nghiên cứu bệnh héo xanh vi khuẩn (ralstonia solanacearum smith) hại một số cây trồng cạn vụ thu đông và xuân hè tại hà nội, phụ cận năm 2014 2015

Khảo sát hiệu lực ức chế của một số thuốc hoá học và thuốc kháng sinh với các mẫu phân lập vi khuẩn gây bệnh héo xanh trên môi trường nhân tạo .... Vì vậy, để góp phần tìm hiểu tình hình

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

- -

LÊ ĐÌNH TIẾN

NGHIÊN CỨU BỆNH HÉO XANH VI KHUẨN

(RALSTONIA SOLANACEARUM SMITH) HẠI MỘT SỐ CÂY

TRỒNG CẠN VỤ THU ĐÔNG VÀ XUÂN HÈ TẠI HÀ NỘI,

PHỤ CẬN NĂM 2014 - 2015

LUẬN VĂN THẠC SĨ

HÀ NỘI, NĂM 2015

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

- -

LÊ ĐÌNH TIẾN

NGHIÊN CỨU BỆNH HÉO XANH VI KHUẨN

(RALSTONIA SOLANACEARUM SMITH) HẠI MỘT SỐ CÂY

TRỒNG CẠN VỤ THU ĐÔNG VÀ XUÂN HÈ TẠI HÀ NỘI,

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa được sử dụng để bảo vệ một học vị nào

Tôi xin cam đoan, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đều được chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày 10 tháng 9 Năm 2015

Tác giả

Lê Đình Tiến

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này, ngoài sự nỗ lực cố gắng của bản thân, tôi nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất của các thầy cô, bạn bè, người thân và các cơ quan đơn vị

Trước tiên tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô trong ban đào tạo sau đại học và khoa Nông họcđã trực tiếp giảng dạy, trang bị những kiến thức bổ ích trong suốt thời gian qua Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo PGS TS Đỗ Tấn Dũng, người đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và động viên tôi trong quá trình thực hiện đề tài và hoàn thiện luận văn

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới nhân dân địa phương huyện Thanh Trì, Gia Lâm, Thạch Thất, Mê Linh - Hà Nội; Gia Đông, Nghĩa Đạo - Bắc Ninh; Văn Lâm - Hưng Yên đã giúp đỡ tôi tận tình trong thời gian thực hiện đề tài

Hà Nội, ngày 10 tháng 9 Năm 2015

Tác giả

Lê Đình Tiến

MỤC LỤC

Lời cam đoan ii

Lời cảm ơn iii

Mục lục iv

Danh mục bảng viii

Danh mục đồ thị x

Danh mục hình xi

MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2.Mục đích và yêu cầu 2

1.2.1.Mục đích 2

1.2.2.Yêu cầu 3

Chương 1 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 4

1.1 Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài 4

1.1.1 Lịch sử nghiên cứu, mức độ phổ biến và tác hại của bệnh héo xanh vi khuẩn 4

1.1.2 Nghiên cứu đặc điểm hình thái, đặc tính sinh lý, sinh hoá của loài vi khuẩn R solanacearum 6

1.1.3 Các phương pháp phát hiện, chẩn đoán và giám định vi khuẩn Ralstonia solanacearum 8

1.1.4 Nghiên cứu biện pháp phòng chống bệnh héo xanh vi khuẩn Ralstonia solanacearum Smith 10

1.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 13

Chương 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Vật liệu và đối tượng nghiên cứu 19

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu: 19

2.1.2 Vật liệu nghiên cứu 19

2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 19

2.2.1 Thời gian nghiên cứu 19

2.2.2 Địa điểm nghiên cứu 19

2.3 Nội dung nghiên cứu 19

2.4 Phương pháp nghiên cứu 20

2.4.1 Phương pháp điều tra bệnh héo xanh vi khuẩn ngoài đồng ruộng 20

2.4.2 Phương pháp nghiên cứu bệnh héo xanh vi khuẩn trong phòng thí nghiệm 20

2.4.3 Phương pháp nghiên cứu bệnh héo xanh vi khuẩn trong nhà lưới 25

2.4.4 Phương pháp xử lý số liệu 27

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 28

3.1 Điều tra thực trạng bệnh héo xanh vi khuẩn gây hại một số cây trồng cạn vùng Hà Nội và phụ cận vụ thu đông 2014 và xuân hè 2015 28

3.1.1 Điều tra bệnh héo xanh vi khuẩn hại cà chua vùng Hà Nội và phụ cận vụ thu đông 2014 28

3.1.2 Tình hình bệnh héo xanh vi khuẩn hại cà chua vùng Hà Nội và phụ cận vụ xuân hè 2015 32

3.1.3 Tình hình bệnh héo xanh vi khuẩn hại khoai tây vùng Hà Nội và phụ cận vụ đông 2014 33

3.1.4 Tình hình bệnh héo xanh vi khuẩn hại ớt vùng Hà Nội và phụ cận vụ thu đông 2014- 2015 36

3.1.5 Tình hình bệnh héo xanh vi khuẩn gây hại cà pháo vùng Hà Nội và phụ cận vụ thu đông 2014 38

3.1.6 Bệnh héo xanh vi khuẩn hại cây lạc 40

3.2 Nghiên cứu một số đặc điểm hình thái khuẩn lạc và đặc tính sinh học của loài R solanacearum Smith 43

3.2.1 Phương pháp phân li nuôi cấy vi khuẩn gây bệnh 45

3.2.2 Đặc điểm hình thái tế bào khuẩn lạc của vi khuẩn R solanacearum Smith 46

3.2.3 Thử gram vi khuẩn R solanacerum bằng dung dịch KOH 3% 49

3.2.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của các mẫu phân lập vi khuẩn R solanacearum 51

3.2.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của các

mẫu phân lập vi khuẩn Ralstonia solanacearum 53

3.2.6 Nghiên cứu một số đặc tính sinh hoá của vi khuẩn R solanacearum 54

3.2.7 Thử phản ứng siêu nhạy của các dòng vi khuẩn gây bệnh héo xanh trên cây thuốc lá (Nicotiana tabacum) 55

3.3 Nghiên cứu phạm vi ký chủ của các mẫu phân lập vi khuẩn R solanacearum phân lập từ các cây ký chủ vùng Hà Nội và phụ cận 57

3.4 Khảo sát hiệu lực phòng trừ thuốc hoá học và thuốc kháng sinh với các mẫu phân lập vi khuẩn R solanacearum trên môi trường nhân tạo 62

3.4.1 Khảo sát hiệu lực phòng trừ vi khuẩn gây bệnh héo xanh bằng vi khuẩn đối kháng B subtilis trên môi trường nhân tạo 65

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 68

Kết luận 68

Đề nghị 69

TÀI LIỆU THAM KHẢO 70

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Giải nghĩa

B subtilis Bacillus subtilis

BVTV Bảo vệ thực vật

HXVK Héo xanh vi khuẩn

P solanacearum Pseudomonas solanacearum

R solanacearum Ralstonia solanacearum

TZC Triphenyl -Tetrazolium - Chloride

SPA Saccarose - peptone - agar

PPSA Potato - Peptone - Saccarose - Agar

ICM Quản lý cây trồng tổng hợp

QCVN Quy chuẩn Việt Nam

DANH MỤC BẢNG

Số bảng Tên bảng Trang

3.1 Tình hình bệnh héo xanh vi khuẩn trên cà chua tại Hà Nội và phụ cận

vụ thu đông năm 2014 31

3.2 Điều tra bệnh HXVK hại cà chua vụ xuân hè 2015 ở một số vùng Hà Nội và phụ cận 32

3.3 Tình hình bệnh HXVK hại khoai tây vụ đông năm 2014-2015 vùng Hà Nội và phụ cận 34

3.4 Diễn biến bệnh HXVK hại ớt tại xã Nghĩa Đạo, huyện Thuận Thành, Bắc Ninh, Đa Tốn Gia Lâm vụ thu đông năm 2014 36

3.5 Tình hình bệnh HXVK gây hại cà pháo (giống quả xanh)

tại Hà Nội và phụ cận vụ đông xuân 2014-2015 38

3.6 Diễn biến bệnh HXVK hại lạc vụ xuân hè 2015 ở vùng Hà Nội và phụ cận 41

3.7 Diễn biến bệnh HXVK hại lạc ở Tiên Dương, Đông Anh vụ xuân hè 2015 42

3.8 Danh mục các mẫu phân lập vi khuẩn Ralstonia solanacearum phân lập trên một số cây ký chủ vùng Hà Nội và phụ cận năm 2014-2015 46

3.9 Một số đặc điểm hình thái của các mẫu phân lập vi khuẩn R solanacearum Smith gây bệnh HXVK hại một số cây trồng vùng Hà Nội và phụ cận năm 2015 47

3.10 Kết quả thử nhuộm Gram cho các mẫu phân lập vi khuẩn trên các cây ký chủ 50

3.11 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của các mẫu phân lập vi khuẩn R solanacearum 52

3.12 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của các mẫu phân lập vi khuẩn R solanacearum 54

3.13 Khảo sát một số đặc tính sinh lý sinh hoá của các mẫu phân lập vi khuẩn Ralstonia solanacearum 55

3.14: Kết quả kiểm tra phản ứng siêu nhạy của các dòng vi khuẩn trên cây thuốc lá (Nicotiana tabacum) 56

3.15 Kết quả lây nhiễm nhân tạo các mẫu phân lập vi khuẩn R

solanacearum trên giống cà chua chịu nhiệt 58

3.16 Kết quả lây nhiễm nhân tạo các mẫu phân lập vi khuẩn

R solanacearum trên giống cà bát 60

3.17 Khảo sát hiệu lực ức chế của một số thuốc hoá học và thuốc kháng

sinh với các mẫu phân lập vi khuẩn gây bệnh héo xanh trên môi

trường nhân tạo 63

3.18 Khảo sát hiệu lực của vi khuẩn đối kháng B subtilis với một số mẫu

phân lập vi khuẩn héo xanh trên môi trường nhân tạo 66

3.8 Kết quả lây nhiễm nhân tạo các mẫu phân lập vi khuẩn R

solanacearum trên giống cà chua chịu nhiệt 58

DANH MỤC HÌNH

Số hình Tên hình Trang

3.1 Triệu chứng bệnh HXVK hại cây cà chua 30

3.2 Bó mạch cây cà chua bị thâm nâu do vi khuẩn R.solanacearum 30

3.3 Triệu chứng bệnh HXVK hại khoai tây 36

3.4 Bó mạch cây khoai tây bị thâm nâu do bệnh HXVK 36

3.5 Triệu chứng bệnh HXVK hại ớt 37

3.6 Triệu chứng bệnh HXVK hại cà pháo 39

3.7 Triệu chứng bệnh HXVK hại lạc 43

3.8: Dịch vi khuẩn R solanacearum Smith gây bệnh héo xanh cà chua tiết ra ở đầu vết cắt 44

