Nghiên cứu phản ứng điều chế chitosan khối lượng phân tử thấp bằng hydro peroxit (h2o2 ) và khảo sát khả năng hấp phụ ion kim loại nặng

Lí do chọn đề tài Chitin [poly-β-1→4-2-axetamiđo-2-đeoxy-D-glucopyranozơ], một polysaccarit với hàm lượng đứng hàng thứ hai trong tự nhiên sau xenlulozơ, là thành phần chính của vỏ các

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KHOA HÓA HỌC

LÊ THỊ LINH TRANG

NGHIÊN CỨU PHẢN ỨNG ĐIỀU CHẾ

CHITOSAN KHỐI LƯỢNG PHÂN TỬ THẤP

KHẢ NĂNG HẤP PHỤ ION KIM LOẠI NẶNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Hóa Công nghệ môi trường

HÀ NỘI - 2016

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, em xin cảm ơn thầy giáo ThS Lê Cao Khải, cùng toàn thể

các thầy cô giáo trong khoa Hóa Học - Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2,

đã tạo điều kiện cho em được tiếp thu những kiến thức chuyên môn về hóa học hữu cơ và công nghệ môi trường

Em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS.Trần Thị Ý Nhi - Viện

Hóa Học - Viện Hàn lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam đã tận tình

hướng dẫn và truyền đạt cho em các phương pháp nghiên cứu khoa học và những kinh nghiệm học thuật quý báu trong quá trình thực hiện khóa luận

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô, các anh chị tại Viện Hóa Học - Viện Hàn lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam đã tận tình giảng dạy, chỉ bảo và dìu dắt em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận

Hà Nội, tháng 05 năm 2016

Sinh viên

Lê Thị Linh Trang

DANH MỤC HÌNH

Hình 3.1: Phổ hồng ngoại của β-chitin 33

Hình 3.2: Phổ hồng ngoại của β-chitosan 35

Hình 3.3: Giản đồ nhiễu xạ tia X của chitosan 35

Hình 3.4: Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa /C và C 36

Hình 3.5: Phổ FT-IR của chitosan khối lượng phân tử thấp 40

Hình 3.6: Phổ 1H-NMR của chitosan khối lượng phân tử thấp 41

Hình 3.7: Phổ 13C-NMR của chitosan khối lượng phân tử thấp 41

Hình 3.8: Phổ nhiễu xạ tia X của Chitosan khối lượng phân tử thấp 42

Hình 3.9: Khả năng hấp phụ Cd2+ của LWC 43

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Một số các kim loại nặng và ảnh hưởng của chúng đến cơ thể sống 21

Bảng 2.1: Thành phần chính của một số nguyên liệu chứa chitin 27 Bảng 3.1: Hàm lượng β-chitin trong mai mực ống 33 Bảng 3.2: Kết quả đo áp suất thẩm thấu của chitosan tại các nồng độ khác

Bảng 3.6: Độ dịch chuyển hóa học của proton (1H) của chitosan 41

Bảng 3.7: Độ dịch chuyển hóa học của cacbon (13C) của chitosan 42

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 1.1: Cấu tạo của xenlulozo, chitin, chitosan 4

Sơ đồ 1.2: Sơ đồ điều chế chitosan 10

Sơ đồ 1.3: Quá trình sản xuất chitin/chitosan truyền thống 10

Sơ đồ 1.4: Công thức cấu tạo của chitin/chitosan 11

Sơ đồ 1.5: Phản ứng đeaxetyl hóa chitin 11

Sơ đồ 1.6: Sơ đồ cơ chế phản ứng thủy phân axit liên kết glucozit của chitosan 16

Sơ đồ 1.7: Cơ chế thủy phân liên kết N-axetyl (phản ứng SN2) 17

Sơ đồ 2.1: Quy trình điều chế chitosan khối lượng phân tử thấp 30

Sơ đồ 3.1: Phản ứng đeaxetyl hóa chitin 34

BẢNG CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG KHÓA LUẬN

Ac: CH3CO CTS: Chitosan DDA: Độ đề axetyl hóa DA: Độ axetyl hóa DMAc: N,N-đimetyl axetamit DP: Độ polymer hóa trung bình GlcN: D-glucosamin

