Nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính kháng oxy hóa của cây bí kỳ nam với mục đích hỗ trợ điều trị bệnh viêm gan c và ung thư gan

TÓM TẮT CÁC NỘI DUNG CỦA ĐỀ TÀI 1.Tên đề tài NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC VÀ HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA CỦA CÂY BÍ KỲ NAM HYDNOPHYTUM FORMICARUM JACK VỚI MỤC ĐÍCH HỖ TRỢ ĐIỀU TRỊ BỆNH VI

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO GIA LAI

CUỘC THI KHOA HỌC – KĨ THUẬT CẤP QUỐC GIA DÀNH CHO

HỌC SINH NĂM HỌC 2015- 2016 ĐƠN VỊ DỰ THI: TRƯỜNG THPT CHUYÊN HÙNG VƯƠNG

SỞ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO GIA LAI

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC VÀ HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA CỦA CÂY BÍ KỲ

NAM (HYDNOPHYTUM FORMICARUM JACK)

NĂM 2016

LỜI CẢM ƠN

Chúng em xin chân thành cảm ơn ThS.Lê Thị Hữu Huyền, trường THPT Chuyên Hùng Vương tỉnh Gia lai, cô Hoàng Hà My và PGS-TS Nguyễn Văn Đậu, trường Đại học KHTN, ĐHQG HN đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện cho nhóm được hoàn thành đề tài này

Chúng em xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô Ban giám hiệu Trường THPT Chuyên Hùng Vương, các thầy cô trong tổ Nghiên cứu Khoa học, tổ Hóa học và tổ Sinh học Trường THPT Chuyên Hùng Vương, tỉnh Gia Lai đã tạo điều kiện tốt nhất có thể để nhóm chúng

em hoàn thành đề tài

Đề tài được thực hiện từ tháng 6/2015 đến tháng 1/2016 tại phòng thí nghiệm Hóa trường THPT chuyên Hùng Vương và phòng thí nghiệm Hóa dược, khoa Hóa học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia, Hà Nội

Tập thể tham gia đề tài nghiên cứu chân thành cám ơn sự hỗ trợ, tư vấn khoa học của các cán bộ nghiên cứu Phòng thí nghiệm hóa Dược, khoa Hóa học, trường Đại học KHTN, ĐHQG HN

Xin cảm ơn gia đình đã động viên, hỗ trợ để chúng con hoàn thành đề tài

Cuối cùng, xin chân thành cảm ơn bạn bè đã ủng hộ, động viên chúng em trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Danh mục bảng

Bảng 1:Kết quả điều chế các cặn chiết từ Bí Kỳ Nam 30

Bảng 2: Phân tích TLC phần chiết Cloroform (HFT) Cloroform - etanol 37

Bảng 3: Tỷ lệ bắt gốc tự do DPPH của các cao phân đoạn từ cây Bí Kỳ Nam 40

Bảng 4: Hoạt tính chống oxy hoá 46

Bảng 5: Khả năng loại gốc tự do – DPPH của cặn axeton (BKN) 46

Bảng 6: Khả năng ức chế xanthin oxydase của mẫu thử ở các nồng độ 47

Bảng 7: Kết quả so sánh IC50 của cao BKN với một số chất khác về khả năng ức chế tế bào dòng Hep-2 48

Danh mục hình Hình 1: Xử lí mẫu cây Bí Kỳ Nam 4

Hình 2: Bên trong thân cây Bí Kỳ Nam 4

Hình 3: Kỳ Nam lá rộng 5

Hình 4: Kỳ Nam lá hẹp 5

Hình 5: Bí Kỳ Nam sau khi phơi khô 5

Hình 6: Nơi cây phát triển (ở Việt Nam) 6

Hình 7: β-SitoSterol 7

Hình 8: Stigmasterol 8

Hình 9: Isoliquiritigenin(2) 8

Hình 10: Protocatechualdehyde(3) 8

Hình 11: Butin (4) 9

Hình 12: Butein (5) 9

Hình 13: Tế bào gan đang bị tấn công bởi vi khuẩn viêm gan C (VKVG-C), trong khi bạch huyết cầu đang phản công 15

Hình 14: Cây Bí Kỳ Nam 18

Hình 15: Xử lí mẫu cây Bí Kỳ Nam 21

Hình 16: Sơ đồ điều chế các phần chiết Bí Kỳ Nam 21

Hình 17: Sắc kí đồ (TLC) phần chiết Cloroform (HFT) Cloroform – etanol 37

Hình 18: Sơ đồ chiết xuất cao toàn phần và các cao phân đoạn 39

Hình 19: Sơ đồ phân lập từ cao etyl axetat cây Bí Kỳ Nam 42

Hình 20: Phổ MS của hợp chất BKN 1 43

Hình 21: Phổ 1H-NMR của hợp chất BKN 1 43

Hình 22: Phổ 13C-NMR của hợp chất BKN 1 44

Hình 23: Cấu trúc của hợp chất BKN 1 (methyl gallate) 44

Hình 24: Kết quả chạy phổ của BKN2 45

Hình 25: Cấu trúc của hợp chất BKN 2 ( 5,7,3’,4’-tetrahidroxyflavonone) 46

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục tiêu 2

3 Nội dung 2

4 Phương pháp nghiên cứu 2

5 Điểm mới của đề tài 3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 4

1.1 Giới thiệu về cây Bí Kỳ Nam 4

1.1.1 Hình thái, mô tả và phân loại của cây Bí Kỳ Nam 4

1.1.2 Bộ phận dùng làm thuốc 5

1.1.3 Phân bố, thu hái và chế biến 6

1.1.4 Công dụng trong Y học và cách sử dụng cây Bí Kỳ Nam trong dân gian [6] 6 1.1.5.Thành phần hóa học, phân tích sơ bộ và hoạt tính sinh học 7

1.2.Sơ lược về hoạt tính kháng oxy hóa [7, 27, 28, 29] 10

1.2.1 Sự hình thành các gốc tự do 10

1.2.2 Chất chống oxy hóa 10

1.2.3 Một số chất chống oxy hóa trong cây Bí Kỳ Nam [1, 2, 3] 12

1.2.4 Hoạt tính kháng oxy hóa của Cây Bí Kỳ Nam (Hydnophytum formicarum Jack) đến viêm gan siêu vi C và ung thư gan [25] 14

CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 Địa điểm và phạm vi nghiên cứu 18

2.1.1 Địa điểm nghiên cứu 18

2.1.2 Đối tượng nghiên cứu 18

2.2 Nội dung nghiên cứu 18

2.3 Hóa chất và thiết bị 19

2.3.1 Hóa chất 19

2.3.2 Thiết bị 19

2.4 Phương pháp nghiên cứu 19

2.4.1 Phương pháp thu hái, định danh và xử lý mẫu 19

2.4.2 Phương pháp định tính và định lượng các nhóm chất có trong Bí Kỳ Nam 20 2.4.3 Phương pháp chiết xuất 25

2.4.4 Phương pháp phân lập 26

2.4.5 Phương pháp xác định cấu tạo hóa học 27

2.5 Phương pháp đánh giá khả năng kháng oxy hóa 28

2.6 Phương pháp thử hoạt tính chống gout 28

2.7 Phương pháp thử hoạt tính chống ung thư 29

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30

3.1 Thu thập và xử lý mẫu 30

3.2 Kết quả định tính và định lượng 30

3.2.1 Kết quả điều chế cặn chiết 30

3.2.2 Kết quả định tính các chất 30

3.2.3 Kết quả của chạy sắc kí lớp mỏng phần chiết Cloroform 36

3.2.4 Chiết xuất cao toàn phần và các cao phân đoạn 38

3.3 Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của cao toàn phần và các cao phân đoạn 39

3.4 Phân lập các cấu tử 40

3.5 Xác định cấu trúc của cấu tử phân lập được 42

3.6 Tác dụng kháng oxy hóa của BKN1 46

3.7 Hoạt tính kháng oxy hoá của cặn axeton (BKN) 46

3.8 Hoạt tính kháng ung thư của cao Bí Kì Nam 47

3.9 Đánh giá hoạt độ chống ung thư gan (Hep-2) 47

3.10 Nhận dạng các hợp chất trong cặn chiết axeton 48

3.11 Kết quả thử hàm lượng chì và asen trong cao 52

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53

Kết luận 53

Kiến nghị 54

TÀI LIỆU THAM KHẢO 55

Tiếng Việt 55

Tiếng Anh 56

Tài liệu Internet 57

PHỤ LỤC 58

MỘT SỐ HÌNH ẢNH TRONG QUÁ TRÌNH NGHIÊN CỨU 58

TÓM TẮT CÁC NỘI DUNG CỦA ĐỀ TÀI

1.Tên đề tài

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC VÀ HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA

CỦA CÂY BÍ KỲ NAM (HYDNOPHYTUM FORMICARUM JACK) VỚI MỤC ĐÍCH HỖ

TRỢ ĐIỀU TRỊ BỆNH VIÊM GAN C VÀ UNG THƯ GAN

2.Mục tiêu và nội dung nghiên cứu

a) Mục tiêu

Phân tích định tính và định lượng một số thành phần có hoạt tính sinh học tiềm năng và

điều chế cao cây Bí Kỳ Nam ứng dụng cho phòng chống bệnh gan và ung thư gan

b) Các nội dung nghiên cứu

(1) Thu thập mẫu thực vật đúng tên khoa học (loài Hydnophytum formicarum Jack)

(2) Định tính sự có mặt của các nhóm chất chính trong Bí Kỳ Nam

(3) Định lượng các nhóm chất có hoạt tính kháng oxy hóa trong các cao dược liệu

(4) Thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hóa các cao chiết toàn phần và các cao phân đoạn

chiết bằng dung môi có độ phân cực khác nhau

(5) Phân lập và tinh chế một số hợp chất từ các cao phân đoạn có tác dụng kháng oxy

hóa tốt

(6) Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất đã phân lập

(7) Đánh giá khả năng kháng oxy hóa

(8) Đánh giá khả năng kháng Gout

(9) Đánh giá khả năng kháng ung thư

TRƯỜNG THPT CHUYÊN HÙNG VƯƠNG CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI

(Ký và ghi rõ họ tên) (Ký và ghi rõ họ tên)

Việt nam có một hệ thực vật rất đa dạng và phong phú với hơn 12.000 loài, 1200 chi thuộc hơn 300 họ thực vật, trong đó có khoảng 3.200 loài cây được sử dụng trong y học dân tộc Do vậy, việc nghiên cứu phát hiện và khai thác tài nguyên vô giá này nhằm tìm ra các hợp chất có hoạt tính sinh học cao là một công việc có ý nghĩa khoa học và thực tiễn [25]

Trong đó, tác dụng kháng oxy hoá cho viêm gan C và ung thư gan là những vấn đề ngày càng được quan tâm ở hầu hết các quốc gia trên thế giới Theo ước tính và thống

kê của Tổ chức y tế thế giới (WHO) thì hàng năm trên toàn cầu có khoảng 9-10 triệu người mới mắc bệnh ung thư và nhiễm viêm gan virus C (HCV), chiếm khoảng 170 triệu người Gan là một bộ phận quan trọng của con người, nó giúp cơ thể giải độc thanh lọc các chất gây hại Tuy nhiên ngày nay xã hội phát triển các mối quan hệ và giao tiếp trong cuộc sống và công việc ngày càng nhiều, con người ngày càng sử dụng nhiều bia rượu và các chất có cồn khác, khiến các độc tố gây hại cho gan tích trữ càng nhiều, gan giải độc không kịp thời gây nên bệnh viêm gan lâu dần thành ung thư [5, 13]

Qua các tài liệu tham khảo,Bí Kỳ Nam được dùng trong nhân dân với nhiều công dụng như lợi tiểu, tiêu viêm kháng sinh, sát trùng; các bệnh về xương khớp như đau nhức gân xương, bong gân, thấp khớp và chữa đau bụng, đi ngoài, nhưng công dụng

2

đáng chú ý nhất của Bí Kỳ Nam là chữa các bệnh về gan như viêm gan, đau gan, vàng

da [25]

Nhằm góp phần làm sáng tỏ về thành phần và hoạt tính sinh học của loài Bí Kỳ

Nam, chúng em chọn đề tài: NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC VÀ HOẠT

TÍNH KHÁNG OXY HÓA CỦA CÂY BÍ KỲ NAM (HYDNOPHYTUM

FORMICARUM JACK)VỚI MỤC ĐÍCH HỖ TRỢ ĐIỀU TRỊ BỆNH VIÊM

GAN C VÀ UNG THƯ GAN

(2) Định tính sự có mặt của các nhóm chất chính trong Bí Kỳ Nam

(3) Định lượng các nhóm chất có hoạt tính kháng oxy hóa trong các cao dược liệu (4) Thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hóa các cao chiết toàn phần và các cao phân đoạn chiết bằng dung môi có độ phân cực khác nhau

(5) Phân lập và tinh chế một số hợp chất từ các cao phân đoạn có tác dụng kháng

oxy hóa tốt

(6) Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất đã phân lập

(7) Đánh giá khả năng kháng oxy hóa

(8) Đánh giá khả năng kháng Gout

(9) Đánh giá khả năng kháng ung thư

4 Phương pháp nghiên cứu

- Phương pháp thu hái, định danh và xử lý mẫu

- Phương pháp chiết xuất và phân lập

+ Phương pháp chiết phân đoạn lỏng – lỏng

+ Phương pháp chiết pha rắn

+ Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân: 1H-NMR, 13C-NMR

+ Phương pháp phổ khối lượng

- Phương pháp xác định hoạt tính kháng oxy hóa

- Phương pháp thử hoạt tính chống Guot

- Phương pháp thử hoạt tính chống ung thư

5 Điểm mới của đề tài

Lần đầu tiên nghiên cứu để xác định cơ sở khoa học, thành phần hóa học và tác dụng kháng oxy hóa của cây Bí Kỳ Nam nhằm góp phần tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính kháng oxy hóa cao, giúp nâng cao hiệu quả chữa bệnh, tăng tính tiện dụng trong việc sử dụng thuốc

4

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU

1.1 Giới thiệu về cây Bí Kỳ Nam

1.1.1 Hình thái, mô tả và phân loại của cây Bí Kỳ Nam

1.1.1.1 Hình thái của cây Bí Kỳ Nam

Trái Bí Kỳ Nam, Kỳ Nam kiến có tên khoa học là Hydnophytum formicarum Jack,

thuộc họ Cà phê - Rubiaceae [25]

Hình 1: Cây Bí Kỳ Nam trưởng thành

Hình 2: Bên trong thân cây Bí Kỳ Nam

1.1.1.2 Mô tả [20]

Cây phụ sinh, cộng sinh với kiến Thân phình thành củ lớn, có hình thù đa dạng, thường hình con quay, to từ 10-30cm, mặt ngoài sần sùi mầu nâu xám; bên trong có những lỗ hổng chằng chịt mang đầy kiến, thịt nạc dày màu trắng đục, chứa nhiều nước Phía dưới củ mọc ra những rễ nhỏ và phía trên mang cành lá, cành ngắn mập, màu nâu

5

Lá cây màu xanh sẫm mọc đối xứng, mặt dưới nhạt, gốc thuôn, đầu tù, phiến lá dày

và nhẵn bóng Lá kèm sớm rụng Hoa Bí Kỳ Nam không có cuống, mọc tụ họp 4-5 cái

ở nách lá, màu trắng Quả hình trứng có đài tồn tại, khi chín màu đỏ da cam, chứa hai hạt

Mùa hoa tháng 5-8; quả tháng 12-1

Hình 3: Kỳ Nam lá rộng Hình 4: Kỳ Nam lá hẹp (Hydnophytum forimicarum Jack.) (Myrmecodia armata DC)

1.1.1.3 Phân loại

Có hai loại cây Kỳ Nam đều được dùng làm thuốc:

a) Kỳ Nam lá hẹp (Myrmecodia armata DC hay Myrmecodia tuberona Bl.) là một

cây phụ sinh, nhưng củ có gai do đó có tên Kỳ Nam gai, màu vỏ xám đen, bổ ra có thịt màu xám vàng, với rất nhiều lỗ cho kiến ở Thân đơn độc, tròn, nhẵn Lá thon, dầy, hẹp, gân phụ mịn 8-10 đôi, lá bẹ 1cm, tiểu nhuỵ 4 Quả nhân cứng, cao 2,5cm, nhân 4-

6

1.1.3 Phân bố, thu hái và chế biến

- Cây mọc hoang, bám vào các cây gỗ trong rừng thứ sinh ở miền Nam và các tỉnh Tây Nguyên nước ta, nhiều nhất ở tỉnh Gia Lai Còn có thể tìm thấy ở các tỉnh Đắk Lắk, KonTum, Lâm Đồng Ngoài ra, trên thế giới cây còn xuất hiện ở tại đầm lầy ngập mặn ở Luzon (Quezon) và Polillo, Quezo, hay loài cây này còn xuất hiện ở Ấn Độ, Trung Quốc, bán đảo Malaixia, Sumatra, Borneo, đến quần đảo Solomon và miền bắc Australia…

Tại các khu rừng ngập mặn của Phú Quốc có thể bắt gặp khá nhiều Bí Kỳ Nam, có những cây có thân lớn nặng hơn 10 kg [25]

Hình 6: Nơi cây phát triển (ở Việt Nam)