3.9: Chẩn đoán nhanh bệnh héo xanh vi khuẩn R solanacearum Smith bằng phương pháp giọt dịch 44

3.10 Mẫu phân lập vi khuẩn R solanacearum (CC-CN-DH-01) trên môi trường SPA 49

3.11 Mẫu phân lập vi khuẩn R solanacearum (CC-CN-DH-01) trên môi trường PPSA 49

3.12 Thử phản ứng gram của mẫu phân lập vi khuẩn R solanacearum (CC-CN-DH-01) bằng KOH 3% 51

3.13 Thử phản ứng gram của mẫu phân lập vi khuẩn R solanacearum hại (KT-Ma-GĐ-01) bằng KOH 3% 51

3.14 Thử phản ứng siêu nhạy trên cây thuốc lá 56

3.15 Lây nhiễm nhân tạo bằng phương pháp sát thương rễ trên giống cà chua chịu nhiệt 59

3.16 Lây nhiễm nhân tạo bằng phương pháp tiêm nách lá 59

3.17 Lây nhiễm nhân tạo các mẫu phân lập vi khuẩn R Solanacearum trên cà bát 61

3.18 Cây cà chua bị bênh HXVK sau khi lây nhiễm nhân tạo 61

3.19 Hai cây cà chua sau khi lây nhiễm nhân tạo 61

MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Việt Nam là một nước đang phát triển, người dân chủ yếu sản xuất nông nghiệp Thu nhập từ hoạt động sản xuất đã góp phần quan trọng trong công cuộc phát triển đất nước Bên cạnh cây trồng chính là cây lương thực, thì rau được biết đến là một loại thực phẩm rất quan trọng cung cấp cho con người những chất thiết yếu hàng ngày Ngoài giá trị dinh dưỡng, rau còn là cây trồng có ý nghĩa kinh tế giữ vai trò quan trong trong cơ cấu cây trồng Việt Nam Ngoài việc đáp ứng nhu cầu trong nước rau còn là mặt hàng xuất khẩu có giá trị, đặc biệt những sản phẩm qua chế biến

Ngày nay, đất nước đang trong công cuộc công nghiệp hóa, hiện đại hóa, đời sống của nhân dân được cải thiện, cơ cấu ngành nông nghiệp trong nền kinh tế nước ta bị thu hẹp Khi mức sống của người dân ngày càng nâng cao thì vấn đề an toàn thực phẩm càng được chú trọng Người dân bắt đầu tìm đến những sản phẩm rau, củ, quả an toàn, chính vì vậy tạo nên sức ép cho các nhà quản lý, cán bộ kỹ thuật chỉ đạo giám sát việc sản xuất, kinh doanh của người nông dân để có những thực phẩm sạch Đáp ứng được nhu cầu của người dân ngày càng tăng

Hiện nay, Ở vùng Hà Nội và phụ cận, diện tích trồng rau màu ngày càng

mở rộng và phát triển với nhiều chủng loại giống cây trồng phong phú với nhiều

mô hình như tập trung đến không tập chung, trồng chuyên canh đến trồng thời

vụ, chính vụ , trái vụ Các chủng loại rau được trồng nhiều nhất phải kể đến: cây

họ cà, khoai tây đậu rau, rau cải các loại, rau muống, rau vụ đông (Cải bắp, xu hào, súp lơ )

Với điều kiện khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng ẩm như hiện hay rất thuận lợi

cho bệnh hại nói chung và bệnh HXVK Ralstonia solanacearum Smith nói riêng phát sinh gây hại Bệnh HXVK Ralstonia solanacearum Smith gây hại trên rất

nhiều cây trồng như cây họ cà, lạc, khoai tây, ớt, thuốc lá … thiệt hại của chúng gây ra rất lớn, ảnh hưởng đến năng suất chất lượng sản phẩm nông nghiệp

Bệnh HXVK còn có tên gọi khác trên các cây ký chủ khác nhau: bệnh chết ẻo lạc, bệnh héo rũ vi khuẩn thuốc lá, bệnh héo xanh cà chua, khoai tây do

loài Pseudomonas solanacearum Smith (1896), Ralstonia solanacearum Smith (Yabuchi et al., 1996) gây ra Vi khuẩn này gây hại phổ biến, phạm vi phân bố

rộng và có phổ ký chủ rộng Chúng gây hại trên 200 loài cây trồng, cây rừng thuộc 35 họ thực vật khác nhau (Kelman, 1953), chủ yếu là cây họ cà (cà chua, khoai tây, thuốc lá, cà pháo, cà tím, ớt, ), họ đâu (lạc), và một số họ thực vật khác Đây là một trong số những bệnh quan trọng và điển hình ở vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới và những vùng có khí hậu ôn hoà trên thế giới (Hayward, 1986) Những kết quả nghiên cứu trong nước cho thấy bệnh héo xanh vi khuẩn là một trong những vấn đề nan giải, rất khó phòng trừ bằng biện pháp riêng rẽ, kể

cả việc dùng thuốc hoá học Để khắc phục tình trạng này, các biện pháp phòng trừ tác nhân gây bệnh bằng phương pháp sinh học được nhiều nhà khoa học quan tâm và nghiên cứu Đây là một trong những phương pháp phòng trừ hiệu quả

nhất hiện nay Khả năng phòng trừ vi khuẩn Ralstonia solanacearum giúp cây cà

chua, khoai tây sinh trưởng phát triển tốt hơn, làm cho tác nhân gây bệnh không kháng thuốc, an toàn với môi trường sinh thái phù hợp với xu hướng nông nghiệp

an toàn hiện nay và đang được rất nhiều nước trên thế giới áp dụng

Vì vậy, để góp phần tìm hiểu tình hình, mức độ phổ biến và mức độ phát sinh phát triển, gây hại của bệnh héo xanh vi khuẩn để có biện pháp phòng trừ hiệu quả, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:

“Nghiên cứu bệnh héo xanh vi khuẩn (Ralstonia solanacearum Smith) hại một

số cây trồng cạn vụ thu đông và xuân hè tại Hà Nội, phụ cận năm 2014 - 2015”

1.2.Mục đích và yêu cầu

1.2.1.Mục đích

Điều tra thực trạng bệnh HXVK hại một số cây trồng cạn tại Hà Nội, phụ cận và khảo sát một số biện pháp phòng trừ bệnh HXVK vụ thu đông 2014 và xuân hè 2015

1.2.2.Yêu cầu

- Đánh giá thực trạng bệnh HXVK hại một số cây trồng cạn vụ thu đông

và vụ xuân hè tại Hà Nội và phụ cận năm 2014 – 2015

- Phân ly, nuôi cấy, nghiên cứu một số đặc điểm hình thái, đặc tính sinh

học của các mẫu phân lập vi khuẩn Ralstonia solanacearum Smith

- Nghiên cứu phạm vi ký chủ của loài vi khuẩn Ralstonia solanacearum

Smith hại một số cây trồng cạn tại vùng Hà Nội,phụ cận

- Khảo sát hiệu lực ức chế của một số thuốc hóa học, thuốc kháng sinh và

vi khuẩn đối kháng Baccilus Subtilis trên môi trường nhân tạo

Chương 1 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

1.1 Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài

1.1.1 Lịch sử nghiên cứu, mức độ phổ biến và tác hại của bệnh héo xanh vi khuẩn

Trong lịch sử, đã có nhiều nghiên cứu về bệnh vi khuẩn hại cây kể từ khi

vi khuẩn hại cây được phát hiện 1866 Sau đó, Hallier đã nghiên cứu và phát hiện

vi khuẩn gây thối củ khoai tây (1875) Đến 1880, Brull người Mỹ đã đi sâu nghiên cứu về bệnh vi khuẩn trên các loại cây ăn quả đặc biệt là vi khuẩn gây cháy xám cây lê Lần đầu tiên, vi khuẩn gây héo xanh được Smith nghiên cứu và

đặt tên là Pseudomonas solanacearum năm 1896, khi nghiên cứu bệnh héo xanh

trên cây cà chua, cà tím và khoai tây tại Mỹ Đồng thời, ông cũng mô tả triệu chứng bệnh héo xanh trên các cây trồng này Đến năm 1909, tác giả phát hiện bệnh héo xanh trên cây thuốc lá Nhưng đến năm 1905, bệnh héo xanh vi khuẩn

ở lạc mới được phát hiện lần đầu tiên ở Indonexia (Machmud and Rats, 1994) Sau này, Yabuuchi đã nghiên cứu và đề nghị đổi tên vi khuẩn gây bệnh héo xanh

vi khuẩn thành tên mới Ralstonia solanacearum Smith (Yabuuchi)

Vi khuẩn Ralstonia solanacearum là loài có phổ ký chủ rộng, chúng có khả năng ký sinh và gây hại trên 200 loài cây trồng, cây rừng thuộc hơn 35 họ thực vật khác nhau, chủ yếu là những cây ký chủ thuộc họ cà, họ đâu, họ chuối (Kelman, 1953)

Bệnh héo xanh vi khuẩn là bệnh gây hại nghiêm trọng, phổ biến có phân bố rộng rãi và điển hình nhất ở vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới và những vùng có khí hậu ôn hoà trên thế giới (Kelman, 1997) Những kết quả nghiên cứu, khảo sát về mức độ phổ biến và tác hại của bệnh HXVK trên một số cây trồng ở các vùng địa lý khác nhau đã được nhiều tác giả đề cập đến (Titatan,

1986; Prio et al., 1997)

Bệnh héo xanh do vi khuẩn R.solanacearum (Smith) gây ra là vấn đề

nghiêm trọng trong ngành công nghiệp sản xuất khoai tây ở Malawwi do làm giảm năng suất và chất lượng bảo quản của củ sau thu hoạch Để định lượng mức

độ và tỷ lệ mắc bệnh, một cuộc khảo sát về kiến thức của nông dân trong việc xác định sự lây lan cũng như việc kiểm soát căn bệnh này đã được tiến hành với