GlcNAc: N-axetyl-D-glucosamin IR: Hồng ngoại

LAB: Lactic axit bacterial

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Lí do chọn đề tài 1

2 Mục đích nghiên cứu 2

3 Nhiệm vụ nghiên cứu 2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1 Giới thiệu chung [1,2,4,15,21] 3

1.1 Cấu trúc tinh thể [1,2,4,31] 4

1.2 Tính tan [22,28] 5

1.3 Khối lượng phân tử [22] 5

1.4 Độ axetyl hóa - Xác định độ axetyl/đeaxetyl hóa [9,14,18] 6

2 Phương pháp điều chế chitin/chitosan [8,20] 8

2.1 Tách chitin từ vỏ phế thải thủy hải sản [1,4,19,20] 8

2.2 Điều chế chitosan [1, 2, 4, 20] 9

3 Tính chất hóa học [1,2,5] 11

3.1 Phản ứng ở nhóm -OH 11

3.2 Phản ứng ở nhóm axetamit 11

3.3 Phản ứng ở nhóm -NH2 12

3.4 Phản ứng cắt mạch chitosan 12

3.4.1 Phương pháp chiếu xạ 13

3.4.2 Phương pháp thủy phân bằng enzym 14

3.4.3 Phương pháp hóa học 15

4 Giới thiệu sơ lược về kim loại nặng 18

4.1 Ảnh hưởng của kim loại nặng và hậu quả của chúng 19

4.2 Giới thiệu về cadimi 21

5 Một số ứng dụng của chitin/chitosan và dẫn xuất 22

5.1 Ứng dụng trong xử lý nước thải 23

5.1.1 Hấp phụ ion kim loại nặng [35] 23

5.1.2 Hấp phụ thuốc nhuộm hoạt tính [12,21,34] 23

5.2 Ứng dụng trong y dược [16,29] 24

5.3 Ứng dụng trong nông nghiệp 24

5.3.1 Chất kích thích sinh trưởng [11,34] 24

5.3.2 Chất bảo quản nông sản [17,25,32,36] 25

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 26

2.1 Nguyên liệu, hóa chất, dụng cụ và thiết bị nghiên cứu 26

2.1.1 Nguyên liệu, hóa chất 26

2.1.2 Dụng cụ, thiết bị nghiên cứu 26

2.2 Thực nghiệm: 27

2.2.1 Điều chế Chitin/chitosan: 27

2.2.1.1 Điều chế chitin: 27

2.2.1.2 Điều chế chitosan: 28

2.2.1.3 Xác định độ axetyl hóa /deaxetyl hóa: 29

2.2.1.4 Xác định khối lượng phân tử trung bình số của chitosan 29

2.2.2 Điều chế chitosan khối lượng phân tử thấp (LWC) 30

2.2.2.1 Quy trình điều chế chitosan khối lượng phân tử thấp 30

2.2.2.2 Khảo sát phản ứng với điều kiện thí nghiệm khác nhau 30

2.2.2.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng đến khối lượng phân tử trung bình  M n của chitosan khối lượng phân tử thấp (LWC) 30

2.2.2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ H 2 O 2 đến khối lượng phân tử trung bình ( M n ) của chitosan trọng lượng phân tử thấp (LWC) 31

2.2.2.2.3 Khảo sát tính tan trong nước của chitosan trọng lượng phân tử thấp (LWC) 31

2.2.3 Thăm dò khả năng hấp phụ ion kim loại nặng của chitosan khối lượng phân tử thấp 31

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33

3.1 Điều chế chitin/chitosan 33

3.1.1 Điều chế chitin 33

3.1.2 Điều chế chitosan từ chitin theo phương pháp kiềm đặc kết hợp nhiệt độ cao 34

3.1.2.1 Phổ hồng ngoại 34

3.1.2.2 Phổ X-Ray 35

3.1.2.3 Khối lượng phân tử 36

3.2 Khảo sát các điều kiện ảnh hưởng đến phản ứng điều chế chitosan khối lượng phân tử thấp 37

3.2.1 Ảnh hưởng của nồng độ H2O2 đến khối lượng phân tử trung bình (Mn) sản phẩm phản ứng đề polyme hoá chitosan 37

3.2.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khối lượng phân tử trung bình (Mn) sản phẩm phản ứng đề polyme hoá chitosan 37

3.2.3 Đánh giá độ tan trong nước của các mẫu chitosan trọng lượng phân tử thấp 39

3.3 Xác định cấu trúc của chitosan khối lượng phân tử thấp 39

3.4 Nghiên cứu sơ bộ khả năng hấp phụ Cd 2+ của sản phẩm phản ứng 42 KẾT LUẬN CHUNG 44

TÀI LIỆU THAM KHẢO 45

MỞ ĐẦU

1 Lí do chọn đề tài

Chitin [poly-β-(1→4)-2-axetamiđo-2-đeoxy-D-glucopyranozơ], một polysaccarit với hàm lượng đứng hàng thứ hai trong tự nhiên sau xenlulozơ, là thành phần chính của vỏ các loài động vật giáp xác như: vỏ tôm, mai cua, mai mực… Chitin/chitosan là một polyme có nhiều tính chất đặc biệt: Tính hòa hợp sinh học, phân hủy sinh học, tính kháng khuẩn, kháng nấm, chống độc… Do đó được sử dụng nhiều trong các lĩnh vực y học, dược phẩm, nông nghiệp, mỹ phẩm, công nghệ môi trường…

Ở Việt Nam, giáp xác là nguồn nguyên liệu dồi dào chiếm 1/3 tổng sản lượng nguyên liệu thủy hải sản Trong công nghiệp chế biến thủy hải sản xuất khẩu chiếm đến 70% - 80% công suất chế biến Hằng năm, các nhà máy chế biến đã thải bỏ một lượng phế liệu giáp xác khá lớn khoảng 70.000 tấn/năm, chính lượng phế thải này đã gây ra hiện tượng ô nhiễm môi trường nghiêm trọng, gây ảnh hưởng lớn đến cuộc sống và sức khỏe của người dân Vấn đề ô nhiễm môi trường đang là vấn đề được quan tâm và có tính toàn cầu Sự bùng

nổ dân số cùng với tốc độ đô thị hóa, công nghiệp hóa nhanh chóng đó tạo ra một sức ép lớn tới môi trường sống ở Việt Nam, đặc biệt là với việc nguồn nước sinh hoạt ngày càng trở nên thiếu hụt và ô nhiễm Một trong số những tác nhân gây ô nhiễm nguồn nước chính là ion kim loại nặng Ở nồng độ thấp, các nguyên tố như Fe (II, III), Cu (II), Mn (II, VII)… là những nguyên tố vi lượng rất cần thiết cho cơ thể Nhưng khi ở nồng độ cao, chúng tích lũy theo chuỗi thức ăn gây ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe con người Một số nguyên tố như: Cr (VI), Cd (II), As (III,V)… còn được biết đến như tác nhân gây ung thư Đã có nhiều loại vật liệu được sử dụng để loại bỏ ion kim loại ra khỏi nguồn nước như: silicagel, zeolit, ligin, tảo biển, rong biển, chitosan, vật liệu clay, bã mía, than hoạt tính, chất dẻo tổng hợp… Tuy nhiên, trong số vật

liệu hấp phụ có nguồn gốc thiên nhiên thì chitin/chitosan và dẫn xuất của nó được cho là vật liệu có khả năng tạo phức tốt nhất với ion kim loại nặng, ion quý hiếm, thuốc nhuộm và có thể tái sử dụng Vì vậy, nghiên cứu tổng hợp vật liệu hấp phụ sinh học trên cơ sở chitin/chitosan đã và đang được nhiều tác giả tiếp tục quan tâm và nghiên cứu