Thu hoạch gần như quanh năm nhưng nhiều nhất vào đầu mùa khô cho củ chất lượng tốt hơn Để nguyên củ, hoặc thái mỏng phơi hay sấy khô Khi dùng đem thuốc tẩm qua nước đang sôi, rồi sao vàng [25]

1.1.4 Công dụng trong Y học và cách sử dụng cây Bí Kỳ Nam trong dân gian [6]

a Tác dụng: Lợi tiểu, tiêu viêm kháng sinh, sát trùng, Y học dân tộc của các nước Đông Nam Á (Việt Nam, Thái Lan, )[21] cũng sử dụng Bí Kỳ Nam phối hợp với các thảo dược khác trong các bài thuốc dùng để chữa bệnh Ngoài ra còn là phương thuốc

để chữa các bệnh:

+ Bệnh về gan: Viêm gan, đau gan, vàng da…

+ Bệnh về xương khớp: Đau nhức gân xương, bong gân, thấp khớp

+ Bệnh về tiêu hóa: Đau bụng, tiêu chảy

+ Ngoài ra còn được dùng để chữa bệnh đau đầu hay điều trị ung thư

7

+ Cách dùng trong dân gian, gian, tại Việt Nam: Thu hái thân, thái mỏng, phơi đến gần khô thì phơi tiếp trong râm Khi dùng đem thuốc tẩm qua nước đang sôi, rồi sao vàng Tại Ấn Độ và Hà Lan, thuốc đắp của củ được dùng cho nhức đầu, Indonesia được sử dụng để điều trị sưng, đau đầu và thấp khớp Ở Thái Lan, được sử dụng để điều trị ung thư

b.Ðơn thuốc:

- Viêm gan, đau gan, vàng da: Bí Kỳ Nam 80g, Hạ Khô Thảo, Diệp Hạ Châu, Hậu Phác Nam, mỗi vị 20g sắc uống Hoặc Bí Kỳ Nam 40g, Thảo Quyết Minh 10g, Astisô 20g, Nhân Trần 15g, cho 500ml nước vào sắc còn 100ml, chia 2 lần uống trước 2 bữa

ăn khoảng 1 giờ Uống liên tục 10-15 ngày

- Ðau nhức gân xương, bong gân, Thấp khớp: Bí Kỳ Nam 40g, phối hợp với Bổ Cốt Toái 30g, rễ Trứng Cuốc, rễ Trinh Nữ, mỗi vị 20g, hoặc Ngũ Gia Bì 30g, rễ Vú Bò, Xuyên Tiêu, mỗi vị 20g, sắc uống hoặc ngâm rượu 30-40 độ (350g thuốc trong 1 lít rượu), ngày dùng 2 lần trước bữa ăn

- Ðau bụng: Sắc 60g thuốc Bí Kỳ Nam cho thật đặc, lấy 1/2 chén nước thuốc, chia 2 lần uống cách nhau 1 giờ

- Liều dùng 6-12g, sắc uống hoặc nấu cao uống

- Ngoài ra, củ Bí Kỳ Nam còn có tác dụng đối với các bệnh về tim mạch, kháng viêm, kháng kí sinh trùng, cũng như được dùng để chữa trị ung thư

- Nghiên cứu Bí Kỳ Nam cho thấy có các hợp chất flavonoid-đây là nhóm hợp chất

có nhiều tác dụng sinh học [25]

1.1.5.Thành phần hóa học, phân tích sơ bộ và hoạt tính sinh học

1.1.5.1 Nghiên cứu hóa học

Nghiên cứu hóa học cho thấy Bí Kỳ Nam kiến có các hoạt chất sinh học rất đa dạng Củ Bí Kỳ Nam có chứa rất nhiều muối vô cơ (có lẽ do kiến tha về) bao gồm 22 nguyên tố (Be, Al, Ca, Cr, Mn, Fe, Zn, Ba, P, Li, Sr, Rb, Hg, Tl, In, Pb, Cd, As, Cs,

Na, K và Mg) Trong số đó có các nguyên tố thiết yếu và đóng vai trò quan trọng cho

cuộc sống như Mn, Fe, Zn và Cr Các chất hữu cơ được tìm thấy như sitosterol (1), stigmasterol (2), các flavonoid và vết ancaloit (Phân viện Dược liệu, thành phần Hồ

Chí Minh, 1981) Đặc biệt sự có mặt của các flavonoid, các hợp chất phenolic như

8

isoliquiritigenin (3), butin (4), butein (5), protocatechualdehyde (6),… đã tạo cho Bí

Kỳ Nam khả năng chống oxy hóa cao[16, 24, 25]

Công thức của các hoạt chất tìm thấy trong Bí Kỳ Nam (Hydnophytum forimicarum Jack.)

dị ứng, ung thư cổ tử cung, đau cơ xơ, lupus ban đỏ (SLE), hen suyễn, rụng tóc, viêm phế quản, đau nửa đầu, đau đầu và hội chứng mệt mỏi mãn tính

Một số nam giới sử dụng β-sitosterol cho tiền liệt tuyến (tuyến tiền liệt lành tính hyperplasia hoặc BPH) Một số phụ nữ sử dụng để điều trị các triệu chứng của thời kì mãn kinh

β-sitosterol cũng được sử dụng để tăng cường hoạt động tình dục

Vận động viên chạy marathon đôi khi sử dụng β-sitosterol để giảm đau và sưng sau khi chạy

*) Stigmasterol

Hình 7: β-Sitosterol

9

Stigmasterol được dùng để ngăn ngừa một số dạng ung thư như buồng trứng, ung thư vú, tuyến tiền liệt và ung thư ruột kết Nó cũng có khả năng chống oxy hóa cao, giảm đường huyết (hypoglycemic), cũng như ức chế tuyến giáp

* Butin: Butin thuộc nhóm flavanone 9

* Butein: Butein thuộc nhóm chalconoid như Isoliquiritigenin

Hình 8 : Stigmasterol

10

1.1.5.2 Nghiên cứu dược học [17, 18, 15]

Các nghiên cứu dược lí Bí Kỳ Nam cho thấy nó có các hoạt tính sinh học như chống oxy hóa, kháng khuẩn, chống ung thư, tác dụng giảm rối loạn đường ruột (intestinal complaints), và ức chế sự tăng trưởng của tế bào (antiproliferative) Các hợp chất phân lập từ Bí Kỳ Nam cũng gây ra "hiện tượng tự chết theo chương trình" (apoptosis) của 7 dòng tế bào thông qua sự điều chỉnh của Bax Do vậy, một số hợp chất trong Bí Kỳ Nam được dùng để điều trị ung thư đốt sống cổ, ung thư ruột kết, tế bàoT ung thư máu Một nghiên cứu về Bí Kỳ Nam của Việt Nam cho thấy nó tác dụng đối với các bệnh gan, tiêu chảy, thấp khớp Ngoài ra, nghiên cứu này cũng phát hiện khả năng ức chế enzim xanthine oxydase có liên quan đến bệnh gout

1.2.Sơ lược về hoạt tính kháng oxy hóa [7, 27, 28, 29]

1.2.1 Sự hình thành các gốc tự do

Nguồn gốc hình thành các gốc tự do (OH. , O2 .–, NO. ,…) như tia UV, bức xạ ion

hóa, ô nhiễm không khí, hút thuốc, trao đổi chất, sự cháy, căng thẳng,… Các gốc tự do

là nguyên nhân gây tổn thương tế bào, protein, axit nucleic, ADN,… và dẫn tới các căn bệnh nguy hiểm như ung thư, lão hóa, tiểu đường, tim mạch,…Do đó, để tránh sự gây hại của các gốc tự do thì cần thiết phải loại bỏ chúng bằng cách sử dụng các chất chống oxy hóa bổ sung như các vitamin (A, C, E,…), polyphenols, flavonoids, anthocyanins, carotenoids,…

1.2.2 Chất chống oxy hóa

Chất chống oxy hóa là một loại hóa chất giúp ngăn chặn hoặc làm chậm quá trình oxy hóa chất khác Sự oxy hóa là loại phản ứng hóa học trong đó electron được chuyển sang chất oxy hóa, có khả năng tạo các gốc tự do sinh ra phản ứng dây chuyền phá hủy

tế bào sinh vật Chất chống oxy hóa ngăn quá trình phá hủy này bằng cách khử đi các gốc tự do, kìm hãm sự oxy hóa bằng cách oxy hóa chính chúng Để làm vậy người ta hay dùng các chất khử (như thiol hay polyphenol) làm chất chống oxy hóa

Dù phản ứng oxy hóa thuộc loại cơ bản trong đời sống nhưng có thể ngăn chặn nó,

chẳng hạn động thực vật duy trì hệ thống rất nhiều loại chất chống oxy hóa như glutathione, vitamin C, E, enzyme catalase, superoxyde dismutase, axit citric