81 nông dân và 489 củ khoai tây thu thập ngẫu nhiên trong 8 chợ lớn để xác định bệnh tiềm ẩn bằng phương pháp DAS- ELISA Kế quả cho thấy 100 % nông dân

đã nhận thức được sự xuất hiện của bệnh héo xanh do vi khuẩn trên cánh đồng của họ và phương thức lây lan Mức độ nhễm bệnh của vi khuẩn gây bệnh héo xanh được đánh giá cao hơn 25 % so với các loại vi khuẩn khác (Kagona, 2008) Tại Ấn Độ từ năm 1940 có báo cáo về bệnh HXVK hại ở khoai tây và cà chua (Kelman, 1953) Đầu tiên gây hại ở vùng Gusdaspenr thuộc bang Punjab, sau

đó xuất hiện ở Bombay năm 1954 (Kelman, 1954) Đến năm 1964 người ta đã xác

định các nòi và các biovar gây hại của vi khuẩn Ralstonia solanacearum (Mehan,

1994) Bệnh phát sinh, phát triển, phân bố rộng rãi ở nhiều vùng trồng trọt đã gây nên những thiệt hại đáng kể Trên khoai tây, bệnh không những gây héo ngoài đồng

mà còn làm thối củ trong bảo quản Ở một số vùng, bệnh làm giảm đáng kể năng suất tới 30-70% Theo Sinha (1986), bệnh héo xanh vi khuẩn là loại bệnh phổ biến, gây nhiễm trên nhiều loại cây trồng khác nhau như: cà chua, khoai tây, lạc, ớt, gừng, đay, đặc biệt ở một số vùng sản xuất kinh tế, bệnh héo xanh vi khuẩn có thể làm giảm tới 70% năng suất

Ở Sri Lanka, bệnh HXVK được phát hiện đầu tiên từ những năm 1930 trên cây cà chua, cà Bệnh lây nhiễm trên nhiều loại cây trồng: cà chua, khoai tây, cà,

ớt, và phân bố rộng rãi ở các vùng sinh thái ẩm và khô, ở các địa hình đất đai cao, thấp khác nhau Trên cây cà chua, ở một vài nơi mức độ nhiễm bệnh tương đối nghiêm trọng Trên cây cà chua mức độ thiệt hại có thể lên đến 81.5% trên giống mẫn cảm Margolobe và 47.0% đối với giống Talatuoya (Abeygunawardena, 1963)

Ở Trung Quốc, bệnh héo xanh vi khuẩn (HXVK) gây hại nghiêm trọng trên nhiều loại cây trồng thuộc họ cà, họ đậu và họ hoà thảo Bệnh héo xanh khoai tây được phát hiện đầu tiên vào cuối năm 1970, lúc đầu bệnh chỉ phát sinh gây hại ở một số vùng nhỏ tại tỉnh Hunan và Sichuan nhưng hiện nay bệnh đã phát triển lan rộng ra các tỉnh phía Bắc (He, 1986) Bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc phát sinh phát triển mạnh và phân bố rộng trên 17 tỉnh trồng lạc của Trung Quốc, gây thiệt hại khoảng 45 – 65 nghìn tấn (Tan and Liao, 1990) Bệnh HXVK

còn gây hại trên nhiều cây trồng khác như: cà chua, khoai lang, gừng, ớt, vừng, dâu tằm (He, 1986)

Còn ở Malaysia, bệnh HXVK gây hại nghiêm trọng trên nhiều cây trồng

(Mehan et al,1986) Trên lạc, tỷ lệ cây nhiễm bệnh trung bình chiếm từ 5-20% và

là nguyên nhân chính làm diện tích trồng lạc giảm từ 5.197 ha năm 1980 còn 1.318 ha năm 1986 với sản lượng tương ứng là 19.437 tấn giảm còn 5000 tấn Vi khuẩn gây bệnh còn lây nhiễm trên nhiều cây ký chủ khác như: cà chua, khoai tây, thuốc lá, và cây cà (Lum, 1990)

Ở Thái Lan, bệnh HXVK là bệnh hại quan trọng và phân bố rộng rãi ở các vùng trồng cây trong cả nước Kể từ lần đầu tiên bệnh HXVK hại trên cà chua được phát hiện vào năm 1957 cho tới nay, bệnh đã gây thiệt hại đáng kể vè năng suất trên nhiều loại cây trồng khác nhau: cà chua, khoai tây, gừng, cà, ớt, thuốc lá (Titatan, 1986)

Ở Indonesia từ những năm 1990 có báo cáo về bệnh HXVK gây hại trên lạc, khoai tây, cà chua ở các vùng Cirebon và phía tây Java và sau đó ở hầu hết các vùng trồng lạc và khoai tây đều bị nhiễm bệnh HXVK như Sumatra, Java, phía nam và phía bắc vùng Bali phổ biến biovar 2, nòi 3 (Machmud, 1986)

1.1.2 Nghiên cứu đặc điểm hình thái, đặc tính sinh lý, sinh hoá của loài vi khuẩn R solanacearum

Bệnh HXVK do loài Pseudomonas solanacearum Smith gây ra, thuộc họ Pseudomonadaceae lớp Eubacteriales Về mặt vị trí phân loại, danh pháp quốc tế

và tên khoa học đối với loài Ralstonia solanacearum Smith ra bệnh HXVK đã

được các tác giả đề cập Sự thay đổi tên gọi loài vi khuẩn gây bệnh héo xanh theo thời gian như sau:

+ Bacillus solanacearum Smith 1896

+ Bacterium solanacearum (Smith) Chester 1897

+ Bacterium solanacearum var asiaticum Smith 1914

+ Pseudomonas solanacearum (Smith 1896) Smith 1914

+ Phytomonas solanacearum (Smith) Bergey et al.1923

+ Xanthomonas solanacearum (Smith) Dowson 1943

+ Xanthomonas solanacearum var asiatica (Smith) Elliott 1951

+ Burkholderria solanacearum (Smith 1896) Yabuuchi et al 1992

Gần đây, với những kết quả nghiên cứu của nhiều tác giải về phân loại,

giám định vi khuẩn gây bệnh héo xanh, theo đề xuất mới của Yabuuchi et al

(1992), tại Hội nghị quốc tế lần 2 về bệnh HXVK tại Pháp (1997) đã thống nhất,

đổi tên và gọi loài vi khuẩn này là Ralstonia solancearum Smith (Smith, 1896;Yabuuchi et al, 1996) Loài R solancearum là loài không đồng nhất, đa

dạng, với tính chuyên hoá khác nhau, bao gồm một số biovar và pathovar khác biệt nhau (Kelman,1997)

Vi khuẩn R solanacearum là loài ký sinh đa thực, chúng gây bệnh trên

các chủng sinh lý khác nhau ở mỗi loài và giống cây trồng, trên mỗi vùng khác nhau có thể chỉ nhiễm một hay một số chủng của chúng và ở mức độ nặng nhẹ khác nhau (Kelman,1953; Hayward, 1994)

Vi khuẩn R solanacearum có hệ thống men rất phong phú để phân giải

thức ăn, chúng có dạng hình gậy ngắn, kích thước 0,4 - 0,8 x 1,0 - 2,0 µm, hai đầu hơi tròn, thường có 1 - 4 lông roi ở một đầu, hảo khí, nhuộm Gram âm, không hình thành bào tử (Buddenhagen and Kelman, 1964) Trên môi trường nhân tạo SPA khuẩn lạc của vi khuẩn có màu trắng kem, trắng sữa dạng tròn nhỏ, láng bóng (Hayward, 1960) Còn trên môi trường TZC, khuẩn lạc có hình không đều, nhày, rìa có màu trắng, ở giữa có phớt hồng nhạt (Kelman, 1953)

Sự phát sinh, phát triển bệnh héo xanh vi khuẩn trên cây ký chủ có liên quan chặt chẽ đến điều kiện ngoại cảnh như: nhiệt độ và độ ẩm đất, lượng mưa, gió, kết cấu và pH đất, v.v Nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn phát triển trong khoảng từ 28 – 35oC, nhiệt độ tối thiểu là 10oC và tối đa là 41oC (chúng có thể chết ở 520C trong vòng 10 phút) Vi khuẩn phát triển ở phạm vi pH khá rộng từ 5,0 - 8,5, nhưng thích hợp nhất là 7,0 – 7,2 Độ ẩm đất và các vi sinh vật đối kháng cũng là những yếu tố hạn chế quan trọng nhằm khống chế hay thúc đẩy sự phát triển của bệnh (Kelman, 1997)

Lượng mưa cũng ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn Ralstonia solanacearum ở những vùng có mưa nhiều, nhiệt độ đất và không khí trong

khoảng 25 – 35oC bệnh thường gây thiệt hại nặng Sau những trận mưa, thời tiết nóng hoặc xen kẽ giữa những ngày mưa và nắng ấm là điều kiện thuận lợi cho

bệnh phát triển nhanh (Tan and Liao, 1990) Vi khuẩn R solanacearum rất mẫn

cảm với điều kiện ẩm độ thấp (Bruddenhagen and Kelman, 1964)

Nghiên cứu những đặc tính sinh hóa chính của vi khuẩn R solanacearum (He, 1983) đã chỉ ra rằng: R solanacearum có khả năng tạo ra H2S, khử nitrat, có phản ứng oxidase và catalasa, ure, pectin, oxi hóa axetat, malonat và gluconat Vi khuẩn không hoá lỏng gelatin, thuỷ thân tinh bột, không phản ứng tạo indol và không sử dụng arginin

Vi khuẩn R Solanacearum là vi khuẩn hiếu khí, không hình thành bào tử

và có khả năng tổng hợp poly-β-hydroxybutyrat như là nguồn các bon dự trữ Nó

có thể tổng hợp sắc tố khuyếch tán mầu nâu trên môi trường thạch có chứa

Tyrozin R.solanacearum có thể khử nitrat thành nitrit và tạo ra khí nhưng không

thể thuỷ phân tinh bột và không hoá lỏng gelatin Nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn phát triển trong khoảng từ 25 -350C R.Solanacearum có phản ứng rất

khác nhau với kháng sinh, các biovar có thể mẫn cảm với streptomycin, nhưng chống chịu với penixilin viomyxin, (He, 1983)