Để góp phần mở rộng ứng dụng của chitin/chitosan và các dẫn xuất,

góp phần bảo vệ môi trường, tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu

phản ứng điều chế chitosan khối lượng phân tử thấp bằng hydro peroxit (H 2 O 2 )

và khảo sát khả năng hấp phụ ion kim loại nặng”

2 Mục đích nghiên cứu

Điều chế chitosan khối lượng phân tử <10 000 Da bằng tác nhân oxy hóa (H2O2) và nghiên cứu thăm dò khả năng hấp phụ ion kim loại nặng trong môi trường nước của sản phẩm

3 Nhiệm vụ nghiên cứu

- Khảo sát các điều kiện phản ứng để điều chế oligochitosan: ảnh hưởng của nồng độ H2O2, thời gian phản ứng, nhiệt độ phản ứng để điều chế chitosan khối lượng phân tử <10000 Da

- Khảo sát các tính chất hóa lý của sản phẩm

- Khảo sát khả năng hấp phụ của ion kim loại nặng của sản phẩm

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1 Giới thiệu chung [1,2,4,15,21]

Trong số các polysaccarit, chitin là nguồn tài nguyên sinh học tự nhiên phong phú chỉ sau xenlulozơ Chitin có cấu trúc phân tử tương tự như xenlulozơ, mạch phân tử của chitin gồm các mắt xích N-axetyl-D-glucosamin nối với nhau bằng liên kết (14) glycosit hay 2-axetamido-2-deoxy- -D-glucozơ Chitosan là sản phẩm deaxetyl hoá của chitin có tên gọi là 2-amido-2-deoxy - -D-glucozơ Trong thực tế chitin, chitosan cùng tồn tại trong một phân tử polymer, gồm các mắt xích (14)-N-axetyl-D-glucosamin và mắt xích (14) - D - glucosamin Khi tỷ lệ (14)-D-glucosamin nhiều hơn thì được gọi là chitosan, ngược lại là chitin Vì trong mắt xích: (14)-D-glucosamin có nhóm amino (-NH2) nên chitosan dễ tan trong một số dung dịch axit loãng như axit axetic 1%, axit focmic, trong khi đó chitin hầu như không tan trong các dung môi hữu cơ Tính tan của chitin - chitosan trong dung dịch axit axetic loãng tăng theo chiều tăng của tần suất xuất hiện nhóm amin trong mắt xích phân tử Người ta sử dụng đặc điểm này để phân biệt chitin hay chitosan Nếu tan trong axit axetic loãng thì gọi là chitosan, nếu không tan thì gọi

là chitin Ngoài ra có thể phân biệt bằng giá trị độ axetyl hoá (DA), hay độ deaxetyl hoá (DDA), DA=(1-DDA), nếu DA>50% được gọi là chitin, nếu DA<50% thì được gọi là chitosan Chitin-chitosan là polysacarit duy nhất có chứa nhóm chức amin nên được đánh giá là vật liệu có tiềm năng hơn xenlulozơ trong nhiều lĩnh vực với nhiều tính chất quý như có khả năng phân hủy sinh học,

có khả năng tương hợp sinh học và đặc biệt là có hoạt tính sinh học Chính vì vậy, ngày nay chitin-chitosan và các dẫn xuất vẫn đang được quan tâm nghiên cứu ứng dụng trong nhiều các lĩnh vực khác nhau như y dược, công nghệ thực phẩm, mỹ phẩm, nông nghiệp, công nghệ môi trường…vv

OH

O O

HO OH

OH

O O

HO

OH

OH

O O

HO OH

OH

O O

HO

OH

OH

O O

O HO

OH

NHCOCH3

O O

HO OH

NHCOCH3

O O

HO

OH

NHCOCH3

O O

HO OH

NHCOCH3

O O

HO

OH

NHCOCH3

O O

HO

OH

NHCOCH3O

O HO

OH

NH 2

O O

HO OH

NH2

O O

HO

OH

NH 2

O O

HO OH

NH2

O O

HO

OH

NH 2

O O

1.2 Tính tan [22,28]

Chitin thể hiện ái lực hạn chế với phần lớn các dung môi vì có liên kết hidro chặt chẽ giữa các phân tử Chitin thường (α-chitin) không tan và hầu như không trương trong dung môi thông dụng mà chỉ tan trong một số dung môi đặc biệt, ví dụ: N,N-dimetylaxetamit (DMAC) có chứa 5-10% LiCl

Chitosan là một polyamin không tan trong nước cũng như trong dung môi hữu cơ nhưng tan trong môi trường axit loãng Độ tan của chitosan phụ thuộc vào độ axetyl hóa, loại axit và nồng độ axit trong dung dịch Khi xử lý chitin/chitosan trong môi trường axit mạnh với nồng độ lớn thường xảy ra phản ứng depolyme hóa (cắt mạch) làm giảm khối lượng phân tử polyme

1.3 Khối lƣợng phân tử [22]

Khối lượng phân tử chitin/chitosan là thông số quan trọng nhưng khó

có thể xác định được chính xác do tính tan kém của chúng và sự đa dạng về kiểu phân bố các nhóm axetyl cũng như mức độ axetyl hóa