Chất oxy hoá còn gọi là gốc tự do, đó là những phân tử hay hợp tử chất có chứa điệntử độc thân không ghép đôi Chính do chứa điện tử độc thân mà gốc tự do có hoạt tính rất mạnh, nó luôn mang tính "huỷ hoại", sẵn sàng thực hiện tính oxy hoá, cướp điện tử của chất mà nó tiếp xúc và làm chất bị nó oxy hoá bị huỷ hoại nặng nề.Trong

cơ thể, phản ứng của chất oxy hoá của gốc tự do gây huỷ hoại tế bào (đặc biệt ở màng

tế bào hoặc cấu trúc di truyền trong nhân tế bào) phá huỷ các mô gây nên quá trình lão hoá

Oxy hóa là quá trình chuyển electron từ nguyên tử này sang nguyên tử khác, oxyhóa rất quan trọng trong quá trình trao đổi chất Tuy nhiên, khi electron ở trạng thái độc thân, chúng sẽ tạo ra các gốc tự do được gọi là những loại oxy hoạt động

(reactiveoxygen species) như: superoxyde (O2.), peroxyl (ROO.), alkoxyl (RO.),

hydroxyl(HO.) và nitric oxyde (NO.) Gốc tự do RO và HO nhanh chóng tấn công vào các phân tử lipid trong màng tế bào, protein trong các mô hay các enzyme, cacbohydrate và ADN gây hư hại màng tế bào, ADN, biến tính protein Quá trình này được xem là nguyên nhân của sự lão hóa và nhiều bệnh tật khác như tim mạch, suy giảm trí nhớ, ung thư, huyết áp,…

Trong cơ thể, bên cạnh các gốc tự do luôn có hệ thống các chất chống oxy hóa “nội sinh” để cân bằng lại, vô hiệu hóa các gốc tự do Hệ thống các chất chống oxy hoánội sinh gồm các enzym như glutathione peroxydase, superroxyd, dismutase đặc biệt là vitamin C, vitamin E, beta-caroten (tiền vitamin A)… xúc tác các phản ứng khử để vô hiệu hoá gốc tự do (còn gọi là "bẫy" gốc tự do) giúp cơ thể khoẻ mạnh Nhưng do các yếu tố bên ngoài tác động vào làm cho các gốc tự do sinh ra quá nhiều và hệ thốngchất oxy hoá nội sinh không đủ sức cân bằng, cơ thể sẽ sinh ra rối loạn bệnh lý, có thể gây ung thư

12

Nguyên nhân gây ra ung thư đã được làm sáng tỏ là một quá trình nhiều bước, trong

đó giai đoạn xúc tiến có liên hệ chặt chẽ đến sự hư hại mô bị viêm và mô bị oxy hóa Bằng thực nghiệm đã chứng minh được các gốc tự do có liên quan đến sự xúc tiến khối

u trong da chuột và các mô khác Khi các chất hoạt hóa khối u được áp dụng cục bộ vào da chuột đã sinh ra H2O2 trong biểu bì, điều này tương quan với khả năng xúc tiến khối u của các chất này Do đó các chất có hoạt tính chống oxy hóa mạnh có khả năng ngăn chặn sự gây ung thư, đặc biệt ở giai đoạn xúc tiến

Do vậy, xu hướng nghiên cứu gốc tự do và các chất chống oxy hóa ngày càng được chú trọng trong lĩnh vực Y-dược nhằm phát hiện những chất chống oxy hóa mang lại những tác dụng tốt có lợi cho sức khỏe con người, trong đó chất chống oxy hóa có nguồn gốc thiên nhiên được nhiều quốc gia, nhiều nhà khoa học quan tâm do đặc tínhít độc, dễ hấp phụ đối với cơ thể và ít gây ra các phản ứng phụ [13]

1.2.3 Một số chất chống oxy hóa trong cây Bí Kỳ Nam [1, 2, 3]

Một số chất chống oxy hóa là chất dinh dưỡng bao gồm: Vitamin A, vitamin C, vitamin D, vitamin E, beta-carotene, selen, hợp chất lycopene,

Ngoài ra còn có các chất chống oxy hóa khác như: flavonoid, ankaloid, saponin, hỗ trợ điều trị ung thư gan và viêm gan C

1.2.3.1 Chất flavonoid

a) Flavonoid

* Chất flavonoid là những chất oxy hóa chậm hay ngăn chặn quá trình oxy hóa do các gốc tự do, có thể là nguyên nhân làm cho tế bào hoạt động khác thường (là các yếu

tố gây biến dị, huỷ hoại tế bào ung thư, tăng nhanh sự lão hoá,…)

Các flavonoid còn có khả năng tạo phức với các ion kim loại nên có tác dụng bảo

vệ cơ thể, ngăn ngừa xơ vữa động mạch, tai biến mạch, lão hoá, thoái hoá gan, tổn thương do bức xạ Flavonoid làm giảm nguy cơ về tim mạch như huyết áp cao, có tác dụng chống độc, làm giảm thương tổn gan, bảo vệ chức năng gan

* Cơ chế chống oxy hóa của flavonoid

Ngăn chặn quá trình oxy hóa do các gốc tự do Có tác dụng bảo vệ cơ thể, ngăn ngừa xơ vữa động mạch, tai biến mạch, lão hoá, thoái hoá gan, tổn thương do bức xạ

13

Có tác dụng củng cố, nâng cao sức chống đỡ và hạ thấp tính thẩm thấu các hồng huyết cầu qua thành mạch thông qua tác dụng lên các cấu trúc màng tế bào của nó hay nói cách khác là duy trì độ mềm dẻo của thành mạch, ứng dụng vào điều trị các rối loạn chức năng tĩnh mạch, giãn hay suy yếu tĩnh mạch

Có tác dụng chống độc, làm giảm thương tổn gan, bảo vệ chức năng gan

Các dẫn xuất flavonoidcó khả năng dập tắt các gốc tự do như HO, ROO Các gốc này sinh ra trong tế bào bởi nhiều nguyên nhân và khi sinh ra cạnh DHA thì sẽ gây ra những ảnh hưởng nguy hại như gây biến dị, hủy hoại tế bào, gây ung thư, tăng nhanh lão hóa Thí nghiệm cho thấy khả năng dập tắt của một số flavonoid theo thứ tự myricetin> quercetin > rhammetin > morin > diosmetin > naringenin >apigenin > catechin > 5,7 dihydroxy-3’, 4’, 5’ trimethoxy flavon >roinin > kaempferol > flavon Flavonoid tạo được phức với các ion kim loại mà chính các ion kim loại này là xúc tác của nhiều phản ứng oxy hóa Các flavonoid có 3, 5, 3’, 4’ hydroxy có khả năng liên kết tốt với các ion kim loại đó theo phức oxychromon, oxycarbonyl hoặc 3’, 4’ orthodioxyphenol

1.2.3.2 Polyphenol

Polyphenol có tác dụng chống oxy hóa mạnh, bắt giữ gốc tự do, bảo vệ tế bào trước

sự tấn công của các gốc tự do độc hại Cao chiết toàn phần Bí Kỳ Nam làm phục hồi tổn thương tế bào gan mà không ảnh hưởng đến các thông số sinh hóa, huyết học cũng như gan, thận về đại thể và vi thể khi sử dụng trong thời gian dài Mục tiêu: Nhằm khảo sát hoạt tính chống oxy hóa, bắt giữ gốc tự do của các phân đoạn chiết từ cây Bí

Kỳ Nam

1.2.3.3 Tanin: Dung dịch Tanin kết hợp với protein tạo thành màng trên niêm mạc

nên thường dùng làm thuốc săn da Tanin có tác dụng kháng khuẩn dùng làm thuốc súc miệng khi viêm niêm mạc miệng hoặc chỗ loét khi nằm lâu Chữa viêm ruột, tiêu chảy Tanin kết tủa với kim loại nặng và ankaloid thường dùng để chữa ngộ độc đường tiêu hoá

1.2.3.4 Saponin (còn gọi là các ginsenoside)

- Tác dụng chống ung thư trên thực nghiệm

- Ginsenoside Rh2 đã được các nhà khoa học Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc… chứng minh có tác dụng kiềm chế sự sinh trưởng, phát triển của tế bào ung thư và khôi

14

phục lại chức năng bình thường của chúng do đã bị mất đi trong quá trình ung thư hóa (được gọi là cảm ứng tái phân hóa tế bào ung thư), đồng thời còn có khả năng phòng chống sự xâm lấn và di căn của các tế bào ác tính Cơ chế cụ thể là: do tốc độ nhân bản nhanh, nên các tế bào ung thư phải có những hoạt động đặc trưng trong giai đoạn G1 Ginsenoside Rh2 có khả năng ngăn chặn sự phát triển của tế bào ung thư ngay trong giai đoạn này, khiến cho chúng bị yếu hoặc chết đi, để không phát triển sang giai đoạn khác Ngoài ra, Ginsenoside Rh2 còn có tác dụng ngăn chặn, kìm hãm việc hình thành ADN và ARN trong nhân bản của tế bào ung thư