Tính độc của vi khuẩn có mối quan hệ với hình thái khuẩn lạc và các race

tổng hợp polysacharit ngoại bào (Kelman, 1954) Các biovar đột biến của P Solanacearum có thể được phát hiện dễ dàng khi chúng được cấy vạch trên môi

trường thạch Kelman có 2,3,5-triphenyl tetrazolium clorit (TZC) sau 36-48h

(Kelman, 1954) Những đột biến có tính độc hoặc không có tính độc thường hình thành các khuẩn lạc nhỏ hình chai có một quầng xẫm nổi bật Các chủng độc thường hình thành những khuẩn lạc màu trắng, thể nhầy lỏng, khoanh tròn mực với màu phớt hồng ở tâm Khả năng tổng hợp chất nhầy poly sacharit là một

thuộc tính chung của tất cả các chủng phân lập P.solanacearum có tính độc 1.1.3 Các phương pháp phát hiện, chẩn đoán và giám định vi khuẩn Ralstonia solanacearum

Phương pháp chẩn đoán dựa vào triệu chứng bệnh thể hiện trên cây: đây là phương pháp chẩn đoán nhanh trong việc kiểm tra phát hiện bệnh HXVK trên

đồng ruộng Tuy nhiên, để kiểm tra chính xác sự có mặt của vi khuẩn trong thân cây bị bệnh, ngoài việc quan sát triệu chứng cây héo, hay bó mạch dẫn có màu nâu, thâm đen, người ta tiến hành cắt đoạn thân cây bệnh dài 2 – 3 cm, đặt trong cốc nước sạch, sau vài phút (nếu đúng bệnh HXVK) thấy dịch vi khuẩn màu trắng sữa tiết ra trên đầu vết cắt vào trong cốc nước Phương pháp này đã được nhiều tác giả đề cập đến (Wang, 1998)

Phương pháp phân ly, nuôi cấy vi khuẩn R solanacearum trên môi trường

chọn lọc nhân tạo TZC cho phép xác định tính độc và tính gây bệnh của vi khuẩn

này Theo Kelman (1953) vi khuẩn Ralstonia solanacearum cấy trên môi trường

TZC có khuẩn lạc nhỏ không đều, nhày, rìa màu trắng sữa, ở giữa có màu phớt hồng nhạt Và những vi khuẩn có độc tính có thể bảo quản dễ dàng trong nước cất vô trùng

Phương pháp lây nhiễm nhân tạo: Phương pháp này dựa vào khả năng gây

héo và chết xanh của vi khuẩn R solanacearum với cây cà chua ở điều kiện thích

hợp nhất cho sự phát triển của bệnh sau thời gian nhất định (Kelman, 1953);

Phản ứng siêu nhạy trên lá thuốc lá: khi tiêm dịch vi khuẩn Ralstonia solanacearum với nồng độ 108 – 109 tế bào/ml vào mô lá cây thuốc lá Sau khi tiêm 24 – 48 giờ quan sát sẽ thấy đốm hoại tử có màu sáng chuyển sang màu nâu xám, còn nếu là vi khuẩn hoại sinh hoặc mất khả năng gây bệnh thì không gây

hiện tượng đám mô chết hoại (Kilary et al., 1983)

Phương pháp sử dụng kỹ thuật PCR có nhiều lợi thế hơn hẳn so với các phương pháp chẩn đoán truyền thống nhờ độ nhạy cao, tốc độ nhanh và chỉ với lượng mẫu nhỏ Ngoài ra sử dụng phương pháp này người ta cũng không phái nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường như các phương pháp khác, kể cả phương

pháp RAPD (Caetano et al.,1991); (Devos et al., 1992) Bằng phương pháp ứng

dụng PCR nhờ đó mà chỉ sau một vài giờ, từ một đoạn DNA ban đầu và một

đoạn DNA mồi (Primer – đối với P solanacearum là P759/760 do Timis, Đại

học Adelaide Úc thiết kế, trùng hợp và cung cấp) người ta có thể nhân lên hàng trăm triệu lần sau đó đi phân tích kiểu gen và xác định, nhận biết một cách chính

xác loài, race và biovar của loài R solanacearum ở trong mẫu cây bệnh, trong

đất nhiễm bệnh, v.v

Các phương pháp huyết thanh, miễn dịch huỳnh quang (IF), miễn dịch liên kết men (ELISA), chuỗi phản ứng men (PCR) và phương pháp "Phân tích đa dạng đoạn dài giới hạn" (RFLP) đã được nhiều tác giả nghiên cứu để chuẩn đoán,

phát hiện, giám định loài R solanacearum Smith

Theo Seal (1998), để chẩn đoán nhanh loài vi khuẩn R solanacearum hại cây

trồng thì phương pháp huyết thanh và PCR có hiệu quả ổn định

1.1.4 Nghiên cứu biện pháp phòng chống bệnh héo xanh vi khuẩn Ralstonia solanacearum Smith

Để phòng chống bệnh héo xanh vi khuẩn không thể dùng một biện pháp riêng rẽ mà phải áp dụng biện pháp tổng hợp, phải kết hợp hài hoà các biện pháp như: chọn giống kháng bệnh, biện pháp canh tác, biện pháp sinh học (Kelman, 1997), (French, 1998)

Chọn tạo và sử dụng giống kháng bệnh được coi là một trong những biện pháp hiệu quả và kinh tế nhất để phòng chống bệnh héo xanh vi khuẩn Nhiều nước đã sử dụng biện pháp dùng giống kháng để nhằm hạn chế tác hại của bệnh

HXVK Ở Mỹ, Scott et al.,(1993) đã nghiên cứu, lai tạo được một giống cà chua

kháng bệnh héo xanh vi khuẩn: Hawaii 7998, CRA66 và PI 126 408 Biện pháp dùng giống thuốc lá kháng bệnh HXVK đã được phổ biến ở Mỹ với các dòng giống thuốc lá có tính kháng bệnh ổn định năng suất cao có tính kháng bệnh tốt

như TI 448A, 79X, Xanthi, DSPA, AWA, TI 79A Ở Australia, Akiew et al.,

(1992) cũng nghiên cứu và ứng dụng một số dòng, giống kháng bệnh HXVK Giống khoai tây kháng bệnh héo xanh vi khuẩn được đưa vào sản xuất tỏ

ra có hiệu quả trong phòng trừ bệnh, một số dòng giống khoai tây kháng bệnh HXVK đã được sử dụng ở Brazil: BP 88068-3, BP 881665, BP.88074-1 (Alice

et al., 1997) Phương pháp này đã sử dụng thành công ở một số vùng nhưng lại không có hiệu quả ở một vài nơi khác Sự nghiên cứu chọn lọc những dòng giống khoai tây kháng bệnh ở các vùng sản xuất trên thế giới được nhiều tác giả đề cập

tới (French et al., 1986)

Biện pháp giống chống chịu sẽ hiệu quả hơn khi kết hợp với các biện pháp phòng trừ bệnh khác Luân canh là một biện pháp có nhiều triển vọng Luân canh

cà chua với lúa nước hoặc những cây trồng không phải là ký chủ của bệnh

HXVK sẽ làm giảm tỷ lệ bệnh một cách đáng kể (Prior et al., 1993);

Các nghiên cứu ở Philippin, Ấn Độ cho thấy luân canh cây họ cà với cây

một lá mầm như lúa, ngô, mía tỉ lệ nhiễm bệnh HXVK giảm đáng kể (Ramesh, et

al., 1992) Để giảm thiểu tác hại của bệnh HXVK trồng khoai tây phải phối hợp các biện pháp canh tác như: luân canh, chọn địa điểm, thời vụ trồng, sử dụng đất sạch bệnh, giống xác nhận sạch bệnh, dụng cụ lao động đã được tiệt trùng và dùng nước sạch để tưới cho cây trồng Luân canh để phòng bệnh cũng được tác giả French, (1998), đề cập đến Hơn nữa nếu phơi ải đất 5 tháng và không trồng luân canh với cây họ cà thì hiệu quả phòng bệnh HXVK sẽ ổn định hơn (Jackson

et al., 1981)

Biện pháp canh tác trên lạc để phòng chống bệnh HXVK cũng rất được coi trọng Những nghiên cứu ở Sơn Đông (Trung Quốc) cho thấy luân canh lạc với lúa nước trong 3 năm, tỷ lệ bệnh giảm từ 83,4% xuống 1.5% (Wang and Hou, 1982) Theo He (1990) cũng cho rằng ngâm ruộng 15 - 30 ngày trước trồng lạc hoặc luân canh với cây lúa nứơc 2 - 4 năm có tác dụng giảm tỷ lệ nhiễm bệnh của lạc Ở các công thức luân canh khác nhau, hiệu lực phòng trừ bệnh HXVK cũng khác nhau Các công thức luân canh có tác dụng phòng trừ bệnh HXVK theo thứ

tự từ cao đến thấp: Lac - lúa nước, lạc - ngô, lạc - đậu tương, lạc - lạc (Giống kháng bệnh héo xanh vi khuẩn) và lạc - khoai lang (Machmud, 1993) Đối với các vùng đất cao khó khăn trong việc trồng lúa và tưới nước nói chung thì luân canh với cây lúa mì, đại mạch, tiểu mạch, ngô trong chu kỳ 4 - 5 năm cũng có tác dụng giảm tỷ lệ bệnh (Wang and Hou, 1982) Trên chân đất sét, bón vôi kết hợp với phân hữu cơ cũng có hiệu lực phòng bệnh nhưng không ổn định

Biện pháp sinh học cũng được sử dụng nhiều, và là biện pháp quan trọng

có ý nghĩa để phòng chống bệnh HXVK (Trigalet et al.,1994) Theo thông tin của CABI (1997), kẻ thù tự nhiên của loài Ralstonia solanacearum là một số vi khuẩn đối kháng như Bacillus subtilis (B subtilis), Pseudomonas fluorescent (P

fluorescent), Bacillus polymyxa , Pseudomonas cepacia và Pseudomonas gladioli

Từ những năm 1952, những nghiên cứu về khả năng sử dụng vi khuẩn đối kháng

B polymyxa trong phòng chống bệnh HXVK trên cà chua đã bước đầu cho thấy

ở công thức có xử lý B polimyxa tỷ lệ héo chỉ ở mức 33%, trong khi đó ở công

thức đối chứng tỷ lệ nhiễm bệnh là 70% Kết quả nghiên cứu về vai trò của vi khuẩn đối kháng cho thấy: một số vi khuẩn có khả năng sản sinh ra các chất làm

