Nghiên cứu bào chế vi nang lactobacillus acidophilus với alginat và chitosan bằng phương pháp đông tụ

Các công nghệ mới khác nhau như bao vi nang, cố định tế bào và lên men liên tục đã được phát triển để có thể cho ra tế bào có số lượng cao ở quy mô lớn và đảm bảo tính ổn định của probio

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về probiotic 2

1.1.1 Đại cương về probiotic 2

1.1.2 Vai trò của probiotic 2

1.1.3 Tình hình nghiên cứu và sản xuất các chế phẩm probiotic trên thế giới và Việt Nam 4

1.1.4 Loài Lactobacilus acidophilus 6

1.2 Tổng quan về vi nang 9

1.2.1 Khái niệm, đặc điểm và ưu nhược điểm của vi nang 9

1.2.2 Các ứng dụng của vi nang trong ngành Dược 12

1.2.3 Các phương pháp bào chế vi nang 13

1.2.4 Tổng quan một số thành phần sử dụng trong bào chế vi nang 19

1.2.5 Một số nghiên cứu trong và ngoài nước về bào chế vi nang probiotic 22

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị nghiên cứu 28

2.1.1 Nguyên liệu 28

2.1.2 Thiết bị 29

2.2 Nội dung nghiên cứu 30

2.2.1 Bào chế vi nang L acidophilus 30

2.2.2 Theo dõi độ ổn định của vi nang L acidophilus đông khô 31

2.3 Phương pháp nghiên cứu 31

2.3.1 Phương pháp bào chế vi nang L acidophilus 31

2.3.2 Phương pháp đánh giá 35

2.3.3 Phương pháp đánh giá độ ổn định của vi nang L acidophilus đông khô 40 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 41

3.1 Kết quả bào chế vi nang L acidophilus 41

3.1.1 Kết quả khảo sát yếu tố công thức ảnh hưởng đến vi nang 41

3.1.2 Kết quả khảo sát quy trình bào chế đến vi nang 56

3.2 Kết quả theo dõi độ ổn định của vi nang L acidophilus đông khô 62

3.3.1 Kết quả đánh giá vi nang L acidophilus ở thời điểm t = 0 62

3.3.2 Kết quả đánh giá khả năng hút ẩm của vi nang bào chế trong môi trường bão hòa muối Kali dihydro phosphat 63

3.3.3 Kết quả theo dõi độ ổn định của vi nang L acidophilus khi bảo quản ở các điều kiện khác nhau 64

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 67

4.1 Bàn luận về kết quả bào chế vi nang L acidophilus 67

4.1.1 Bàn luận về kết quả khảo sát công thức 67

4.1.2 Bàn luận về kết quả xây dựng quy trình 73

4.2 Bàn luận về kết quả theo dõi độ ổn định của vi nang đông khô 76

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 80

TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

(American Type Culture Collection)

B longum Bifidobacterium longum

B bifidum Bifidobacterium bifidum

B subtilis Bacillus subtilis

Cfu Số đơn vị khuẩn lạc (Colony-Forming Units)

DP Degree of Polymerization (Mức độ trùng hợp)

E coli Escherichia coli

EE Hiệu suất tạo nang (Encapsulation efficiency)

EY Hiệu suất bao vi sinh vật (Encapsulation yield)

FAO Tổ chức Nông lương thế giới (Food and Agriculture

Organization)

GRAS Chứng nhận an toàn (Generally Recognized As Safe)

MRS Môi trường nuôi cấy vi khuẩn (de Man, Rogosa,

Sharpe)

Bảng 2.4 Các yếu tố ảnh hưởng và các mức khảo sát 30 Bảng 2.5 Các thông số kỹ thuật và các mức khảo sát 31 Bảng 3.1 Kết quả bào chế vi nang khi thay đổi thể tích cắn sinh khối tế bào 42

Bảng 3.2 Kết quả bào chế vi nang khi thay đổi tỷ lệ pha nước /pha dầu 43 Bảng 3.3 Kết quả bào chế vi nang khi thay đổi tỷ lệ Tween 80 44 Bảng 3.4 Kết quả bào chế vi nang khi thay đổi nồng độ alginat 46

Bảng 3.5 Kết quả bào chế vi nang khi thay đổi nồng độ Calciclorid 48

Bảng 3.6 Kết quả bào chế vi nang khi thay đổi nồng độ glycerol 49

Bảng 3.7 Kết quả bào chế vi nang khi thay đổi nồng độ chitosan 51

Bảng 3.8 Kết quả đánh giá khả năng bảo vệ VSV của vi nang trong môi

trường acid pH 1,2 khi thay đổi nồng độ Chitosan 52

Bảng 3.9 Phần trăm số VSV sống sót ở các thời điểm so với mật độ ban

Bảng 3.10 Kết quả đánh giá khả năng giải phóng VSV trong môi trường đệm

phosphat pH 7,4 khi thay đổi nồng độ Chitosan 54

Bảng 3.11 Phần trăm số VSV giải phóng ở pH 7,4 so với mật độ ban đầu 55

Bảng 3.12 Kết quả bào chế vi nang khi thay đổi thời gian nhũ hóa 56

Bảng 3.13 Kết quả bào chế vi nang khi thay đổi tốc độ khuấy môi trường 57

Bảng 3.14 Kết quả bào chế vi nang khi thay đổi thời gian ủ trong calci clorid 58

Bảng 3.15 Kết quả bào chế vi nang khi thay đổi thời gian ủ vi nang trong

Bảng 3.18 Đặc tính của vi nang L acidophilus sau đông khô 62

Bảng 3.19 Phần trăm khối lượng vi nang tăng lên trong môi trường bão hòa

Bảng 3.20 Kết quả theo dõi chất lượng vi nang L acidophilus sau 5 tháng

Bảng 3.21 Kết quả theo dõi chất lượng vi nang L acidophilus sau 5 tháng

Bảng 4.1 So sánh kết quả nghiên cứu về thời gian nhũ hóa với các tác giả

Hình 1.5 Cấu trúc dạng mono α-L-guluronic acid (G); β-D-mannuronic acid

Hình 1.6 Vị trí của ion calci trong gel và sự tạo gel calci alginat 21 Hình 1.7 Cấu trúc hóa học của chitin, chitosan và cellulose 22

Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn hiệu suất tạo vi nang, hiệu suất bao VSV, số lượng

VSV sau đông khô khi thay đổi tỷ lệ pha nước /pha dầu

43

Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn hiệu suất tạo vi nang, hiệu suất bao VSV, số lượng

VSV sau đông khô khi thay đổi tỷ lệ chất diện hoạt 45

Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn hiệu suất tạo vi nang, hiệu suất bao VSV, số lượng

VSV sau đông khô khi thay đổi nồng độ alginat 47

Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn hiệu suất tạo vi nang, hiệu suất bao VSV, số lượng

VSV sau đông khô khi thay đổi nồng độ Calciclorid 48

Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn hiệu suất tạo vi nang, hiệu suất bao VSV, số lượng

VSV sau đông khô khi thay đổi nồng độ glycerol 50

Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn hiệu suất bao VSV, số lượng VSV trong 1g vi nang

Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn phần trăm số lượng VSV sống sót trong môi

trường acid pH 1,2 khi thay đổi nồng độ Chitosan 53 Hình 3.8 Đồ thị biểu diễn phần trăm số lượng VSV giải phóng trong môi 55

trường pH 7,4 khi thay đổi nồng độ Chitosan

Hình 3.9 Sơ đồ quy trình bào chế vi nang L acidophilus 61

Hình 3.11 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa kích thước vi nang và khả

năng hút ẩm trong môi trường bão hòa muối Kali dihydrophotphat 64 Hình 3.12 Đồ thị biến thiên độ ẩm theo thời gian bảo quản 65 Hình 3.13 Đồ thị biến thiên số lượng VSV theo thời gian bảo quản 66

ĐẶT VẤN ĐỀ

Cùng với sự phát triển của xã hội, khoa học công nghệ thì cụm từ, “chế phẩm

sinh học” không còn quá xa lạ đối với mọi người Nhắc tới chế phẩm sinh

học probiotic, prebiotic chúng ta thấy ngay được những lợi ích mà chúng mang lại

cho sức khỏe của con người Chế phẩm sinh học ngày nay đã được ứng dụng rộng

rãi trong nhiều lĩnh vực của đời sống như công nghiệp thực phẩm, sản xuất dược

phẩm, mỹ phẩm, nông nghiệp, thuốc thú y

Đối với chế phẩm probiotic, khả năng ổn định hoạt tính của probiotic là một

vấn đề quan trọng Những năm gần đây, việc sử dụng các polyme tự nhiên để thiết

kế xây dựng các hệ phân phối thuốc được nhiều nhà khoa học trên thế giới chú ý

đến bởi khả năng tương thích sinh học và phân hủy sinh học rất tốt của chúng Các

công nghệ mới khác nhau như bao vi nang, cố định tế bào và lên men liên tục đã

được phát triển để có thể cho ra tế bào có số lượng cao ở quy mô lớn và đảm bảo

tính ổn định của probiotic trong một thời gian dài

Tuy nhiên, ở Việt Nam, các sản phẩm probiotic vẫn chưa được chú trọng

nghiên cứu, nguồn cung cấp chủ yếu phụ thuộc vào nhập khẩu và sản xuất trong

nước chỉ với quy mô nhỏ Sản phẩm nhập khẩu có chất lượng ổn định nhưng giá

thành cao; trong khi các nhà sản xuất trong nước vẫn chưa quan tâm đến việc đầu tư

công nghệ mới Sản phẩm probiotic trong nước chủ yếu là các thế hệ cũ, ít được bảo

vệ khỏi sự suy thoái trong đường tiêu hóa cũng như sự giảm tỷ lệ sống sót gây ra

bởi các yếu tố bên ngoài như bao bì và điều kiện bảo quản Do đó, các chế phẩm

probiotic không phát huy được tác dụng cũng như hiệu quả điều trị không cao

Vì các lý do trên, chúng tôi đã thực hiện đề tài: “Nghiên cứu bào chế vi nang

Lactobacillus acidophilus với alginat và chitosan bằng phương pháp đông tụ từ

nhũ tương” với hai mục tiêu sau:

1 Xây dựng được công thức bào chế và xác định được một số thông số quy

trình bào chế vi nang L acidophilus với alginat và chitosan bằng phương pháp nhũ

tương ở quy mô phòng thí nghiệm

2 Bước đầu đánh giá độ ổn định của vi nang L acidophilus bào chế được

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về probiotic

1.1.1 Đại cương về probiotic

Khái niệm probiotic đầu tiên được đưa ra bởi nhà khoa học Eli Metchnikoff, ghi trong cuốn sách “Kéo dài sự sống” năm 1908 Ông cho rằng những người nông dân Bulgary sống lâu vì họ thường xuyên sử dụng sữa chua có chứa VK lactic có lợi cho VSV đường ruột [38] Đến năm 2002, Tổ chức Y tế thế giới (WHO) và tổ chức Nông lương thế giới (FAO) đã đưa ra định nghĩa hoàn chỉnh nhất về probiotic như sau: “Probiotic là những VSV sống mà khi đưa vào cơ thể với một lượng đủ lớn sẽ đem lại tác động có lợi cho sức khỏe vật chủ” [82] Những loài VK hay sử

dụng trong chế phẩm probiotic thuộc chi Bifidobacterium và chi Lactobacillus

Trong quá trình sử dụng, VK probiotic bị ảnh hưởng bởi nhiều điều kiện bất lợi của

MT bên ngoài và đường tiêu hóa, cho nên để có tác dụng, bất kỳ sản phẩm nào chứa probiotic nào cũng phải có ít nhất 107 - 108 cfu/ml TB VSV sống cho đến ngày hết hạn sử dụng [45, 70]

1.1.2 Vai trò của probiotic

1.1.2.1 Tác động kháng khuẩn

Probiotic làm giảm số lượng VK để ngăn chặn các mầm bệnh cụ thể là:

Tiết ra các chất kháng khuẩn: VK probiotic tạo ra các chất đa dạng có thể ức chế cả khuẩn Gram (+) và Gram (-) gồm có các acid hữu cơ, hydrogen peroxid và chất diệt khuẩn Những hợp chất này không chỉ làm giảm những sinh vật mang mầm bệnh có thể sống được mà còn ảnh hưởng đến sự trao đổi chất của VK và tạo

ra các độc tố do làm giảm pH khoang ruột thông qua sự tạo ra các acid chuỗi ngắn

dễ bay hơi, chủ yếu là các acid acetic, propionic, và butyric, nhất là acid lactic Các VSV probiotic còn có khả năng cạnh tranh với các VSV gây bệnh để ngăn chặn sự bám dính của chúng vào đường ruột và cạnh tranh dinh dưỡng cần thiết [72]

1.1.2.2 Tác động trên mô biểu bì ruột

- Probiotic đẩy mạnh sự liên kết chặt chẽ giữa những TB biểu mô và sự tạo ra các phân tử phòng vệ như chất nhầy

- Làm giảm kích thích việc bài tiết và những hậu quả do bị viêm của quá trình lây nhiễm VK [61]

1.1.2.3 Tác động miễn dịch

Probiotic được xem như là tác nhân kích thích giải phóng các phân tử kháng viêm cho đường ruột [48] Cụ thể:

- Đẩy mạnh sự báo hiệu cho TB vật chủ để làm giảm đáp ứng viêm

- Tạo đáp ứng miễn dịch để làm giảm dị ứng

- Cải thiện hệ VSV đường ruột, ngăn ngừa tiêu chảy và táo bón

1.1.2.4 Tác động đến vi khuẩn đường ruột

VK probiotic điều chỉnh thành phần của VK đường ruột và điều hòa hoạt động trao đổi chất của sinh vật đường ruột Sự sống sót của probiotic phụ thuộc vào công dụng và liều lượng của mỗi giống VK được tiêu hóa, vị trí trong đường tiêu hóa: ở khoang ruột, chúng tạo nên sự cân bằng tạm thời của hệ vi sinh đường ruột,

sự thay đổi này có thể thấy được sau một vài ngày sử dụng Probiotic có thể làm giảm pH của đường tiêu hóa và do đó sẽ gây cản trở cho hoạt động tiết enzym của VSV Mặt khác, probiotic còn làm tăng sự dung nạp đường lactose: giúp tránh khỏi tình trạng đầy hơi, khó tiêu khi hấp thu những loại thức ăn có chứa nhiều lactose và làm tăng VK có lợi và giảm VK gây hại [3]

1.1.2.5 Một số vai trò khác đối với cơ thể

Chống dị ứng: Bổ sung probiotic góp phần chống lại một số phản ứng dị ứng của cơ thể, cung cấp nhiều chất quan trọng cho cơ thể như (acid folic, niacin, riboflavin, vitamin B6 và B12

Chống ung thư: nhiều NC cho thấy các VK probiotic có thể làm giảm nguy

cơ ung thư ruột kết và ung thư bàng quang Ngoài ra còn có tác dụng khử chất độc gây ung thư có trong cơ thể và làm chậm sự phát triển của các khối u bướu

Probiotic có tác dụng làm giảm nồng độ cholesterol trong huyết thanh, làm giảm huyết áp cao Ngoài ra, còn giúp người bệnh nhanh chóng bình phục sau khi mắc bệnh tiêu chảy do sử dụng kháng sinh Probiotic đem lại nhiều tác dụng có lợi cho cơ thể vật chủ, nhưng hiểu biết của con người về cơ chế tác dụng của các VK probiotic còn rất hạn chế [59] Một số tác giả cho rằng VK probiotic ức chế sự phát

triển của các VK gây bệnh trong đường tiêu hóa Các cơ chế cụ thể được nêu ra như: cạnh tranh chất dinh dưỡng, cạnh tranh vị trí bám dính trên niêm mạc ruột, ức chế sự phát triển của VK có hại bằng kích thích hệ thống miễn dịch ruột, bằng các sản phẩm trao đổi chất của VK probiotic [33, 63]

1.1.3 Tình hình nghiên cứu và sản xuất các chế phẩm probiotic trên thế giới và Việt Nam

Việc sử dụng thực phẩm có chứa các VSV có lợi cho cơ thể đã được biết đến

từ lâu, tuy nhiên việc NC hệ VSV đường ruột và sử dụng probiotic mới thực sự phát triển từ những năm 80 của thế kỉ 20 Năm 1998, Apajalahti và cộng sự đã thực hiện những NC về đặc điểm phân loại và quần thể VSV đường ruột ở người và động vật

Netherwood và cộng sự (1999) [61]; Gong và cộng sự (2002) [36]; Yoon và cộng sự (2002) [83] đã sử dụng kỹ thuật gen để NC sự thay đổi cấu trúc quần thể và đặc điểm sinh học của hệ VSV đường ruột ở động vật dưới tác động của probiotic

Ở nước ta, các chế phẩm probiotic đã chiếm lĩnh thị trường hơn 10 năm nay, tuy nhiên việc NC sản xuất probiotic phục vụ cho đời sống mới bắt đầu được quan tâm Trong khoảng một thập kỷ gần đây, đã có sự gia tăng mạnh mẽ về số lượng các sản phẩm y tế có nguồn gốc từ probiotic Probiotic ngày càng được bào chế dưới nhiều dạng chế phẩm khác nhau sử dụng theo đường uống như bột, cốm, viên nang, pellet… và đường khác như viên đặt, kem bôi da Tuy nhiên, nhiều báo cáo chỉ ra rằng các VK probiotic trong các chế phẩm chủ yếu thuộc thế hệ 1 nên khả năng bảo

vệ VSV vẫn còn rất thấp, số lượng VSV sống sót được còn hạn chế [5]

Khác với các chế phẩm khác, chế phẩm probiotic phải duy trì số lượng VSV sống sót nhất định trong hệ tiêu hóa của người dùng trong thời hạn sử dụng Đa phần các sản phẩm probiotic sử dụng theo đường uống, nên chúng chịu tác dụng của dịch vị ở dạ dày và của acid mật ở ruột, vì vậy VSV bị chết rất nhiều, không đi đến ruột được hoặc đến ruột với số lượng ít không đủ gây tác dụng Việc đảm bảo khả năng sống sót của VSV probiotic trong sản xuất, bảo quản, lưu hành và giữ được tỉ lệ VSV sống sót cao ở ruột không hề đơn giản Do vậy, trong thành phần công thức và quy trình sản xuất các sản phẩm probiotic cần cải tiến so với các chế phẩm thông thường Chế phẩm probiotic thường có thêm các TD bảo vệ như chất

xơ, đường… Về phương pháp: có nhiều hướng NC khác nhau như tối ưu hóa phương pháp ĐK tạo bột, áp dụng phương pháp lên men 2 bước, phương pháp vi nang hóa, phương pháp bào chế kết hợp với sử dụng các TD bảo vệ [60]

Một số cơ sở có sản xuất nguyên liệu probiotic ở nước ta là công ty TNHH – MTV Pasteur Đà Lạt (Davacco) công ty TNHH – MTV vaccin và sinh phẩm Nha Trang (viết tắt Biopharco) với một số chế phẩm hay gặp trên thị trường như enzym

Biosub, Biosubtyl DL, Viabiovit, Vivac bio với chủng VSV B subtilis Công ty cổ

phần ANABIO có nhà máy sản xuất nguyên liệu probiotic chứa các chủng VSV

lactic và B subtilis Do vậy, thị trường chế phẩm probiotic không chỉ lớn về số

lượng mà còn đa dạng về chủng loại VSV, đồng thời giá thành sản phẩm các chế phẩm probiotic đã được hạ nhiều lần Đến nay trên thị trường nước ta đã có mặt các sản phẩm probiotic của bốn thế hệ bào chế như sau:

Bảng 1.1: Các thế hệ bào chế của chế phẩm chứa probiotic [5]:

Thế hệ 1

(non-coated)

VSV sống (trong sữa chua, phomat, kim chi,… )

Giá rẻ, dễ sử dụng VSV gần như không sống

sót khi qua dạ dày và dịch mật

Bào tử Thuận lợi cho nuôi

cấy, sản xuất, lưu hành

Mất nhiều thời gian phát triển thành VSV → Chậm tác dụng, hạn chế khả năng cạnh tranh với VSV gây bệnh

Probiotic đông khô Tỷ lệ sống ở nhiệt độ

thường cao hơn Tỷ lệ VSV bị chết vẫn cao ở dạ dày

Thế hệ 2

(Entericcoated)

VSV đưa vào dưới dạng viên nén, viên nang có lớp ngoài bao tan trong ruột

Bảo vệ VSV khi đi qua dạ dày và dịch mật

Mất thời gian màng bao tan

Thế hệ 4

(Dual- coated)

