Một số đặc điểm dịch tễ của hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (prrs) trên địa bàn huyện sơn động bắc giang từ 2010 2014

Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học phân tử của các chủng virus PRRS gây bệnh cho đàn lợn trên địa bàn huyện Sơn Động.. Một số đặc điểm sinh học phân tử của các chủng virus PRRS gây bệnh

MỤC LỤC

Trang

Lời cam đoan ii

Lời cảm ơn iii

Mục lục iv

Danh sách các chữ viết tắt vii

Danh mục các bảng viii

Danh mục các hình ix

MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu của đề tài 2

1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome – PRRS) 3

1.1.1 Khái quát về lịch sử Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn trên thế giới 3

1.1.2 Khái quát về lịch sử Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn tại Việt Nam 5

1.2 Tình hình nghiên cứu PRRS trên thế giới và trong nước 8

1.2.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 8

1.2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 8

1.3 Căn bệnh 9

1.3.1 Hình thái cấu trúc của virus PRRS 10

1.3.2 Đặc tính sinh học của virus 13

1.3.3 Sức đề kháng của virus PRRS 13

1.3.4 Những virus liên quan 14

1.3.5 Những vi khuẩn kế phát 14

1.4 Dịch tễ học của bệnh 15

1.4.1 Động vật cảm nhiễm 15

1.4.2 Động vật môi giới mang và truyền virus PRRS 15

1.4.3 Chất chứa mầm bệnh 16

1.4.4 Đường truyền lây 17

1.4.5 Điều kiện lây lan 18

1.5 Cơ chế sinh bệnh 18

1.6 Triệu chứng, bệnh tích 20

1.6.1 Triệu chứng 20

1.6.2 Bệnh tích 22

1.7 Các phương pháp chẩn đoán PRRS 23

1.7.1 Chẩn đoán lâm sàng 23

1.7.2 Chẩn đoán bằng phương pháp giải phẫu bệnh 24

1.7.3 Chẩn đoán bằng phương pháp huyết thanh học 24

1.7.4 Kỹ thuật RT – PCR (Reverse transcriptase polymerase chain reaction) 25

1.8 Phòng và điều trị bệnh 26

1.8.1 Phòng bệnh 26

1.8.2 Điều trị bệnh 27

Chương 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

2.1 Đối tượng nghiên cứu 28

2.2 Địa điểm nghiên cứu 28

2.3 Nội dung nghiên cứu 28

2.3.1 Một số đặc điểm dịch tễ học của dịch PRRS trên địa bàn huyện Sơn Động từ năm 2010 đến 2014 28

2.3.2 Xác định một số yếu tố nguy cơ làm phát tán lây lan, ảnh hưởng đến tình hình dịch PRRS trên địa bàn huyện Sơn Động 28

2.3.3 Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học phân tử của các chủng virus PRRS gây bệnh cho đàn lợn trên địa bàn huyện Sơn Động 28

2.4 Nguyên liệu nghiên cứu 28

2.4.1 Dịch tễ 28

2.4.2 Mẫu bệnh phẩm 28

2.4.3 Sinh phẩm, hóa chất dùng cho tách chiết RNA 29

2.4.4 Cặp mồi (primer) và kit PCR 29

2.5 Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm 29

2.5.1 Dụng cụ 29

2.5.2 Trang thiết bị 29

2.6 Phương pháp nghiên cứu 30

2.6.1 Phương pháp điều tra thu thập thông tin bệnh và mẫu bệnh phẩm 30

2.6.2 Các phương pháp tính tỷ lệ và hệ số trong dịch tễ học 30

2.6.3 Phương pháp RT-PCR (Reverse transcriptase polymerase chain reaction) 32

2.6.4 Phương pháp giải trình tự gen 34

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35

3.1 Một số đặc điểm dịch tễ học của dịch PRRS trên địa bàn huyện Sơn Động từ năm 2010 đến 2014 35

3.1.1 Khái quát về điều kiện tự nhiên – xã hội của huyện Sơn Động 35

3.1.2 Tình hình chăn nuôi lợn tại huyện Sơn Động 36

3.1.3 Tình hình dịch PRRS trên đàn lợn ở Sơn Động từ 2010 - 2014 37

3.1.4 Tổng hợp về tình hình dịch PRRS của các năm 2010 – 2014 tại huyện Sơn Động 45

3.1.5 Kết quả tổng hợp về triệu chứng lâm sàng và bệnh tích của lợn mắc bệnh Tai xanh trên địa bàn huyện Sơn Động 51

3.2 Xác định một số yếu tố nguy cơ làm phát tán lây lan, ảnh hưởng đến tình hình dịch PRRS trên địa bàn huyện Sơn Động 54

3.2.1 Yếu tố nguy cơ về vị trí chuồng trại chăn nuôi 55

3.2.2 Yếu tố nguy cơ không tiêm phòng vắc xin phòng PRRS 58

3.2.3 Yếu tố nguy cơ về nguồn cung cấp lợn giống 59

3.2.4 Yếu tố vệ sinh, tiêu độc, khử trùng môi trường chăn nuôi 61

3.3 Một số đặc điểm sinh học phân tử của các chủng virus PRRS gây bệnh cho đàn lợn trên địa bàn huyện Sơn Động 62

3.3.1 Kết quả RT- PCR chẩn đoán PRRS 62

3.3.2 Giải trình tự gene 64

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 67

Kết luận 67

Đề nghị 68

TÀI LIỆU THAM KHẢO 69

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

bp Base pair (Cặp bazơ)

cDNA Complement Deoxynucleotide Acid

CMI Cell mediated immunity (Miễn dịch trung gian tế bào) ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay

NSP Nonstructural Protein (Protein phi cấu trúc)

ORF Open Reading Frame (Khung đọc mở)

PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng trùng hợp chuỗi gen) PRRS Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome

PRRSV Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus

RT-PCR Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction

(Phản ứng PCR ngược)

TCID50 50% Tissue Culture Infectious Dose

VNT Phản ứng trung hòa virus trên môi trường tế bào một lớp

Động 41 3.3 Tổng hợp tình hình dịch PRRS ở lợn trong năm 2013 tại huyện

Sơn Động 43 3.4 Tổng hợp tình hình dịch PRRS ở lợn trong năm 2014 tại huyện

Sơn Động (từ 29/5/2014 – 25/7/2014) 45 3.5 Tổng hợp về phạm vi dịch, mức độ dịch PRRS các năm từ 2010 –

2014 46 3.6 Tổng hợp về tỷ lệ mắc, tỷ lệ chết của từng loại lợn mắc PRRS qua

các năm 2010 – 2014 48 3.7 Đặc điểm thời gian và độ dài của các đợt dịch PRRS 50 3.8 Một số biểu hiện lâm sàng ở lợn mắc PRRS trên địa bàn huyện Sơn

Động 52 3.9 Kết quả nghiên cứu một số bệnh tích ở lợn mắc PRRS trên địa bàn

huyện Sơn Động 53 3.10 Kết quả phân tích nguy cơ từ đường giao thông chính 56 3.11 Kết quả phân tích nguy cơ từ sông, ngòi đến dịch bệnh PRRS 57 3.12 Kết quả phân tích nguy cơ từ việc không tiêm phòng vắc xin đến

dịch bệnh PRRS 58 3.13 Kết quả phân tích nguy cơ nguồn cung cấp giống 60 3.14 Kết quả phân tích yếu tố nguy cơ không vệ sinh, tiêu độc, khử

trùng môi trường chăn nuôi 62 3.15 Thông tin về mẫu huyết thanh của lợn bị bệnh PRRS tại các địa

phương trên địa bàn huyện Sơn Động 63 3.16 Tỷ lệ tương đồng (%) về trình tự nucleotide của 5 chủng virus PRRS

trong nghiên cứu với nhau và với các chủng virus PRRS tham chiếu 66

DANH MỤC CÁC HÌNH

Số hình Tên hình Trang

1.1 Bản đồ lịch sử xuất hiện PRRS trên thế giới 4

1.2 Hình thái Virus PRRS 11

1.3 Hình ảnh cấu trúc hệ gen của virus PRRS 11

1.4 Các phương thức truyền lây virus PRRS 17

1.5 Virus PRRS xâm nhập và phá hủy tế bào đại thực bào 19

1.6 Mô hình nguyên lý của phản ứng RT-PCR 25

3.1 Biểu đồ so sánh phạm vi dịch PRRS các năm từ 2010 – 2014 46

3.2 Biểu đồ so sánh mức độ dịch PRRS các năm từ 2010 - 2014 46

3.3 Biểu đồ so sánh tỷ lệ lợn mắc PRRS ở từng lứa tuổi qua các năm 49

3.4 Biểu đồ so sánh tỷ lệ lợn chết do PRRS ở từng lứa tuổi qua các năm 49

3.5 Kết quả chẩn đoán virus PRRS bằng phản ứng RT-PCR 63

3.6 Mối quan hệ di truyền giữa các chủng virus PRRS với nhau và với các chủng virus PRRS tham chiếu khác Những chủng virus PRRS sử dụng trong nghiên cứu này được đánh dấu hình tròn (●) 65

MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Trong những năm gần đây, ngành chăn nuôi đang phát triển mạnh mẽ và giữ một vị trí quan trọng trong nền kinh tế nước ta, đặc biệt là chăn nuôi lợn Do nhu cầu xã hội phát triển nên số lượng lợn được nuôi ngày càng tăng cao Chăn nuôi lợn thực sự trở thành nguồn thu nhập quan trọng đối với các hộ nông dân và

là một trong những nghề góp phần chuyển dịch cơ cấu trong nông nghiệp

Cùng với sự phát triển của chăn nuôi, sự gia tăng sản lượng động vật, thì ngành chăn nuôi cũng phải đối mặt với không ít khó khăn, đặc biệt là những bệnh ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng sinh sản, tăng trưởng của vật nuôi Và một trong số những bệnh gây thiệt hại rất lớn cho người chăn nuôi lợn trong những năm gần đây là Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp (Porcine reproductive and respiratory syndrome - PRRS)

Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp, hay bệnh Tai xanh là bệnh truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm xảy ra ở lợn mọi lứa tuổi Lợn nái thường truyền mầm bệnh cho bào thai, gây sảy thai, thai chết lưu, lây sang lợn con theo mẹ làm lợn yếu ớt, tiêu chảy, rối loạn hô hấp, tỷ lệ chết cao Lợn sau cai sữa, lợn thịt viêm phổi nặng, đực giống mất tính dục, chất lượng tinh kém Bệnh lây lan nhanh và

có thể bội nhiễm với nhiều loại mầm bệnh khác như: Dịch tả, Phó thương hàn,

Tụ huyết trùng, Liên cầu khuẩn, Suyễn, làm ốm chết nhiều lợn

Do tính chất nghiêm trọng và khả năng lây lan rộng của bệnh, việc chẩn đoán và phát hiện bệnh sớm là rất quan trọng Trong những năm gần đây, kỹ thuật sinh học phân tử đã phát triển một cách mạnh mẽ và chứng minh được vai trò ưu việt, trong đó kỹ thuật PCR ngày càng được ứng dụng rộng rãi hơn Đây là một kỹ thuật có độ chính xác cao, ít tiêu tốn thời gian và về mặt chi phí có thể chấp nhận được

Sơn Động là một huyện miền núi thuộc tỉnh Bắc Giang, tập quán chăn nuôi lợn của người dân còn theo hình thức nhỏ lẻ, quy mô hộ gia đình Do địa bàn là huyện miền núi nên việc tiếp cận với những tiến bộ khoa học kỹ thuật và phòng

bệnh cho vật nuôi gặp nhiều hạn chế Những năm gần đây, dịch lợn Tai xanh thường xảy ra trên địa bàn huyện gây những thiệt hại lớn cho người chăn nuôi

Xuất phát từ tình hình thực tế nêu trên, để góp phần trong công tác chẩn đoán bệnh nhanh, chính xác, phù hợp với tình hình thực tế nhằm đánh giá được một số đặc điểm dịch tễ học của hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS) trên địa bàn huyện Sơn Động tỉnh Bắc Giang và nâng cao hiểu biết về bệnh cho người

chăn nuôi và cán bộ thú y cơ sở chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Một số đặc điểm dịch tễ của Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS) trên địa bàn huyện Sơn Động - Bắc Giang từ 2010 – 2014”

1.2 Mục tiêu của đề tài

- Làm rõ tình hình dịch bệnh và đặc điểm dịch tễ của Hội chứng rối loạn

sinh sản và hô hấp ở lợn trên địa bàn huyện Sơn Động - tỉnh Bắc Giang

- Xác định được đặc điểm sinh học phân tử của các chủng virus PRRS gây bệnh trên địa bàn huyện Sơn Động – Bắc Giang

1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

- Kết quả của đề tài sẽ cung cấp các thông tin về dịch tễ học của dịch PRRS nhằm tạo cơ sở khoa học cho việc chẩn đoán, phòng và chống dịch bệnh

có hiệu quả

- Tạo cơ sở để giúp các nhà quản lý, hộ chăn nuôi đưa ra các biện pháp tái đàn nhanh chóng và bền vững sau khi dịch xảy ra, giúp nâng cao hiệu quả trong chăn nuôi

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome – PRRS)

Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm của lợn mọi nòi giống, mọi lứa tuổi (lợn nái, lợn con theo mẹ, lợn con sau cai sữa, lợn choai, lợn thịt và lợn đực giống) Triệu chứng lâm sàng đặc trưng ở cơ quan hô hấp và sinh sản Lợn nái chửa bị bệnh, dấu hiệu rõ nhất là sảy thai, đẻ non, thai chết lưu, lợn sinh ra chết yểu, chậm động dục trở lại sau cai sữa (Đào Trọng

Đạt, 2008) Tỷ lệ bị bệnh, tỷ lệ chết cao hay thấp phụ thuộc vào lứa tuổi mắc, sức

đề kháng của con vật và điều kiện chăm sóc nuôi dưỡng Bệnh có tốc độ lây lan nhanh Lợn bị bệnh thường kế phát các bệnh Dịch tả lợn, Phó thương hàn lợn, Tụ huyết trùng lợn, bệnh do E.coli, Streptococcus suis, suyễn lợn

1.1.1 Khái quát v ề lịch sử Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn trên thế

gi ới

Vào cuối những năm 80, những báo cáo về một bệnh còn chưa biết nguyên nhân đã bắt đầu ở Mỹ và khởi đầu chỉ nói đến triệu chứng lâm sàng của bệnh (Keffaber, 1989) Lúc đó, những nhà thú y và người nghiên cứu cho rằng hội chứng này khác thường vì tính trầm trọng, kéo dài, kết hợp triệu chứng rối loạn sinh sản, hô hấp và không biết được những trường hợp ở thể ẩn tính Rất nhanh chóng, năm 1988 bệnh lan sang Canada và vào tháng 11 năm 1990, một hội chứng tương tự đã được báo cáo ở Munster - Đức Sau đó, những thông tin về bệnh này ở Châu Âu bắt đầu tăng lên nhanh chóng (OIE, 2005): ở Hà Lan, Tây Ban Nha, Bỉ, Anh năm 1991 và 1992 ở Pháp Năm 1998, bệnh được phát hiện ở Châu Á như Hàn Quốc, Nhật Bản

Lúc đầu do căn nguyên chưa được biết nên hội chứng được đặt tên là

“bệnh thần bí ở lợn” (Mistery swine Disease - MSD) Về sau, bệnh lan trên toàn thế giới và được gọi bằng nhiều tên khác nhau: Hội chứng hô hấp và vô sinh của lợn (Swine infertility and respiratory disease – SIRS) Bệnh thần bí của lợn được dùng nhiều ở Mỹ Ở Châu Âu phổ biến dùng tên: “Hội chứng hô hấp và sảy thai

ở lợn (Porcine Endemic abortion and Respiratory syndrome – PEARS); “Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn” (Porcine respiratory and reproductive syndrome - PRRS) và “Bệnh Tai xanh của lợn” (Blue Ear disease – BED)

Đến năm 1992, tại Hội nghị Quốc tế về hội chứng này tổ chức tại Minesota (Mỹ), tổ chức Thú y thế giới (OIE) đã thống nhất tên gọi là Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp (Porcine reproductive and respiratory syndrome - PRRS) Kể từ đó cho đến nay, tên này đã trở thành tên gọi chính thức của bệnh (William T.Christianson, 2001)

Hình 1.1 Bản đồ lịch sử xuất hiện PRRS trên thế giới

Nguồn: http://www.sanidadanimal.info/cursos/curso/9/epidemi.htm

Từ năm 2005 trở lại đây, 27 nước và vùng lãnh thổ thuộc tất cả các châu lục (trừ châu Đại Dương) trên thế giới đã báo cáo cho Tổ chức thú y thế giới khẳng định phát hiện có dịch PRRS (Cục thú y, 2008)

Trong số các nước nêu trên có cả các nước có ngành chăn nuôi phát triển mạnh như Mỹ, Hà Lan, Đan Mạch, Anh, Pháp, Đức…Tổn thất do PRRS gây ra tại các nước này lên đến hàng trăm triệu đô la Ở Mỹ người ta đánh giá thiệt hại kinh tế cuả PRRS trong những năm gần đây là lớn nhất so với thiệt hại do các bệnh khác gây ra ở lợn, khoảng 560 triệu đô la mỗi năm bao gồm chi phí tiêu huỷ lợn chết và lợn ốm, chi phí chống dịch và xử lý môi trường (Neumanm and Kliebenstein, 2006)

Tháng 9/2007, Nga báo cáo chính thức có dịch bệnh tai xanh do chủng virus PRRS thể độc lực cao gây ra (Tô Long Thành, 2007)

Các nước trong khu vực Châu Á cũng có tỷ lệ PRRS lưu hành rất cao, ví

dụ ở Trung Quốc là 80%, Đài Loan 94,7-96,4%, Philippine 90%, Thái Lan 97%, Malaysia 94%, Hàn Quốc là 67,4-73,1% Có thể khẳng định rằng PRRS là nguyên nhân gây tổn thất kinh tế cho ngành chăn nuôi lợn ở nhiều quốc gia trên thế giới (Nguyễn Bá Hiên và Huỳnh Thị Mỹ Lệ, 2007)

Ở Trung Quốc, PRRS đã liên tục xảy ra, trong vòng hơn 3 tháng của năm

2006, chủng PRRS virus độc lực cao đã gây ra đại dịch lây lan ở hơn 10 tỉnh phía Nam và làm hơn 2 triệu con lợn ốm, trong đó có khoảng hơn 400.000 con đã chết Đến tháng 7 năm 2007, dịch bệnh đã xảy ra ở 25 tỉnh với hơn 180.000 lợn mắc bệnh và 45.000 con đã bị chết Điều đáng chú ý là virus gây ra đại dịch PRRS vào năm 2006 ở Trung Quốc đã cho thấy những thay đổi, tăng tính cường độc so với các chủng virus PRRS cổ điển được phân lập tại nước này từ năm

1996-2006 (Gao et al., 2004) Kết quả nghiên cứu toàn diện của Trung Quốc đã

khẳng định chủng virus PRRS gây bệnh tại nước này là chủng độc lực cao, đặc biệt có sự biến đổi của virus (thiếu hụt 30 acid amin trong gen)

1.1.2 Khái quát v ề lịch sử Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn tại Việt Nam

Ở Việt Nam, theo thông báo của Cục Thú y (2007) các kết quả điều tra huyết thanh học tại một số trại lợn giống của các tỉnh phía Nam đã phát hiện có

sự lưu hành của PRRS virus chủng cổ điển, độc lực thấp PRRS đã xuất hiện và lưu hành tại nước ta từ năm 1997 Tuy nhiên sự bùng phát thành dịch và gây tổn thất đáng báo động cho ngành chăn nuôi lợn thực sự mới bắt đầu từ tháng 3 năm

2007 Dịch tai xanh đã xảy ra thành nhiều đợt tại 3 miền Bắc, Trung, Nam và gây thiệt hại đáng kể cho chăn nuôi lợn, đặc biệt là ảnh hưởng đến sự phát triển đàn giống

Theo Nguyễn Ngọc Tiến (2011) diễn biến tình hình dịch bệnh qua các năm 2007, 2008, 2009 và 2010 như sau:

* Năm 2007

Đợt 1: Dịch PRRS bùng phát tại Hải Dương ngày 12/03/2007 Do việc

buôn bán, vận chuyển lợn ốm không được kiểm soát nên dịch đã lây lan nhanh và phát triển mạnh tại 164 xã, phường của 25 huyện, quận thuộc 7 tỉnh: Hải Dương, Hưng Yên, Quảng Ninh, Thái Bình, Bắc Ninh, Bắc Giang và Hải Phòng Số lợn mắc bệnh là 31.750, trong đó số chết và tiêu huỷ là 7.296 con

