét nghiệm trong phòng thí nghiệm

Các mẫu dùng cho chẩn đoán trong phòng thí nghiệm (phân lập virus) thường là các mô sinh thiết nhưng nên lấy mẫu từ 1-2 trường hợp bị nhiễm cấp tính Mẫu sinh thiết nên bao gồm 2-3 nốt sần hoặc mụn nước, dùng nước sạch để rửa Nếu mẫu xét nghiệm là máu thì phải lấy vô trùng từ con vật mắc bệnh đang

ở giai đoạn đầu của quá trình sốt Dùng chất chống đông để bảo quản mẫu máu Ngoài ra có thể lấy bệnh phẩm là khí quản, phổi, hạch lympho tăng sinh Mẫu phải mang đi xét nghiệm trong vòng 24 giờ trong điều kiện bảo quản bằng đá ướt, nếu bảo quản bằng đá khi thì tối đa cũng chỉ là 1 ngày

Mẫu dùng trong chẩn đoán vi thể là các mô phải được giữ trong dung dịch

formalin 10%, không được làm đông lạnh để gửi tới phòng thí nghiệm

Mẫu làm huyết thanh: lấy tối thiểu 3 mẫu trong trường hợp phát hiện sớm

và 3 mẫu trong trường hợp mãn tính Có thể lấy huyết thanh của những cá thể hồi phục sớm (ở 14-21 ngày)

Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm có rất nhiều phương pháp khác nhau Ban đầu phương pháp chủ yếu được sử dụng là phương pháp khuếch tán trên thạch Tuy nhiên, chẩn đoán đậu dê bằng phương pháp virus hoặc huyết thanh cổ điển phụ thuộc vào virus sống càng ngày càng khó thực hiện, nhất là đối với các quốc gia bị bệnh này xâm nhập qua con đường nhập khẩu động vật Do đó phương pháp sử dụng kit ELISA phát hiện kháng nguyên, phát hiện kháng thể virus, và các phương pháp sinh học phân tử mới nhất như PCR, Real-time PCR có khả năng phát hiện acid Nucleic của GPV là rất hiệu quả, vì thế mà hết sức có lợi

* ELISA-Kỹ thuật chất hấp phụ miễn dịch gắn enzyme (Enzyme - link immunosorbent assays)

Đây là kỹ thuật khá nhạy và đơn giản, cho phép xác định kháng nguyên (KN) hoặc kháng thể (KT) ở nồng độ thấp (khoảng 0,1ng/m l) Hai kỹ thuật ELISA được dùng nhiều là kỹ thuật trực tiếp và kỹ thuật gián tiếp (hay kỹ thuật

“sanwich” – bánh kẹp)

Kỹ thuật bánh kẹp: nhỏ kháng huyết thanh chứa KT vào giếng ở bản nhựa

để cho KT bám vào thành giếng, nhỏ tiếp dịch KN cần xét nghiệm Nếu là KN đặc hiệu với KT thì sẽ gắn với KT, thêm cộng hợp KT gắn enzyme vào giếng để cho KT cộng hợp gắn với KN mà trước đó đã gắn với KT đầu tiên, tạo nên một

“bánh kẹp” KT – KN – KT gắn enzyme, cuối cùng bổ sung cơ chất của enzyme Enzyme thuỷ phân cơ chất làm thay đổi màu dung dịch Tốc độ thuỷ phân của enzyme tỷ lệ thuận với lượng KT gắn enzyme, cũng có nghĩa tỷ lệ thuận với KN cần xét nghiệm

Kỹ thuật hấp phụ miễn dịch gián tiếp: nhỏ dịch KN cho hấp phụ lên thành

giếng, nhỏ tiếp kháng huyết thanh (chứa kháng thể) cần xét nghiệm rồi ủ Nếu trong huyết thanh có chứa KT đặc hiệu với KN thì sẽ gắn với nó, thêm cộng hợp

kháng – KT đã gắn enzyme, thêm cơ chất của enzyme Tốc độ thuỷ phân của cơ chất gắn liền với sự thay đổi màu dung dịch và tỷ lệ thuận với lượng KT cần xác định trong mẫu