Lớp bên trong là protein, lớp ngoài là polysaccharid

VSV có tỷ lệ sống cao Chịu được acid dịch vị và muối mật

Lớp bao bên trong có tính thúc đẩy giải phóng VSV tại đích

Đòi hỏi công nghệ cao, kỹ thuật bào chế hiện đại, trang thiết bị đắt tiền Giá thành cao [5]

1.1.4 Loài Lactobacilus acidophilus

VK sinh acid lactic (viết tắt là LAB) là một trong những VK được sử dụng rộng rãi nhất trong sản xuất probiotic và được NC thử nghiệm lâm sàng nhiều nhất

VK lactic được đặc trưng bởi khả năng sinh acid lactic rất mạnh từ các loại đường

khác nhau đặc biệt là đường lactose Hầu hết LAB đều thuộc họ Lactobacillaceae

và được xếp 4 chi: Streptococcus, Pediococcus, Lactobacillus và Leuconostoc

Thuật ngữ LAB là để chỉ một nhóm đa dạng VK gồm: VK Gram dương, không sinh bào tử, catalase âm được tìm thấy trong một số MT sống [21] LAB

bao gồm nhiều chi trong đó chi Lactobacillus là chi lớn nhất với 185 loài theo kết

quả phân loại lại năm 2008 [25]

1.1.4.1 Đặc điểm hình thái

L acidophilus được phân lập đầu tiên bởi Moro (năm 1900) từ phân trẻ sơ sinh và vào thời điểm đó đã được phân loại nhầm là Bacillus acidophilus

L acidophilus là trực khuẩn Gram dương, dạng hình que KT khoảng

2-10µm, không sinh bào tử, không có lông roi, không di động, không ưa muối, không

ưa acid, calatase âm tính, kỵ khí tùy tiện và có khả năng chuyển hóa đường lactose

tạo ra sản phẩm L (+) lactic [44]

Hình 1.1 : Hình ảnh L acidophilus trên kính hiển vi điện tử

Tại Việt Nam, trong các chế phẩm probiotic có mặt trên thị trường thì chủng

L acidophilus có tần suất xuất hiện nhiều nhất Trong NC của nhóm tác giả của

trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội năm 2012 đã tiến hành khảo sát thành phần VSV sống và đánh giá đặc tính probiotic của 24 sản phẩm men tiêu hóa có mặt trên thị trường Hà Nội Kết quả cho thấy theo thông tin ghi trên nhãn, VK trong các sản

phẩm men tiêu hóa thuộc 4 chi: Bacillus, Lactobacillus, Streptococcus và Bifidobacterium, trong đó loài L acidophilus là VKthường dùng nhất, có mặt trong

80% các sản phẩm [8]

1.1.4.2 Điều kiện sinh trưởng, phát triển

Nhiệt độ thích hợp cho L acidophilus sinh trưởng là 370C - 420C và có thể phát triển được ở nhiệt độ cao đến 450

C nhưng không phát triển ở 20 - 220C hoặc nhiệt độ cao hơn 48oC Có khả năng chịu được điều kiện acid trong khoảng pH 5-6

trong thời gian 24 - 36 giờ [16]

1.1.4.3 Môi trường nuôi cấy

L acidophilus là VSV có nhu cầu dinh dưỡng rất cao, để sinh trưởng bình

thường ngoài nguồn Cacbon chúng cần Nitơ, một phần dưới dạng các acid amin, một số vitamin, các chất sinh trưởng và các chất khoáng như Mg, Mn, Fe, Chúng không phát triển được trong MT đơn giản chỉ có Glucose và NH4+ như một số loài khác Vì thế phải cho vào MT một số chất giàu dinh dưỡng: pepton, cao nấm men,

cao thịt, các loại đường để chúng lên men L acidophilus là VK vi hiếu khí, do đó

MT nuôi cấy thường là kỵ khí hoặc với 5-10% CO2.Trên MT thạch MRSA hoặc canh dinh dưỡng MRSB, sau 48 giờ ủ ở 370C, 5% CO2 VK phát triển rất tốt, làm

MT trở nên đục, có cặn lắng ở đáy hay những khuẩn lạc đều hình cầu, đường kính 1mm [35]

1.1.4.4 Tác dụng của các chủng L acidophilus

L acidophilus được biết là một loài có vai trò probiotic Tính chất bám dính

và khả năng liên kết với nhau của L acidophilus tạo thành một tập đoàn VK lactic

chính là cơ chế hữu hiệu để hạn chế VK có hại Khi VK lactic vào trong cơ thể chúng định cư ở đường ruột và cạnh tranh vị trí gắn kết trên thành ruột với VSV có hại,

làm hạn chế số lượng VSV có hại trong đường ruột Đồng thời, L acidophilus có

khả năng sinh tổng hợp một số chất có hoạt tính kháng khuẩn như acid lactic, hydrogen peroxid, diacetyl và bacteriocin làm hạn chế sự phát triển của VK có hại

Ngoài ra, L acidophilus còn có vai trò như một chất hỗ trợ tiêu hóa lactose cho

những người thiếu hụt men tiêu hóa lactose

Các chủng probiotic thương mại chính của L acidophilus được mô tả bởi Shan (2007) [72], bao gồm L acidophilus LA-1 và LA-5, NCFM, DDS-1 và SBT-

2026, các ATCC,… Các chủng đều đã được FDA cấp tiêu chuẩn An toàn (GRAS)

đồng thời được coi là probiotic quan trọng nhất Hỗn hợp các chủng L acidophilus

NCFM có tác dụng làm giảm tỷ lệ mắc bệnh tiêu chảy ở trẻ em Nếu sử dụng hợp

lý, thường xuyên, L acidophilus có tác dụng tiêu hóa lượng đường lactose trong các

bệnh nhân không dung nạp lactose

Một NC của trường đại học của Nebraska đã cho thấy rằng thức ăn bổ sung

có L acidophilus L1 sẽ làm giảm 61% lượng Escherichia coli O157: H7 trong đường ruột NC cũng chỉ ra L acidophilus có khả năng làm giảm cholesterol

Khi các bệnh nhân điều trị bằng kháng sinh, một lượng lớn VK có lợi trong

đường ruột sẽ bị tiêu diệt Do đó các bác sỹ khuyên các bệnh nhân nên sử dụng L acidophilus để củng cố lợi khuẩn cho đường ruột

Lactobacillus GG dùng cho trẻ em từ 5-14 tuổi bị hội chứng ruột kích thích

trong hơn 8 tuần và tạo ra 3 tỉ TB mỗi ngày khi dùng 2 lần VK này giúp giảm số

lần đau và mức độ đau bụng Lactobacillus GG dùng cho trẻ em đang uống thuốc

kháng sinh và hỗ trợ giảm tiêu chảy

L acidophilus LA-5 có khả năng sản xuất bacteriocin CH5 có tác dụng kháng khuẩn và ức chế Typhimurium Salmonella và Campylobacter jejuni, cải thiện đường ruột, ngăn ngừa tiêu chảy, tăng cường sức đề kháng cho đường ruột L acidophilus LA-5 tác dụng lên hệ miễn dịch, làm lượng cytokine tăng lên, tăng hoạt động thực bào và sản xuất kháng thể L acidophilus LA-5 đã cho thấy ức chế sự

phát triển của các TB ung thư vú, và tác động tích cực trên các bệnh nhân hóa trị liệu

Ngoài ra, người ta cũng chứng minh được rằng L acidophilus NCFM có tác

dụng làm giảm tỷ lệ mắc các triệu chứng sốt, ho và sổ mũi, tác dụng chống viêm

cũng đã được quan sát thấy ở những người sử dụng L acidophilus NCFM [72]

Hiện nay, L acidophilus được sử dụng nhiều trong các chế phẩm probiotic

như: Antibio, Lactomin, Lacteolforte,… để điều trị các trường hợp rối loạn tiêu hóa

do dùng kháng sinh dài ngày hoặc trong các trường hợp đầy bụng khó tiêu, trẻ kém

ăn, chậm lớn Bên cạnh các sản phẩm probiotic thì chúng còn khả năng lên men tạo acid lactic, một dung môi được ứng dụng nhiều trong thực tiễn bảo quản thực phẩm hay dùng trong dung dịch vệ sinh như dạ hương, lactacyd,…

Một số sản phẩm chứa L acidophilus được liệt kê trong bảng 1.2

Bảng 1.2: Một số sản phẩm probiotic chứa L acidophilus trên thị trường [5]

Stt Tên Thành phần lượng Hàm Dạng bào chế Nhà sản xuất

1 Antibio L acidophilus 108 Gói bột 1g Organon (Mỹ)

2 Biosubtyl LD L acidophilus, B subtilis 107-108 Gói bột 1g Viện Vaccin Đà lạt

3 Biolacto L acidophilus, L

8 Viên nang Union (Mỹ)

4 Lactomed L acidophilus, L.biphilus,

Viên nang Biopharco (VN)

8 Probio L acidophilus 109 bột đông khô Imexpharm (VN)

9 Lactominplus L acidophilus, B.longum,

L.rhamnosus 10

8-109

HH probiotic bao vi nang 300mg

Mebipharm (VN)

10 Laclean gold

L acidophilus, B.longum, L.rhamnosus, B.bifidus, Entercoccus faecium

107 - 109 Cốm pha HD

uống Biotech (Hàn Quốc)

11 Kidlac

L acidophilus, B.longum, B.breve, Entercoccus

Vi nang (microcapsule) là những tiểu phân hình cầu hoặc không xác định, KT

từ 0,1 µm đến 5mm (thông thường từ 100 - 500 µm) bên trong chứa hoạt chất dạng lỏng hoặc rắn, còn bên ngoài được bao bằng màng mỏng polyme liên tục [58]

Vi nang hóa là quá trình bao gói những giọt chất lỏng nhỏ, rắn hoặc phân tử nhỏ bằng một lớp màng thích hợp [58] Đây là một trong những phương pháp cố định TB được sử dụng rộng rãi hiện nay với các chất tạo màng (tạo gel) là các polyme có nguồn gốc tự nhiên như gelatin, AGL, CS, cellulose,… hoặc có nguồn gốc nhân tạo như polyamid, polystyren, polyacrylat, polyacrylamid, polyester, polyvinyl pyrrolidon (PVP), polyethylen glycol (PEG)… để bẫy, nhốt và bao gói các TB, cơ thể VSV sống [11] Vi nang giúp TB được cách ly với MT xung quanh, làm giảm sự tổn thương cũng như sự tổn thất số lượng TB, bằng cách này chúng sẽ được bảo vệ tốt hơn trong các điều kiện bất lợi như acid cao, pH thấp, muối mật, sốc nhiệt, và chỉ phóng thích TB tại nơi mong muốn