ức chế vi khuẩn gây bệnh, một số khác còn có khả năng cạnh tranh phát triển nhanh, lấn chiếm cả vùng rễ cây trồng khiến cho vi khuẩn gây bệnh không còn chỗ để phát triển Mặt khác, bản thân một loài vi khuẩn đối kháng đó có thể giữ vai trò quan trọng trong việc ức chế vi khuẩn gây bệnh ở vùng rễ Trong điều

kiện nhà kính, vi khuẩn Bacillus polymyxa và vi khuẩn Pseudomonas fluorescens

góp phần hạn chế triệu chứng héo trên cà chua Các biện pháp cải tạo đất bằng hỗn hợp theo công thức Ammonium sulphate, bột xương, bột hải ly, cua, glycetin Xỉ silic làm tăng khả năng tạo khuẩn lạc ở đầu rễ cây của chủng

Pseudomonas fluorescens và qua đó làm tăng khả năng chống bệnh HXVK cho

cây được thí nghiệm trong chậu Ngoài ra, các chủng R solanacearum không độc

cũng là một tác nhân được quan tâm nhiều trong chiến lược phòng trừ bệnh HXVK Các chủng không độc tính đã được nghiên cứu, sử dụng phòng chống bệnh HXVK trên lạc ở điều kiện nhà kính

Việc nghiên cứu và ứng dụng phương pháp gốc ghép để phòng trừ bệnh HXVK đã được tiến hành Kỹ thuật ghép trong sản xuất cây giống rau được ứng

dụng lần đầu tiên tại Nhật Bản năm 1927, để chống bệnh héo do nấm Fusarium

sp trên dưa hấu Các nghiên cứu về cơ chế kháng bệnh HXVK của cây cà chua ghép trên gốc kháng bệnh HXVK đã được nghiên cứu Việc ghép cà chua nhiễm bệnh HXVK trên gốc cà tím kháng bệnh đã được Wang (1998) tiến hành, kết quả

là có từ 20 – 31,8% số cây chết so với 100% số cây không được ghép bị chết do bệnh HXVK

Phòng trừ bệnh HXVK bằng biện pháp hoá học nhìn chung ít có tác dụng, tốn kém và khó thực hiện được Có nhiều nghiên cứu về biện pháp này như: xử

lý đất bằng phương pháp xông hơi nhưng ít có tác dụng hạn chế bệnh (Murakoshi

and Takahashi, 1984) Sử dụng thuốc kháng sinh có ưu điểm lớn là có tính hấp phụ thuốc tốt, dễ chuyển dịch trong mạch dẫn, mô cây nhưng lại có mặt hạn chế

vì dễ hình thành dạng, chủng vi khuẩn kháng thuốc ở nồng độ cao Prior et

al.,(1997) đã nghiên cứu và đưa ra nhận xét: biện pháp dùng thuốc hoá học ít có hiệu quả trong phòng từ bệnh HXVK

1.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Từ nắm 1960, bệnh HXVK hại những cây trồng cạn phổ biến như cà chua, khoai tây, thuốc lá, cà, lạc đã được nhắc đến ở nước ta Đến năm 1967 – 1968, kết quả điều tra bệnh cây của Viện bảo vệ thực vật cho thấy bệnh HXVK hại phổ biến ở vùng đồng bằng, trung du và miền núi phía bắc Việt Nam

Tác giả Lê Lương Tề (1997) đã nghiên cứu triệu chứng bệnh HXVK, đặc tính sinh học, quy luật phát sinh, phát triển của bệnh và một số hướng phòng trừ

Tác giả đã nêu ra phạm vi ký chủ của loài R solanacearum trên các cây trồng

cạn: cà chua, khoai tây, lạc, thuốc lá, cây cà, vừng, ớt và cây đay

Khi nghiên cứu về tính phổ biến của bệnh HXVK trên cây trồng cạn, tác giả Đỗ Tấn Dũng (1995a) cho rằng bệnh HXVK phát sinh, phát triển và gây hại nghiêm trọng trên cà chua, khoai tây, lạc Trên cây thuốc lá tỷ lệ nhiễm bệnh do

vi khuẩn R solanacearum gây hại có phần nhẹ hơn Tác giả cũng đã nghiên cứu

ban đầu về bệnh HXVK hại cây cà chua, đặc tính sinh học của vi khuẩn gây bệnh, phương pháp chẩn đoán nhanh và một số biện pháp phòng trừ ban đầu trên một số cây trồng cạn như lạc, thuốc lá, cà chua

Theo tác giả Đoàn Thị Thanh và cs (1995), vi khuẩn Ralstonia solanacearum không những gây hại trên khoai tây mà còn ký sinh gây hại trên cà chua, thuốc lá, lạc và cây cà Tác giả còn cho rằng, đây là loài vi khuẩn đa thực,

có phạm vi ký chủ rộng, gây hại chủ yếu trên các cây trồng họ cà, họ đậu

Tác giả Nguyễn Văn Biếu và cs (1996) cho biết bệnh HXVK là một trong những bệnh phổ biến ở các vùng trồng thuốc lá như Hà Tây, Bắc Giang, Cao Bằng, Hà Nội Bệnh phát sinh và gây hại nặng ở Ba Vì, Hà Tây, có nơi tỷ lệ bệnh lên đến 20%, trong khi đó ở các vùng khác bệnh nhẹ hơn Các tác giả cho rằng bệnh HXVK phát sinh, phát triển tuỳ thuộc vào thời vụ, giống, kỹ thuật canh tác

và vùng sinh thái trồng của cây thuốc lá

Bệnh HXVK hại lạc là bệnh hại phổ biến trên nhiều vùng trồng ở nước ta Kết quả điều tra tình hình sản xuất lạc ở Việt Nam do Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn chủ trì cùng sự hợp tác của Viện nghiên cứu cây trồng vùng nhiệt đới bán khô hạn quốc tế (ICRISAT) năm 1990 - 1991 cho thấy bệnh HXVK đã trở thành bệnh hại quan trọng và nan giải ở nhiều địa phương Nghiên cứu của Nguyễn Xuân Hồng và cs (1997) chỉ ra rằng ở miền bắc Việt Nam, các mẫu phân

lập vi khuẩn R solanacearum đều thuộc Race 1 (Biovar 3 và 4), vì vậy phạm vi

ký chủ rộng, có tính độc cao và có thể tồn tại lâu trong đất

Theo tác giả Tạ Thị Thu Cúc và cs (1983), trong các loại bệnh chủ yếu hại trên cà chua như mốc sương, virus, HXVK thì bênh HXVK do loài vi khuẩn

Ralstonia solanacearum là một bệnh gây hại nghiêm trọng Theo tác giả, bệnh phát sinh và gây hại nặng ở những vùng đất trũng, không thoát nước, đất thịt nặng hoặc những chân đất bón nhiều đạm, không cân đối với lân và kali

Về tác hại của bệnh HXVK đối với khoai tây bảo quản, Ngô Đức Thiệu và

cs (1978) cho rằng vi khuẩn R solanacearum có thể là nguyên nhân của bệnh

thối ướt gây thiệt hại khoảng 20 - 25% năng suất

Kết quả nghiên cứu bệnh HXVK hại khoai tây của Viện Bảo vệ thực vật (1971 - 1976) đã chỉ ra rằng bệnh HXVK là loại bệnh hại nguy hiểm đối với các vùng sản xuất khoai tây Những yếu tố sinh thái liên quan đến sự phát sinh, phát triển và tác hại của bệnh trên khoai tây đã được đề cập

Khi nghiên cứu về bệnh HXVK trên các giống khoai tây nhập nội, tác giả Hà Minh Trung và cs (1989) đã chỉ ra triệu chứng và nêu nguyên nhân gây

bệnh chết xanh cây khoai tây trên đồng ruộng là do loài vi khuẩn R solanacearum gây ra

Tác giả Lê Lương Tề và cs (1997) đã nghiên cứu và chỉ ra rằng vi khuẩn

Ralstonia solanacearum xâm nhập qua vết thương xây xát và di chuyển trong bó mạch ở thân, lá, sản sinh độc tố có tác động gây héo Các yếu tố thời tiết như nhiệt độ, ẩm độ cao sẽ làm bệnh gây hại nặng hơn Bệnh có thể phát sinh và gây hại trên thuốc lá vụ xuân hè và vụ động Thuốc lá trồng trên đất cát pha, đất thịt

nhẹ và trên các thửa ruộng trồng luân canh với cây họ cà và lạc bệnh thường hại nặng hơn

Trong báo cáo tại Hội nghị quốc tế các nhóm công tác nghiên cứu về bệnh HXVK hại lạc lần thứ 3 tại Trung Quốc do Viện nghiên cứu cây trồng cạn Quốc

tế (ICRISAT) tổ chức, Nguyễn Xuân Hồng và cs (1993) đã báo cáo hiện trạng bệnh HXVK hại lạc tại Việt Nam Tác giả cho biết bệnh HXVK hại lạc là một trong những bệnh hại phổ biến, bệnh phát sinh, phát triển thuận lợi trong điều kiện nhiệt độ và ẩm độ tương đối cao Bệnh gây hại nặng hơn ở vụ lạc thu so với lạc xuân

Theo tác giả Lê Lương Tề (1997), bệnh HXVK hại lạc thường phát sinh ở

cả hai vụ trồng lạc vụ lạc xuân và vụ lạc thu Trong điều kiện nhiệt độ tương đối cao, ẩm ướt, cây sinh trưởng kém, đất thô, nhất là trên đất trồng độc canh bệnh gây hại nặng

Theo tác giả Đỗ Tấn Dũng (1997) khi nghiên cứu bệnh HXVK hại lạc vùng Đông Anh Hà Nội có nhận xét: bệnh phát sinh gây hại nặng từ giai đoạn cây lạc ra hoa đến rộ quả non Trên đất luân canh với lúa nước, mức độ nhiễm bệnh nhẹ hơn so với độc canh cây lạc hay luân canh với cây trồng khác Trong nghiên cứu, tác giả cũng đề cập đến đặc điểm hình thái, đặc điểm phát sinh gây hại, đặc tính sinh lý, sinh hoá cũng như tính độc và tính gây bệnh của vi khuẩn