* Kỹ thuật PCR

Phương pháp PCR - phản ứng dây truyền nhờ hoạt động của enzyme ADN

- polymerase – do Kary Mullis cùng cộng sự phát minh năm 1985, đã đưa lại một cuộc cách mạng trong di truyền học sinh học phân tử Đây là phương pháp hoàn toàn mới trong việc nghiên cứu, phân tích gen và hệ gen Khó khăn lớn nhất trong việc phân tích gen ở chỗ chúng là những mục tiêu đơn lẻ và rất nhỏ trong một hệ gen phức tạp khổng lồ Kỹ thuật PCR ra đời đã thay đổi tất cả, giúp chúng

ta có thể tạo ra một số lượng lớn các bản sao của một đoạn ADN mong muốn Do những ưu điểm tuyệt đối trong nghiên cứu sinh học phân tử, kỹ thuật PCR được nhanh dêng áp dụng rộng rãi để chẩn đoán các bệnh về virus, vi khuẩn, các bệnh

ký sinh trùng và cho kết quả rất chính xác Mặt khác sự phân tích thành phần và trật tự nucleotide trên phân tử ADN trong hệ gen còn có ý nghĩa to lớn trong phân loại các loài sinh vật Chính nhờ tính thực tiễn to lớn của kỹ thuật này tác giả của PCR, Kary Mulis, được tặng giải thưởng Nobel vào năm 1993

Kỹ thuật PCR có độ nhạy cao, cho phép xác định chính xác

Capripoxviruses trong các mẫu sinh thiết da và nuôi cấy tế bào trong khi các phương pháp trên có thể xảy ra phản ứng chéo với một số virus khác

Ưu điểm của phương pháp PCR

Thời gian thực hiện nhanh, chỉ cần 3 giờ là có thể khuếch đại được một trình tự đáng quan tâm

Thực hiện đơn giản và ít tốn kém (nó được thực hiện trong ống nghiệm plastic nhỏ gồm thành phần tối thiểu được thực hiện đồng thời), yêu cầu về độ tinh sạch của mẫu không cao (vết máu khô, mẫu vật khảo cổ)

Nhược điểm của phương pháp PCR

Cần phải có ADN mồi đặc trưng cho ADN cần khuếch đại Để có đoạn mồi này ít nhất phải biết trước trình tự nucleotide cần khuếch đại

Kích thước ADN cần khuếch đại không vượt quá 3 kb

Khả năng ngoại nhiễm lớn (do thao tác nhiều lần)

Sai sót còn do sử dụng enzyme Taq - polymerase khoảng 104(sai sót cho một lần sao chép)

1.3 Phòng bệnh

Gia súc mắc bệnh đậu dê không có thuốc điều trị đặc hiệu

Đối với gia súc đã mắc bệnh có thể xử lý như sau:

- Tiêu hủy toàn bộ đàn gia súc mắc bệnh Trong 1 ổ dịch, nên tiêu hủy toàn bộ cừu, dê và xử lý bằng cách đốt hoặc chôn Hố chôn sâu tối thiểu 2,5m Đồng thời, có thể tiêm phòng cho những con vật chưa tiếp xúc với các con vật bị bệnh; giám sát vận chuyển gia súc và các phương tiện giao thông

- Thực hiện các biện pháp vệ sinh thú y như tiêu độc, sát trùng chuồng trại, nơi chăn thả, dụng cụ chăn nuôi và phương tiện vận chuyển gia súc bằng một số hóa chất như Xút, Formol, Benkocid, BKA, Vime-iodin, Han-iodin

- Kiểm soát chặt chẽ vận chuyển động vật và sản phẩm động vật trong vùng dịch

- Kiểm dịch gia súc từ nơi khác đưa về

- Tiêm phòng bao vây vùng có dịch và các vùng có nguy cơ lây lan bệnh đậu dê và đậu cừu

Biện pháp phòng bệnh đậu dê

- Không chăn thả dê vào khu vực có dê, cừu đang mắc bệnh đậu

- Vệ sinh chuồng trại sạch sẽ, cho dê ăn uống đầy đủ, trợ sức nhằm tăng sức đề kháng bệnh cho dê