1.2.4 Hoạt tính kháng oxy hóa của Cây Bí Kỳ Nam (Hydnophytum formicarum

Jack) đến viêm gan siêu vi C và ung thư gan [25]

1.2.4.1 Khái niệm bệnh viêm gan

Viêm gan siêu vi C là bệnh truyền nhiễm, chủ yếu ảnh hưởng đến gan, do siêu vi viêm gan C (HCV) gây ra Bệnh thường không có triệu chứng, nhưng viêm mạn tính

có thể dẫn đến mô sẹo ở gan và cuối cùng là xơ gan Nhìn chung, triệu chứng của xơ gan biểu hiện rõ sau nhiều năm mắc phải Trong một số trường hợp, bệnh nhân xơ gan

sẽ bị suy gan, ung thư gan hoặc thực quản và giãn tĩnh mạch dạ dày có thể gây tử vong HCV chủ yếu lây qua đường máu do tiêm chích ma túy, dụng cụ y khoa không đảm bảo vô khuẩn và tiêm truyền Ước tính có 130–170 triệu người trên toàn thế giới bị viêm gan siêu vi C Giả thuyết về bệnh viêm gan siêu vi C (lúc đầu gọi là "không A không B") được đưa ra vào thập niên 70 và đến năm 1989 thì xác định là bệnh viêm gan siêu vi C Bệnh viêm gan siêu vi C chỉ có ở người và tinh tinh Siêu vi tồn tại dai dẳng trong gan ở khoảng 85% bệnh nhân viêm gan C Tình trạng viêm nhiễm dai dẳng

có thể điều trị bằng thuốc: phác đồ điều trị chuẩn là kết hợp peginterferon và ribavirin, trong một số trường hợp dùng thêm hoặc boceprevir hoặc telaprevir Nhìn chung, 50–80% bệnh nhân được điều trị lành bệnh Những bệnh nhân chuyển sang xơ gan hoặc ung thư gan có lẽ cần phải ghép gan Viêm gan siêu vi C là nguyên nhân hàng đầu dẫn đến ghép gan dẫu rằng tái nhiễm siêu vi C sau cấy ghép thường xảy ra Hiện vẫn chưa

có vắc xin phòng ngừa viêm gan siêu vi C [8]

1.2.4.2 Nguyên nhân và nguồn gốc bệnh [14, 15]

ra bệnh viêm gan Một loại lây qua thức ăn; đó là vi khuẩn viêm gan A Một loại lây qua máu; đó là vi khuẩn viêm gan B Nhưng chỉ sau một thời gian ngắn, người ta nhận thấy điều này không hoàn toàn đúng, vì đa số bệnh nhân viêm gan không phải do vi khuẩn viêm gan A hoặc B gây ra Vì thế danh từ "non-A, non-B hepatitis" ra đời vào

đầu năm 1974, để diễn tả những trường hợp này

Sau hơn một phần tư thế kỷ, với kỹ thuật nghiên cứu các phân tử cực kỳ nhỏ bé (molecular biologic techniques), các khoa học gia đã khám phá thêm một vi khuẩn viêm gan thứ ba Ðó là vi khuẩn viêm gan C Trong vòng một thời gian ngắn, họ đã phát họa được cơ cấu và hình thù của vi khuẩn viêm gan này một cách chi tiết với từng chất hóa học xếp dọc theo thứ tự trên chuỗi nhiễm thể ARN Khám phá này là một điểm son lịch sử, dẫn đầu cho hàng loạt những khám phá quan trọng kế tiếp trong việc chữa trị bệnh viêm gan C Song song với những cuộc nghiên cứu công phu và tỉ mỉ về những bệnh nhiễm trùng khác, nhất là bệnh AIDS, sự hiểu biết về vi khuẩn viêm gan C

và cách thức chữa bệnh tiếp tục tăng trưởng một cách rất khả quan

Hình 13: Tế bào gan đang bị "tấn công" bởi vi khuẩn viêm gan C (VKVG-C), trong

khi bạch huyết cầu đang "phản công"

16

1.2.4.3.Đặc tính của vi rút viêm gan C

Vi khuẩn viêm gan C cực kỳ nhỏ bé, với đường kính là 50 nm, nên phải nhìn dưới kính hiển vi điện tử mới thấy được Vi khuẩn được bảo vệ bởi một lớp vỏ kiên cố, nên phải nấu sôi lên 100°C trong vòng 5 phút mới có thể tiêu diệt được chúng Khi xâm nhập vào cơ thể, vi khuẩn viêm gan C có khuynh hướng tàn phá và tiêu hủy gan của chúng ta một cách tương đối chậm chạp nhưng chắc chắn, đưa tới viêm gan (inflammation, hepatitis), xơ gan (liver fibrosis), chai gan (liver cirrhosis) và ung thư gan

Trong lúc tăng trưởng, chúng có khả năng thay đổi đặc tính di truyền ARN của mình, “hóa trang” và biến dạng thành nhiều "hình thù" khác nhau Khả năng biến hóa này đã giúp chúng thoát khỏi vòng kiểm soát chặt chẽ của hệ thống miễn nhiễm (immune system) Vì thế, sau một thời gian ngắn, cơ thể chúng ta, có thể chứa đựng hàng tỷ vi khuẩn viêm gan C với nhiều mã di truyền khác nhau, với những chiếc "áo giáp" khác nhau

Sự biến đổi chất nhiễm thể trong hơn 2000 năm qua, đã tạo ra nhiều kiểu gene khác nhau (genotypes) với những tên như vi khuẩn viêm gan C số 1, vi khuẩn viêm gan C số

2, vi khuẩn viêm gan C số 3, v.v Trong mỗi genotype này, người ta còn phân chia thành những tiểu loại (subtypes) a, b, c, d, e, v.v., dựa theo một số đặc tính chính yếu khác nhau Vì thế vi khuẩn viêm gan C được phân loại thành viêm gan C 1a, 1b, 1c, 2a, 2b, 2c, 2d, 3a, 3b, 3c, 3d, 3f, 4a, 4b v.v Khám phá này ban đầu chỉ dùng trong những cuộc khảo cứu, nhưng nay đã trở thành một lối thử máu vô cùng quan trọng trong quá trình chữa bệnh viêm gan C

Trong các loại vi khuẩn viêm gan C, loại genotype số 1 chiếm tỷ lệ cao nhất trên thế giới nói chung và ở nước Mỹ nói riêng với 35% loại 1a và 35% loại 1b Loại 1b cũng được tìm thấy nhiều nhất ở châu Âu, Nhật Bản cũng như Ðài Loan Loại số 3 thường thấy ở Pakistan, Úc, Scotland Loại số 4 ở Trung Ðông và Châu Phi cũng như South Africa Loại số 6 tại Hồng Kông và Macau Phần còn lại thuộc loại số 6 hoặc số 7 Một

số ít thuộc số 2, 3 Nói một cách tổng quát, các loại genotypes đều nguy hiểm như nhau, nhưng vi khuẩn viêm gan C loại 2 và 3 dễ chữa nhất Loại số 1, nhất là 1b khó chữa hơn cả [8, 14, 15]

17

1.2.4.4 Yếu tố và điều kiện bất lợi

Nhiều dữ kiện khác nhau có thể gây ảnh hưởng trực tiếp đến sự tiến triển của bệnh viêm gan C Vì thế bệnh có thể phát triển nhanh chóng hơn dự tính gấp nhiều lần Những người bị viêm gan C sau khi nhận máu nhiễm khuẩn, sẽ bị chai gan nhanh hơn (thường từ 8 đến 14 năm sau khi bị lây bệnh) Có lẽ trong lúc nhận máu, cơ thể đã bị tấn công và xâm lấn một cách ồ ạt bởi hàng tỷ vi khuẩn viêm gan C cùng một lúc, nên gan bị viêm nặng hơn

Rượu bia, nếu uống quá nhiều sẽ gây tổn thương tế bào gan, và gan sẽ bị chai nhanh hơn Người viêm gan C kinh niên mà uống quá nhiều rượu bia, không khác gì như

"châm dầu vào lửa"

Một số thuốc khác nhau cũng có thể làm cho lá gan bị chai nhanh hơn Vì thế, người viêm gan C nên rất thận trọng khi uống bất cứ một loại thuốc nào, ngay cả các loại thuốc cỏ cây bày bán trên thị trường mà không cần toa bác sĩ

Gan cũng sẽ bị hư nhanh chóng hơn nếu cùng một lúc bệnh nhân bị nhiễm trùng bởi nhiều loại vi khuẩn viêm gan khác nhau Ðây là trường hợp khi bệnh nhân bị cùng một lúc nhiều loại bệnh nhiễm trùng khác nhau như viêm gan B, viêm gan C, viêm gan D hoặc bệnh HIV-AIDS