Cũng theo nghiên cứu của tác giả Đỗ Tấn Dũng (1998), bệnh HXVK hại

cà chua là một bệnh có diễn biến phức tạp, phụ thuộc vào điều kiện thời tiết, mùa

vụ, đất đai, cơ cấu luân canh và trình độ canh tác ở mỗi vùng Đồng thời, mức độ nhiễm bệnh có sự biến động giữa các năm, liên quan chặt chẽ đến các yếu tố khí hậu, thời tiết, cơ cấu luân canh và biện pháp kỹ thuật canh tác Thử nghiệm sử

dụng vi khuẩn đối kháng B subtilis, P fluorescent để hạn chế sự xâm nhiễm và

phát sinh gây hại của bệnh HXVK

Để chẩn đoán nhanh vi khuẩn R solanacearum trong cây, phương pháp

kháng huyết thanh và PCR (chuỗi phản ứng Polymerase) tỏ ra thích hợp hơn cả Đặc biệt, phương pháp PCR có khả năng nhanh nhạy, đặc hiệu hơn các phương pháp khác (Lê Lương Tề, 1997)

Tác giả Hà Minh Trung và cs (1989) cho rằng loại bỏ củ bệnh, củ xây xát

sẽ góp phần hạn chế sự lây lan phát triển của bệnh

Trong các biện pháp phòng chống bệnh HXVK thì chọn giống kháng bệnh được coi là giải pháp có nhiều ưu điểm nhất Trong kết quả thử nghiệm lây bệnh nhân tạo với chủng BN, biovar 3, race 1 của 36 dòng/giống cà chua trong bộ giống kháng chuẩn quốc tế (Trần Văn Lài, Chu Văn Chuông và cs, 2002) đã cho rằng các giống Caraibo Caravel, CLN 1464-111-30-45 và một số dòng, giống thuộc nhóm giống Hawaii có khả năng kháng bệnh cao, các nguồn gen kháng như: UPCA 1169, CRA 84-26-3, VC-1, CRA 66 và PT127805 A có vai trò quyết định tạo nên tính kháng của một số dòng, giống khảo nghiệm

Chiến lược chọn tạo giống kháng bệnh ở nước ta đã được nghiên cứu và ứng dụng trên cây lương thực và được áp dụng từ lâu, nhất là trên cây lúa, ngô Tuy nhiên đối với bệnh HXVK trên cây cà chua, khoai tây và lạc thì việc chọn tạo giống kháng vẫn chưa có hệ thống Mặc dù từ những năm 1986, trong chương trình chọn tạo giống khoai tây và một số cây trồng khác, nhiều tác giả đã đưa ra chỉ tiêu chọn giống kháng một số bệnh như: HXVK, virus, mốc sương Phạm Xuân Tùng (1995) đã phát hiện ra 4 tổ hợp lai khoai tây có khả năng kháng bệnh HXVK từ quần thể lai ban đầu Go có bố, mẹ mang gen kháng

Để làm cơ sở khoa học cho việc chọn tạo giống kháng, khi nghiên cứu

đặc điểm di truyền tính kháng của khoai tây với loài vi khuẩn Ralstonia solanacearum, Phạm Xuân Tùng (1995), đã cho biết: tính kháng bệnh HXVK rất phức tạp và nhiều khả năng được quy định bởi nhiều gen và có quan hệ mật thiết với kiểu gen cây ký chủ

Trong quá trình thử, khảo nghiệm, đánh giá chọn giống kháng bệnh HXVK, tác giả Đoàn Thị Thanh (1995) đã cho biết: từ 140 dòng giống khoai tây ban đầu, tác giả đã chọn được các giống: KT2, KH3, KT8, Nicola và VT2 cho năng suất cao và ổn định ở các vùng sinh thái, tỷ lệ nhiễm bệnh thấp

Một số nghiên cứu nhằm chọn tạo giống lạc kháng bệnh cũng được triển khai tại viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam Các thí nghiệm chậu vại và đồng ruộng, dùng kỹ thuật lây nhiễm bệnh nhân tạo đã cho phép

đánh giá một số giống lạc nhập nội và địa phương có tính kháng bệnh HXVK (Nguyễn Xuân Hồng và cs, 1995)

Khảo sát 19 giống lạc kháng bệnh HXVK nhập nội từ viện ICRISAT,

đã thấy rằng tất cả các giống đều nhiễm dòng Ralstonia solanacearum ở Việt

Nam, trong đó giống KPs 17 và đặc biệt chọn được giống MD7 có tính kháng bệnh cao được đưa vào khảo nghiệm trên diện rộng và sản xuất tại một số vùng sinh thái (Nguyễn Xuân Hồng và cs, 1993)

Khi nghiên cứu về mối liên quan giữa bệnh HXVK hại lạc với các yếu

tố sinh thái, kỹ thuật, Lê Lương Tề (1997) nhận xét: bệnh có thể phát sinh ở các giai đoạn sinh trưởng của cây, cao điểm của bệnh là vào thời điểm ra hoa, quả non, sau đó bệnh giảm ở giai đoạn quả già Về ảnh hưởng của phân bón thì vôi và kali có tác dụng hạn chế tác hại của bệnh, đảm bảo năng suất cao hơn đối chứng Chế độ luân canh có ảnh hưởng tới sự phát triển của bệnh, chu

kỳ luân canh càng dài, mức độ gây hại của bệnh càng giảm ở công thức luân canh lúa - lạc - lúa và mía - lạc thì tỷ lệ bệnh HXVK thấp hơn so với công thức luân canh lạc xuân - lạc thu hoặc lúa - khoai tây - lạc

Tác giả Đỗ Tấn Dũng (1997), khi nghiên cứu bệnh HXVK hại lạc ở vùng Đông Anh – Hà Nội có nhận xét: mức độ bệnh HXVK hại lạc trên đất luân canh lạc với lúa nước thấp hơn so với đất luân canh lạc với cây trồng khác

Ngoài ra, các biện pháp phòng trừ bệnh HXVK như: luân canh, sử dụng

thuốc kháng sinh Streptomycine, sử dụng vi khuẩn đối kháng B subtilis đã

được nghiên cứu, khảo nghiệm Tuy nhiên hiệu quả còn thấp, chưa ổn định và chưa được áp dụng trong sản xuất

Theo tác giả Đỗ Tấn Dũng (2009) khi nghiên cứu bệnh héo xanh vi khuẩn hại cà chua và một số cây rau mầu vụ thu đông - xuân hè năm 2007-

2008 ở Ninh Bình cho biết: kết quả khảo sát ban đầu cho thấy luân canh cây

cà chua với lúa nước hoặc các cây không phải là ký chủ của bệnh đã có tác dụng hạn chế sự phát sinh gây hại của bệnh héo xanh vi khuẩn ngoài đồng ruộng Tác giả cho biết luân canh với các công thức trên thì mức độ nhiễm bệnh héo xanh vi khuẩn giảm đi một cách đáng kể Tỷ lệ bệnh héo xanh vi khuẩn hại cà chua dao động từ 8,0-8,4% khi luân canh cà chua với lúa nước và mức độ nhiễm bệnh HXVK khá nghiêm trọng ở những chân ruộng luân canh

cà chua với những cây trồng cạn khác hoạc trồng lại trên đất đã trồng cà chua

vụ trước tỷ lệ bệnh dao động từ 13,8-19,6%

Theo Tác giả Đỗ Tấn Dũng và cs (2011) có thể sử dụng chế phẩm vi sinh vật

đối kháng B subtilis kết hợp với thuốc kháng sinh, thuốc hóa học để phòng trừ bệnh

HXVK hại cây khoai tây cho hiệu quả cao Sử dụng chế phẩm vi sinh vật đối kháng B subtilis xử lý đất trước khi trồng khoai tây có tác dụng hạn chế khả năng xâm nhiễm, phát sinh, phát triển của bệnh HXVK Sử dụng các loại thuốc hoá học, thuốc kháng sinh

có khả năng phòng trừ bệnh HXVK Sau 28 ngày theo dõi, thuốc Lobo 8WP có hiệu lực phòng trừ bệnh HXVK hại khoai tây cao nhất đạt 78,8% - 80,2% Tiếp đến là thuốc Streptomycine (hiệu lực của thuốc là 69,4% - 70,9%) Thuốc Validamycin có hiệu lực thấp nhất (hiệu lực của thuốc chỉ đạt 61,6% - 62,3%)

Theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Văn Đĩnh và cs (2005) trong quá trình thực hiện biện pháp quản lý cây trồng tổng hợp (ICM) đã xây dựng được quy trình ICM trên khoai tây tại đồng bằng sông Hồng Quy trình ICM gồm 6 bước: xác định thuận lợi khó khăn trong sản xuất và tiều thụ khoai tây, tuyên truyền nâng cao giác ngộ, tổ chức nhằm sở thích về ICM, thí nghiệm do nông dân quản lý, tham quan đầu bờ, hội thảo, đánh giá và nhân rộng Áp dụng quy trình quản lý tổng hợp đối với bệnh héo xanh như: trồng giống khoẻ, sử dụng phân chuồng hoại mục, luân canh với lúa nước, bón phân cân đối, đã mang lại kết quả tốt Tỷ lệ cây bị bệnh héo xanh năm thứ 3 giảm so với đối chứng từ 45 – 58% Năng suất khoai tây của các hộ ICM cao hơn cảu các hộ đối chứng từ 13,4 – 36,8% Quy trình đã áp dụng thành công trong sản xuất tại 4 tỉnh sản xuất nhiều khoai tây (Hà Tây, Nam Định, Thái Bình và Hà Nội) và có khả năng áp dụng cho cây trồng khác

Chương 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu và đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu:

Bệnh HXVK Ralstonia solanacearum Smith hại một số cây trồng cạn vùng

Hà Nội, phụ cận vụ thu đông 2014 và xuân hè 2015

2.1.2 Vật liệu nghiên cứu

- Cây kí chủ: Một số cây trồng cạn: cà chua, khoai tây, ớt, cà pháo, lạc

- Môi trường nuôi cấy:

+ Môi trường SPA (Sacarose - Peptone - Agar) (Hayward, 1960)

+ Môi trường PPSA (Potato – Peptone – Sacarose – Agar)

- Một số dụng cụ trang thiết bị thiết yếu khác phục vụ cho nghiên cứu tại phòng thí nghiệm Bộ môn Bệnh cây, Khoa Nông học, Học Viện Nông nghiệp Việt Nam