Hình 1.2 – Các loại vi nang a) Vi nang dạng lỏng; b) Vi nang dạng rắn; c) Vi nang nhiều lớp;

d) Vi nang đa nhân; e) Vi nang trong vi nang

Vi nang có nhiều loại: VN đơn nhân là VN phần nhân bên trong chỉ chứa một khối dung dịch hoặc chất rắn, VN đa nhân là VN bên trong có chứa nhiều nhân nhỏ (VN trong VN), VN nhiều lớp là VN được thiết kế với nhiều lớp bao khác nhau [5]

1.2.1.2 Đặc điểm của vi nang

- Vi nang không làm tổn hại đến các TB sống mà còn bảo vệ TB sống [47]

- Vi nang cho phép cố định số lượng TB sống lớn hơn các phương pháp cố định

TB khác

- Mỗi loại vật liệu vi nang và mỗi loại TB sống lại hoạt động ở các điều kiện khác nhau nên phải lựa chọn điều kiện tạo thành vi nang như pH, nhiệt độ, thời gian…

- Độ bền cơ học của lớp màng của VN là một đặc điểm quan trọng Nó phải có

độ bền tương đối để có thể bảo vệ được các TB sống, tuy nhiên lớp màng này

lại không được quá vững chắc làm ảnh hưởng đến khả năng phóng thích TB khi cần thiết [81]

- KT hạt VN, độ bền vững của hạt và khả năng phóng thích TB có mối quan hệ với nhau KT hạt càng lớn thì độ bền vững của hạt càng cao, khả năng bảo vệ

TB sống càng cao, nhưng khả năng phóng thích TB càng khó, đôi khi còn làm giảm giá trị cảm quan của sản phẩm KT hạt VN càng nhỏ thì độ bền càng thấp, khả năng bảo vệ TB sẽ thấp đi nhưng khả năng phóng thích TB sẽ dễ dàng hơn

- Ngoài ra còn một số đặc điểm khác như sự mài mòn của các hạt VN do sự va chạm và ma sát vào nhau, khả năng kháng khuẩn…

1.2.1.3 Ưu điểm của vi nang

- Vi nang giúp bảo vệ TB sống và tạo ra mật độ VSV đủ lớn tại ruột non và trực tràng VN như tấm áo bảo vệ các TB sống chống chịu được điều kiện khắc nghiệt của MT và đường tiêu hóa: nhiệt độ, acid,… Ngoài ra, VN làm ổn định hoạt tính trao đổi chất của TB khi có sự thay đổi pH, nhiệt độ, hay sự có mặt các chất ức chế có trong MT lên men do đó làm tăng độ ổn định và kéo dài khả năng tồn tại của chúng [57, 81]

- Bảo vệ VK chống lại các tác nhân bacteriophage bên ngoài, từ đó đảm bảo quá trình lên men không bị nhiễm tạp, hư hại Quá trình bao gói cũng có thể ngăn chặn các VSV sinh sôi nảy nở trong thực phẩm để tránh thay đổi các hương vị của sản phẩm [22]

- Tăng cường khả năng tồn tại của VK, tạo điều kiện để điều khiển TB và cho phép kiểm soát liều lượng VN cũng cho phép điều chỉnh tốc độ sinh trưởng của VSV, cho phép sử dụng TB ở một pha riêng biệt đối với MT lên men, do đó có khả năng dừng phản ứng nhanh

- Vi nang có khả năng tạo ra mật độ VSV lớn do có thể cố định một lượng lớn

TB sống Trong các ngành thực phẩm có các sản phẩm lên men như bia, rượu, thì kỹ thuật vi nang hóa là một trong những phương pháp cố định TB VSV trong công đoạn lên men, từ đó sử dụng VSV tiết kiệm, tối ưu và hiệu quả hơn

- Vi nang có thể làm cho TB kéo dài khả năng tồn tại, từ đó giúp cho thời gian bảo quản chủng, giống TB VSV được lâu dài cũng như dự kiến sẽ kéo dài thời

hạn sử dụng của các chế phẩm sinh học ở nhiệt độ phòng, tăng khả năng chịu nhiệt, tăng khả năng chịu nén, chịu biến dạng và tăng khả năng chịu acid

- Trong lĩnh vực sản xuất, đặc biệt là ngành sản xuất các sản phẩm liên quan đến probiotic, thì việc vi nang hóa TB có ý nghĩa rất quan trọng Nó giúp cho các sản phẩm probiotic khi đến tay người tiêu dùng vẫn còn nguyên giá trị sử dụng

1.2.1.4 Nhược điểm của vi nang

- Màng hay thành TB nguyên vẹn thường chống lại sự thẩm thấu của chất nền, sản phẩm và những phản ứng thích hợp nên trước hoặc sau khi vi nang hóa đòi hỏi phá hủy rào cản để thẩm thấu

- Phần lớn các vật liệu sử dụng trong quá trình tạo VN như gelatin, thạch, các loại tinh bột,… đều là các nguồn dinh dưỡng mà VSV có thể tiêu hóa được Điều này làm VSV bên trong vi nang hoặc VSV tạp nhiễm từ bên ngoài có thể tiêu hóa lớp vỏ nang và làm cho lớp màng bảo vệ bị rách, thủng,… dẫn đến hiệu quả vi nang hóa sẽ giảm xuống đáng kể Có bằng chứng cho thấy một số chủng

VK có khả năng tiêu hóa, sử dụng chính vật liệu vi nang Do vậy, mỗi chủng VSV phải được NC vật liệu phù hợp nhất [68]

- Kích thước VN quá lớn có thể làm giảm giá trị cảm quan của sản phẩm

- Bên cạnh thách thức trong việc NC để tìm ra kỹ thuật bào chế VN thích hợp, chọn vật liệu đóng gói an toàn - hiệu quả, lựa được chủng VK có hiệu lực, tiềm năng thì để sử dụng và sự phát triển các sản phẩm vi nang probiotic đòi hỏi cả yếu tố về thời gian và nguồn lực tài chính Brownlie ước tính rằng các công đoạn vi nang hóa probiotic có thể làm tăng chi phí hai hoặc ba lần so với không bao gói [20] Chi phí vi nang hóa probiotic sử dụng polyme sinh học tự nhiên thường rất cao và khả năng để mở rộng quy mô sản xuất cũng khá khó khăn

1.2.2 Các ứng dụng của vi nang trong ngành Dược

Tuy rằng không phải hoạt chất nào cũng có thể bào chế dưới dạng VN, nhưng công nghệ vi nang hóa đã là một trong những bước tiến bộ của ngành Dược, góp phần giải quyết những vấn đề khó khăn trong lĩnh vực sản xuất dược phẩm VN được tạo ra nhằm rất nhiều mục đích khác nhau [80]:

- Bảo vệ dược chất trước ảnh hưởng của MT (ví dụ bào chế aspirin kéo dài kháng acid dịch vị tốt), bảo vệ các chất nhạy cảm với độ ẩm, ánh sáng, chất oxi hóa (nifedipin, vitamin A, vitamin K)

- Chuyển các dược chất ở dạng lỏng thành các hệ chất rắn khô (giả rắn) thuận lợi cho việc vận chuyển, bảo quản hoặc thành các dạng bột có độ trơn chảy cao thuận lợi cho việc bào chế (dễ dàng đưa vào viên nén)

- Tách các phần tương kỵ với nhau (ví dụ để tăng độ ổn định của cặp tương kỵ aspirin và clorpheniramin maleat bằng cách tạo thành VN của từng chất trước khi trộn chung với nhau)

- Giảm độc tính và tương tác với dịch vị (KCl, sắt sulfat…

- Che dấu mùi vị (paracetamol…)

- Bào chế dạng bao tan ở ruột đối với những thuốc cần hấp thu chọn lọc ở dịch ruột hơn là ở dạ dày

- Hạn chế bay hơi (methol) [10]

- Kiểm soát sinh khả dụng của dược chất trong VN (tăng hoặc giảm khả năng giải phóng hoặc hướng đến tác dụng tại đích)

1.2.3 Các phương pháp bào chế vi nang

Về nguyên tắc, phương pháp chung nhất để bào chế vi nang không yêu cầu bắt buộc phải có những thiết bị riêng đặc biệt, có thể sử dụng máy và phương tiện có sẵn như: nồi phản ứng, máy làm đồng nhất, nồi bao viên thông thường, máy bao màng mỏng Việc lựa chọn phương pháp chế tạo phụ thuộc vào đặc điểm, tính chất của nguyên vật liệu như độ tan, tính tương đồng, KT vi nang…

Vi nang có thể được chế tạo bằng nhiều phương pháp khác nhau nhưng có thể tổng quát thành các phương pháp sau [9]

1.2.3.1 Phương pháp tách pha hay đông tụ

Nguyên tắc: Các pha được tách nhờ sự thay đổi nhiệt độ, sự hóa muối hoặc khi thêm một dung môi thứ hai vào hệ vi nang

Phương pháp này thường được áp dụng đối với các dung dịch polyme thân nước, polyme được dùng phải có khả năng tạo thành màng phim Nếu chỉ sử dụng một loại dung dịch keo thì gọi là phương pháp tách pha đông tụ đơn, nếu sử dụng

nhiều loại dung dịch keo thì gọi là phương pháp tách pha đông tụ phức

a Đông tụ đơn giản

Nguyên tắc: là quá trình loại nước của các keo thân nước dùng trong hệ do đó làm giảm độ tan của các chất keo, các chất keo sẽ tủa lại trên bề mặt tiểu phân phân tán (dung dịch TB tự do)

Trong phương pháp này thường chỉ sử dụng một loại polyme (gelatin, polyvinyl alcol, carboxymethyl cellulose), làm giảm độ tan của chất keo bằng cách: thêm vào một dung môi có thể trộn lẫn với nước (ethanol, aceton, isopropanol,…) hoặc thêm vào một muối vô cơ hay thay đổi nhiệt độ [5]