Đợt 2: Ngày 25/06/2007, dịch xuất hiện tại Quảng Nam và lan ra các tỉnh

Miền Trung, ngày 13/07/2007 dịch xuất hiện tại các tỉnh phía Nam Trong đợt này dịch xuất hiện tại 178 xã, phường của 40 huyện, quận thuộc 14 tỉnh, thành phố gồm Quảng Nam, TT-Huế, Đà Nẵng, Quảng Ngãi, Bình định, Quảng Trị, Long An, Bà Rịa-Vũng Tàu, Khánh Hòa, Cà Mau, Lạng Sơn, Hà Nội, Thái Bình

và Hải Dương Số lượn mắc bệnh là 38.827 con, trong đó số chết và tiêu hủy là 13.070 con

* Năm 2008

Dịch PRRS xảy ra thành hai đợt chính tại 956 xã, phường thuộc 103 huyện của 26 tỉnh, thành phố Tổng số lợn mắc bệnh là 309.586 con, trong đó xố lợn chết và buộc phải tiêu huỷ là 300.906 con

Đợt 1: Dịch tái phát ngày 23/08/2007 tại một số tỉnh miền Trung như:

Thanh Hoá, Nghệ An, Hà Tĩnh, sau đó dịch lây lan và xuất hiện ở 825 xã, phường của 61 huyện, quận của 10 tỉnh gồm Thái Nguyên, Thái Bình, Nam Định, Ninh Bình, Thanh Hoá, Nghệ An, Hà Tĩnh, TT-Huế, Quảng Nam, Lâm Đồng làm chết 271.654 con lợn mắc bệnh, trong đó đã tiêu huỷ 270.608 con Những tỉnh bị ảnh hưởng nặng là Thanh Hoá, Hà Tĩnh, TT-Huế, Nghệ An và Thái Bình

Đợt 2: Dịch xuất hiện tại 131 xã, phường của 42 huyện, quận thuộc 19

tỉnh, thành phố: Bà Rịa-Vũng Tàu, Bạc Liêu, Bến Tre, Bình Định, Cà Mau, Gia Lai, Hà Nam, Hải Dương, Lào Cai, Phú Thọ, Phú Yên, Quảng Nam, Quảng Ninh, Quảng Trị, Sóc Trăng, Tây Ninh, Thừa Thiên-Huế, Trà Vinh, Vĩnh Long Tổng số gia súc mắc bệnh là 37.932 con, trong đó số con chết và tiêu huỷ là

30.298 con Dịch xuất hiện rải rác khắp 3 miền, trong đó tỉnh bị ảnh hưởng nặng

nề là Quảng Trị, Thừa Thiên-Huế, Bà Rịa-Vũng Tàu

* Năm 2009

Dịch PRRS xảy ra tại 69 xã thuộc 26 huyện của 13 tỉnh, thành phố là Bà Rịa-Vũng Tàu, Bạc Liêu, Bến Tre, Bắc Giang, Bình Dương, Đắc Lắc, Đồng Nai, Gia Lai, Hưng Yên, Quảng Ninh, Quảng Nam, Tiền Giang và Vĩnh Long với 7.030 lợn mắc bệnh và 5.847 lợn buộc phải tiêu huỷ

* Năm 2010

Trong năm 2010 dịch PRRS có nhiều diễn biến phức tạp, dịch xảy ra trên diện rộng từ miền Bắc - Trung - Nam dịch xảy ra hai đợt dịch lớn:

Đợt 1/2010 (miền Bắc): Dịch PRRS xảy ra từ ngày 23/3/2010 tại Hải

Dương Tính đến hết tháng 6/2010, toàn quốc ghi nhận các ổ dịch tai xanh tại

461 xã, phường, thị trấn của 71 quận, huyện thuộc 16 tỉnh, thành phố Tổng số lợn mắc bệnh là 146.051 con trong đó số tiêu hủy là 65.911 con

Đợt 2/2010 (miền Trung và miền Nam): Đợt dịch này bắt đầu từ ngày

11/6/2010 tại Sóc Trăng Sau đó dịch xuất hiện tại Tiền Giang (ngày 19/6), Bình Dương (ngày 27/6), Long An (ngày 15/7), Lào Cai (11/7), Quảng Trị (01/7) Trong đợt dịch này, toàn quốc ghi nhận các ổ dịch tai xanh tại 42.080 hộ chăn nuôi của 1.517 xã, phường, thị trấn thuộc 215 quận, huyện của 36 tỉnh, thành phố Tổng số lợn trong đàn mắc bệnh là 970.857 con, số mắc bệnh là 717.830 con, trong đó số chết, tiêu hủy là 413.540 con

Năm 2012, dịch xảy ra tại 353 xã, phường của 74 quận, huyện thuộc 23 tỉnh, thành phố, với số lợn mắc bệnh trên 77 ngàn con, số lợn chết và buộc phải tiêu hủy gần 45 ngàn con (NongNghiep.vn)

Năm 2013 Dịch Tai xanh ở lợn đã xảy ra tại 168 xã, phường của 46 huyện, quận thuộc 13 tỉnh; tổng số lợn mắc bệnh 38.532 con; số lợn tiêu hủy là 18.452 con So với năm 2012, số tỉnh có dịch giảm 43,5%; số huyện có dịch giảm gần 40%; số xã có dịch giảm 42,4%; số gia súc mắc bệnh, chết và phải tiêu hủy giảm 42,6% (Cục Thú y, 2013)

Từ tháng 7 năm 2013, dịch tai xanh trên lợn đã được khống chế

1.2 Tình hình nghiên cứu PRRS trên thế giới và trong nước

1.2.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Tác giả Nelson EA et al (1993) trên cơ sở phân tích cấu trúc gen của các

chủng PRRSV phân lập từ các vùng địa lý khác nhau đã xác định được 2 nhóm genotype là:

- Nhóm I: Gồm những virus thuộc dòng Châu Âu, đại diện bởi virus Lelystad

- Nhóm II: Gồm những virus thuộc dòng Bắc Mỹ, đại diện bởi virus VR - 2332

Meng XJ et al (1995); Kapur V et al (1996), bằng kết quả phân tích trình

tự nucleotid và axit amin của virus VR-2332 và virus Lelystad cho rằng các virus này đang tiến hoá do đột biến ngẫu nhiên và do tái tổ hợp trong gen

Theo kết quả nghiên cứu của Thanawongnuwech R et al (1998) cho biết

thời gian nhiễm trùng huyết, tốc độ bài thải và tái sản trong đại thực bào của PRRSV ở lợn 4 đến 8 tuần tuổi dài hơn so với lợn 16 đến 24 tuần tuổi

Theo Wills RW et al (1997) khi bị nhiễm PRRSV sẽ làm tăng tính mẫn cảm của lợn đối với Streptococcus suis serotyp 2, và làm trầm trọng thêm tình trạng bệnh do Salmonella choleraesuis trong cơ thể lợn khi có kế phát

1.2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Trần Thị Bích Liên và Trần Thị Dân (2003) bằng kỹ thuật ELISA, khảo sát 1.082 mẫu huyết thanh của lợn thu nhận từ 21 trại nuôi công nghiệp và hộ chăn nuôi của các tỉnh thành thuộc miền Đông Nam Bộ cho thấy:

- 85,71% số cơ sở chăn nuôi phát hiện có lợn nhiễm PRRSV và 36,78%

số mẫu huyết thanh dương tính

- Lợn hậu bị và lợn thịt lúc giết mổ có tỉ lệ nhiễm cao nhất: 51,24% và 49,25%

- Khu vực chăn nuôi tập trung có tỷ lệ nhiễm (56,72%) cao hơn so với khu vực chăn nuôi gia đình (29,98%)

- Trong 130 mẫu huyết thanh dương tính có 59,23% số mẫu nhiễm chủng Bắc Mỹ, 36,92% số mẫu nhiễm cả hai chủng Bắc Mỹ và Châu Âu, chỉ có 3,8%

số mẫu nhiễm chủng Châu Âu

Nguyễn Lương Hiền và cs (2001) điều tra tình hình Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở đàn lợn nuôi trên địa bàn Thành phố Hồ Chí Minh và các tỉnh lân cận cho thấy trong số 2.036 mẫu huyết thanh của lợn được kiểm tra có 596 mẫu huyết thanh có kháng kháng thể PRRSV, chiếm tỷ lệ 29,27%; 5 trong số 15 trại lợn được lấy mẫu xét nghiệm có lợn bị nhiễm PRRSV, chiếm tỷ lệ 33%

Tại Cần Thơ, kết quả xét nghiệm của La Tấn Cường (2005) cho biết tỷ lệ nhiễm PRRSV của đàn lợn nuôi trên địa bàn là 66,86%

Điều tra huyết thanh học của Kamakawa và Hồ Thị Việt Thu từ 1999

- 2003 cho thấy tỷ lệ nhiễm PRRSV của đàn lợn trên địa bàn tỉnh Cần Thơ

là 7,7%

Thông báo của Cục thú y (2007): Các kết quả điều tra huyết thanh học tại một số trại lợn giống của các tỉnh phía Nam đã phát hiện có sự lưu hành của PRRSV chủng cổ điển, độc lực thấp, gây bệnh với mức độ nhất định

Kết quả khảo sát bước đầu của Lê Văn Năm (2007) về tình hình Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn trong đợt dịch 2007 tại một số xã thuộc vùng đồng bằng Bắc Bộ: Tỷ lệ lợn ốm, đối với lợn nái nuôi con là 74,86%; nái hậu bị và nái chửa là 74,07%; lợn con theo mẹ là 89,10%; lợn choai là 80,07%; lợn đực giống là 47,57%

Lợn con bị bệnh, tỷ lệ bị tiêu chảy khá cao (83,25%); lợn ốm bị táo bón 50,50%; lợn con bị lạc giọng 60,50%

1.3 Căn bệnh

Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn do virus thuộc giống Arterivirus, họ Arteriviridae, bộ Nidovirales có cấu trúc vỏ bọc dạng chuỗi đơn ARN Dựa vào phân tích cấu trúc gen người ta đã xác định được hai nhóm virus