2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

2.2.1 Thời gian nghiên cứu

Từ tháng 10/2015 tới tháng 07/2015

2.2.2 Địa điểm nghiên cứu

Một số hợp tác xã nông nghiệp trồng rau vùng Hà Nội và phụ cận

2.3 Nội dung nghiên cứu

- Tình hình bệnh héo xanh vi khuẩn hại một số cây trồng cạn tại một số vùng trồng rau tại Hà Nội, phụ cận vụ thu đông và xuân hè năm 2014- 2015;

- Nghiên cứu một số đặc điểm hình thái khuẩn lạc và đặc tính sinh học của

loài Ralstonia solanacearum Smith

+ Nuôi cấy vi khuẩn Ralstonia solanacearum Smith trên môi trường nhân

tạo: SPA, PPSA/

+ Thử gram vi khuẩn Ralstonia solanacearum bằng dung dịch KOH 3%

+ Nghiên cứu đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào vi khuẩn trên môi trường nhân tạo

+ Nghiên cứu ảnh hưởng của yếu tố nhiệt độ, môi trường đến vi khuẩn

Ralstonia solanacerum

+ Nghiên cứu các đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn Ralstonia solanacerum

- Thử phản ứng siêu nhạy trên mô lá cây thuốc lá các mẫu phân lập vi

khuẩn Ralstonia solanacerum

- Nghiên cứu phạm vi ký chủ của các mẫu phân lập vi khuẩn Ralstonia solanacearum Smith phân lập từ các cây ký chủ vùng Hà Nội và phụ cận

- Khảo sát hiệu lực ức chế đối với các mẫu phân lập của các loại thuốc hóa

học, thuốc kháng sinh và vi khuẩn đối kháng Bacillus subtilis

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp điều tra bệnh héo xanh vi khuẩn ngoài đồng ruộng

Tiến hành điều tra bệnh HXVK ngoài đồng ruộng hại cà chua, khoai tây, cà pháo, ớt, lạc tại một số vùng trồng rau tại Hà Nội và phụ cận vụ thu đông và xuân

hè năm 2014- 2015;

Điều tra theo phương pháp điều tra của Cục bảo vệ thực vật (1995), Viện BVTV (1997) kết hợp với QCVN 01-38:2010 Tại các ruộng, các điểm được chọn, điều tra theo phương pháp 5 điểm chéo góc, mỗi điểm 50 cây, điều tra định

kỳ 7 ngày/ lần Dựa vào triệu chứng điển hình của bệnh HXVK trên đồng ruộng

để đánh giá mức độ bị nhiễm bệnh

+ Tỷ lệ bệnh (TLB %):

TLB (%) = B A x 100

Trong đó: A: tổng số cây bị bệnh

B: tổng số cây điều tra

2.4.2 Phương pháp nghiên cứu bệnh héo xanh vi khuẩn trong phòng thí nghiệm

2.4.2.1 Phương pháp phân li nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường nhân tạo

* Phương pháp phân lập vi khuẩn

Các mẫu thu về được rửa sạch, sau đó được sát trùng bằng cồn 70o Ngâm mẫu bệnh vào trong cốc nước cất vô trùng Dùng que cấy vi khuẩn đã khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn, lấy một vòng dịch trên bề mặt cắt của thân cây bệnh cấy trên môi trường SPA, PPSA Nuôi cấy trong điều kiện nhiệt độ 28-30oC

Hoặc từ mẫu bệnh có triệu chứng héo xanh vi khuẩn điển hình, lựa chọn

mô bệnh đặc trưng Khử trùng bề mặt mô bệnh bằng cồn 700 từ 2-3 phút Rửa lại

mô bệnh bằng nước vô trùng Sử dụng dao mổ vô trùng cắt mô bệnh thành những mẩu nhỏ có kích thước từ 5-6 mm Sau đó dùng panh vô trùng cấy những mẫu nhỏ vào môi trường SPA, PPSA Nuôi cấy ở nhiệt độ 28-300C Khi vi khuẩn phát triển cấy chuyển sang môi trường khác

* Môi trường nuôi cấy

+ Môi trường SPA (Sacarose - Peptone - Agar) (Hayward, 1960)

ở 1210C trong thời gian 45 phút, để nguội 55 - 600C trước khi rót vào đĩa peptri

Cách làm môi trường: Khoai tây rửa sạch, thái nhỏ kích thước 1 x 2 x 1

cm cho vào nồi chứa 1000ml nước cất đun sôi, sau khi đun sôi được 20 phút thì lọc lấy phần nước, bổ sung thêm nước cho đủ 1000ml Cho từ từ 22g agar, đường Sacarose 15g, nước cất 1000ml, Pepton 5g, Mg(SO4)7H2O 0,25g, KH2PO4 0.5g

và Ca(NO3)2 0.2g vào dung dịch nước trên Khuấy đều nhẹ nhàng cho dung dịch hòa tan đồng thời đun sôi Môi trường được cho vào bình tam giác sau đó hấp khử trùng ở 1210C trong thời gian 45 phút, để nguội 55 - 600C trước khi rót vào đĩa peptri đã được khử trùng

2.4.2.2 Phương pháp thử gram vi khuẩn R solanacerum bằng dung dịch KOH 3%

Thí nghiệm tiến hành với các mẫu phân lập vi khuẩn được từ các cây ký chủ Mỗi mẫu phân lập vi khuẩn phân lập được từ cây ký chủ khác nhau, sau khi

đã phân lập và nuôi cấy trên môi trường SPA, mỗi mẫu phân lập vi khuẩn chọn

ra 1 hộp môi trường mới cấy chuyển (72 giờ trờ lại)

Chuẩn bị lam sạch và dung dịch KOH 3%, nhỏ 1 giọt nhỏ dung dịch KOH lên bề mặt lam đã khử trùng, sau đó dùng que cây vi khuẩn, lấy 1 vòng que cấy

vi khuẩn từ hộp môi trường của các mẫu phân lập được Mỗi mẫu phân lập lặp lại như thế Đợi 30 giây cho khuẩn lạc vi khuẩn tan đều trong giọt KOH, dùng đầu que cấy vi khuẩn khẽ kéo giọt dịch lên, nếu vi khuẩn gram âm thì sẽ có dạng nhầy và có thể kéo lên cao 2 – 3 cm

2.4.2.3 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào vi khuẩn trên môi trường nhân tạo

+ Nghiên cứu đặc điểm hình thái khuẩn lạc: Cấy các mẫu phân lập vi khuẩn trên môi trường SPA, PPSA đặt trong điều kiện nhiệt độ thích hợp 280C Mỗi môi trường cấy 3 hộp pettri, mỗi hộp cấy 3 điểm

Chỉ tiêu theo dõi: Quan sát sự phát triển của khuẩn lạc, màu sắc, bề mặt khuẩn lạc, tốc độ phát triển của vi khuẩn sau 24, 48 và 72 giờ nuôi cấy

2.4.2.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của các mẫu phân lập vi khuẩn từ các cây ký chủ

- Thí nghiệm gồm 5 công thức, các công thức được thực hiện trên môi trường là SPA, PPSA (một công thức là 1 mẫu phân lập đại diện cho từng cây ký chủ: cà chua, khoai tây, ớt, cà pháo, lạc) mỗi công thức nhắc lại 3 lần , mỗi lần nhắc lại 3 hộp petri

Phương pháp tiến hành: Chuẩn bị các mẫu phân lập vi khuẩn phân lập từ cà chua, khoai tây, ớt, cà pháo, lạc và các hộp Petri chứa các môi trường SPA, PPSA Dùng que cấy vi khuẩn đã khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn, lấy một vòng que cấy vi khuẩn từ hộp môi trường của các mẫu phân lập cấy trên môi trường SPA và PPSA

Nuôi cấy trong điều kiện nhiệt độ 30- 32oC Theo dõi sự phát triển của khuẩn lạc (mm) vi khuẩn ở các yếu tố thí nghiệm sau 24, 48 và 72 giờ nuôi cấy

2.4.2.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của các mẫu phân lập vi khuẩn

Thí nghiệm gồm 5 công thức, các công thức được thực hiện trên môi trường

là SPA (một công thức là 1 mẫu phân lập vi khuẩn đại diện cho từng cây ký chủ:

cà chua, khoai tây, ớt, cà pháo, lạc) mỗi công thức nhắc lại 3 lần , mỗi lần nhắc lại 3 hộp pettri

Phương pháp tiến hành: Chuẩn bị các mẫu phân lập vi khuẩn phân lập từ cà chua, khoai tây, ớt, cà pháo, lạc và các hộp Petri chứa các môi trường SPA Dùng que cấy vi khuẩn đã khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn, lấy một vòng que cấy vi khuẩn từ hộp môi trường của các mẫu phân lập cấy trên môi trường SPA Nuôi cấy các mẫu phân lập vi khuẩn trên môi trường SPA Đặt ở các ngưỡng nhiệt độ

200C, 250C, 300C, 350C Mỗi ngưỡng nhiệt độ nhắc lại 3 lần Theo dõi sự phát triển của khuẩn lạc (mm) vi khuẩn ở các yếu tố thí nghiệm sau 24, 48 và 72 giờ nuôi cấy

2.4.2.6 Nghiên cứu một số đặc tính sinh hóa của vi khuẩn R solanacerum

* Phản ứng oxy hóa catalaza H 2 0 2

Mục đích: Kiểm tra khả năng hoạt động của enzym catalaza H202 của vi khuẩn Chuẩn bị dung dịch H2O2 nồng độ 3-10 %, nhỏ một giọt lên phiến kính Dùng đầu que cấy lấy một ít vi khuẩn mới hoạt hóa (24 giờ) trộn vào giọt H2O2 trên phiến kính Sau đó khuấy vi khuẩn và quan sát sau 1 – 2 giây, nếu có bọt khí màu trắng xuất hiện thì vi khuẩn có phản ứng dương, nếu không có bọt khí xuất hiện thì vi khuẩn không có phản ứng, âm tính

* Khả năng thủy phân tinh bột

Môi trường: Bổ sung tinh bột tan (0.2%) vào môi trường nước thịt pepton, khử trùng ở 1210C trong 20 phút rồi đổ ra hộp Petri