Khối lượng phân tử của chitin tự nhiên càng khó xác định vì nó tồn tại

ở dạng chặt chẽ với protein, muối khoáng cũng như hầu hết các chất màu Hơn nữa, độ dài mạch chính của chitin/chitosan có thể giảm trong quá trình

xử lý với axit và kiềm Khối lượng phân tử chitin sau khi tách khỏi protein cũng như các chất khác được tính toán theo các phương pháp đo độ nhớt, sắc

ký thẩm thấu gel (GPC-Gel Permeation Chromatography) hoặc sắc ký loại trừ theo độ lớn phân tử (SEC -Size Exclusion Chromatography) trong dung môi DMAc/LiCl Kết hợp các phương pháp SEC, tán xạ ánh sáng và đo độ nhớt thì có thể xác định được chính xác khối lượng phân tử trung bình và độ phân

bố của khối lượng phân tử Từ các số liệu thu được từ phương pháp GPC đã khẳng định các mẫu chitin tách từ mai cua, vỏ tôm và mai mực ống có độ polyme hóa (degree of polymeizaion - DP) nằm trong khoảng 2000 - 4000 Chitosan tan được trong dung dịch axit loãng và khối lượng phân tử có thể

xác định theo phương pháp sắc ký lỏng cao áp ghép nối với cột loại trừ theo

độ lớn phân tử (SE-HPLC-size exlusion high performance liquid chromatography) GPC-HPLC, GPC, phương pháp đo độ nhớt… cũng có thể chuyển hóa chitosan thành chitin qua phản ứng N-axetyl hóa và khối lượng phân tử được tính theo phương pháp GPC trong hệ dung môi DMAc/LiCl Trong đó phương pháp đơn giản nhất để xác định khối lượng phân tử polyme

là xác định theo phương pháp gián tiếp qua phép đo độ nhớt Phép đo độ nhớt không phải là phương pháp tuyệt đối để xác định khối lượng phân tử mà chỉ

là phương pháp tương đối dựa trên cơ sở độ nhớt của dung dịch polyme tăng

tỉ lệ với số lượng các phân tử thêm vào

Phương pháp đo áp suất thẩm thấu là phương pháp dựa trên định luật Vant-Hoff Theo định luật này, sự phụ thuộc giữa áp suất thẩm thấu P, thể tích V và nhiệt độ tuyệt đối T và số gam phân tử của vật chất trong dung dịch pha loãng được biểu diễn bằng phương trình trùng với dạng phương trình của dạng khí lí tưởng:

PV = nRT = (g/M)RT

→ P = (g/V)(RT)/M

→M = (RTC)/P Trong đó:

g: khối lượng của chất hòa tan (g)

M: khối lượng phân tử của chất (g/mol)

C: nồng độ của dung dịch

R: hằng số

T: nhiệt độ tuyệt đối

1.4 Độ axetyl hóa - Xác định độ axetyl/đeaxetyl hóa [9,14,18]

Độ axetyl hóa là hàm lượng nhóm (-NHCOCH3) còn độ đeaxetyl hóa là hàm lượng nhóm (-NH2) trong chitin và chitosan Mắt xích cơ sở của chitin là

N-axetyl-D-glucosamin (GlcNAc) Mặc dù hầu hết các nhóm amino gắn với C2 đã bị axetyl hóa, nhưng trong tự nhiên chitin vẫn tồn tại một số nhóm amino tự do Hơn nữa, phản ứng đeaxetyl hóa chitin còn xảy ra trong quá trình tách loại protein bằng kiềm Vì vậy, các mẫu chitin trên thực tế có DDA khác nhau (khoảng 5 - 15%) phụ thuộc vào nguồn gốc và cách điều chế chúng Để thu được chitin có cấu trúc thuần nhất (chỉ gồm các mắt xích GlcNAc) thì phải tiến hành N-axetyl hóa chọn lọc các nhóm amino tự do Khi chitin bị đeaxetyl hóa đáng kể thì trở nên tan trong dung dịch axit axetic loãng

và được gọi là chitosan

O OH

NH2O OH

DDA

O OH

NHCOCH 3 O OH

N-NRM ở trạng thái rắn, cho phép đo lưỡng sắc cầu, phổ khối, chuẩn độ điện thế, chuẩn độ nitrat (phương pháp chuẩn độ sử dụng bạc nitrat), chuẩn độ với axit picric, chuẩn độ độ dẫn, sắc ký lỏng cao áp, sắc ký khí - lỏng, sắc ký thẩm thấu gel, nhiệt phân - sắc ký khí, sắc ký khí

Trong các phương pháp xác định DA đã được áp dụng thì phổ IR là phương pháp thuận tiện đặc biệt trong trường hợp mẫu ở trạng thái rắn, không

hòa tan trong các dung môi Đối với chitosan (tan trong môi trường axit loãng) thì phổ 1H-NRM là phương pháp nhanh, chính xác và có độ nhạy cao

Đo trong dung môi D2O, CD3COOD/D2O hoặc DCl/D2O

2 Phương pháp điều chế chitin/chitosan [8,20]

Chitin có ở nhiều loài khác nhau, từ các loài nấm đến các động vật bậc thấp Vỏ của các loài động vật chân đốt là nguồn nguyên liệu chính để điều chế chitin, trong thành phần của vỏ các loài động vật này có chứa 20 - 50% chitin tính theo khối lượng khô Vỏ tôm, mai cua là nguồn nguyên liệu phế thải từ công nghiệp chế biến thủy sản, hải sản được sử dụng để sản xuất chitin thương mại Các nguồn nguyên liệu khác để sản xuất chitin là: mai mực, sâu

bọ, tảo, nấm… Thành tế bào một số loại nấm chứa cả chitin cũng như chitosan và được coi là nguồn chitosan tự nhiên Chitosan được điều chế bằng cách thực hiện phản ứng deaxetyl hóa chitin trong môi trường kiềm