Nhóm I gồm các virus thuộc chủng Châu Âu (tên gọi phổ thông là virus Lelystad) gồm nhiều phân nhóm đã được xác định Nhóm virus này được Wensvoort và cộng sự - Viện thú y Trung ương – Lelystad – Hà Lan phân lập được bằng tế bào đại thực bào phế nang của lợn và được đặt tên là virus Lelystad – LV

Nhóm II gồm các virus thuộc dòng Bắc Mỹ (với tên gọi là VR – 2332)

Nhóm này được Collins và cộng sự - Mỹ phân lập được vào năm 1992

Về mặt di truyền và tính kháng nguyên, hai nhóm virus này hoàn toàn khác nhau Sự khác nhau về cấu trúc chuỗi nucleotide của virus thuộc hai chủng

là khoảng 40% (Han J and Y.Wang, 2006), do đó ảnh hưởng đến đáp ứng miễn dịch bảo hộ chéo giữa 2 chủng Tại thực địa, sự đa dạng cả về đặc tính di truyền

và đặc tính kháng nguyên của các chủng virus PRRS là nguyên nhân dẫn đến việc sử dụng vacxin không hiệu quả và đôi khi xảy ra những ổ dịch PRRS lớn

Qua nghiên cứu giải mã gen của virus tại Mỹ và Trung Quốc cho thấy: các mẫu virus gây ra các ổ dịch PRRS tại việt Nam có mức độ tương đồng về amino acid từ 99 - 99,7% so với chủng virus PRRS gây bệnh thể độc lực cao ở Trung Quốc và đều mất 30 acid amin Kết quả này cũng hoàn toàn giống với kết quả công cường độc của Trung tâm chẩn đoán Thú y TW Tất cả đều thống nhất chủng virus gây ra các ổ dịch PRRS ở Việt Nam hiện nay thuộc dòng Bắc Mỹ, chủng này có sự tương đồng về kháng nguyên với chủng có độc lực cao gây bệnh tại Trung Quốc (Cục thú y, 2008)

Theo kết quả khảo sát của Nguyễn Ngọc Hải và Võ Khánh Hưng (2012): chủng virus gây Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn tại Việt Nam chiếm

đa số là chủng Trung Quốc (65%), kế đến là dòng NA (32%) và ít nhất là chủng

EU (1,3%)

1.3.1 Hình thái c ấu trúc của virus PRRS

Hạt virus có đường kính 50–70 nm, chứa nucleocapsid cùng kích thước có cấu trúc đối xứng 20 mặt, đường kính 35 nm, được bao bọc bên ngoài bởi một lớp vỏ bọc dính chặt với cấu trúc bề mặt giống như tổ ong Bộ gen bao gồm 1 phân tử dạng chuỗi đơn dương ARN kích thước từ 13 - 15 kb Sợi ARN virus có

1 cổng 5’ và 1 dải cổng đầu 3’ Gen ARN polymeraza chiếm khoảng 75% đầu 5’ của bộ gen, gen mã hoá cho các protein cấu trúc của virus nằm ở đầu 3’ (Nguyễn

Bá Hiên, 2007)

Hình 1.2 Hình thái Virus PRRS

swine/

Nguồn:http://www.apcfilters.com/custom-manufacturing-antimicrobial-filter-Genome virus PRRS có kích thước khoảng 15 kilobase và bao gồm 9 khung

đọc mở (ORF) (Meulenberg et al., 1993), trong đó ORF1a và ORF1b chiếm 75%

chiều dài genome và mã hóa cho 14 protein phi cấu trúc khác nhau (NSP)

Hình 1.3 Hình ảnh cấu trúc hệ gen của virus PRRS

Nguồn: http://www.porcilis-prrs.com/microbiology-prrsv-structure.asp

Các protein cấu trúc của virus PRRS mã hóa bởi các ORF từ 2-7 Các ORF mã hóa protein tương ứng được trình bày trong bảng 1.1

Bảng 1.1 Chức năng các ORF của virus PRRS

ORF1a và ORF1b Các enzyme sao chép RNA

ORF2a và ORF 2b Glycoprotein màng nhỏ GP2a

Nguồn : http://www.porcilis-prrs.com/microbiology-prrsv-structure.asp

Tất cả các protein đều cần thiết cho quá trình sản xuất virus gây bệnh nhưng chỉ cần GP5, M và N đã có thể sản xuất hạt virus Chúng chiếm 90-95% lượng protein cấu trúc của virus Trong số đó, protein GP5 (glycoprotein 5) được

mã hóa bởi ORF5, là một protein được glycosyl hóa, gắn với màng bọc ngoài của virus PRRRS, có tính kháng nguyên mạnh và chịu trách nhiệm gây bệnh của virus (Vũ Khắc Hùng và cs., 2015)

Protein GP5 cùng với protein N là đích chủ yếu của các kháng thể trung hòa, tham gia vào cơ chế “lẩn tránh” đáp ứng miễn dịch cơ thể vật chủ của virus PRRS, do ngăn cản hiện tượng trình diện kháng nguyên virus của các đại thực bào với các tế bào có thẩm quyền miễn dịch trong cả đáp ứng miễn dịch dịch thể và

qua trung gian tế bào (CMI-cell mediated immunity) (Ansari et al., 2006)

Ngoài ra, GP5 còn tham gia hiện tượng “chết theo chương trình” (apoptosis) của các tế bào trong cơ thể bị nhiễm virus PRRS Sự biến đổi của GP5 là một trong những nguyên nhân làm gia tăng khả năng lây nhiễm và gây bệnh của virus PRRS, làm cho dịch PRRS ngày càng phức tạp, do làm giảm hiệu quả phòng bệnh của các vacxin phòng bệnh đang lưu hành Chính vì vậy, nghiên cứu giải mã gen kháng nguyên GP5 (ORF5) của virus PRRS đương nhiễm hiện

nay là thực sự cần thiết, giúp cho chẩn đoán xác định bệnh nhằm sớm áp dụng các biện pháp khống chế và khoanh vùng dịch tễ, giảm thiệt hại do dịch bệnh gây

ra (Tony L Goldberg et al., 2000) Ngoài ra, dữ liệu gen học và hiểu biết di

truyền học của gen ORF5 giúp cho việc nghiên cứu sản xuất các vacxin thế hệ mới phù hợp với virus PRRS đang lưu hành và còn cho phép xác định mức độ tiến hóa của virus đang nhiễm với các chủng trước đó tại Việt Nam và trên thế giới (Vũ Khắc Hùng và cs., 2015)

1.3.2 Đặc tính sinh học của virus

Virus rất thích hợp với đại thực bào, đặc biệt là đại thực bào hoạt động ở vùng phổi Virus nhân lên ngay bên trong đại thực bào, sau đó phá huỷ và giết chết đại thực bào (tới 40%) Đại thực bào bị giết chết nên sức đề kháng của lợn mắc bệnh bị suy giảm nghiêm trọng Do vậy lợn bị bệnh thường dễ bị nhiễm khuẩn thứ phát

Tuy có một số khác biệt về di truyền và kiểu hình nhưng các chủng virus Bắc Mỹ và các chủng virus Châu Âu lại tạo ra các triệu chứng lâm sàng về hô hấp và sinh sản ở lợn rất giống nhau

Dựa vào những kết quả nghiên cứu tổn thương đại thể và vi thể của tổ chức phổi lợn mắc bệnh, người ta chia ra hai nhóm virus: nhóm virus có độc lực cao và nhóm virus có độc lực thấp Nhóm virus có độc lực cao thường gây ra các tổn thương ở tổ chức phổi lợn bệnh nặng hơn nhóm virus có độc lực thấp

Gần đây, tại Trung Quốc các nhà nghiên cứu với quy mô rộng lớn nhất từ trước đến nay đã khẳng định là có sự biến đổi về độc lực của virus PRRS, hậu quả lợn nhiễm virus PRRS có tỷ lệ chết rất cao, trên 20% trong tổng số nhiễm bệnh (Kegong Tian, 2007)

1.3.3 S ức đề kháng của virus PRRS

Virus gây PRRS có thể tồn tại một năm ở nhiệt độ lạnh từ - 20oC đến

-700C; trong điều kiện 4oC virus có thể sống một tháng Với nhiệt độ cao, cũng như các virus khác virus PRRS đề kháng kém: ở 37oC chịu được 48 giờ, 56oC chết sau một giờ Khoảng pH phù hợp là 6,5-7,5 Với các chất sát trùng thông thường và môi trường có pH axit, virus dễ dàng bị tiêu diệt Dưới tác động của

ánh nắng mặt trời hoặc tia tử ngoại vô hoạt virus nhanh chóng, các dung môi hòa tan chất béo cũng dễ dàng phá hủy virus (Nguyễn Bá Hiên và cs., 2009)

1.3.4 Nh ững virus liên quan

Họ Arteriviridae chỉ có một giống duy nhất, chứa tất cả 4 thành viên: virus gây đông sữa ở chuột (Lactat dohydrogenase virus - LDV), virus viêm động mạch ngựa (Equine arteritis virus – EAV), virus sốt xuất huyết khỉ (Simian hemorrhagic fever virus – SHFV) và virus PRRS Các thành viên trong hộ Arteriviridae có cấu trúc và sự nhân lên giống với virus họ Coronaviridae (William T.Christianson, 2001) Sự khác biệt giữa hai họ virus này chính là bộ gen của Arteriviridae chỉ bằng ½ bộ gen của Coronaviridae và nét giống nhau đặc trưng của chúng là bản sao mã giống nhau đặc trưng của lớp Nidoviral Trong nhóm virus này, virus PRRS có quan hệ gần nhất với LDV dựa trên tính đồng đẳng

Bên cạnh sự giống về tổ chức và cấu trúc gen, virus PRRS còn có chung các đặc tính khác với virus LDV, EAV và SHFV Đại thực bào là tế bào mục tiêu cho tất cả 4 virus này Virus PRRS, EAV và SHFV nhân lên trong đại thực bào phế nang, LDV nhân lên hoàn toàn nghiêm ngặt trong phần lớn tế bào đại thực bào màng bụng chuột nhắt Sự phân giải diệt tế bào của các đại thực bào bị bệnh nhanh chóng là chung đối với mỗi loại virus

Hơn nữa để phát triển trong đại thực bào 4 virus này đều có thể sinh ra bệnh không có triệu chứng, dai dẳng