Hình 1.3 – Các giai đoạn của quá trình tách pha đông tụ đơn [5]

b Đông tụ phức tạp

Nguyên tắc: Là quá trình tương tác giữa các phân tử tích điện âm và tích điện dương của hai hay nhiều hợp chất cao phân tử, thường do sự thay đổi nồng độ các chất tan cao phân tử hay pH Các polyme càng có sự khác nhau về điểm đẳng điện càng dễ dàng tạo thành hạt đông tụ [12]

Thực chất quá trình đông tụ phải trải qua 3 giai đoạn với điều kiện khuấy trộn liên tục

- Giai đoạn 1: Tạo ra hệ 3 pha không trộn lẫn từ môi trường phân tán lỏng: pha dược chất tạo nhân, pha vật liệu tạo vỏ và dung môi

- Giai đoạn 2: Hoàn thiện tạo lớp vở bao xung quanh nhân

- Giai đoạn 3: Làm rắn vỏ bao vi nang

Quá trình tách pha có thể bao gồm:

- Tách pha do thay đổi nhiệt độ

- Tách pha do thêm vào một polyme khác không tương đồng: Nhân được phân tán vào dung dịch polyme thứ nhất để tạo màng không tan trong dung dịch Màng này sẽ đông vón xung quanh nhân khi phân tán thêm dung dịch đậm đặc polyme thứ hai không tương đồng

- Tách pha do sự hóa muối: Thêm dung dịch đậm đặc muối điện ly mạnh vào

hệ chế tạo vi nang, sẽ tạo thành 2 pha, kết quả là một pha trong đó sẽ trở nên bão hòa các tiểu phân keo

- Tách pha do sự tương tác giữa các polyme: các polyme trái dấu sẽ tương tác với nhau tạo thành hạt đông tụ bao quanh nhân

Kĩ thuật đông tụ hóa muối còn được biết đến là kỹ thuật ion hóa cố định gel, ion hóa tạo gel để tạo ra các hạt gel không tan (hydrogel) Trong phương pháp này các polyanion như alginat kết hợp với các ion đa hóa trị tạo thành các hạt gel có mạng lưới không gian ba chiều bao gói lấy VSV hoặc có thể kết hợp tạo phức với các polyanion khác trên bề mặt của hạt gel alginat

để tạo lớp màng có độ bền cơ học cao hơn và ngăn thấm tốt hơn

Kỹ thuật đông tụ hóa muối sử dụng alginat và calci clorid làm chất bao gói có những ưu điểm sau: đơn giản, dễ làm, chi phí thấp, không phải sử dụng nhiệt độ cao hoặc các dung môi hữu cơ Đông tụ cho phép kết hợp một

số lượng lớn VSV với chất bao gói [31], tuy nhiên nhược điểm là gây thất thoát VSV trong quá trình bào chế Kỹ thuật nhỏ giọt thường cho các vi nang

có kích thước lớn nằm trong khoảng 2 - 5 mm [51] Đối với kỹ thuật phun đông tụ, sử dụng hệ thống phun dung dịch alginat dưới áp suất không khí tạo các giọt nhỏ và trở thành đông tụ khi gặp môi trường có tác nhân liên kết chéo Kỹ thuật này cho vi nang có kích thước bé (5 – 15µm) nhưng yêu cầu bắt buộc là phải có thiết bị thích hợp, tốn kém, khả năng tắc nghẽn cao [62]

Nồng độ alginat thường được sử dụng để tạo thành gel khoảng 0,6 -

2% và nồng độ dung dịch calci clorid là 0,05 - 1,5 M Kích thước và hình dạng của vi nang khác nhau tùy thuộc vào các thiết bị sử dụng

Hydrogel được bào chế bằng các kỹ thuật cơ bản là kỹ thuật nhỏ giọt,

kỹ thuật phun đông tụ và kỹ thuật hóa rắn nhũ tương

Kỹ thuật phun sấy

Kỹ thuật phun sấy liên quan đến việc phát tán nhũ tương hoặc hỗn dịch của VSV và các chất mang vào một luồng khí khô, làm nước bốc hơi ngay lập tức, chất rắn còn lại là các vi nang mang VSV ở dạng bột khô Phun sấy cho các vi nang có kích thước nang từ 5 – 80 µm [34] Quá trình phun sấy được điều khiển bằng thay đổi tốc độ phun dịch, tốc độ của khí sấy và nhiệt độ

So với các phương pháp khác, phương pháp phun sấy có những ưu điểm sau: quá trình liên tục, chi phí thấp và dễ dàng để mở rộng quy mô Tuy nhiên, do quá trình sử dụng nhiệt độ cao nên có thể gây ngừng hoạt động hoặc gây thương tích trong tế bào làm tỷ lệ VSV sống thấp và ổn định thấp trong bảo quản

Theo Anal và Singh khi quá trình này được sử dụng để bao probiotic, một số VSV bị ngừng hoạt động sau một vài tuần lưu trữ ở nhiệt độ phòng, điều này có liên quan tới sự sốc gây ra bởi nhiệt độ [11] Có thể khắc phục bằng cách tìm kiếm các chủng chịu được nhiệt độ cao, tối ưu hóa các thông số bào chế, lựa chọn nhiệt độ thích hợp và sử dụng thêm chất bảo vệ Ảnh hưởng của các chất bảo vệ được biết đến làm tăng cường sự sống sót của VSV trong phun sấy [17]

Kỹ thuật nhỏ giọt

Phương pháp nhỏ giọt ứng dụng nguyên lý căn bản là khi một chất lỏng được

để rơi tự do thì sẽ tạo thành giọt hình cầu do sức căng bề mặt của chất lỏng Phương pháp nhỏ giọt được thực hiện theo nguyên tắc tạo giọt đồng thời và lồng vào nhau của hỗn dịch TB và dung dịch tạo vỏ gói

Quy trình thực hiện vi nang bằng AGL theo phương pháp nhỏ giọt được thực hiện như sau:

- Điều chế dung dịch AGL, dung dịch CaCl2 (chất hỗ trợ tạo gel)

- Bổ sung TB tự do vào dung dịch AGL để tạo huyền phù TB

- Cho tất cả lượng hỗn hợp AGL và TB tự do vào trong ống bơm tiêm và nhỏ

giọt vào trong dung dịch hỗ trợ tạo gel Khi giọt hỗn hợp AGL và TB tiếp xúc với dung dịch hỗ trợ tạo gel (calci clorid) thì ngay lập tức polyme AGL bao quanh TB

và hình thành khung 3 chiều bởi liên kết với ion Ca2+ Nồng độ phổ biến thường được sử dụng để đóng gói TB là AGL 1-2% và dung dịch hỗ trợ tạo gel là khoảng 0,05-1,5M

- Hạt vi nang sau khi bào chế sẽ được sấy khô Giai đoạn sấy này ít nhiều sẽ ảnh hưởng đến TB, có thể làm tổn thương TB Các phương pháp sấy thường sử dụng là sấy thăng hoa, sấy phun và sấy tầng sôi

- Ưu điểm của phương pháp nhỏ giọt là thiết bị tương đối đơn giản, gọn gàng,

dễ sử dụng, năng suất vi nang cao và bảo vệ TB tốt

- Nhược điểm của phương pháp nhỏ giọt là chỉ có thể tạo ra các hạt VN có hình dạng cầu, không tạo ra được các hạt VN có hình dạng thay đổi linh hoạt [5]

Kỹ thuật hóa rắn nhũ tương

Vi nang có thể được tạo ra từ nhũ tương gồm hai hay nhiều chất lỏng không đồng tan với nhau Nhũ tương tạo thành có thể là loại dầu/nước (D/N) hoặc nước/dầu (N/D) phụ thuộc vào độ tan của hoạt chất trong nước và polyme sử dụng Dựa vào kỹ thuật hóa rắn nhũ tương mà có thể chia thành 3 phương pháp: bốc hơi dung môi, thay đổi dung môi và tạo liên kết chéo

Vi nang probiotic được tạo từ nhũ tương thường sử dụng phương pháp tạo liên kết chéo (đông tụ) Quá trình bào chế tiến hành cơ bản như sau: Hỗn dịch polyme chứa TB VSV được thêm vào một lượng lớn dầu thực vật như dầu đậu nành, dầu hướng dương, dầu hạt cải, dầu ngô Các hỗn hợp được đồng nhất để tạo thành một nhũ tương N/D Khi nhũ tương N/D được hình thành, các polyme hòa tan trong nước phải được đông tụ từ các hạt gel nhỏ trong pha dầu bằng cách tạo liên kết chéo với các ion hóa trị II như Ca2+, Mg2+… [50]

Quá trình đông tụ có thể xảy ra từ bên trong hoặc từ bên ngoài [50]

- Đông tụ từ bên trong (internal gelation method):

Muối của calci trộn cùng với dung dịch AGL và VSV Sau khi quá trình nhũ hóa xảy ra, nhỏ từ từ dung dịch acid acetic vào nhũ tương làm giải phóng ion Ca2+

ra khỏi muối AGL tạo liên kết chéo với ion Ca2+, đông tụ lại và tạo thành vi nang

- Đông tụ từ bên ngoài:

Ion Ca2+ không cho vào cùng với dung dịch AGL mà được thêm vào sau khi

nhũ tương N/D hình thành, ion Ca2+ đi qua pha ngoại vào tiếp xúc với AGL trong pha nội, quá trình đông tụ xảy ra và vi nang được hình thành

Vi nang thu được có KT nhỏ hơn KT giọt pha nội của nhũ tương và nằm trong khoảng từ 25 µm đến 2 mm

Phương pháp hóa rắn nhũ tương là một phương pháp thích hợp để vi nang hóa probiotic trong các vi nang có kích thước nhỏ hơn 1 mm [68] Loại và lượng chất diện hoạt cũng như lượng dầu và dung dịch calci clorid có thể ảnh hưởng đến hiệu suất của quá trình tạo vi nang Các nghiên cứu gợi ý sử dụng tỷ lệ pha dầu/alginat là 2:1 trong bao gói probiotic, Tween 80 được sử dụng như là một chất ổn định trong quá trình tạo vi nang probiotic [73] Kỹ thuật đông tụ từ nhũ tương có hiệu quả

trong việc giữ số lượng của L acidophilus LA – 5 và B bifidum BB - 12 cao hơn mức tối thiểu điều trị (> 107 cfu/g)