2.1 Tách chitin từ vỏ phế thải thủy hải sản [1,4,19,20]

Nguyên tắc chung để điều chế chitin là loại bỏ muối khoáng (chủ yếu là canxicacbonat), protein và các chất màu khỏi phế liệu thủy, hải sản Hai phương pháp chủ yếu được áp dụng để tách chitin/chitosan là phương pháp hóa học và phương pháp lên men vi sinh vật

Theo phương pháp hóa học: Quá trình điều chế chitin được thực hiện

theo các bước: tách khoáng - tách protein - khử màu Muối khoáng thường được tách ra bằng cách xử lý nguyên liệu với dung dịch axit HCl, protein bị thủy phân trong môi trường kiềm, chất màu được loại bỏ bằng dung môi hoặc tác nhân oxi hóa Trong quá trình xử lý, một số nhóm axetamit trong các mạch đại phân tử chitin bị thay thế bởi nhóm amino do phản ứng deaxetyl hóa

Điều chế chitin theo phương pháp hóa học có một số mặt hạn chế như phải sử dụng một lượng lớn kiềm, axit, nước rửa do đó chi phí lớn và gây ô nhiễm môi trường Việc sử dụng axit và kiềm nóng dẫn đến việc cắt giảm mạch chitin tạo ra nhiều sản phẩm khác nhau

Theo phương pháp xử lý vi sinh vật: Protein được tách khỏi vỏ các

loài giáp xác bằng cách xử lý với enzim hay vi sinh vật theo nguyên tắc: vi khuẩn sinh ra lactic (LAB: lactic acid bacterial) tự có trong phủ tạng của vỏ phế thải (vỏ tôm, cua, mai mực…) với một lượng rất nhỏ cùng với nguồn LAB thuần chủng được bổ sung có tác dụng bảo quản và thủy phân phế thải Hỗn hợp lên men bao gồm: vỏ phế thải, LAB, dung dịch glucozo Trong quá trình lên men, LAB sản sinh ra axit lactic làm giảm pH của môi trường, tạo điều kiện cho quá trình thủy phân protein, thủy phân khoáng tạo thành các lactat canxi, magie…là các muối tan được trong nước Bằng phương pháp ly tâm, phần dung dịch lỏng chứa protein và các muối khoáng hòa tan được loại

bỏ thu được phần chitin không hòa tan Để có chitin sạch, có thể xử lý tiếp bằng dung dịch axit và kiềm loãng

Phương pháp điều chế chitin bằng phương pháp lên men vi sinh vật có một số ưu điểm như chi phí thấp, cấu trúc sản phẩm không bị thay đổi nhiều

và đặc biệt là ít gây ô nhiễm môi trường

β-chitin được sản xuất chủ yếu từ mai mực ống theo cách đơn giản hơn

vì thành phần của mai mực ống chủ yếu là chitin, hàm lượng protein và muối khoáng thường rất thấp Hơn nữa, do sự sắp xếp các mạch đại phân tử trong β-chitin khác hẳn với α-chitin nên α-chitin có các liên kết hidro chặt chẽ hơn,

vì vậy khi xử lý mai mực ống với axit và kiềm thường ở điều kiện êm dịu hơn nhiều so với xử lý vỏ tôm để thu được β-chitin

2.2 Điều chế chitosan [1, 2, 4, 20]

Chitosan là sản phẩm deaxetyl hóa của chitin Chitosan thương mại có nhiều loại với độ deaxetyl hóa khác nhau nhưng thường được điều chế bằng cách deaxetyl hóa chitin trong môi trường kiềm nồng độ 40 - 50% ở 100 -

130oC trong 24 giờ Phản ứng deaxetyl hóa xảy ra như sau:

O OH

NHCOCH3O OH

n

O OH

NH2O OH

x

O OH

NHCOCH 3 O OH

y

dd NaOH, to

Sơ đồ 1.2: Điều chế chitosan

Chitosan thu được theo phương pháp này có DDA lên tới 90% Để thu được chitosan có độ deaxetyl hóa cao hơn phải tiến hành phản ứng lặp đi lặp lại nhiều lần Phản ứng deaxetyl hóa β-chitin diễn ra dễ dàng hơn nhiều so với α-chitin: Từ các mẫu α-chitin, β-chitin có DDA tương đương nhau tiến hành phản ứng deaxetyl hóa trong NaOH 30% ở 100oC với thời gian như nhau (2 giờ) thu được β-chitosan với DDA ≈ 70% trong khi đó đối với α-chitin giá trị

đó là ≈20% Tuy nhiên khi sử dụng dung dịch kiềm đặc thì bên cạnh phản ứng deaxetyl hóa còn xảy ra phản ứng thủy phân mạch chitin/chitosan làm giảm đáng kể khối lượng phân tử của chitin/chitosan

Ta có thể mô tả quá trình điều chế chitosan từ vỏ mai mực ống qua sơ

Sơ đồ 1.4: Công thức cấu tạo của chitin/chitosan

Ta thấy trong mỗi mắt xích của chitin/chitosan vừa có nhóm chức OH) vừa có nhóm chức amin (-NHCOCH3/NH2) nên có ba trung tâm phản ứng chính, vì vậy nó vừa có tính chất của ancol lại vừa có tính chất của amin

(-3.1 Phản ứng ở nhóm -OH

Phản ứng với axit, anhidric axetic hay HCl thu được sản phẩm ở dạng este

[Chit(OH)2]n + 2nHCl → [Chit(OCl)2]n + 2nH2O Phản ứng với ankyl sunfat trong ankyl halogenua thu được các este Phản ứng với các hợp chất vinyl tạo este