Sự biến đổi chủng là tính tương tự khác của nhóm virus này Có những biến chủng của LDV, EAV và SHFV khác nhau về độc lực cũng như tính gây miễn dịch (William T.Christianson, 2001)

1.3.5 Nh ững vi khuẩn kế phát

Sau khi xâm nhập vào cơ thể, virus PRRS thường tấn công, phá huỷ và giết chết đại thực bào, đặc biệt là đại thực bào vùng phổi Kết quả làm suy giảm

hệ thống phòng vệ tự nhiên của cơ thể Hệ thống phòng vệ của cơ thể bị suy giảm

là điều kiện lí tưởng cho các mầm bệnh khác kế phát

Một số vi khuẩn kế phát thường gặp trong PRRS:

Các tác giả Nguyễn Hữu Nam và cs (2007); Bùi Quang Anh và cs (2008) đều có kết quả nghiên cứu những loại vi khuẩn gây bệnh kế phát trong đường hô hấp khi lợn mắc Tai xanh thường gặp là:

Actinobacillus Pleuropneumoniae (Vi khuẩn gây bệnh Viêm phổi màng phổi);

Mycoplasma hyopneumoniae (Vi khuẩn gây bệnh Suyễn lợn);

Pasteurella multocida (Vi khuẩn gây bệnh Tụ huyết trùng lợn);

Bordetella bronchiseptica (Vi khuẩn gây bệnh Viêm teo mũi);

Streptococcus Suis type 2 (Vi khuẩn gây bệnh Liên cầu khuẩn);

Haemophilus parasuis (Vi khuẩn gây bệnh Viêm đường hô hấp)

1.4 Dịch tễ học của bệnh

1.4.1 Động vật cảm nhiễm

Các tác giả Lê Văn Năm (2007); Đào Trọng Đạt (2008) đều cho biết mọi giống lợn ở các lứa tuổi đều cảm nhiễm với PRRSV Các cơ sở chăn nuôi công nghiệp với quy mô lớn, bệnh thường lây lan nhanh, tồn tại lâu dài trong đàn nái, rất khó thanh toán Lợn nái thường truyền mầm bệnh cho bào thai

Cho đến nay kết quả nghiên cứu ở một số nước châu Âu đều cho thấy virus gây PRRS không cảm nhiễm cho các loại thú khác và người Tuy nhiên, từ thực nghiệm các nhà khoa học đã chứng minh một số loại gia cầm chân có màng như vịt trời (Mallard duck) rất mẫn cảm với PRRSV, virus có thể nhân lên ở loài vịt này Vì thế việc phát tán PRRSV trên diện rộng là khó tránh khỏi (Trung tâm Khuyến nông Quốc gia, 2007)

1.4.2 Động vật môi giới mang và truyền virus PRRS

Trong tự nhiên, lợn đực và lợn nái mang virus, đây là nguồn tàng trữ và truyền bá mầm bệnh cho lợn nhà Lợn rừng bị nhiễm virus không có biểu hiện lâm sàng cũng đóng vai trò làm lây truyền virus cho lợn nhà và ngược lại, lợn nhà cũng truyền mầm bệnh cho lợn rừng

Trong thực nghiệm, người ta cũng truyền được virus trực tiếp cho một

số loài chuột và từ chuột nhiễm mầm bệnh sang chuột khoẻ (virus PRRS dòng Châu Âu)

1.4.3 Ch ất chứa mầm bệnh

Will et al (1997) cho biết khi đã nhiễm virus, lợn có thể thải virus trong

dịch họng, nước bọt, nước tiểu, phân đến ít nhất 28 ngày sau khi nhiễm virus; virus có rất ít trong phân và chúng cũng bị bất hoạt nhanh chóng khi ở trong phân Tuy nhiên, việc bài thải virus qua phân là một vấn đề còn gây tranh cãi, một số nghiên cứu báo cáo rằng PRRSV có trong phân từ ngày 28 đến 35 sau khi gây nhiễm thực nghiệm, trong khi đó một số các nghiên cứu khác lại không phát hiện được virus trong các mẫu phân

Lợn đực có thể thải virus qua tinh dịch trong 43 ngày Bằng phương pháp RT-PCR, các nhà nghiên cứu đã phát hiện được ARN của PRRSV trong tinh dịch

92 ngày sau khi lợn bị nhiễm virus (Christopher-Hennings J et al., 1995)

Nguồn gốc của virus trong tinh dịch lợn đực hiện nay chưa được xác định chính xác, nhưng người ta cũng đã phân lập được virus trong dịch hoàn 25 ngày sau khi nhiễm, trong tuyến củ hành ở 101 ngày sau khi nhiễm virus Tinh dịch lợn có chứa virus cũng có thể lây nhiễm sang bào thai và lợn nái khi phối giống

Lợn nái nhiễm virus có thể truyền sang cho bào thai từ giai đoạn giữa trở

đi và cũng thải qua nước bọt và sữa

Trong cơ thể lợn nhiễm virus:

- Từ 2 - 4 ngày sau khi nhiễm đã có thể phân lập được virus ở phổi, hạch lympho, hạch amidan, tuyến Thymus, lách và máu Lượng virus nhiều nhất ở hạch amidan và phổi ở 14 ngày sau khi nhiễm, ở hạch lympho sau 3 ngày

- Ở hạch amidan, hạch lympho và tuyến Thymus vẫn có thể phân lập được virus sau 21 ngày, ở phổi là sau 35 ngày

- PRRSV thường cư trú ở phế nang, vùng trung tâm hạch lympho và lách

Ở những con nái có chửa virus có thể qua được nhau thai, tuy nhiên khả năng qua nhau thai của virus này hiện còn nhiều tranh cãi Virus cũng có thể xâm nhập vào thận, não, gan, khí quản, tủy xương và đám rối màng treo ruột

Virus có thể xâm nhập vào đại thực bào vùng phổi, hạch amidan, hạch lympho, lách nhưng không xâm nhập được vào các đại thực bào ở gan, thận, tim

và các tế bào tiền thân của đại thực bào như bạch cầu đơn nhân trung tính, tế bào

tủy xương Tế bào đích chủ yếu của virus là đại thực bào phế nang, tại đây virus nhân lên một cách mạnh mẽ nhất, tuy nhiên chỉ có 2% đại thực bào phế nang bị virus xâm nhập

1.4.4 Đường truyền lây

Các yếu tố môi trường: Xe cộ, không khí, khách,côn trùng

Hình 1.4 Các phương thức truyền lây virus PRRS

* Truyền lây trực tiếp: Các đường lây truyền trực tiếp của PRRSV trong

và giữa các quần thể lợn bao gồm các lợn nhiễm bệnh và tinh dịch bị nhiễm virus PRRSV được phát hiện từ nhiều loại chất tiết và các chất thải từ lợn bao gồm máu, tinh dịch, nước bọt, dịch họng, phân, nước tiểu, hơi thở ra, sữa và sữa

đầu (Wagstrom et al., 2001)

Truyền lây theo chiều dọc xảy ra trong suốt giai đoạn giữa đến giai đoạn cuối của thời kỳ mang thai Các nhà nghiên cứu đã phân lập được virus từ đại thực bào, phổi, gan, lách, huyết thanh hoặc dịch cơ thể của lợn con sinh ra cả sống và chết, nhưng không phân lập được từ thai chết khô, họ cũng phát hiện kháng thể chống virus PRRS đặc hiệu trong dịch xoang ngực hoặc sữa đầu Dấu hiệu này chỉ ra rằng truyền bệnh qua nhau thai là phổ biến trong giai đoạn cuối

kỳ chửa (William Christianson and Han Soo Joo, 2001)

Truyền lây theo chiều ngang cũng đã được báo cáo qua tiếp xúc trực tiếp

Truyền lây trực tiếp

Truyền lây gián tiếp

•Khí dung (dịch hầu họng, phân, nước tiểu)

•Vật liệu bị tạp nhiễm (thức ăn,găng tay, kim tiêm)

giữa lợn bệnh và lợn cảm nhiễm ,cũng như sự lây truyền qua tinh dịch của những lợn đực nhiễm bệnh

* Truyền lây gián tiếp

Một số đường truyền lây gián tiếp qua các dụng cụ, thiết bị đã được xác định Nguy cơ lây truyền qua những đường này có thể được giảm thiểu qua áp dụng các bảng nội quy, nghĩa là thay giày dép, quần áo, rửa tay, tắm, tạo những khoảng thời gian nghỉ khoảng 12 giờ giữa những lần tiếp xúc với lợn

Các phương tiện vận chuyển cũng là một cách làm lây lan PRRSV cơ học tiềm năng Sử dụng một mô hình tỷ lệ 1:150, lợn mẫn cảm đã thu nhận PRRSV qua tiếp xúc ở bên trong mô hình vận chuyển vấy nhiễm với PRRSV

1.4.5 Điều kiện lây lan

Ở các cơ sở có lưu hành bệnh, môi trường bị ô nhiễm, bệnh lây lan quanh năm nhưng tập trung vào thời kỳ có nhiều lợn nái phối giống và bệnh phát sinh thành dịch, với tỷ lệ cao, lợn nái có hội chứng rối loạn sinh sản, trong khi lợn con

bị viêm đường hô hấp phổ biến

Bệnh có thể lây từ nước này sang nước khác qua việc xuất lợn có mang mầm bệnh mà không được kiểm dịch chặt chẽ Một số nước đang phát triển nhập lợn giống có phẩm chất và năng suất cao từ các nước Bắc Mỹ và Tây Âu, do không thực hiện tốt công tác kiểm dịch nên đã mang bệnh vào nước mình Thực tế cho thấy, trong khoảng gần hai thập kỷ qua, bệnh Tai xanh đã thâm nhập và trở thành dịch địa phương ở nhiều nơi trên thế giới Chỉ có Australia, New Zealand, Phần Lan, Na Uy,

Thụy Điển và Thụy Sỹ tuyên bố là sạch bệnh (Drew T et al., 2008)

Hình 1.5 Virus PRRS xâm nhập và phá hủy tế bào đại thực bào

Nguồn: Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH

Lúc đầu, PRRSV có thể kích thích các tế bào này, nhưng sau 2 hoặc 3 ngày virus sẽ giết chết chúng, các virion được giải phóng và ồ ạt xâm nhiễm sang các tế bào khác Ở giai đoạn đầu của quá trình xâm nhiễm của PRRSV, dường như hiệu giá kháng thể kháng lại các loại virus và vi khuẩn khác không liên quan trong cơ thể của lợn tăng cao do sự kích hoạt của đại thực bào trong hệ thống miễn dịch Điều này rất dễ gây ra sự nhầm lẫn trong việc đánh giá mức độ miễn dịch đối với các bệnh truyền nhiễm ở cơ thể lợn