1.2.3.2 Phương pháp trùng hiệp

Là một trong những phương pháp tương đối mới để bào chế vi nang Cơ sở của phương pháp là do phản ứng của các monome tại bề mặt nhân và pha phân tán Pha nhân và vỏ có thể ở trạng thái lỏng hoặc khí, vì vậy phản ứng trùng hiệp hóa có thể xảy ra ở bề mặt lỏng – lỏng, lỏng – khí, rắn – lỏng hoặc rắn – khí

1.2.3.3 Phương pháp tĩnh điện

Phương pháp này đòi hỏi cả vỏ và nhân đều được làm thành dạng khí dung

Vỏ vi nang được hóa lỏng trong quá trình bào chế vi nang và phải có khả năng bao quanh nhân Khí dung tạo thành phải có điện tích trái dấu Phương tiện bào chế vi nang cần có 3 khoang riêng, trong đó 2 khoang được dùng để phun vật liệu làm vỏ

và dược chất làm nhân, khoang thứ 3 dùng để pha trộn Các ion tích điện trái dấu sẽ tích tụ và bao quanh các giọt lỏng khi chúng đang được phun khí dung

1.2.3.4 Các phương pháp khác

Các phương pháp này ít sử dụng trong bào chế vi nang probiotic Các phương pháp này bao gồm: Kỹ thuật ly tâm, kỹ thuật phun sấy, kỹ thuật phun kết tụ,

kỹ thuật bao tầng sôi, kỹ thuật dùng nồi bao viên thông thường,…[6]

1.2.4 Tổng quan một số thành phần sử dụng trong bào chế vi nang

1.2.4.1 Alginat

Nguồn gốc, cấu trúc của alginat

ALG là thuật ngữ dùng để chỉ muối của acid alginic, đôi khi nó được dùng

để gọi cho dẫn xuất của acid alginic hoặc chính là acid alginic Acid alginic được phát hiện năm 1881 ALG là một acid hữu cơ có trong tảo nâu (thuộc họ Rhaephyceae) trọng lượng phân tử từ 32.000 đến 200.000 Da ALG được tìm thấy

ở thành TB và ở gian bào tảo nâu dưới dạng muối hỗn hợp của calci, magnesi, natri, kali của acid alginic Trong đó chỉ có dạng muối natri là tan trong nước Dạng muối natri có tầm quan trọng lớn nhất, ngoài ra dạng muối của Ca, Mg, K, amoni cũng như acid alginic và propylen glycol AGL - dẫn xuất tổng hợp duy nhất của acid alginic đều được chấp nhận như một phụ gia thực phẩm an toàn và cũng ứng dụng rộng rãi Đến nay AGL đã trở thành polyme sinh học biển phong phú nhất thế giới và là polyme sinh học nhiều thứ hai sau cellulose

Công thức hóa học: (C6H7NaO6) n

Hình 1.4: Công thức cổ điển của hai đơn vị monomeric acid alginic

ALG là một polyme có các monome là hai acid manunuronic (viết tắt là M)

và acid guluronic (viết tắt là G) gắn với nhau bằng liên kết 1 – 4 glycosid AGL có

tỷ lệ khối G cao (tỷ số M/G thấp) tạo gel cứng hơn Ngược lại, AGL chủ yếu là khối

M thì gel hình thành mềm hơn và đàn hồi hơn Một số giả định cho rằng do cation liên kết với khối G tốt hơn khối M và khối MG luân phiên

Hình 1.5: Cấu trúc dạng mono α-L-guluronic acid (G); β-D-mannuronic acid (M)

và dạng liên hợp của Alginat

Một số tính chất liên quan đến bào chế vi nang

AGL có tính chất quan trọng là độ tan, độ nhớt dung dịch và khả năng tạo gel

Độ tan: AGL không tan trong cồn, ether và các dung môi hữu cơ; tan chậm

trong nước tạo thành một dung dịch sền sệt có độ nhớt dao động trong khoảng 10 ÷ 3500cps

Độ nhớt: AGL có khả năng làm tăng độ nhớt của dung dịch nước ở nồng độ

thấp Độ nhớt tỷ lệ thuận với chiều dài phân tử AGL, nói cách khác là khối lượng phân tử của AGL càng cao thì độ nhớt của dung dịch càng tăng Ngoài ra, độ nhớt của dung dịch AGL còn phụ thuộc vào nồng độ AGL, nhiệt độ, pH, sự có mặt của các ion kim loại trong dung dịch Ion calci có mặt trong dung dịch AGL sẽ làm tăng

độ nhớt do ion calci tạo liên kết chéo với AGL làm tăng trọng lượng phân tử Do đó việc bổ sung Ca2+ là một cách để điều chỉnh (tăng, giảm) độ nhớt mà không cần tăng/giảm lượng AGL hoặc thay đổi trọng lượng phân tử Và khi nồng độ Ca2+ đạt đến mức nào đó thì sẽ hình thành gel

Sự gel hóa: ở pH trung tính và nhiệt độ thường AGL nhanh chóng bị gel hóa

Gel AGL tạo thành có tính thuận nghịch Với tính chất này, AGL được sử dụng rất rộng rãi trong công nghệ cố định TB và vi nang hóa các phân tử sinh học nhạy cảm

như protein và acid nucleic [10] Tuy nhiên AGL có nhược điểm là dễ tạo vết nứt rạn trong MT acid làm mất tính ổn định cơ học, hạt vi nang thường chìm xuống dưới đáy bao bì làm giảm giá trị cảm quan của sản phẩm và gây tốn kém trong quá trình lên men (phải khuấy để phân phối đều TB)

Hình 1.6 : Vị trí của ion calci trong gel và sự tạo gel calci alginat

Cơ chế đông tụ ion của AGL được mô phỏng theo hình “hộp trứng” – được Grant đưa ra đầu tiên và đến nay vẫn được chấp nhận [37] Do cấu hình đặc biệt nên đoạn mạch MMMM là các dải hẹp, còn đoạn mạch GGGG tạo thành dạng nếp gấp như một cái vỉ trứng, khoảng không gian giữa các vỉ khi xếp lên nhau tương tự như chỗ đặt quả trứng Khi có mặt Cation hóa trị II và III (như ion Ca2+

) chúng sẽ khớp vào các khoảng trống này bằng liên kết với các nhóm COO- và các nguyên tử oxy

tạo vùng nối liên kết các phân tử AGL với nhau và hình thành gel (hình 1.6)

Một số ứng dụng của alginat

Trong công nghệ bào chế dược phẩm, ngoài việc sử dụng để bào chế dạng vi nang và siêu vi nang chứa dược chất, AGL còn được sử dụng làm tá dược rã, TD dính trong viên nén, TD độn trong viên nang, TD kiểm soát giải phóng trong viên giải phóng kéo dài, chất ổn định nhũ tương/hỗn dịch (propylen glycol AGL) TD tăng độ nhớt và cải tiến hệ treo của các chất rắn giúp ổn định thể chất trong một số thuốc nước như kem, gel, bột nhão, thuốc nhỏ mắt, nhỏ mũi [69]

Trong công nghệ vi sinh, AGL được sử dụng trong kỹ thuật bất động TB và bất động enzym Những năm gần đây, có nhiều NC ứng dụng tạo vi nang chứa

VSV để tăng khả năng sống của chúng trong các điều kiện bất lợi [52, 60, 75] Hạt

vi nang tạo thành có ưu điểm hình cầu đẹp và tương đối đồng đều [3] Việc cố định

TB với AGL có thể thực hiện ở điều kiện không quá khắt khe: ở nhiệt độ thường,

pH trung tính, nhưng dung dịch đệm không được chứa citrat/phosphat

1.2.4.2 Chitosan

CS là một polyaminosaccarid sinh học có phân tử lượng từ 50 - 2000 kDa, mức độ acetyl hóa từ 40 đến 98%, thu được từ phản ứng deacetyl hóa chitin Chitin được tìm thấy trong một số loài thực vật bậc thấp như nấm, tảo (có vai trò giống như cellulose trong các loài cây) Chitin còn xuất hiện trong vỏ mai (bộ xương ngoài) của động vật không xương sống như: tôm, cua, mực; lớp bao ngoài của các loài côn trùng cánh cứng Cấu trúc hóa học của chitin gần giống với cellulose

Hình 1.7: Cấu trúc hóa học của chitin, chitosan và cellulose

CS là dẫn xuất được tạo thành nhờ phản ứng deacetyl hóa chitin ở nhiệt độ cao (1200C) trong dung dịch kiềm mạnh Khác với chitin, CS tan được trong dung dịch acid và độ tan phụ thuộc vào loại và nồng độ acid

CS có những ưu điểm là: độc tính thấp, tương thích sinh học cao với TB VK

và nhiều hoạt chất khác, có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm,… đồng thời còn tự phân hủy được nên CS thường được dùng làm chất mang trong ngành dược phẩm [49] CS đã được ứng dụng rộng rãi và hiệu quả trong kỹ nghệ bào chế thuốc như: thuốc chữa bỏng, giảm đau, thuốc hạ cholesterol, thuốc chữa bệnh dạ dày, chống đông tụ máu, thuốc về xương khớp và tăng sức đề kháng [39]

1.2.5 Một số nghiên cứu trong và ngoài nước về bào chế vi nang probiotic

1.2.5.1 Các nghiên cứu trên thế giới

- Về hiệu quả của vi nang đối với probiotic

Có thể nói, vi nang hóa đã tạo ra một bước tiến mới trong công nghiệp sản

xuất dược phẩm và thực phẩm trên thế giới Nhờ đó mà thị trường sản phẩm probitic đơn thuần hay các thực phẩm được bổ sung probiotic (bánh mỳ, sữa, sữa chua, kem, phomai, bánh – kẹo, nước trái cây, …) không ngừng phát triển cả về số lượng lẫn chất lượng [76] Trong tương lai, ứng dụng vi nang hóa trong bào chế các chế phẩm sinh học kiểm soát giải phóng sẽ giải quyết được các vấn đề hạn chế của probiotic [24] Các kết quả này xuất phát từ nhiều NC khác nhau đã chứng minh hiệu quả rõ rệt của vi nang đối với sự sống sót của VK trong các dạng chế phẩm

Ding WP và Shah NP (2008) đã tiến hành khảo sát sự tồn tại của 8 chủng

VK probiotic ở dạng tự do và bao vi nang trong nước ép cam và táo NC đánh giá các sự thay đổi về các chỉ tiêu gồm: hàm lượng acid malic, pH dung dịch và số lượng VK probiotic sau mỗi tuần Kết quả theo dõi chất lượng sau 6 tuần cho thấy

pH của nước ép cam giảm nhanh hơn và nhiều hơn pH của nước táo Đối với cả 2 loại nước ép đều cho thấy sự giảm pH của mẫu vi nang thấp hơn so với mẫu tự do