Lấy vi khuẩn mới hoạt hoá cấy vạch hay cấy chấm lên hộp thạch Sau 2-5 ngày nhỏ thuốc thử Lugol lên vết cấy để quan sát khả năng phân giải tinh bột Nếu thuốc thử Lugol không bắt màu quanh vết cấy tức là vi khuẩn có khả năng phân giải tinh bột

vi khuẩn mới hoạt hóa (18-24 giờ) Dùng panh vô khuẩn gắp giấy tẩm chi-acetat đưa vào từng ống nghiệm, dài đến nút bông nhưng không chạm vào môi trường Nuôi vi khuẩn ở nhiệt độ thích hợp, sau 3,7,14 ngày quan sát Nếu giấy biến đen

là phản ứng dương tính, nếu không đổi mầu thì là âm tính

* Khả năng phân giải gelatin

Môi trường: Pepton 5 g, Gelatin 100-150 ml, nước cất 1000 ml, pH = 7,2-7,4 Phân môi trường vào các ống nghiệm (4-5 ml), khử trùng ở 1150C trong

20 phút Cấy vi khuẩn mới hoạt hóa (18-24 giờ) chích sâu vào môi trường gelatin, giữ 2 ống không cấy làm đối chứng, nuôi ở 200C trong thời gian 2,7,10,14,30 ngày

Quan sát khả năng làm dịch hóa gelatin tại nhiệt độ phòng từ 200C trở xuống Nếu bề mặt môi trường gelatin không lõm xuống, gelatin vẫn ở trạng thái

ổn định là phản ứng âm tính (không sinh gelatinaza), nếu một phần hay toàn bộ gelatin hóa lỏng thì là phản ứng dương tính

2.4.2.7 Khảo sát hiệu lực của chế phẩm vi khuẩn đối kháng Bacillus subtilis với các mẫu phân lập vi khuẩn trên môi trường nhân tạo

Phương pháp tiến hành: chuẩn bị hộp Petri chứa môi trường SPA (pH = 7) với lượng 15ml môi trường/ hộp petri Hòa vi khuẩn thuần trong nước vô trùng thành dịch ở các nồng độ khác nhau (mật độ bào tử 106 , 107 và 108 cfu/ ml), dùng pipet hút 0,1ml dịch vi khuẩn trang đều lên bề mặt môi trường; dùng giấy lọc tròn (đã được hấp vô trùng ), đường kính 5mm nhúng vào dịch chế phẩm vi sinh vật đối kháng đã được pha ở các nồng độ khác nhau (tế bào vi khuẩn 106 ,

107 và 108 cfu/ ml), sau đó đặt vào các hộp môi trường Thí nghiệm được đặt trong tủ định ôn ở ngưỡng nhiệt độ 280C

Bố trí thí nghiệm: gồm 4 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại 3 hộp petri

CT1(đối chứng): Giấy lọc thấm nước vô trùng

CT2: Giấy lọc thấm chế phẩm VSV đối kháng B subtilis (106 cfu/ ml)

CT3: Giấy lọc thấm chế phẩm VSV đối kháng B subtilis (107 cfu/ ml)

CT4: Giấy lọc thấm chế phẩm VSV đối kháng B subtilis (108cfu/ ml) Chỉ tiêu theo dõi: đo đường kính vòng vô khuẩn trên môi trường SPA ở các công thức thí nghiệm sau nuôi cây 24, 48 và 72 giờ

2.4.2.8 Khảo sát hiệu lực của một số thuốc kháng sinh, thuốc hóa học với các mẫu phân lập vi khuẩn trên môi trường SPA

Hòa vi khuẩn thuần trong nước vô trùng thành dịch (108cfu /ml), dùng pipet hút 0,1ml dịch vi khuẩn trang đều lên bề mặt môi trường; dùng giấy lọc hình tròn (đã được hấp vô trùng), đường kính 5mm nhúng vào các dịch thuốc đã được pha

ở các nồng độ khác nhau, sau đó đặt vào các hộp môi trường Thí nghiệm được đặt trong tủ định ôn ở ngưỡng 280C

Bố trí thí nghiệm: gồm 4 công thức (Theo phương pháp của Kiraly và cs (1983); + Công thức 1: Giấy lọc thấm dịch thuốc Chloramphenicol (0.1%)

+ Công thức 2: Giấy lọc thấm dịch thuốc Strep gold 70WP (0,1%)

+ Công thức 3: Giấy lọc thấm dịch thuốc Nika Su 82SL (0,1 %)

+ Công thức 4 (Đối chứng): Giấy lọc thấm nước vô trùng

Thí nghiệm gồm 4 công thức Mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại 3 hộp petri

Chỉ tiêu theo dõi: Đo đường kính vòng vô khuẩn (mm) ở các công thức sau nuôi cây 24, 48 và 72 giờ

2.4.3 Phương pháp nghiên cứu bệnh héo xanh vi khuẩn trong nhà lưới

2.4.3.1 Phương pháp thử phản ứng siêu nhạy của các mẫu phân lập vi khuẩn R solanacearum

Thí nghiệm tiến hành với các mẫu vi khuẩn héo xanh đã phân lập thuần Mỗi mẫu vi khuẩn phân lập chuẩn bị 1 hộp môi trường mới cấy (48 giờ đổ lại và

cấy chuyển không quá 2 lần) Cho vào mỗi hộp môi trường có khuẩn lạc vi khuẩn 20ml nước cất vô trùng, dùng que cấy vi khuẩn khua tan đều khuẩn lạc vi khuẩn

và đổ vào cốc thủy tinh Mỗi mẫu phân lập để 1 cốc thủy tinh khác nhau

Chuẩn bị cây thuốc lá và xi lanh đã khử trùng để tiêm dịch vi khuẩn vào mô lá thuốc lá Mỗi mẫu phân lập vi khuẩn tiêm trên 3 lá thuốc lá, mỗi lá tiêm 10 điểm Chỉ tiêu theo dõi: theo dõi số mô lá chết hoại xuất hiện sau 3 ngày

2.4.3.2.Nghiên cứu phạm vi ký chủ của các mẫu phân lập vi khuẩn trên các

cây kí chủ khác nhau

Lây nhiễm nhân tạo bệnh HXVK hại cây trồng theo phương pháp sát thương rễ (Wang, 1998) và phương pháp tiêm nách lá (Leaf axil injection)

Bố trí thí nghiệm lây bệnh nhân tạo bằng phương pháp sát thương rễ như sau:

Tiến hành trồng cây vào các chậu có chứa đất phù sa (đất được hấp ở

1210C, 1,5 atm trong 45 phút), đến khi cây có 3 - 5 lá thật thì tiến hành lây bệnh

Từ nguồn vi khuẩn đã được phân lập, sử dụng để lây bệnh nhân tạo trên cây trồng Nguồn vi khuẩn được pha trong nước vô trùng với mật độ bào tử

108 cfu/ 1ml, tiến hành lây bệnh bằng phương pháp sát thương rễ (dùng dao sạch sát thương về một phía, cách gốc 1cm, sâu 2cm, rộng 3cm) Mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại 30 cây

Chỉ tiêu: Theo dõi số cây bị bệnh, tính tỷ lệ bệnh (%) sau 7, 14, 21, 28 ngày lây nhiễm

Bố trí thí nghiệm lây bệnh nhân tạo bằng phương pháp tiêm nách lá như sau:

Sau khi trồng cây 10 – 15 ngày, dùng kim tiêm vào nách lá thứ 3 kể từ trên xuống, với lượng là 0.1 – 0.2ml dịch vi khuẩn/cây Đặt cây chỗ râm mát, giữ ẩm vết lây Thí nghiệm gồm 4 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần nhắc lại 30 cây

Chỉ tiêu: Theo dõi số cây bị bệnh, tính tỷ lệ cây héo (%) sau 7, 14, 21,

28 ngày lây nhiễm

2.4.4 Phương pháp xử lý số liệu

Số liệu được xử lý thống kê sinh học theo phần mềm IRRISTART 4.0 (Biên soạn Phạm Tiến Dũng, 2003) và chương trình Excel Các giá trị trung bình của các nghiệm thức được so sánh bằng F, t, LSD, Dulcan ở mức xác suất P = 0,95 (α = 0,05) Các giá trị a, b, c… được ghi các giá trị trung bình có ký hiệu chữ giống nhau thì có giá trị giống nhau về trắc nghiệm Duncan

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1 Điều tra thực trạng bệnh héo xanh vi khuẩn gây hại một số cây trồng cạn vùng Hà Nội và phụ cận vụ thu đông 2014 và xuân hè 2015

Loài R solanacearum gây bệnh héo xanh có phạm vi ký chủ trên các cây

trồng cạn: cà chua, khoai tây, lạc, thuốc lá, cây cà, vừng, ớt và cây đay (Lê Lương Tề (1997) Trong thực tiễn sản xuất, bệnh HXVK đã phát sinh, phát triển gây hại tương đối nặng trên các cây trồng như: cà chua, lạc, khoai tây, cà pháo,

cà bát Bệnh HXVK làm cho những cây trồng này bị chết xanh, mất khoảng, giảm năng suất nghiêm trọng, gây ảnh hưởng không ít tới thu nhập của người nông dân Tuy nhiên, những nghiên cứu về bệnh HXVK chưa nhiều nên việc phòng trừ gặp nhiều khó khăn và chưa đạt hiệu quả như mong muốn

Nhiều kết quả nghiên cứu trong và ngoài nước chỉ ra rằng, bệnh HXVK là bệnh hại quan trọng và khó phòng trừ bằng các biện pháp riêng rẽ, kể cả việc dùng biện pháp hóa học nhằm làm giảm thiệt hại do bệnh gây ra Để góp phần tìm hiểu về tình hình bệnh HXVK hại một số cây trồng cạn, chúng tôi tiến hành điều tra tình hình bệnh HXVK hại một số cây trồng chính ở vùng Hà Nội và phụ cận vụ thu đông 2014 và xuân hè 2015

3.1.1 Đi ều tra bệnh héo xanh vi khuẩn hại cà chua vùng Hà Nội và phụ cận

vụ thu đông 2014

Cây cà chua (Lycopersicon esculentum Mill) có nguồn gốc tại Peru và

được đưa đến châu Âu vào thế kỷ 16 Đến nay cây cà chua là loại rau phổ biến ở nhiều nước Cà chua là loại rau ăn quả cao cấp, cung cấp cho cơ thể hàng ngày lượng Vitamin, khoáng chất và các dưỡng chất quan trọng khác Theo số liệu của Fao (2001), diện tích trồng cà chua trên thế giới trung bình khoảng 3,7 triệu ha/năm, sản lượng khoảng 100 triệu tấn

Những năm gần đây, việc nghiên cứu áp dụng tiến bộ khoa học kỹ thuật trong việc trồng cà chua ngày càng nhiều Vì thế, diện tích và sản lượng cà chua