Trong hệ thống miễn dịch của cơ thể, đại thực bào đóng một vai trò vô cùng quan trọng Đây là tế bào trình diện kháng nguyên thiết yếu, mở đầu cho quá trình đáp ứng miễn dịch đặc hiệu (Nguyễn Bá Hiên và cs., 2009) Khi tế bào đại thực bào bị virus phá huỷ, các phản ứng miễn dịch không xảy ra được, lợn nhiễm bệnh rơi vào trạng thái suy giảm miễn dịch và dễ dàng mắc các bệnh nhiễm trùng thứ phát, điều này có thể thấy rõ ở những đàn lợn vỗ béo chuẩn bị giết thịt, khi bị nhiễm PRRSV sẽ có sự tăng đột biến về tỷ lệ viêm phổi kế phát

do những vi khuẩn vốn sẵn có trong đường hô hấp như Pasteurella multocida,

Mycoplasma hyopneumoniae, Streptococcus suis, Staphylococcus Ngoài ra lợn mắc PRRS thường bị bội nhiễm với các bệnh khác như Dịch tả lợn, Tụ huyết

trùng, Phó thương hàn, bệnh do Xoắn khuẩn Leptospira spp, bệnh do

Streptococcus spp, Mycoplasma spp, E.coli… Các bệnh kế phát này mới là

nguyên nhân gây chết nhiều ở lợn mắc PRRS (Wang X et al., 2007)

Viêm phổi làm thiếu oxy nên gây rối loạn chuyển hóa của thai, thai bị suy dinh dưỡng và gây chết thai, sảy thai Lợn chửa kỳ cuối thì nhu cầu oxy tăng cao

vì phải nuôi thai, ở thời kỳ cuối thai tăng trưởng rất nhanh nên nhu cầu về oxy tăng gấp bội, vì vậy lượng thiếu hụt oxy càng nghiêm trọng, nên thai hay sảy vào

kỳ cuối Sau sảy thai tế bào nội mạc tử cung bị thoái hóa, hoại tử nên làm chậm các quá trình sinh lý khác (Trương Quang, 2009)

1.6 Triệu chứng, bệnh tích

1.6.1 Tri ệu chứng

Biểu hiện triệu chứng lâm sàng của bệnh phụ thuộc vào nhiều yếu tố: chủng virus, tuổi, giới tính, điều kiện môi trường, trạng thái miễn dịch của đàn cũng như điều kiện quản lý chăm sóc (Nguyễn Hữu Nam và Nguyễn Thị Lan, 2007)

Nhìn chung lợn mắc PRRS thường có biểu hiện lâm sàng đặc trưng như: sốt cao 40 - 41oC, bỏ ăn, da ửng đỏ, viêm phổi nặng, ỉa chảy, tai xanh, lợn nái mang thai thường sảy thai, thai chết lưu hoặc lợn sơ sinh chết yểu (Tiêu Quang

An và Nguyễn Hữu Nam, 2011) Tuy nhiên, tùy từng chủng virus, đặc điểm giống lợn, lứa tuổi, trạng thái miễn dịch cơ thể và các nhân tố ngoại cảnh mà triệu chứng lâm sàng rất khác nhau Theo ước tính cứ 3 đàn lợn lần đầu tiếp xúc với mầm bệnh thì một đàn không có biểu hiện, một đàn biểu hiện ở mức độ vừa

và một đàn bị nặng (Nguyễn Bá Hiên và cs., 2009) Lý do cho điều này vẫn chưa giải thích được, tuy nhiên với những đàn khỏe mạnh thì mức độ bệnh cũng nhẹ hơn, hơn nữa cũng có thể do virus tạo nhiều biến chủng với độc lực khác nhau Thực tế nhiều đàn có huyết thanh dương tính nhưng không có dấu hiệu lâm sàng Đây là đặc điểm chính của hội chứng PRRS

Thời kỳ ủ bệnh có thể kéo dài từ 3 - 37 ngày (FAO, 2011) Các triệu chứng chính gồm có:

- Các dấu hiệu về da: da thường đổi màu từ ửng đỏ tới xanh, đặc biệt là vùng da tai và vùng âm hộ Có dấu hiệu phù nề dưới da, mí mắt, chi sau, mõm…

- Các triệu chứng về hô hấp ở lợn con và lợn trưởng thành: khó thở, suy

hô hấp Các triệu chứng về hô hấp thường trở nên nghiêm trọng hơn khi nhiễm

các bệnh kế phát Pasteurella multocida, Porcine Circovirus Type 2 (PCV2),

Mycoplasma hyopneumonia, Streptococcus suis, Salmonella cholerasuis, Haemophilus parasuis, Swine influenza virus…Tỷ lệ chết cao thường gặp ở lợn con (30 - 50%) và thấp hơn ở lợn trưởng thành (4 - 20%) (OIE, 2008)

Lợn đực giống giảm hưng phấn hoặc mất tính dục, lượng tinh dịch ít, chất lượng tinh dịch kém, thể hiện: nồng độ tinh trùng (C) thường dưới 80.106; hoạt lực của tinh trùng (A) dưới 0,6; sức kháng của tinh trùng (R) dưới 3000; tỷ lệ kỳ hình (K) tăng trên 10%; tỷ lệ sống của tinh trùng giảm xuống còn dưới 70% và

độ nhiễm khuẩn tăng cao trên 20.103 Lợn đực giống rất lâu mới hồi phục được khả năng sinh sản của mình (Nguyễn Văn Thanh, 2007)

* Lợn con theo mẹ:

Thể trạng gầy yếu, triệu chứng phát ra đột ngột, đường huyết hạ thấp do không bú mẹ, mí mắt sưng, có dử màu nâu, trên da xuất hiện những đám phồng rộp (Phạm Ngọc Thạch và cs., 2007)

Lợn con thường tiêu chảy hàng loạt và rất nặng, phân dính đầy xung quanh hậu môn Đây là triệu chứng đặc trưng của PRRS ở lợn con chưa cai sữa, biểu hiện này không phổ biến ở lợn lớn Phát ban đỏ là biểu hiện phổ biến thứ 2

và xảy ra ngay sau khi bệnh bắt đầu xuất hiện Chảy nước mắt, mắt có rỉ và mí

mắt sưng húp là biểu hiện phổ biến thứ 3, kết hợp với triệu chứng lạc giọng, khản tiếng, thở khó, thở thể bụng, chảy nước mũi, khớp đau, sưng nên chân thường choãi ra, đi lại khó khăn, tỷ lệ tử vong cao (Lê Văn Năm, 2007)

* Ở lợn con sau cai sữa và lợn thịt:

Ở lợn thịt, các triệu chứng tập trung chủ yếu ở đường hô hấp Lợn bị viêm phổi nặng, ho nhiều, thở rất khó khăn, thở dốc, thở thể bụng, có con ngồi thở như chó ngồi, có con tựa vào tường để lấy sức thở, hắt hơi, chảy nước mắt Do phổi

bị viêm nặng nên hiện tượng da xanh (đặc biệt là tai xuất hiện sớm), điển hình và chiếm tỷ lệ lớn ở loại lợn này

Ở lợn con sau cai sữa, mí mắt thường sưng húp, có màu đỏ thâm, làm cho mắt lõm sâu tạo nên một quầng thâm xung quanh mắt nên nhìn lợn giống như được “đeo kính râm” Tỷ lệ táo bón ở lợn loại này rất cao nhưng tỷ lệ tiêu chảy thấp hơn lợn con theo mẹ (Lê Văn Năm, 2007)

1.6.2 B ệnh tích

Nghiên cứu bệnh tích là một trong những khâu quan trọng để xác định các tổn thương do bệnh nguyên gây ra Kết quả nghiên cứu về bệnh tích đại thể và bệnh tích vi thể ở các nhóm lợn bệnh của nhiều tác giả cho thấy:

* Lợn nái chửa: Đặc biệt là lợn nái chửa kỳ 2 thường bị đẻ non hoặc đẻ

chậm Trường hợp đẻ non (sảy thai) thì thấy nhiều thai chết, trên cơ thể thai chết lưu thường có nhiều đám thối rữa Trường hợp đẻ muộn thì số thai chết lưu ít hơn nhiều so với đẻ non Song số lợn con sinh ra rất yếu, nhiều con chết trong lúc đẻ

do thời gian đẻ kéo dài Mổ khám thấy bệnh tích tập trung ở phổi, phổi bị phù nề, viêm hoại tử và tích nước, cắt miếng phổi bỏ vào bát nước thấy phổi chìm

* Lợn nái nuôi con, lợn choai và lợn vỗ béo: Bệnh tích tập trung ở phổi

Các ổ viêm thường gặp ở thuỳ đỉnh, song cũng thấy ở các thuỳ khác nhưng hầu như các ổ viêm áp xe đó không xuất hiện đối xứng Các ổ viêm, áp xe thường có màu xám đỏ, rắn, chắc Khi cắt đôi đám phổi có biến đổi thấy có mủ chảy ra, mô phổi cũng lồi ra và có màu đỏ xám loang lổ như tuyến ức như đá granit Trong một thuỳ phổi có nhiều đám biến đổi như mô tả Cắt miếng phổi biến đổi bỏ vào nước thấy miếng phổi chìm, chứng tỏ phổi đã bị phù nề tích nước nặng

Những lợn bị táo bón thì ruột chứa nhiều phân cục rắn chắc, niêm mạc ruột bị viêm nhưng ở những lợn bị tiêu chảy thì thành ruột mỏng trên bề mặt có phủ một lớp màu nâu

* Lợn con theo mẹ: Xác gầy, da trùng, ruột chứa nhiều nước, đôi khi thấy

có một số cục sữa vón không tiêu, thành ruột mỏng, loét van hồi manh tràng Hạch màng treo ruột xuất huyết, gan sưng và tụ huyết Thận xuất huyết lấm tấm đầu đinh ghim, não xung huyết, hạch hầu, họng, amidan sưng, sung huyết (Phan Đăng Kỳ và Phạm Sỹ Lăng, 2007)