- Thường xuyên tiêu độc, sát trùng chuồng trại bằng các loại hoá chất trên

- Giải pháp phòng bệnh đậu dê tốt nhất là tiêm phòng vaccine đậu dê Có thể là loại vaccine vô hoạt, sử dụng cho dê, cừu từ 1 tháng tuổi trở lên Liều tiêm dưới da hoặc trong da 1ml/con Vaccine được sử dụng tiêm phòng cho dê, cừu 1 năm/2 lần Không tiêm vaccine cho dê đang ốm, sắp đẻ, mới đẻ Không tiêm vaccine trong vòng 14 ngày trước khi giết mổ

Chương II NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Chủng virus đậu phân lập được trên thực địa tại Thành Phố Tam Điệp, tỉnh Ninh Bình (GPVNB1)

Giống dê cỏ 02 - 03 tháng tuổi

2.2 Địa điểm nghiên cứu

Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ sinh học thú y khoa Thú Y - Học Viện nông Nghiệp Việt Nam

Bệnh viện thú y - Khoa Thú y - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam

2.3 Thời gian nghiên cứu

Từ tháng 12 năm 2014 đến tháng 8 năm 2015

2.4 Nội dung nghiên cứu

Đề tài gồm 3 nội dung nghiên cứu chính:

- Gây bệnh thực nghiệm cho dê bằng chủng virus GPVNB1

- Nghiên cứu một số triệu chứng lâm sàng của dê được gây nhiễm chủng virus GPVNB1

- Nghiên cứu một số bệnh tích đại thể, bệnh tích vi thể ở cơ quan tổ chức của dê được gây nhiễm chủng virus GPVNB1

2.5 Vật liệu

2.5.1 Virus

Virus sử dụng là chủng GPVNB1 được phân lập từ dê mắc bệnh đậu tại địa bàn Thị xã Tam Điệp, tỉnh Ninh Bình Dê này có biểu hiện triệu chứng đặc trưng

là sốt cao từ 40ºC đến 41ºC, ở trên da có xuất hiện các nốt đậu kích thước từ 0,5

cm đến 1 cm, đặc biệt là các vùng mũi miệng, tai, cổ, bụng, mặt sau đuôi, và chân, các hạch lympho bề mặt sưng đặc biệt là symahạch sau hầu, chảy nước mắt, nước mũi, nước dãi nhiều và có lẫn mủ do các nốt đậu trong niêm mạc mắt, mũi, mồm bị loét Con bệnh thở khó và có tiếng kêu do hạch sau hầu sưng gây áp lực lên đường hô hấp Virus được nuôi cấy, phân lập trên tế bào tinh hoàn dê sơ

cấp (GT) tại Phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ sinh học Thú y đạt hiệu giá virus là 105 TCID50/ml

2.5.3 Hóa chất

Test kit ELISA 96 giếng của hãng Nunc, Thermo Scientific

Kit cho phản ứng PCR của hang Platium Quantitative superMix-UDG của hãng Invitrogen, Life Technologies

Các hóa chất tinh khiết khác:

- Dung dịch axit sulfuric (H2SO4) 1N, dung dịch TAE, ethanol 70 % đến 75 %

- Kháng nguyên chuẩn virus đậu dê

- Kháng thể dê kháng virus đậu dê

- Chất gắn kết cho ELISA kháng nguyên (Rabbit anti-goat horseradish peroxidase conjugate)

IgG Hóa chất tinh khiết: Etylen diamin tetraIgG axit axetic (EDTA), Agarose

- Primer và probe phát hiện ADN của virus đậu dê

- Môi trường tăng trưởng (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)

- Môi trường bảo quản (Glasgow Eagle’s Medium)

- Huyết thanh thai bê (FCS) và tế bào tinh hoàn dê

Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm chia làm 2 lô:

Lô thí nghiệm 03 con, được ký hiệu lần lượt là TN1, TN2 và TN3

Lô đối chứng 02 con, được ký hiệu lần lượt là ĐC1, ĐC2

Dê thí nghiệm và đối chứng được nuôi tại khu nuôi động vật thí nghiệm

đạt tiêu chuẩn về điều kiện chăm sóc nuôi dưỡng vệ sinh an toàn sinh học thú y

Trước khi gây nhiễm, tiến hành theo dõi tình trạng sức khỏe của dê trong

7 ngày với các chỉ tiêu: nhiệt độ, tình trạng ăn uống, biểu hiện lâm sàng 05 dê được lấy máu để kiểm tra sự có mặt của virus đậu GPVNB1 bằng phương pháp Elisa cho kết quả âm tính với kháng thể đậu dê