Trong mỗi mắt xích của chitin có 2 nhóm (-OH) ở C3 và C6, đều có khả năng tham gia phản ứng Do cấu trúc phân tử, nhóm (-OH) bậc 2 ở C3 bị án ngữ không gian nên phản ứng kém hơn nhóm (-OH) bậc 1 ở C6

n

O OH

Phản ứng trên thường được thực hiện với NaOH 40% ở 120oC trong 1→3h Hiệu suất đeaxetyl hóa chỉ đạt 70% Điều này có nghĩa là sản phẩm phản ứng là chuỗi polyme vẫn có cả mắt xích N-axetyl-D-glucozamin đan xen với β (1→4) glucozamin

Để đánh giá mức độ đeaxetyl hóa của chitin người ta đưa ra khái niệm

độ đeaxetyl hóa (DDA) được tính theo công thức sau:

DDA =

Với A là tổng số % mắt xích N-axetyl-D-glucozamin

Muốn thu được chitosan đeaxetyl hóa hoàn toàn DDA  0, phải rửa sạch mẫu rồi xử lý kiềm lặp lại nhiều lần

3.3 Phản ứng ở nhóm -NH 2

Phản ứng xảy ra ở nhóm amin -NH2 và nhóm amit - NHCOCH3 hai nhóm này gắn ở vị trí C2 (hay ở vị trí N) Tại đây nhóm -NH2 của chitin/chitosan có đôi điện tử không phân chia do đó về mặt hóa học, chúng có khả năng phản ứng cao với các tác nhân ái lực electron để tạo ra các dẫn xuất tương ứng

Phản ứng gắn với các nhóm -OH tại C3 (hoặc C6) hay gắn polietylenglycol vào nhóm -NH2 thu được các dẫn xuất có cấu trúc hóa học cồng kềnh nhằm cản trở không gian, làm giảm các liên kết cầu hidro giữa các mạch và trong mạch phân tử của chitin/chitosan như lúc ban đầu, để tạo ra các dẫn xuất tan trong nước

3.4 Phản ứng cắt mạch chitosan

Do quá trình chuyển hóa trong động thực vật chủ yếu xảy ra trong môi trường nước nên chitosan với khả năng tan kém trong nước đã làm hạn chế phần nào hiệu quả và phạm vi ứng dụng Vì vậy, để tăng khả năng ứng dụng của chitosan chúng ta phải cải thiện khả năng tan trong nước của chitosan

Hiện nay, trên thế giới, các nhà khoa học đã nghiên cứu và tìm ra rất nhiều phương pháp để cải thiện khả năng tan trong nước của chitosan, trong

đó phương pháp đề polyme hóa được coi là phương pháp đơn giản và hiệu quả nhất

Quá trình depolyme hóa là quá trình phả hủy các liên kết glucozit trong mạch đại phân tử dưới các tác nhân cắt mạch như: enzym, hóa chất chiếu xạ…Các tác nhân cắt mạch phá hủy liên kết glucozit, chuyển hóa chitosan thành oligome có khả năng tan trong nước cao hơn so với chitosan đại phân tử

Có nhiều phương pháp cắt mạch chitosan như: cắt mạch bằng enzym, cắt mạch bằng chiếu xạ, cắt mạch bằng phản ứng hóa học… Trong đó cắt mạch bằng phản ứng hóa học là phương pháp đơn giản và được sử dụng rộng rãi nhất

3.4.1 Phương pháp chiếu xạ

Quy trình chiếu xạ để thủy phân chitosan:

Chitosan bột, đóng gói bằng polyetylen, được chiếu xạ với nguồn tia γ

Co60(coban), tốc độ chiếu 1,4 kGy.h-1, liều chiếu xạ từ 10-500 kGy Chitosan sau khi chiếu xạ được làm trương nở trong nước (100g chitosan/1 lít H2O) trong 30 phút Sau đó cho thêm axit axetic 1N, khuấy trong 4 giờ cho tan hoàn toàn Tiến hành trung hòa bằng 0,5M natribicacbonat, pH của dung dịch

là 6 Dùng H2O2 để khử màu của sản phẩm và các sản phẩm khác trong quá trình chiếu xạ Tiến hành phân tách: Kết tủa bằng dung dịch etanol, sau đó lọc thu được hai dạng sản phẩm, phần kết tủa, phần nước lọc Phần kết tủa được rửa bằng MeOH và làm khô Phần nước trong được cô đặc lại, kết tủa và đem lọc thu hồi sản phẩm Tiến hành đo độ nhớt (η) đồng thời xác định khối lượng phân tử trung bình ( Mw) của sản phẩm Cơ chế của quá trình chiếu xạ:

Trong đó R-H và R-NH2 là các phân tử chitosan có khối lượng phân tử lớn, R C n là gốc chitosan khối lượng phân tử lớn nằm trong nguyên tử cacbon Cn, F1, F2 là phần của chuỗi chính Sau khi bị bẻ gãy, độ nhạy chiếu

xạ của phân tử polyme cho trước có thể được đánh giá từ hiệu suất depolyme chiếu xạ của nó

Phương trình của Charlesby Pnner:

D Gd

1

Trong đó, Mn là khối lượng phân tử trung bình số của chitosan ở liều lượng hấp thụ được; D và Mno là khối lượng phân tử trung bình số của chitosan ban đầu Kết quả thu được cho thấy chitosan 8B (DDA=99%) thì nhạy cảm hơn phương trình chiếu xạ so với 10B (DDA=90%)

Ưu điểm của phương pháp là không có dư lượng hóa chất nên có độ tinh khiết cao Nhược điểm là yêu cầu có thiết bị đặc biệt, hiệu quả cắt mạch kém hơn so với phương pháp hóa học Phương pháp chiếu xạ phù hợp cho sự phân hủy các loại polyme khác nhau