May mắn thay, không phải ai bị viêm gan C cũng sẽ bị chai gan Và trên lý thuyết chỉ khoảng 5% bệnh nhân viêm gan C mới bị thiệt mạng bởi căn bệnh này Tuy thế, với 2% tổng số dân chúng toàn cầu, viêm gan C đã trở thành một trong những căn bệnh nguy hiểm nhất trong thế kỷ 21 Riêng tại Mỹ, sẽ có khoảng 8 đến 10 ngàn người thiệt mạng mỗi năm [8, 14, 15]

Kết luận:

Mặc dù cây cây Bí Kỳ Nam đã được sử dụng trong Y học cổ truyền, nhưng hiện nay ở Việt Nam chưa có nghiên cứu nào về loài này Việc nghiên cứu thành phần hóa học và các hoạt tính sinh học sẽ góp phần làm sáng tỏ thêm thành phần hóa học cũng như các kinh nghiệm sử dụng cây thuốc này trong dân gian và đặc thù loài tại Việt Nam để định hướng cho những nghiên cứu ứng dụng tiếp theo

18

CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Địa điểm và phạm vi nghiên cứu

2.1.1 Địa điểm nghiên cứu

Tại phòng thí nghiệm Hóa trường THPT chuyên Hùng Vương Gia Lai và phòng thí nghiệm Hóa dược, khoa Hóa học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc

gia, Hà Nội

2.1.2 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu cây Bí Kỳ Nam, chủ yếu phần thân phình thành củ do kiến đục làm tổ, tạo thành hốc, lỗ - Caulis Hydnophyti được dùng làm thuốc

Hình 14:Cây Bí Kỳ Nam

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Thu thập mẫu thực vật đúng tên khoa học (loài Hydnophytum formicarum Jack)

- Định tính sự có mặt của các nhóm chất chính trong Bí Kỳ Nam

- Định lượng các nhóm chất có hoạt tính kháng oxy hóa trong các cao dược liệu

- Thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hóa các cao chiết toàn phần và các cao phân đoạn chiết bằng dung môi có độ phân cực khác nhau

- Phân lập và tinh chế một số hợp chất từ các cao phân đoạn có tác dụng kháng oxy

hóa tốt

- Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất đã phân lập

19

- Đánh giá khả năng kháng oxy hóa của cấu tử phân lập được

- Hoàn thiện nghiên cứu và báo cáo kết quả dự án

2.3 Hóa chất và thiết bị

2.3.1 Hóa chất

Các hóa chất sử dụng trong quá trình nghiên cứu đạt yêu cầu theo tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam IV (DĐVN IV)[25]

Dung môi sử dụng: n-hexane, Cloroform, n-butanol, etyl axetat, acetone, etanol,

nước cất, acid formic, acid acetic…

Thuốc thử: dung dịch acid sulfuric 10%, dung dịch amoniac đậm đặc

Chất nhồi cột sắc ký: silica gel pha thường (Silica gel 60 0,040-0,063mm (230-400 mesh ASTM), Merck), pha đảo (YMC, 30-50 µm, FuJisilisa Chemical Ltd.), Sephadex LH-20 và Dianion HP-20 Ngoài ra còn sử dụng sắc ký lớp mỏng pha thường (TLC-Silicagel 60 F254 Merck), pha đảo (RP18 Merck)

2.3.2 Thiết bị

Cân phân tích hiện số Mettler Toledo AB204-S, độ chính xác 0,0001 g

Micropipette 100, 200, 500 µL (Human), micropipette 50 µL (Excel monopette 8000)

Các dụng cụ thủy tinh: cột sắc ký, pipette, đũa thủy tinh, cốc có mỏ nhiều thể tích, bình tam giác, bình cầu hai cổ nhám, ống sinh hàn, bình gạn, bình chạy sắc ký

Bếp điện, tủ sấy Memmert, máy cô quay Yamato, bình chiết, máy lọc hút chân không, tủ sấy, máy nung

Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker Avance AM500 FT-NMR, máy đo phổ khối lượng

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp thu hái, định danh và xử lý mẫu

20

+ Thu hoạch gần như quanh năm nhưng nhiều nhất vào đầu mùa khô cho củ chất lượng tốt hơn Hoặc để nguyên củ, hoặc thái mỏng phơi hay sấy khô Khi dùng đem thuốc tẩm qua nước đang sôi, rồi sao vàng

+ Loại bỏ những phần bị hư hỏng

2.4.1.2 Định danh

- Thu mẫu có đầy đủ các bộ phận cần thiết phần thân phình thành củ do kiến đục làm tổ, tạo thành hốc, lỗ - Caulis Hydnophyti được dùng làm thuốc làm mẫu tiêu bản

- Ghi chép tất cả những thông tin về loài nghiên cứu như: mô tả hình thái, màu sắc hoa, quả, nơi phân bố và môi trường sống, tình trạng của cây trong tự nhiên

- Chụp ảnh sinh cảnh, môi trường cây mọc, toàn phần hay một phần của quần thể thực vật

-Xác định tên khoa học dựa trên phân tích hình thái thực vật, đối chiếu với các tài

liệu phân loại thực vật

2.4.1.3 Xử lý mẫu

Phần thân phình thành củ do kiến đục làm tổ, tạo thành hốc, lỗ - Caulis Hydnophyti được dùng làm thuốc của cây Bí Kỳ Namsau khi thu hái, tiến hành loại bỏ các phần bị sâu bệnh, nấm mốc, vàng héo, úa dập cũng như các loài thực vật ký sinh khác Sau đó rửa sạch, thái nhỏ, phơi, sấy khô ở 50-60 oC và xay thành bột thô để tiến hành chiết xuất, phân lập các hợp chất

2.4.2 Phương pháp định tính và định lượng các nhóm chất có trong Bí Kỳ Nam 2.4.2.1 Định lượng các phần chiết

a) Xử lí mẫu

Mẫu Bí Kỳ Nam (lá rộng) được mua tại rừng KonKaKing huyện Kbang, huyện Mang Yang Gia Lai, tháng 8 năm 2015 Mẫu cũng có thể mua ở Điện Biên 2, xã

Eakmut, huyện Eakar Đăk lăk hoặc Kam Long tỉnh Kon Tum

Mẫu Bí Kỳ Nam được giám định tên khoa học là Hydnophytum formicarum Jack,

thuộc họ Cà phê - Rubiaceae Mẫu được lưu giữ tại phòng thí nghiệm hoá trường THPT Chuyên Hùng Vương – Gia Lai

Bí Kỳ Nam được sấy khô (không quá 50 oC) và cắt thành miếng nhỏ ~ 2-3 mm

21

Hình 15: Xử lí mẫu cây Bí Kỳ Nam

b)Sơ đồ điều chế các phần chiết

Etanol

Cao etanol Định tính các lớp chất

Hình 16:Sơ đồ điều chế các phần chiết Bí Kỳ Nam

c) Qui trình điều chế các phần chiết

Bí Kỳ Nam đã cắt nhỏ (500 g) được ngâm với etanol 96o trong thời gian khoảng

2-3 ngày Trong thời gian ngâm thỉnh thoảng khấy đều để tăng sự khuếch tán giữa mẫu ngâm và dung môi Sau đó, lọc lấy dịch chiết etanol (qua giấy lọc), sau đó ngâm tiếp mẫu với lượng etanol mới Quá trình ngâm chiết này lặp lại 5 lần

Gộp các dịch chiết etanol và sử dụng máy chưng cất để loại etanol ở nhiệt độ ~ 50 oC dưới áp suất giảm đến khi còn khoảng 200 ml Pha loãng dịch cồn này với ~ 200 ml nước, thu được dịch cồn-nước

Bí Kỳ Nam

Cặn chiết Etyl axetat Cặn chiết

Clorofom

22

Chiết dịch cồn-nước lần lượt với Cloroform và etyl axetat (tăng dần độ phân cực của

dung môi) Thao tác chiết được lặp lại ~3-4 lần (cho đến khi lớp dung môi chiết hầu như

không còn màu là được) Làm khô các dịch chiết với Na2SO4 khan Cất loại hết dung

môi và tiếp tục hút chân không đến khô, thu được các cặn Clorofom (kí hiệu HFT) và

cặn etyl axetat (kí hiệu HFE)tương ứng

2.4.2.2 Định tính các nhóm chất trong dịch chiết ete (ether) dầu hỏa

Cân khoảng 5g Bí Kỳ Nam (đã cắt nhỏ) cho vào bình chiết soxhlet Chiết bằng ete

dầu hỏa đến khi dung môi trong bình chiết không màu Dịch chiết đem cất thu hồi bớt

dung môi Dịch chiết đậm đặc thu được dùng để làm các phản ứng định tính chất béo,

tinh dầu, phytosterol và carotenoid

a Định tính chất béo

Mô tả thí nghiệm:

Nhỏ vài giọt dịch chiết ether dầu hỏa trên giấy lọc, hơ khô xem có để lại vết mờ

trên giấy hay không

b Định tính carotenoid

Mô tả thí nghiệm:

Cô 5ml dịch chiết ete dầu hỏa tới cặn Thêm 1-2 giọt acid sulfuric đặc, thấy xuất

hiện màu xanh ve

c Định tính phytosterol

Mô tả thí nghiệm:

Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết ether dầu hỏa Bốc hơi dung môi đến khô Cho

vào ống nghiệm 1ml anhydrid acetic, lắc kỹ, thêm 1ml H2SO4 đặc theo thành ống

nghiệm Kết quả cho thấy giữa hai lớp chất lỏng xuất hiện một vòng màu tím đỏ, lắc

nhẹ, lớp chất lỏng trên có màu xanh

2.4.2.3 Định tính các thành phần trong dịch chiết cồn

Bã dược liệu sau khi chiết bằng ether dầu hỏa để bay hơi dung môi đến khô Chiết

hồi lưu với 50ml cồn 900 trong 30 phút Dịch chiết được lọc và cô còn 10ml để làm các

phản ứng định tính flavonoid, coumarin, saponin, acid hữu cơ, acid amin và đường tự

do

a Định tính saponin

Thực hiện với 3 phản ứng hóa học sau đây:

23

* Phản ứng tạo bọt

Mô tả thí nghiệm:

Lấy 2 ống nghiệm cỡ bằng nhau, cho vào ống thứ nhất 5ml HCl 0,1N và ống thứ 2

là 5ml NaOH 0,1N Cho thêm vào mỗi ống 2-3 giọt dịch chiết cồn rồi bịt ống nghiệm,

lắc mạnh cả 2 ống trong 15 giây Để yên, thấy ống kiềm có cột bọt bền và cao gấp hai

ống kia

* Phản ứng Salkowski

Mô tả thí nghiệm:

Lấy 10ml dịch chiết cồn cho vào bình cầu và thêm 10ml acid sulfuric loãng Đun

cách thủy sinh hàn ngược trong 4 giờ Để nguội và chiết với cloroform Lấy khoảng

2ml dịch chiết cloroform cho vào ống nghiệm Thêm từ từ 1ml acid sulfuric đặc theo

thành ống nghiệm, mặt tiếp xúc giữa hai lớp xuất hiện vòng màu tím

*Phản ứng Liebermann - Burchardt

Mô tả thí nghiệm:

Lấy 0,2ml dịch chiết cloroform ở trên cho vào một ống nghiệm rồi cô tới cắn

Cho vào cắn 0,5ml anhydrid acetic, lắc đều, đặt nghiêng ống 45o rồi thêm 0,5ml acid

sulfuric đặc theo thành ống nghiệm để dịch lỏng trong ống chia thành 2 lớp: Lớp

acid ở dưới và lớp anhydrid ở trên Mặt tiếp xúc giữa hai lớp chất lỏng trong ống

nghiệm xuất hiện màu tím đỏ

b Định tính coumarin

Mô tả thí nghiệm:

Phản ứng mở và đóng vòng lacton : Cho vào 2 ống nghiệm mỗi ống 1ml dịch

chiết cồn, ống 1 thêm 0,5ml dung dịch NaOH 10%, ống 2 để nguyên Sau đó đun cả

2 ống nghiệm trên cách thủy sôi trong vài phút Ống thứ nhất có màu vàng xuất

hiện Sau đó cho thêm vào mỗi ống 2 ml nước cất thấy ống thứ nhất trong hơn ống

thứ 2, nhưng sau khi axit hóa thì cả 2 ống đều đục như nhau (phản ứng dương tính)

24

Mô tả thí nghiệm:

Cho 2ml dịch chiết cồn vào một ống nghiệm, thêm một ít bột magie kim loại, rồi

thêm vài giọt acid hydrocloric đặc; Đun nóng trên cách thủy sau vài phút thấy xuất

hiện màu tím đỏ (phản ứng dương tính)

* Phản ứng với dung dịch FeCl3 5%

Mô tả thí nghiệm:

Cho 2ml dịch chiết cồn vào một ống nghiệm, thêm 2-3 giọt FeCl3 5%, thấy

dung dịch có màu xanh sẫm

* Phản ứng với kiềm

Mô tả thí nghiệm:

Nhỏ vài giọt dịch chiết cồn lên một mảnh giấy lọc, hơ khô rồi đặt mảnh giấy lên

miệng lọ amoniac đặc thấy màu vàng hiện rõ, khi soi dưới đèn tử ngoại thấy có

màu vàng sáng (phản ứng dương tính)

d Định tính acid hữu cơ

Mô tả thí nghiệm:

Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết cồn và cô tới cắn Hòa cắn trong 1ml nước

và thêm vài tinh thể Na2CO3 thấy có bọt khí nổi lên

e Định tính acid amin

Mô tả thí nghiệm:

Lấy 3ml dịch cồn cho vào ống nghiệm Thêm 1-3 mảnh ninhydrin, đun sôi 2

phút, dung dịch chuyển màu tím

2.4.2.4.Định tính các nhóm chất khác

a Định tính ankaloid

Mô tả thí nghiệm:

Lấy 1g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 50ml, thêm 15ml dung dịch

H2SO4 2%, đun sôi vài phút Để nguội, lọc dịch chiết vào bình gạn, kiềm hóa dịch

lọc bằng dung dịch NH4OH 6N đến pH kiềm Chiết ankaloid bằng cloroform

(CHCl3) 3 lần, mỗi lần 5ml Dịch chiết CHCl3 được gộp lại và lắc với H2SO4 2%

Gạn lấy lớp nước acid, cho vào 3 ống nghiệm, mỗi ống khoảng 1ml để làm các phản

ứng sau:

25

(1) Với thuốc thử Mayer (tủa trắng hay vàng nhạt)

(2) Với thuốc thử Bouchardat (tủa nâu)

(3) Với thuốc thử Dragendorff (tủa vàng cam hoặc đỏ)

b Định tính anthranoid

Mô tả thí nghiệm: (Phản ứng Borntraeger)

Cho vào ống nghiệm 1g bột dược liệu, thêm dung dịch H2SO4 25% tới ngập

dược liệu rồi đun sôi trong vài phút Lọc dịch chiết vào bình gạn, để nguội rồi lắc

với 5ml ether Lấy 1ml dịch ether cho vào ống nghiệm, thêm 1ml KOH 10%, quan

sát màu của lớp dung dịch KOH (đỏ)

c Định tính tanin

Mô tả thí nghiệm: (Phản ứng với gelatin 1%)

Lấy 1g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 50ml Thêm nước ngập dược

liệu rồi đun sôi vài phút Lọc nóng, lấy 1ml dịch lọc cho vào ống nghiệm, thêm vài

giọt dung dịch gelatin 1%, quan sát tủa (bông trắng)

d Định tính đường khử tự do

Mô tả thí nghiệm:

Lấy 2ml dịch chiết nước cho vào ống nghiệm Thêm vào đó 0,5ml thuốc thử

Fehling A và 0,5ml thuốc thử Fehling B Đun sôi cách thủy vài phút thấy xuất

hiện tủa đỏ gạch (phản ứng dương tính)

e Định tính polysaccharid

Mô tả thí nghiệm:

Lấy 2 ống nghiệm sạch cho vào mỗi ống:

Ống 1: 4ml nước cất và 5 giọt thuốc thử lugol

Ống 2: 4ml dịch chiết nước dược liệu và 5 giọt thuốc thử lugol thấy xuất hiện

màu nâu đỏ

2.4.3 Phương pháp chiết xuất

2.4.3.1 Tạo dịch chiết toàn phần

Dược liệu sau khi đã xử lý thích hợp được chiết với etanol tuyệt đối bằng pháp

ngâm lạnh trong 4 lần, mỗi lần 7 ngày Gộp dịch chiết etanol và cất thu hồi hết dung

môi dưới áp suất giảm cho đến khi thành cặn, thu được cao toàn phần

26

2.4.3.2 Phương pháp chiết phân đoạn lỏng - lỏng

Phương pháp chiết lỏng - lỏng thực hiện bằng bình gạn thủy tinh Cao đặc thu được

từ dịch chiết của dược liệu được phân tán vào nước, sau đó lần lượt lắc với các dung môi hữu cơ không tan trong nước với độ phân cực tăng dần để tiến hành phân tách các nhóm chất có tính phân cực khác nhau khỏi pha nước [7]

2.4.3.3 Phương pháp chiết pha rắn

Chiết pha rắn được tiến hành trên cột sắc ký thủy tinh có kích cỡ khác nhau tùy thuộc vào lượng mẫu đem chiết