Tiến hành gây bệnh đậu cho 03 dê thí nghiệm bằng 2ml chủng virus GPVNB1 liều 105TCID50/ml qua tiêm dưới da Trong vòng 14 ngày kể từ ngày gây nhiễm, cứ 2 ngày chúng tôi tiến hành lấy máu để kiểm tra sự có mặt của virus 02 con dê đối chứng không được tiêm virus đậu dê

Sau khi gây nhiễm chủng virus GPVNB1 nếu dê có biểu hiện triệu chứng sốt cao từ 40ºC đến 41ºC, ở trên da có xuất hiện các nốt đậu kích thước từ 0,5 cm đến 1 cm, đặc biệt là các vùng mũi miệng, tai, cổ, bụng, mặt sau đuôi, và chân,

các hạch lympho bề mặt sưng đặc biệt là hạch sau hầu, chảy nước mắt, nước mũi, nước dãi nhiều và có lẫn mủ do các nốt đậu trong niêm mạc mắt, mũi, mồm bị loét, con bệnh thở khó và có tiếng kêu do hạch sau hầu sưng gây áp lực lên đường hô hấp cho đến khi dê chết hoặc có các triệu chứng điển hình của bệnh đậu dê thì tiến hành mổ khám, kiểm tra bệnh tích đại thể, làm tiêu bản bệnh lý quan sát bệnh tích vi thể, làm hóa mô miễn dịch xem sự phân bố virus ở các cơ quan trong cơ thể

2.6.2 Theo dõi triệu chứng lâm sàng của dê được gây nhiễm chủng virus GPVNB1

Triệu chứng lâm sàng của dê được gây nhiễm chủng virus GPVNB1 xác

định thông qua theo dõi, quan sát và ghi chép đầy đủ từ bước bắt đầu nuôi dê, sau khi gây nhiễm cho đến khi dê có triệu chứng bệnh điển hình hoặc chết Đồng thời chúng tôi theo dõi dê lô đối chứng để so sánh với dê lô thí nghiệm thông qua một

số chỉ tiêu:

* Nhiệt độ: cắm nhiệt kế qua hậu môn một cách nhẹ nhàng, thẳng hướng sâu vào trực tràng và để yên trong 3 phút rồi rút ra đọc chỉ số thân nhiệt

Tiến hành đo vào: buổi sáng từ 6h-8h, buổi chiều 16h-18h

* Tần số hô hấp (lần/phút): dùng ống nghe ở vùng phổi đếm nhịp thở trong 1 phút hoặc có thể nhìn hõm bụng lúc dê thở rồi đếm số nhịp thở trong vòng 1 phút

* Tần số mạch (lần/phút): dùng ống nghe đếm số lần tim đập trong 1 phút Nghe ở vị trí tim của dê: 5/7 quả tim ở bên trái, đáy nằm ngang nửa ngực Đỉnh tim

ở phần sụn của sườn 5, cách xương ngực 2cm Mặt trước tim tới xương sườn 3, mặt sau xương sườn 6, tim sát vách ngực khoảng sườn 3-4 cm, phần còn lại bị phổi bao phủ Nhưng cách xa thành ngực hơn so với trâu bò

2.6.3 Phương pháp phân lập và giám định virus GPVNB1

Tế bào, môi trường nuôi cấy

Tế bào tinh hoàn dê sơ cấp: tinh hoàn dê được lấy từ dê 2 - 3 tháng tuổi khỏe mạnh, chưa được miễn dịch với vacxin đậu dê Tinh hoàn dê được xử lý, cắt nhỏ, tách tế bào tinh hoàn bằng quy trình trypsin ấm Tế bào tách được ly tâm

thu cặn hòa với môi trường nuôi EMEM có 10% huyết thanh bào thai bê cho vào chai nuôi Các chai tế bào nuôi được đặt trong tủ ấm 37ºC với 5% CO2, khi tế bào trong chai nuôi đạt độ phủ 90% diện tích chai là lúc thích hợp để gây