3.4.2 Phương pháp thủy phân bằng enzym

Có tới hơn 30 loại enzymcó thể sử dụng được để phân hủy chitin/chitosan: chitosanaza, aminaza, hemicellulaza, cellulaza, papain, lysozyme, pepsin… Trong dó pepsin, papain, pectinaza, có tác nhân lytic tốt hơn các loại enzym khác và hiệu quả cắt mạch polyme cao nhất là sử dụng pectinaza Phương

pháp thủy phân bằng enzym cho phép thu được sản phẩm có dư ít lượng hóa chất, nên rất phù hợp với mục đích sử dụng trong y học Tuy nhiên vấn đề mở

rộng quy trình sản xuất còn có nhiều khó khăn Trong số các loại enzym được

sử dụng loại hemicellulaza có giá thành rẻ hơn cả

Quá trình thủy phân bằng enzym: Chitosan được hòa tan trong dung

dịch axit axetic 1% ÷ 2% khuấy sau 3 giờ, điều chỉnh pH= 5,5 Để qua đêm,

sau đó đặt vào bể ổn nhiệt (50o

C với hemixenlluloza) hay tủ ấm (37oC với

pectinaza) Cho dung dịch enzym vào, lượng enzym được tính theo lượng chất tan (chitosan) Dừng phản ứng cắt mạch sau 3÷30 giờ (tùy từng loại enzym) bằng cách đun sôi dung dịch phản ứng trong 10 phút để tách bỏ enzym Tiến

hành lọc, dung dịch sau khi lọc được trung hòa bằng NaOH 10%, pH đạt giá trị pH=9 Tiến hành ly tâm thu được phần kết tủa, rửa sản phẩm kết tủa bằng etanol nhiều lần Sản phẩm lại được tách bằng sắc ký lỏng cao áp HPLC để phân đoạn

Quá trình thủy phân khi có mặt pectinaza (chiết từ nấm cúc màu nâu

sẫm) ở pH=3, nhiệt độ 37oC làm cho độ nhớt của dung dich giảm nhanh Oligome thu được trong quá trình này có khối lượng phân tử dao động trong khoảng 20,000÷5000 Da Chitosan khối lượng phân tử thấp có độ kết tinh cao hơn và đa dạng hình hơn chitosan

3.4.3 Phương pháp hóa học

 Phương pháp thủy phân axit:

Một số tác giả thủy phân chitosan bằng cách hòa tan chitosan trong axit HCl (0,5%) với nồng độ polyme 1%÷ 1,5% khuấy ở 65oC÷100oC trong 3 giờ Sau đó để nguội đến nhiệt độ thường Dùng NaOH để trung hòa (đến pH8) Tiến hành lọc, phần kết tủa được rửa nhiều lần bằng etanol, sau đó làm khô bằng axeton Phần nước trong được tách muối bằng MeOH, sau đó cô đặc lại

và kết tủa trong etanol để thu phần sản phẩm tan trong nước Các nghiên cứu cho thấy độ polyme hóa DP phụ thuộc vào nồng độ axit HCl Khi dùng axit HCl đặc nóng thu được sản phẩm có DP= 2÷5, khi dùng axit HCl loãng (0,5%) thu được sản phẩm có DP≈30…

Các loại axit vô cơ đã được sử dụng như: Axit clohydric (HCl), axit sunfuric (H2SO4), axit photphoric (H3PO4), axit nitric (HNO3) Trong đó axit clohydric được nghiên cứu nhiều hơn cả Do giá thành HCl và khi trung hòa bằng NaOH, sản phẩm phụ là NaCl không độc, dễ tách

Ưu điểm của phương pháp là: Phản ứng cắt mạch xảy ra mạnh nhanh, nhưng các bước tách sản phẩm và dư lượng hoá chất thường khó triệt để

Sự thủy phân của liên kết glucozit (depolyme hóa) và liên kết N-axetyl của chitosan được nghiên cứu trong HCl đặc, HCl loãng Các kết quả nghiên cứu cho thấy, tốc độ thủy phân của kiên kết glucozit tương đương với tốc độ

đề N-axetyl hóa trong axit loãng Trong khi đó thì liên kết glycozit được thủy phân nhanh hơn 10 lần so với liên kết N-axetyl trong HCl đặc Điều này có thể giải thích bằng cách giả sử rằng, quá trình thủy phân của liên kết N-axetyl

là phản ứng SN2, trong khi thủy phân của liên kết glucozit là phản ứng SN1, với bước làm giảm vận tốc là sự hình thành cacbocation

H

Tốc độ tới hạn (Rate-limiting)

O O

Sơ đồ 1.6: Sơ đồ cơ chế phản ứng thủy phân axit liên kết glucozit của chitosan

Cơ chế được chấp nhận của quá trình thủy phân liên kết glucozit (phản ứng S N 1)

O O

OH

CH2OH

O NH

CH3 O

O OH

CH2OH

O NH

CH3 OH

O O

OH

CH2OH

O NH

Sơ đồ 1.7: Cơ chế thủy phân liên kết N-axetyl (phản ứng S N 2)

Trên đây là sơ đồ mô tả cơ chế thủy phân liên kết N-axetyl và liên kết

glucozit của chitosan bằng axit

- Thủy phân liên kết N-axetyl (phản ứng SN2)

- Thủy phân liên kết glucozit (phản ứng SN1)

 Phương pháp oxy hóa cắt mạch bằng tác nhân H 2 O 2

Các tác nhân oxy hóa được sử dụng như là: HNO3/NaNO2, H2O2

Cơ chế đề polyme trong hệ chitosan và H2O2 như sau:

HO HOO

O

H2 2      2  2

(5*)

HO là gốc oxi hóa rất mạnh, phản ứng chủ yếu của HOvới polysaccarit được chứng minh là mất bớt hydro Nó phản ứng với cacbonhydrat rất nhanh và phản ứng như phương trình:

4 Giới thiệu sơ lƣợc về kim loại nặng

Kim loại nặng là nhưng kim loại có khối lượng riêng lớn hơn 5g/cm3 Các kim loại nặng tồn tại trong nước thải gây ảnh hưởng tới sức khỏe con người và môi trường sống như là Zn, Cu, Pb, Cd, Hg, Ni, Cr, As… Một vài kim loại trong số này có thể cần thiết cho cơ thể sống (bao gồm động vật, thực vật, các vi sinh vật) khi chúng ở một hàm lượng nhất định như Zn, Cu, Fe … tuy nhiên khi ở một lượng lớn hơn hoặc nhỏ hơn nó sẽ trở nên độc hại Những nguyên tố như Pb, Cd, Ni không có lợi ích nào cho cơ thể sống Những kim loại này khi đi vào cơ thể động vật hoặc thực vật ngay cả ở dạng vết cũng có thể gây độc hại

Nguyên nhân chính gây ra ô nhiễm kim loại nặng là do các quá trình sản xuất công nghiệp, quá trình khai khoáng, quá trình tinh chế quặng, kim loại, sản xuất kim loại thành phẩm, các ngành công nghiệp khác như quá trình

tạo màu và nhuộm, các sản phẩm thuộc da, cao su, dệt, giấy, luyện kim, mạ điện và nhiều ngành khác… Khác biệt so với nước thải ngành công nghiệp, nước thải sinh hoạt thường chứa trong nó một lượng kim loại nhất định bởi quá trình tiếp xúc lâu dài với Cu, Zn, hoặc Pb của đường ống hoặc bể chứa

Kim loại nặng được phân loại nói chung là chất độc hại hoặc rất độc hại đối với các động vật sống dưới nước hoặc rất nhiều các loài thực vật

Trong môi trường các kim loại nặng tồn tại trong các hợp chất vô cơ hoặc hữu cơ Có một vài bằng chứng cho thấy rằng khi trong nước thải có chứa các hợp chất hữu cơ thì độc tính của kim loại đối với các động thực vật sống giảm đi Tuy nhiên cũng có khi tồn tại một số các hợp chất hữu cơ mà sự

có mặt của nó cùng với các kim loại nặng lại làm tăng thêm độc tính của kim loại đó Ví dụ như metyl thủy ngân

Đối với con người một số các kim loại khi tồn tại một hàm lượng nhất định trong cơ thể con người sẽ có ích, tuy nhiên khi nồng độ của các kim loại này lớn hoặc thấp hơn mức cho phép thì nó sẽ là chất độc gây rối loạn trong

cơ thể con người và tạo ra các bệnh nguy hiểm như rối loạn cơ quan thần kinh, phá hủy gan, thận hoặc gây ra các bệnh ung thư…

4.1 Ảnh hưởng của kim loại nặng và hậu quả của chúng

Ngày nay con người tiếp xúc trực tiếp với kim loại nặng ở nhiều dạng thức khác nhau Kim loại nặng đã đi vào cơ thể con người và sinh vật qua chuỗi thức ăn Loài người tiếp xúc lâu dài với các kim loại độc hại trong môi trường với liều lượng khác nhau Giáo sư Jerome Nriagu thuộc trường đại học Michigan khẳng định: “Hơn 1 tỷ người đã thành các vật thí nghiệm thực sự khi tiếp xúc với những kim loại độc có hàm lượng cao trong môi trường” Theo tác giả này, nhiều triệu người bị các chứng nhiễm độc kim loại dưới mức phát bệnh Như ta sẽ thấy sau đây, phần lớn những người nhiễm độc ở các nước đang phát triển, Liên xô cũ và Trung Âu, nhưng có nhiều khu đô thị

của các nước phát triển đã trở thành nơi bị ô nhiễm nặng bởi kim loại Sự nhiễm độc ngày càng tràn lan, nhất là nếu như việc xả chất thải cứ tiếp tục theo mức độ hiện nay thì ta khó lòng hy vọng sự tăng trưởng này có khi nào giảm đi được Trong một nghiên cứu số lượng kim loại xả ra trên toàn cầu, khẳng định là nó gia tăng ở thế giới thứ ba, có lẽ do việc các công nghiệp gây

ô nhiễm nhất được đưa sang các nước phương Nam và giảm bớt ở các nước công nghiệp, do đó người và các sinh vật khác phải tiếp xúc với kim loại ở mức cao hơn nhiều so với mức họ vẫn sống” Về mặt này, thuỷ ngân, Crom, Cadimi, Chì ở trong số những kim loại nặng độc hại nhất, sau đó đến Đồng

Nếu ta loại trừ các kim loại độc hại nhất hoặc các kim loại không có chút ích lợi nào cho người mà ta đã biết như Chì, Cadimi thì ở đây cũng thế,

“chính là liều lượng tạo chất độc”, như Paracelse đã nói ở thời Trung cổ Trong một chế độ ăn uống bình thường, người ta tiêu thụ từ 2 đến 5 mg đồng mỗi ngày Thấp hơn số lượng này sinh ra bệnh thiếu máu và ở trường hợp đặc biệt của các trẻ em, người ta thấy có sự chậm tâm thần vận động, nhưng nếu liều lượng cao hơn 15 mg/ngày, những triệu chứng nôn mửa và đau bụng xuất hiện và ở các ca nghiêm trọng có thể tiến đến hôn mê và tử vong