Sự thay đổi pH tỷ lệ nghịch với nồng độ acid malic Sự thay đổi nồng độ acid malic trong nước cam và nước táo gần giống nhau Kết quả đếm số lượng probiotic cho thấy mẫu vi nang probiotic đã có hiệu quả bảo vệ VSV tốt hơn, vẫn duy trì được số

lượng probiotic sau 6 tuần cao hơn là 5,5 log cfu/g [27]

Sultana và cộng sự (2000) đã theo dõi hiệu quả của vi nang lên sự sống sót

của L acidophilus và Bifidobacterium bổ sung vào sữa chua trong thời gian 8 tuần

cho thấy số lượng VSV bị suy giảm là 0,5 log cfu/g ít hơn so với khi sử dụng TB tự

do là 1 log cfu/g Hơn nữa, quá trình lên men sữa chua với VK probiotic dạng vi nang ít làm giảm pH của MT acid hơn và điều này cũng có lợi cho VSV [79]

- Về bào chế vi nang probiotic

Các kỹ thuật phổ biến nhất trong bào chế vi nang probiotic hiện nay là phun sấy (phun đông tụ), nhũ tương và phương pháp nhỏ giọt (đùn) Đối với mỗi probiotic lại có các đặc tính khác nhau vì vậy việc tìm ra quy trình và tá dược phù hợp cho từng probiotic là rất cần thiết

Hanna và cộng sự (2011) đã NC bào chế vi nang L acidophilus bằng

phương pháp nhỏ giọt với nguyên liệu chính là AGL 2% kết hợp thử nghiệm lần

lượt với gelatin 2% và tinh bột ngô 24% Kết quả đánh giá hiệu suất bao VSV của

vi nang (EY%) và sau 90 phút thử nghiệm trong MT acid cho thấy AGL phối hợp với tinh bột ngô (tỷ lệ 1:1) cho kết quả tốt nhất Kết quả đánh giá tính ổn định sau 3 tháng bảo quản trong điều kiện thường (300C) và điều kiện trong tủ lạnh (40C) bước

đầu cho thấy khả năng sống của vi nang L acidophilus được cải thiện khi bảo quản

ở nhiệt độ thấp hơn Kết quả thử nghiệm lâm sàng trên 2 nhóm bệnh nhân đã được

chẩn đoán nhiễm Helicobacter pylory sau 2 tuần sử dụng mẫu vi nang thì trên 70%

số bệnh nhân ở cả 2 nhóm đều cho thấy có tỷ lệ đáng kể Helicobacter pylory bị tiêu

diệt [40]

Lotfipour và cộng sự (2012) đã tiến hành khảo sát được 14 CT khác nhau

của nồng độ AGL và CaCl2 cũng như thời gian ủ trong CaCl2 khác nhau để đông

cứng vi nang tạo thành theo phương pháp đùn Kết quả: đặc tính vi nang L acidophilus thu được có hình cầu với phân bố KT hẹp từ 1,32 ± 0,04 đến 1,70 ±

0.07 mm; hiệu quả đóng gói vi nang cao hơn 98% Phân tích yếu tố ảnh hưởng qua mặt đáp cho thấy cả 3 yếu tố khảo sát đều ảnh hưởng đến KT, hình dạng và hiệu quả bao VSV của vi nang trong đó nồng độ alginat đóng vai trò quan trọng nhất

theo hệ số hồi quy của nó Hơn nữa, hiệu quả sống sót của L acidophilus trong MT

acid cao hơn đáng kể so với VSV tự do khi tăng nồng độ AGL [54]

Zanjani và cộng sự (2014) đã tiến hành bao gói hai chủng VSV L casei và

B bifidum trong vi nang bằng kỹ thuật nhũ tương với tỷ lệ/nồng độ các thành phần

như sau: tỷ lệ N/D là 1:5; natri AGL 1%; tinh bột ngô 2%; dung dịch calci clorid 0,1 M; dung dịch CS 0,4%; tỷ lệ Tween 80 trong pha dầu là 0,2% Quá trình nhũ hóa tiến hành với tốc độ 350 v/ph, thời gian 20 phút, thời gian ủ trong CaCl2 là 30 phút, thời gian ủ dung dịch CS là 40 phút Kết quả: Vi nang thu được có KT trung bình là

123 ± 2,11 µm, cao hơn có ý nghĩa thống kê (p <0,05) so với vi nang không bao CS chỉ đạt KT là 90 ± 1,69 µm Kết quả thử trong MT mô phỏng dịch dạ dày - ruột sau

2 giờ cho thấy: số lượng của cả 2 chủng VSV trong vi nang AGL có thành phần tinh bột và CS đều tăng lên có ý nghĩa thống kê so với mẫu VSV tự do (p <0,05) [84]

Sohail Asma và cộng sự (2011) đã bào chế vi nang AGL bao CS và không

bao CS chứa 2 chủng L acidophilus và L rhamnosus theo 2 phương pháp khác

nhau là phun đông tụ và phương pháp đùn Kết quả kích thước vi nang thu được ứng với 2 phương pháp trên là 35µm (hạt vi mô) và 2mm (hạt vĩ mô) Dạng vi nang AGL (không bao CS) cho thấy đã làm tăng đáng để khả năng sống của cả 2 chủng

trong MT acid so với dạng tự do Cụ thể: với chủng L rhamnosus số VSV còn lại

sau 40 phút trong hạt vi mô và vĩ mô khác nhau không ý nghĩa thống kê nhưng sau

120 phút thì số VSV còn lại trong hạt vi mô ít hơn có ý nghĩa thống kê so với hạt vĩ

mô (p < 0,05) Với chủng L acidophilus sau 90 phút, số VSV còn lại trong hạt vi

mô và vĩ mô còn lại đều cao hơn có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) so với dạng tự do Hơn nữa, NC cũng cho thấy hiệu quả của CS đối với vi nang AGL trong MT dạ dày

- ruột Theo đó, khi không bao CS thì hạt vĩ mô bảo vệ VSV tốt hơn hạt vi mô (p < 0,05), nhưng sau khi được bao CS hạt vi mô cho kết quả bảo vệ VSV tương tự với hạt vĩ mô (p > 0,05) [77]

Ngoài ra, nhiều NC đã công bố cho thấy vi nang alginat có thể cải thiện bằng cách phối hợp thêm với thành phần khác như tinh bột, gelatin, lecithin,… Hay việc

bổ sung vitamin (như acid ascorbic, B2…) đạm sữa, tinh bột, sữa gầy, prebiotic

cũng làm tăng khả năng sống của probiotic trong vi nang [14], [29], [30], [56]…

- Về bào chế vi nang probiotic sử dụng kết hợp alginat và chitosan

Để tránh sự rò rỉ ion calci trong gel calci AGL dẫn đến phá hủy cấu trúc của

vi nang nên hạn chế để vi nang calci AGL tiếp xúc với các MT chứa acid nồng độ cao hay các chế phẩm có nguồn gốc từ sữa như sữa lỏng, sữa chua, kem,… vì trong các sản phẩm này có các thành phần tạo phức chelat với ion calci Gần đây, các nhà

NC đã tìm ra nhiều biện pháp khác nhau để cải thiện đặc tính lý hóa của vi nang bào chế từ AGL

Lee và cộng sự (2004) đã tiến hành đánh giá ảnh hưởng của CS trọng lượng

phân tử thấp, trung bình, cao (được ký hiệu là CS A, B và C tương ứng) đến sự sống

còn của vi nang AGL chứa L bulgaricus KFRI 673 Thử nghiệm trong dung dịch

dạ dày mô phỏng cho thấy L bulgaricus nhạy cảm với MT acid, sau 60 phút không

còn thấy sự tồn tại của VSV Kết quả đánh giá khả năng phát hành TB VSV trong

MT ruột giả cho thấy vi nang đã phân rã hoàn toàn tuy nhiên có sự sụt giảm số lượng TB so với ban đầu NC của tác giả đã cho thấy CS có tiềm năng trong việc

cải thiện khả năng sống của VK trong vi nang AGL đặc biệt là CS có mức độ acety hóa 85% và trọng lượng phân tử 3800Da (CS A) [53]

W Krasaekoopt và cộng sự (2004) đã tiến hành NC hiệu quả của việc phủ

chitosan và poly-L-lysine (PLL) bên ngoài vi nang AGL để tạo ra lớp áo bảo vệ thứ

2: kết quả cho thấy vi nang phủ CS có hiệu quả bảo vệ đối với L acidophilus và L.casei tốt hơn B bifidum và tốt hơn PLL khi thử nghiệm trong điều kiện dạ dày –

ruột mô phỏng Kết quả phân tích cấu trúc cắt ngang của vi nang thông qua kính hiển vi điện tử truyền qua TEM cho thấy độ dày của vi nang AGL tăng lên sau khi được bao CS và PLL khoảng 17% so với trước khi bao nhưng không phát hiện được

sự thay đổi về độ bền cơ học của vi nang bằng phương pháp này [51]

1.2.5.2 Các nghiên cứu tại Việt Nam

Tại Việt Nam, các NC về probiotic phần lớn chỉ dừng lại ở mức phân lập và định danh, tuyển chọn giống có hoạt tính cao và chỉ tập trung vào các chủng vi hiếu

khí như L acidophilus, Staphylococcus thermophilus, Lactococcus, B bifudum,…

Gần đây, đã có nhiều NC ứng dụng để tạo ra các sản phẩm giàu probiotic như: tạo

đồ uống lên men lactic từ cơ chất gạo lức, tạo thức uống giàu probiotic từ quả sơ ri,

lên men nước ép cam từ VK L plantarum, bổ sung probiotic vào dịch ép từ trái

điều, nước cà chua, nước cà rốt,… Tuy nhiên đa phần các NC này đều sử dụng trực tiếp nguyên liệu probiotic dạng tự do, ít sử dụng probiotic dạng vi nang Có lẽ do các NC về vi nang probiotic ở nước ta còn khá hạn chế vẫn còn ở giai đoạn NC cơ bản đầu tiên