Pha tĩnh sử dụng là silicagel pha thường (silicagel 60, 0,040 - 0,063 mm (230-400 mesh ASTM), Merck) Cao phân đoạn của dược liệu được tẩm với lượng vừa đủ silicagel rồi thực hiện cất loại dung môi cho đến khi được bột khô tơi Lượng bột khô này được đưa lên cột sắc ký, sau đó rửa giải bằng các hệ dung môi được lựa chọn có độ

phân cực tăng dần [7]

2.4.4 Phương pháp phân lập

Quá trình phân lập sử dụng phương pháp sắc ký cột với các cơ chế chủ yếu là sắc

ký cột hấp phụ và sắc ký cột lọc gel Phương pháp nhồi cột ướt được sử dụng chủ yếu đối với tất cả các loại sắc ký cột Theo dõi quá trình rửa giải bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng

2.4.4.1 Sắc ký trao đổi ion

Sử dụng cột nhồi là dianion HP-20

Nguyên tắc: Sắc ký trao đổi ion được sử dụng để tách các loại ion vô cơ hoặc hữu

cơ nhờ lực hút tĩnh điện giữa hai điện tích trái dấu Sự tách riêng các chất của một hỗn hợp dựa vào việc hợp chất nào của hỗn hợp mang điện tích ngược dấu với điện tích của hạt nhựa, bị hạt nhựa bắt giữ lại trong cột Nhựa trao đổi ion mang nhóm chức có điện tích dương nên sẽ bắt giữ các ion âm của pha động và ngược lại, nhựa trao đổi cation mang nhóm chức có điện tích âm sẽ bắt giữ các ion dương của pha động [7]

2.4.4.2 Sắc ký cột hấp thụ

Thực hiện với bản mỏng tráng sẵn silica gel pha thường (TLC-silica gel 60 F254, Merck) và pha đảo (RP18, Merck)

2.4.4.3 Sắc ký lọc gel

Sử dụng cột nhồi là Sephadex LH-20

Nguyên tắc: Sắc ký lọc gel là phương pháp phân tách các phân tử trong dung dịch dựa trên kích thước của chúng thông qua sự trao đổi lặp đi lặp lại các phân tử chất tan giữa dung môi pha động và cùng dung môi đó được pha tĩnh giữ trong các lớp xốp của gel Khoảng kích thước lỗ của gel xác định khoảng kích thước phân tử được phân tách qua quá trình sắc ký [1, 2,7]

2.4.4.4 Sắc ký lớp mỏng

Nguyên tắc: Sắc ký lớp mỏng là phương pháp phân tích dựa trên cơ chế hấp phụ trong đó lượng chất phân tích sau khi chấm lên bản mỏng sẽ di chuyển trên lớp chất hấp phụ mịn, vô cơ hay hữu cơ, theo một chiều nhất định Trong quá trình chạy sắc ký, phụ thuộc vào hệ dung môi pha động và khả năng hấp phụ của các thành phần trong chất phân tích sẽ tạo ra các vệt sắc ký ở các vị trí khác nhau

Các chất được phát hiện bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10 % (v/v) pha trong etanol phun đều lên bản mỏng rồi sấy ở nhiệt độ cao trong vài phút cho đến khi lên màu [9]

2.4.5 Phương pháp xác định cấu tạo hóa học

Việc xác định cấu trúc của hợp chất tinh khiết được thực hiện thông qua phân tích

dữ liệu các phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance, NMR) Kết quả biện luận được khẳng định sau khi giải phổ và so sánh với tài liệu bộ phổ chuẩn trong các nghiên cứu đã được công bố

Phổ được đo gồm có NMR một chiều (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) và hai chiều (HMBC, HSQC) Thực hiện trên máy Bruker Avance AM500 FT-NMR tại Viện Hoá học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam với chất chuẩn nội là

tetramethyl silan (TMS)

28

2.5 Phương pháp đánh giá khả năng kháng oxy hóa

Phương pháp đánh giá kháng oxy hóa bằng DPPH (1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl)

[18,19]

a) Nguyên tắc

Dựa vào khả năng các chất kháng oxy hóa chuyển hóa gốc tự do picryhydrazyl thành sản phẩm phân tử làm cho dung dịch chuyển từ màu tím sang vàng

1,1-diphenyl-2-b) Cách tiến hành

Hoạt tính bắt gốc tự do DPPH xác định khả năng cho hydro của mẫu thử kháng oxy hóa Pha dung dịch DPPH nồng độ 100 µM trong etanol ngay trước khi dùng Hỗn hợp phản ứng có thể tích 3000 µL, gồm 1500 µL mẫu khảo sát ở các nồng độ 100 µg/mL;

20 µg/mL; 4 µg/mL; 0,8 µg/mL và 1500 µL dung dịch DPPH nồng độ 100 µM Các hỗn hợp phản ứng được lắc trong 1 phút và ủ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút, rồi tiến hành đo quang ở bước sóng 517 nm Mẫu trắng được tiến hành tương tự mẫu thử nhưng thay 1500 µL DPPH bằng 1500 µL etanol Công thức tính:

SA DPPH (%) = [(Ac –As)/Ac] x 100

Trong đó:

SA DPPH (%): tác dụng bắt gốc tự do (Scavenging Activity) của DPPH

As : mật độ quang của mẫu khảo sát

Ac: mật độ quang của mẫu trắng

Tất cả thí nghiệm được lặp lại 3 lần để tránh sai số Tác dụng bắt gốc tự do được đánh giá qua giá trị IC50

2.6 Phương pháp thử hoạt tính chống gout

Phương pháp được dựa trên khả năng ức chế enzyme xanthine oxydase Enzyme này còn được dùng trong nhiều phép thử sinh học khác như: ức chế sự phát triển của các tế

bào ung thư, tác dụng kháng viêm, kháng khuẩn

Chuẩn bị mẫu nghiên cứu

Mẫu thử được hòa tan trong dung môi dimethyl sulfoxyd (DMSO) hoặc trong đệm

để được dung dịch gốc ở nồng độ 10 mg/ml Dung dịch gốc sau đó được pha loãng bằng

hệ đệm thành các nồng độ thích hợp để thực hiện các phản ứng enzym

29

Cách tiến hành

Đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxydase trên đĩa UV 96 giếng Costar 3635 được

tiến hành theo phương pháp của Noro trong ống nghiệm và của Nguyễn Thị Thanh Mai

trên đĩa 96 giếng và được điều chỉnh cho phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm 13]

[11-Nguyên tắc của phương pháp dựa trên sự tạo thành của acid uric từ xanthin nhờ sự xúc tác của xanthin oxydase

xanthine oxidase

axit uric xanthine

Lượng acid uric tạo ra tỷ lệ thuận với hoạt độ enzym và được định lượng bằng phương pháp đo quang ở 290 nm Mẫu có chất thử được so sánh với mẫu không có chất thử để đánh giá tác dụng ức chế enzym của chất thử

2.7 Phương pháp thử hoạt tính chống ung thư

Hoạt tính chống ung thư của mẫu được đánh giá dựa trên khả năng gây độc dòng tế bào

ung thư gan (Hep-2)

Qui trình chung:

Dòng tế bào được bảo quản trong nitơ lỏng, đánh thức và duy trì trong môi trường dinh dưỡng MEME hoặc DEME có bổ sung huyết thanh bê tươi Khi phát triển đến phase log tế bào sẽ được dùng để khảo sát với mẫu thử gồm 4-10 thang nồng độ khác nhau, trên một phiến vi lượng 96 giếng (lỗ) Phiến thử nghiệm gồm tế bào ung thư, môi trường nuôi cấy và mẫu thử được ủ ở 370C dưới bầu khí CO2 từ 48-72 giờ để tế bào tiếp tục phát triển Tiếp theo, lấy phiến ra, cố định tế bào, rửa, nhuộm, loại thuốc nhuộm thừa và hòa lại trong dung dịch chuẩn Qui trình thử được lặp lại ba lần Kết quả được

ghi lại trên máy đọc Elisa ở bước sóng 495-515 nm Nồng độ bán ức chế (IC50) được tính theo chương trình Table curve

3.2 Kết quả định tính và định lượng

3.2.1 Kết quả điều chế cặn chiết

Bảng 1: Kết quả điều chế các cặn chiết từ Bí Kỳ Nam

3.2.2.1 Định tính các nhóm chất trong dịch chiết ete (ether) dầu hỏa

Các thí nghiệm trên đã đưa ra kết quả:

a Kết quả của định tính chất béo

Hiện tượng quan sát:Sau khi hơ khô miếng giấy thấm không thấy xuất hiện vết

mờ mờ trên miếng giấy

Kết luận:Mẫu Bí Kỳ Nam không có chất béo

b Kết quả của định tính carotenoid