nhiễm virus

Gây nhiễm bệnh phẩm cho tế bào

Lấy 1 ml mẫu đã được xử lý cấy vào chai nuôi tế bào T25 đã được chuẩn

bị ở trên Sau khi ủ 1 h ở 37ºC, hút sạch môi trường cũ, rửa lớp tế bào bằng PBS trước khi cho 5 ml môi trường DMEM mới có bổ sung hepes, 2 % FCS và dung dịch kháng khuẩn vào Theo dõi bệnh tích tế bào (CPE) trong vòng 7 ngày Nếu

bị nhiễm virus, mặt tế bào sẽ có CPE đặc trưng, màng tế bào bị co lại so với các

tế bào xung quanh, tế bào có dạng tròn và có sự tích đống của các nhiễm sắc chất Lúc đầu CPE chỉ xuất hiện ở một vài chỗ, sau khoảng 4 đến 6 ngày CPE sẽ lan rộng ra và phủ trên toàn bộ thảm tế bào Nếu sau 7 ngày không thấy có CPE thì cho toàn bộ chai nuôi cấy vào đông (-70ºC) và tan (làm từ 2 - 3 lần) Sau đó ly tâm ở 600 vòng trong 15 phút thu lấy phần trong ở trên để cấy chuyển lần 2 sang chai nuôi tế bào T25 mới và tiếp tục theo dõi CPE như trên

Phương pháp phân lập

Xử lý mẫu bệnh phẩm: mẫu tổ chức da dê có mụn đậu (1g) được nghiền

với môi trường DMEM theo tỷ lệ 1/10 có bổ sung kháng sinh và chất chống nấm Bệnh phẩm sau khi được xử lý làm đông tan 3 lần, ly tâm tốc độ 10.000 vòng/phút (v/p) trong thời gian 10 phút, thu dịch nước trong gây nhiễm cho tế bào Theo dõi bệnh lý tế bào (CPE) sau khi gây nhiễm đến 14 ngày

Phương pháp giám định virus đậu dê

Theo phương pháp của Ireland và Binepal (1998) sử dụng cặp mồi P1 và P2 Chạy PCR theo chu trình nhiệt 95ºC, 5 phút; tiếp theo 35 chu kỳ 94ºC/1 phút, 55ºC/1 phút, 72ºC/1 phút; 72ºC/10 phút;

Bảo quản sản phẩm ở 4ºC cho đến khi điện di kiểm tra sản phẩm và bảo quản lâu dài ở -20ºC

2.6.4 Phương pháp chẩn đoán phòng thí nghiệm

2.6.4.1 Lấy mẫu và bảo quản mẫu

Việc lấy mẫu phải được làm cẩn thận, với mỗi dê sử dụng bộ dụng cụ lấy mẫu khác nhau, và mẫu sau khi lấy được đánh dấu cẩn thận của từng con theo ký hiệu: TN1, TN2, TN3, TN4, TN5

2.6.4.2 Phát hiện kháng thể

Xử lý mẫu

Lấy máu của dê thí nghiệm, và tách thu lấy huyết thanh dùng để phát hiện kháng thể bằng phương pháp ELISA

Bảo quản mẫu

Huyết thanh giữ ở 4ºC trong vòng 1 tuần và -20ºC nếu để lâu hơn

Phát hiện kháng thể bằng phương pháp ELISA

Dùng đĩa ELISA polysteryne 96 giếng của hãng Nunc, Maxisorp để thực hiện phản ứng ELISA Trước khi sử dụng, khay giếng và các hóa chất phải được

để ở nhiệt độ phòng ít nhất 1 giờ

Phủ 100 µl Antigen virus đậu dê 1/800 trong Coating buffer lên các giếng,

ủ 4ºC/18h hoặc 37ºC/1h

Rửa 3 lần với washing solution (PBS chứa 0,05% Tween 20)

Cho 100 µl huyết thanh dê pha loãng 1/10 trong PBST chứa 2% bột sữa không kem, ủ 37ºC/1h

Rửa 5 lần với washing solution; Cho 100 µl Conjugate vào mối giếng, 37ºC/1h

Rửa 5 lần với washing solution; Cho 100 µl cơ chất (One shot substrate)

để yên ở nhiệt độ phòng thí nghiệm trong 10-15 phút

Dừng phản ứng với 100 µl dung dịch H2SO4 1M

Đọc mật độ quang (OD) trên máy đọc ELISA ở bước sóng 450 nm

Mẫu được đánh giá có kết quả ELISA dương khi OD ≥ 0,2