Khi quan sát bệnh tích vi thể ở phổi, nhiều tác giả kết luận thường thấy dịch thẩm xuất và hiện tượng thâm nhiễm, trong phế nang chứa đầy dịch viêm và đại thực bào, một số trường hợp hình thành tế bào khổng lồ nhiều nhân Một bệnh tích đặc trưng nữa là sự thâm nhiễm của tế bào phế nang loại II (pneumocyse) làm cho phế nang bị nhăn lại, thường bắt gặp đại thực bào bị phân huỷ trong phế nang (Nguyễn Văn Thanh, 2007)

Viêm phổi kẽ là bệnh tích chắc chắn thấy ở PRRS Bệnh tích này có thể quan sát được ở lợn mọi lứa tuổi, ở những lợn nhỏ hơn cũng ít bị che khuất bởi bệnh tích các bệnh kế phát (William T.Christianson, 2001)

Ngoài ra còn thấy một số bệnh tích khác ở đàn lợn đang phát triển như: Viêm mũi đặc trưng bởi mất lông nhung biểu mô, tế bào biểu mô bị sưng lên hoặc chứa khí, bong vẩy trên bề mặt biểu mô

1.7 Các phương pháp chẩn đoán PRRS

1.7.1 Ch ẩn đoán lâm sàng

Theo Benfiled (1992), khi có dấu hiệu rối loạn hô hấp trên cả đàn ở mọi lứa tuổi, lợn nái giảm khả năng sinh sản và năng suất đàn giảm hơn bình thường thì có thể nghi bệnh do virus PRRS Cụ thể tỷ lệ chết lúc sinh >20%, tỷ lệ sảy thai, thai chết lưu >8%, tỷ lệ lợn con chết trước khi cai sữa >26%, tỷ lệ lợn con chết trong tuần đầu tiên vượt quá 25% Ngoài ra lợn con theo mẹ, lợn cai sữa có dấu hiệu của hội chứng viêm phế quản phổi, suy hô hấp và một số lợn có biểu hiện tái xanh cũng là những dấu hiệu đầu của bệnh PRRS (Nguyễn Bá Hiên và cs., 2007)

Tuy nhiên bệnh có thể không điển hình theo lứa tuổi vì vậy trong chẩn đoán lâm sàng cần phân biệt bệnh PRRS với các bệnh: Viêm não Nhật Bản, bệnh giả dại, cúm lợn, viêm màng phổi, suyễn, bệnh do Toxoplasma (Lê Văn Năm, 2007)

1.7.2 Ch ẩn đoán bằng phương pháp giải phẫu bệnh

Đối với lợn con, lợn vỗ béo, lợn chuẩn bị xuất chuồng: Khi mổ khám thấy phổi rắn, chắc và có vùng xám và hồng

Trên tiêu bản vi thể cho thấy viêm phổi kẽ tăng sinh đa điểm hoặc lan tràn làm vách phế nang dầy lên, giảm số lượng tế bào lympho trong các tổ chức lympho…

1.7.3 Ch ẩn đoán bằng phương pháp huyết thanh học

Theo A.Buttner et al (2000) để phát hiện sự có mặt của virus PRRSV

người ta có thể sử dụng phương pháp kháng thể huỳnh quang gián tiếp (IFA); phương pháp miễn dịch enzym trên thảm tế bào một lớp và phản ứng trung hòa virus trên môi trường tế bào một lớp (VNT); phương pháp miễn dịch bệnh

lý khi sử dụng kháng thể chuẩn để phát hiện virus có trong mẫu bệnh phẩm lợn bệnh PRRS

Phương pháp ELISA có thể chuẩn đoán một số lượng mẫu huyết thanh lớn

và kết quả nhanh Khi dùng phương pháp này có thể phát hiện được cả chủng virus có nguồn gốc Bắc Mỹ và chủng có nguồn gốc từ Châu Âu

Phản ứng trung hòa virus trên môi trường tế bào một lớp (Virus neutralization test) là chỉ thị tốt nhất để đánh giá tình trạng bệnh trong quá khứ vì kháng thể trung hòa có thể tồn tại ít nhất một năm Tuy nhiên phản ứng trung hòa virus kém nhạy hơn các phản ứng huyết thanh khác vì kháng thể trung hòa xuất hiện chậm hơn

Có một thực tế là khi đánh giá kết quả của một phản ứng huyết thanh phải cân nhắc đến trạng thái miễn dịch của đàn sau khi được tiêm phòng vacxin vì hiện tại chưa có phản ứng huyết thanh học nào phân biệt được kháng thể do lợn mắc bệnh tự nhiên hay do tiêm phòng vacxin (Anette, 1997)

1.7.4 K ỹ thuật RT – PCR (Reverse transcriptase polymerase chain reaction)

Dùng phản ứng RT - PCR phân tích mẫu máu (được lấy trong giai đoạn đầu của pha cấp tính) để xác định sự có mặt của virus, đây là phản ứng tương đối nhạy và chính xác

Kỹ thuật RT – PCR hay còn gọi là phản ứng PCR ngược là một phản ứng nhân một đoạn giới hạn của khuôn RNA, theo nguyên lý của phản ứng PCR bao gồm hai giai đoạn: Giai đoạn thứ nhất là chuyển đổi một sợi RNA làm khuôn thành cDNA, sau đó qua giai đoạn thứ hai dùng DNA hai sợi này làm khuôn để tiếp tục thực hiện phản ứng PCR

Hình 1.6 Mô hình nguyên lý của phản ứng RT-PCR

Nguồn: http://www.biomedcentral.com/1472-6750/3/22/figure/F2?highres=y

RNA là một sợi bao gồm 4 nucleotit liên kết với nhau, trong đó có Adenine, Guanine, Cystein, Uracil Chuỗi nucleotit này phải được chuyển đổi thành DNA hai sợi mà thành phần Uracil được thay thế bằng Thyamine Phản ứng tạo cDNA từ RNA hệ gen phải nhờ đến vai trò của enzyme phiên mã ngược

Do vậy giai đoạn này được gọi là giai đoạn chuyển ngược Khi đã có DNA phản ứng tiếp theo sẽ là PCR Toàn bộ phản ứng nhân một đoạn DNA từ khuôn RNA qua hai giai đoạn nói trên được gọi là phản ứng RT- PCR hay phản ứng PCR ngược Thay đổi nhiệt độ để phù hợp cho mỗi chu kỳ

tố truyền lây của bệnh truyền nhiễm nói chung Vì thế nguyên tắc khống chế của bệnh PRRS chính là sự tác động vào các khâu trên của quá trình sinh dịch Có nghĩa là cần phải phá vỡ vòng truyền lây của tác nhân gây bệnh và hiệu quả nhất

là sự tác động vào điểm yếu nhất của quá trình truyền lây

Hiện nay trên thế giới có ít nhất 21 loại vacxin phòng bệnh tai xanh Tại Việt Nam, Cục Thú y công bố 7 loại vacxin được phép sử dụng năm 2013 theo văn bản 1989/TY-DT

Do chưa hiểu rõ cơ chế miễn dịch bảo hộ và sự đa dạng, thay đổi liên tục của virus PRRS nên chưa có loại vacxin nào thực sự thành công Mặc dù lợn được tiêm phòng vẫn có thể nhiễm virus gây bệnh tai xanh cường độc, nhưng khi

bị nhiễm lợn sẽ bài thải virus trong thời gian ngắn hơn và hồi phục nhanh hơn Theo Nguyễn Bá Hiên và Huỳnh Thị Mỹ Lệ (2012) trong bối cảnh thực tế

ở Việt Nam, gần như khó có thể duy trì tình trạng âm tính với PRRSV Vì vậy, duy trì sự ổn định của đàn đối với PRRSV là cần thiết Một phương pháp cũng nhằm mục đích như phương pháp dùng vacxin chỉ khác là sử dụng chính “virus còn nguyên độc lực” của trại để phơi nhiễm toàn đàn nái cùng lúc để rút ngắn thời gian nhiễm tự nhiên và tạo miễn dịch bảo hộ đồng chủng 100% cùng lúc Dĩ nhiên là có tổn thất, nhưng tiên liệu được và sau 3 tháng đàn ổn định, thời gian bảo hộ kéo dài 2 năm với điều kiện không có chủng khác xâm nhập

Bên cạnh đó cần chú ý thực hiện tốt công tác vệ sinh phòng bệnh và tăng cường công tác tuyên truyền, giáo dục nâng cao ý thức phòng bệnh cho người chăn nuôi cũng như các biện pháp kiểm dịch nhằm kiểm soát và ngăn ngừa dịch bệnh bùng phát, lây lan, nhất là trong điều kiện hội nhập mạnh mẽ như hiện nay

1.8.2 Điều trị bệnh

Đây là một bệnh do virus gây ra do đó, không có thuốc điều trị đặc hiệu cho PRRS Chỉ điều trị các bệnh bội nhiễm do vi khuẩn gây ra như: Tụ huyết trùng, Phó thương hàn, Suyễn lợn, Liên cầu khuẩn, do đó hiện nay chưa có thuốc đặc trị để điều trị bệnh này Chỉ có thể sử dụng một số thuốc tăng cường sức đề kháng cho lợn như vitamin C nồng độ cao (có thể gấp hai lần so với liều điều trị thông thường), khoáng vi lượng, sử dụng các loại kháng sinh phổ rộng để điều trị cho lợn mắc bệnh kế phát Điều trị phải đầy đủ, đúng liều, đủ thời gian Bên cạnh đó, cần phải nâng cao an toàn sinh học, thực hiện tốt quy tắc chăn nuôi “cùng vào, cùng ra” Thực hiện việc vệ sinh tiêu độc khử trùng chuồng trại, phương tiện vận chuyển

ra vào trại, vệ sinh tốt đối với người ra vào chuồng trại, công nhân làm việc trong

trại; xử lý tốt phân, rác thải bằng phương pháp hoá học hoặc sinh học

Chương 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

Lợn nghi mắc bệnh Tai xanh nuôi trên địa bàn huyện Sơn Động - tỉnh Bắc Giang

2.2 Địa điểm nghiên cứu

Để triển khai các nội dung nghiên cứu của đề tài, chúng tôi thực hiện nghiên cứu tại các địa điểm sau:

- Địa bàn huyện Sơn Động – tỉnh Bắc Giang

- Bộ môn Vi sinh vật – Truyền nhiễm, Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam

- Trung tâm nghiên cứu và phát triển công nghệ vắc xin – Công ty cổ phần phát triển công nghệ nông thôn (RTD)

2.3 Nội dung nghiên cứu

2.3.1 Một số đặc điểm dịch tễ học của dịch PRRS trên địa bàn huyện Sơn Động từ năm 2010 đến 2014

2.3.2 Xác định một số yếu tố nguy cơ làm phát tán lây lan, ảnh hưởng đến tình hình dịch PRRS trên địa bàn huyện Sơn Động

2.3.3 Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học phân tử của các chủng virus PRRS gây bệnh cho đàn lợn trên địa bàn huyện Sơn Động

2.4 Nguyên liệu nghiên cứu

2.4.3 Sinh ph ẩm, hóa chất dùng cho tách chiết RNA

- Trizol Reagent (Invitrogen)

- Chloroform

- Isopropanol

- Ethanol 70% pha trong nước đã xử lý

- H2O đã xử lý RNase (nước tinh khiết)

2.4.4 C ặp mồi (primer) và kit PCR

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng kit SuperScriptTM (Invitrogen)

sử dụng mồi Oligo dT với trình tự:

5’- CTGTGAATGCTGCGACTACGATTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’

2.5 Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm

2.5.1 D ụng cụ

- Dụng cụ lấy mẫu: xilanh lấy mẫu, lọ đựng mẫu, túi nylon, đá khô…

- Pipette vô trùng loại: 2ml, 5ml, 10ml (Corning)

- Đầu típ vô trùng (10µl, 20µl, 200µl, 1000µl) (Sorenson)

- Pipette aid (GenMate)

- Multipipette: 8 kênh (GenMate)

- Máy ly tâm lạnh Centrifuge 5417C (Eppendorf) (tube ly tâm 1,5ml)

- Máy ly tâm EBA 12 (Hettich Zentrifugen) (cho tube ly tâm 15ml)

- Máy ly tâm Centrifuge 5804R (Eppendorf) (cho tube ly tâm 50ml)

- Máy trộn (vortex) LaborA (Bioblock Scientific)

- Máy spindown

- Bộ nguồn điện di EC 105 (APPARATUS)

- Tủ lạnh thường và tủ lạnh -20oC (Sanyo)

2.6 Phương pháp nghiên cứu

2.6.1 Ph ương pháp điều tra thu thập thông tin bệnh và mẫu bệnh phẩm

Sử dụng phương pháp dịch tễ học của Nguyễn Như Thanh (2001) nghiên cứu hiện tại, hồi cứu

2.6.1.1 Chọn mẫu điều tra

Điều tra trên địa bàn toàn huyện

2.6.1.2 Phương pháp

- Trực tiếp quan sát để phát hiện lợn mắc PRRS Những lợn có triệu chứng điển hình như: sốt đỏ, giảm ăn hoặc bỏ ăn, lợn nái đẻ non, sảy thai, thai chết lưu, ho, khó thở… được coi là lợn nghi mắc PRRS

- Phỏng vấn chủ hộ chăn nuôi về những thông tin cần thiết

- Phương pháp nghiên cứu dịch tễ học thực địa, phương pháp nghiên cứu hồi cứu dựa vào việc điều tra ổ dịch, thu thập thêm thông tin thứ cấp từ Trạm Thú

y Sơn Động, Phòng Nông nghiệp và Phát triển nông thôn và các cơ quan liên quan

- Phương pháp lấy mẫu huyết thanh: Cố định lợn, dùng seringe lấy máu khoảng 4 - 5ml ở vịnh tĩnh mạch cổ hoặc tĩnh mạch tai, để 1-2 giờ cho máu đông

tự nhiên (hoặc để 1 giờ ở 37oC), sau đó để qua đêm ở 4oC Phải lấy máu lúc lợn

bị sốt cao vì lúc đó nồng độ của virus là cao nhất Có thể đo nhiệt độ trước khi lấy máu Tiến hành chắt huyết thanh vào ống eppendorf và bảo quản ở -20oC cho đến khi kiểm tra

2.6.1.3 Nội dung điều tra, theo dõi

- Tổng đàn, số lợn mắc, chết do PRRS tại các hộ, các trang trại chăn nuôi (2010 – 2014)

- Xác định sự tương quan giữa các yếu tố về khí hậu, mùa vụ, độ tuổi và tỷ

n: Tổng số mẫu nghiên cứu

* Phương pháp tính tỷ suất chênh hay tỷ số lệch (Odds Ratio = OR):

Tỷ suất chênh hay tỷ số lệch là một chỉ số xấp xỉ của nguy cơ tương đối trong các nghiên cứu bệnh chứng, nó cũng là một số đo của nguy cơ so sánh, nó

so sánh độ chênh lệch của bệnh sẽ xảy ra trong nhóm có tiếp xúc (có phơi nhiễm) với yếu tố nguy cơ và độ chênh lệch của bệnh sẽ xảy ra trong nhóm không tiếp xúc (không phơi nhiễm) với yếu tố nguy cơ

- Số liệu được tính toán ghi theo bảng đưới đây:

Tiếp xúc với yếu tố nguy cơ Có mắc PRRS Không mắc

PRRS

Pt(1 − Pt) / n

- Công thức tính tỷ suất chênh:

b: số mẫu không có bệnh nhưng có tiếp xúc với yếu tố nguy cơ

c: số gia súc có bệnh, nhưng không tiếp xúc với yếu tố nguy cơ

d: số gia súc không có bệnh và cũng không tiếp xúc yếu tố nguy cơ

- Khi so sánh tỷ suất chênh có ba khả năng xảy ra:

+ Nếu OR > 1 nói lên sự liên quan giữa bệnh và cảm nhiễm với yếu tố nguy cơ, trị số của OR càng lớn thì kết hợp giữa bệnh và cảm nhiễm càng mạnh + Nếu OR = 1 nói lên bệnh và sự cảm nhiễm với yếu tố nguy cơ không có liên quan gì đến nhau

+ Nếu OR < 1 nói lên một kết hợp âm tính

*Phân tích thống kê

Số liệu thô được xử lý và tính toán bằng phần mềm MS.Excel và phần mềm WinEpiscope 2.0

2.6.3 Ph ương pháp RT-PCR (Reverse transcriptase polymerase chain reaction)

2.6.3.1 Phương pháp tách chiết RNA từ mẫu bệnh phẩm

Các bước tách chiết RNA từ mẫu huyết thanh được tiến hành theo sự chỉ dẫn của Kit, cụ thể:

- Cho 700µl Trizol Reagent vào 200µl dung dịch mẫu, vortex trộn đều, ủ

- Ly tâm 12.000 vòng/phút/4oC trong vòng 10 phút

- Loại bỏ Isopropanol, giữ lại tủa RNA

- Rửa tủa RNA bằng 1 ml cồn 70% bằng cách đảo nhẹ ống Ly tâm 12.000 vòng/15 phút ở 4oC

- Loại bỏ hoàn toàn cồn 70%, làm khô tủa RNA tự nhiên ở nhiệt độ phòng trong 5-10 phút

- Hòa tan tủa RNA trong 30µl nước vô trùng (đã xử lý Rnase) Bảo quản

ở -20oC đến khi kiểm tra

2.6.3.2 Phương pháp tổng hợp cDNA

cDNA được tổng hợp từ RNA đã được tách chiết nhờ enzyme phiên mã ngược (reverse transcriptase) Để tạo cDNA chúng tôi dùng bộ kit SuperScriptTM (Invitrogen) sử dụng mồi Oligo dT với trình tự 5’- CTGTGAATGCTGCGACTACGATTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’

Thành phần phản ứng và điều kiện tổng hợp cDNA như sau: 5µl RNA tinh sạch, 4.5µl nước đã loại RNase, 3µl dNTPs (2.5mM mỗi loại), 2µl mồi oligo dT (200pM/µl), 1µl SuperscriptTM II RNase H-reverse transcriptase (200U/µl), 0.5µl RNase inhibitor (10U/µl) và 4µl 5X first strand buffer Phản ứng tổng hợp cDNA được thực hiện ở 37°C trong 60 phút và sau đó 94°C trong vòng 5 phút

2.6.3.3 Phương pháp PCR

cDNA được tổng hợp ở trên được bổ sung trực tiếp vào ống phản ứng PCR sử dụng kit AccuPower PCR Premix (BIONEER) Kit này chứa DNA taq-polymerase và các thành phần cần thiết cho quá trình khuyếch đại DNA Mồi (primer) được sử dụng trong nghiên cứu này là các cặp mồi đã được công bố trước đây (Feng và cs., 2008 ; Han và cs., 2009)

Phản ứng PCR được thực hiện theo chương trình như sau: 25 chu kỳ (940C – 1 phút; 540C – 1 phút; 720C – 1 phút) và cuối cùng 8 phút ở 720C

2.6.3.4 Chạy điện di kiểm tra sản phẩm PCR

Sản phẩm PCR sẽ được kiểm tra trên gel agarose

Đổ thạch 1%: Cân 0,2 gram Agarose cho vào 20ml dung dịch đệm TBE

1X Đun nóng trong 2 phút và để nguội tới khoảng 45 – 50oC Bổ sung 5µl thuốc nhuộm ADN (Safe view) và lắc đều Đổ gel vào khuôn

Nhỏ 1µl Loading Dye lên giấy parafirm Hút 5µl sản phẩm PCR trộn đều với Loading Dye rồi tra vào mỗi giếng và chạy điện di ở 100mA, 120V trong vòng 30 phút Kết quả của phản ứng PCR được đọc trên hộp đèn tử ngoại

Mẫu được đánh giá dương tính với PRRS nếu xuất hiện vạch đặc hiệu có kích thước 603 bp

2.6.4 Ph ương pháp giải trình tự gen

Lựa chọn một số mẫu dương tính PRRS để tiến hành giải trình tự, so sánh với các chủng đã công bố trên ngân hàng gen quốc tế (GenBank)

Sản phẩm PCR nhân lên bởi cặp mồi ORF5-F/ORF5-R (603 bp) sẽ được gửi sang công ty Macrogen của Hàn Quốc để giải trình tự gen

Trình tự DNA thu được sẽ được phân tích bằng phần mềm BioEdit 7.0.5.3

và DNAstar trên cơ sở đối chiếu so sánh giữa trình tự nucleotide được giải trình

tự theo chiều xuôi và ngược của cặp mồi