Đỗ Quốc Cường (2009) đã tiến hành bào chế vi nang L acidophilus theo

phương pháp đùn sử dụng hỗn hợp gồm gelatin 10% và AGL 2%, và thay đổi KT là 1,0; 1,5; 2,0 mm Kết quả khảo sát trong MT dạ dày nhân tạo cho thấy vi nang đã

bảo vệ tốt cho VK L acidophilus tốt hơn so với VK ở dạng tự do, hạt vi nang có KT lớn hơn (2,0 ± 0,1mm và 1,5 ± 0,1mm) thì khả năng bảo vệ L acidophilus tốt hơn

vi nang có KT nhỏ (1,0 ± 0,1mm) [2]

Nghiên cứu của Nguyễn Mai Hương (2014) cho thấy hiệu quả phối hợp tinh bột đã cải thiện thể chất và làm tăng lượng VSV sống sót sau đông khô của nguyên liệu probiotic dạng vi nang Hạt vi nang có kích thước lớn hơn, đồng đều, bề mặt

hạt giảm nhăn nhúm và giữ được độ cầu tốt hơn, màu sắc trắng đẹp Hạt cứng, giảm xốp, rất dễ làm nhỏ, ít hút ẩm Với nồng độ AGL 2% và tinh bột 10% cho thể chất hạt tốt nhất Bước đầu đánh giá độ ổn định nguyên liệu bảo quản trong lọ PE kín tại

40C cho thấy sau 12 tuần nguyên liệu vẫn đạt tiêu chuẩn của nguyên liệu probiotic

ĐK [7]

Ninh Thị Kim Thu (2013) đã NC vai trò của alginat trong quá trình tạo nguyên liệu probiotic dạng bột đông khô và đánh giá ảnh hưởng của AGL đến khả

năng sống sót của VK L acidophilus trong quá trình đóng thuốc bột và đóng nang

cứng Kết quả NC cho thấy: khi sử dụng dung dịch AGL 2% làm TD bảo vệ trong

quá trình ĐK đã làm tăng tỷ lệ sống sót của L acidophilus so với mẫu ĐK bằng

nước cất tuy nhiên thể chất của sản phẩm thu được sau ĐK khó làm nhỏ và nhanh bị hút ẩm trở lại Điều này có thể khắc phục bằng cách bổ sung sữa gầy 10% Trong quá trình đóng thuốc bột và đóng nang cứng cho thấy AGL khi sử dụng làm TD độn

đã bảo vệ VSV trong điều kiện tiếp xúc với MT pH acid thì sống sót cao hơn lần lượt là khoảng 37 lần và 100 lần so với khi chỉ sử dụng tinh bột làm TD độn [13]

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị nghiên cứu

2.1.1 Nguyên liệu

Nguyên liệu chứa VSV

Chủng VSV L acidophilus ATCC 4356 dạng đông khô

Nguyên liệu pha MT

Bảng 2.1 Các nguyên liệu pha môi trường

Tên nguyên liệu Nguồn gốc Tiêu chuẩn

Kali dihydro phosphat Trung Quốc TKHH Magnesi sulfat heptadihydrat

Mangan sulfat tetrahyrat

Bảng 2.2 Các tá dược sử dụng

Bảng 2.3: Các môi trường sử dụng trong nghiên cứu

Môi trường MRS lỏng (MT1)

Cao thịt 10g Magnesi sulfat heptadihydrat 0,2g

Cao nấm men 5g Mangan sulfat tetrahydrat 0,05g

9 Tủ sấy WiseVen WOF – DAIHAN Scientific Hàn Quốc

12 Kính hiển vi gắn camera Nikon eclipse Ci-L Nhật

14 Máy khuấy từ IKA® RH Basic 1 Đức

15 Máy lắc điều nhiệt SHAKER INCUBATOR LSI 100B

Beijing KWF Sci - Tech Development

TQ

18 Ống nghiệm, bình nón, đĩa petri,…

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Bào chế vi nang L acidophilus

2.2.1.1 Khảo sát yếu tố công thức ảnh hưởng đến vi nang

Qua các tài liệu NC trong và ngoài nước có liên quan đến bào chế vi nang chứa TB VSV cho thấy các yếu tố thuộc công thức có ảnh hưởng rất lớn đến vi nang bào chế được Do đó, NC tiến hành khảo sát một số yếu tố công thức với các mức thay đổi nồng độ/tỷ lệ như sau:

Bảng 2.4: Bảng xây dựng các yếu tố ảnh hưởng và mức độ khảo sát

2.2.1.2 Khảo sát quy trình bào chế vi nang

Phương pháp bào chế vi nang L acidophilus với AGL và CS bằng phương

pháp hóa rắn nhũ tương thực chất là quá trình đông tụ nhũ tương từ bên ngoài Trong đó: ion Ca2+

không cho vào cùng với dung dịch AGL mà được thêm vào sau khi nhũ tương N/D hình thành, ion Ca2+

đi qua pha ngoại (pha dầu) vào tiếp xúc với AGL trong pha nội (pha nước) thúc đẩy quá trình đông tụ xảy ra để hình thành vi nang Do đó quá trình đông tụ không xảy ra đồng thời như phương pháp đông tụ từ bên trong mà cần thời gian để các hạt nhũ tương được hình thành (gọi tắt là thời gian nhũ hóa) và thời gian ion calci di chuyển vào pha nội để tạo vi nang với AGL

(thời gian ủ calci clorid) Các bước nhũ hóa tạo vi nang và ngâm ủ vi nang trong CS được quyết định bởi các thông số thời gian khuấy, tốc độ khuấy, thời gian ngâm ủ calci clorid và CS Khi các thông số này thay đổi cũng sẽ làm thay đổi chất lượng vi nang bào chế được Do đó, chúng tôi tiến hành khảo sát các thông số với các chỉ số thay đổi tương ứng như sau:

Bảng 2.5: Bảng xây dựng các thông số kỹ thuật và các mức khảo sát

Stt Các thông số Đơn vị Các mức khảo sát

1 Tốc độ khuấy v/ph 200; 400; 600

2 Thời gian nhũ hóa Phút 10; 20; 30

3 Thời gian ủ CaCl2 Phút 20; 30; 45

4 Thời gian ngâm Chitosan Phút 20; 30; 45

2.2.2 Theo dõi độ ổn định của vi nang L acidophilus đông khô

Sau khi bào chế thì chất lượng của vi nang L acidophilus có thể thay đổi trong

quá trình bảo quản do ảnh hưởng của các điều kiện khách quan của MT (nhiệt độ,

độ ẩm, ánh sáng) Chế phẩm vi nang mà đề tài NC chứa probiotic thuộc chi

Lactobacillus là loại không sinh bào tử như các loài sinh bào tử bền nhiệt như Bacillus spp,… Vì vậy, điều kiện bảo quản ảnh hưởng rất lớn đến độ ổn định của vi nang L acidophilus Do đó, chúng tôi tiến hành đánh giá độ ổn định của vi nang L acidophilus bào chế được ở hai điều kiện bảo quản khác nhau là: điều kiện bảo quản

ở nhiệt độ phòng và điều kiện bảo quản trong tủ lạnh

Chất lượng của vi nang L acidophilus được đánh giá dựa trên 1 số chỉ tiêu gồm: Hàm ẩm và số lượng VK L acidophilus sống sót trong 1g chế phẩm ĐK Kết

quả được so sánh với kết quả thu được ở thời điểm ban đầu ngay sau ĐK để đánh

giá độ ổn định của vi nang L acidophilus

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp bào chế vi nang L acidophilus

2.3.1.1 Phương pháp nhân giống

Cân, đong các thành phần MT MRS (công thức trong bảng 2.3) Hòa tan, phân tán hết các thành phần Hút 10,0ml MRS lỏng vào mỗi ống nghiệm, đậy kín ống nghiệm (ống thủy tinh, KT 1,5 x 20cm) Hấp tiệt khuẩn MT ở nhiệt độ 115oC trong

20 phút Để nguội, cấy 0,1g giống L acidophilus vào các ống nghiệm trên Ủ trong

tủ ấm ở điều kiện 37o

C, 5% CO2 trong 24 giờ

2.3.1.2 Phương pháp nuôi cấy

Pha 100ml dung dịch MT MRS lỏng theo công thức ở bảng 2.3 Hòa tan hết các thành phần, cho vào bình nón có dung tích thích hợp Nút bông kín và hấp tiệt khuẩn ở điều kiện 115o

C trong 20 phút bằng nối hấp tiệt khuẩn Để nguội, cấy 10,0ml giống (đã nhân giống ở trên) vào bình nón Ủ trong tủ ấm ở 37oC, 5% CO2trong 24 giờ

2.3.1.3 Phương pháp thu hỗn dịch sinh khối tế bào

Dịch nuôi cấy TB được lắc đều cho đồng nhất Li tâm thu sinh khối với tốc độ

4000 vòng/phút trong 10 phút Rửa sinh khối 2 lần với dung dịch nước cất đã tiệt khuẩn bằng cách ly tâm như trên Dùng 10,0ml dung dịch nước cất đã tiệt khuẩn để thu cắn sinh khối [12]

2.3.1.4 Phương pháp bào chế vi nang L acidophilus

Qua tham khảo tài liệu [51], VSV được cố định vào trong vi nang theo phương pháp nhũ tương có quy trình như sau:

Chuẩn bị pha nước (có chứa sinh khối VSV)

- Nghiền và cân tinh bột, hấp tiệt khuẩn, sấy khô

- Cân AGL (với các tỷ lệ khác nhau 1%; 2%; 3%; 4%), glycerol (với các tỷ lệ 0%; 7,5%; 15%; 22%) cho vào bình nón 100ml đã có sẵn nước tinh khiết với các thể tích thay đổi là 30ml; 40ml; 50ml; 60ml; 70ml, khuấy đều Đậy nút bông và đem đi hấp tiệt khuẩn ở 115oC trong 20 phút

- Để nguội ở nhiệt độ phòng, thêm tinh bột đã tiệt trùng ở trên, khuấy 15 phút ở tốc độ 400v/ph, bổ sung thêm sinh khối VSV (thu được ở phần 2.3.1.3) khuấy từ thêm 15 phút cho đồng nhất (thực hiện trong tủ vô trùng)

- Hút 1,0 ml dịch pha nội để đếm số lượng VSV ở thời điểm đầu tiên (ký hiệu là N1); từ đó để tính ra hiệu suất bao VSV trong nang tươi tạo thành so với ban đầu (theo công thức nêu ở mục 2.3.2.3)