Thu và phân loại phôi sau khi gây siêu bài noãn

- Lõi thép cho vào bên trong foley catherter ruột của foley catherter - Lõi thép làm nới rộng lỗ cổ tử cung Khi giội rửa thu hoạch phôi cần có một số dụng cụ sau:... Foley catherter để g

TRƯỜNG DHDL VĂN LANG KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LỚP K11S

Sau khi l y phôi kh i c th ấy phôi khỏi cơ thể ỏi cơ thể ơ thể ể

m , phôi đ ẹ, phôi được nuôi bảo quản và ược nuôi bảo quản và c nuôi b o qu n và ảo quản và ảo quản và

c t gi đ ch c y chuy n do ấy phôi khỏi cơ thể ữ để chờ cấy chuyển do ể ờ cấy chuyển do ấy phôi khỏi cơ thể ể

đó ch t l ấy phôi khỏi cơ thể ược nuôi bảo quản và ng c a dung d ch ủa dung dịch ịch

gi i r a, nuôi và b o qu n ội rửa, nuôi và bảo quản ửa, nuôi và bảo quản ảo quản và ảo quản và phôi,

ảo quản và ưởng rất lớn đến tỷ lệ ấy phôi khỏi cơ thể ớn đến tỷ lệ ến tỷ lệ ỷ lệ ệ

đ u thai sau khi c y ậu thai sau khi cấy ấy phôi khỏi cơ thể

Chỉ tiêu Yêu cầu

Nhiệt độ trong phòng từ 15 - 25 o C hoặc

sunphate Thêm vào môi trường huyết thanh thai bê(FCS) hoặc albumin huyết thanh bò BSA, tất cả đã được khừ trùng

Các yêu c u v môi ầu về môi ề môi

tr ườ cấy chuyển do ng

Qui trình pha dung d ch PBS ịch

 Hòa tan NaCl, KCl, NaHPO4, KH2PO4 trong 8 lít nước cất 2 lần hoặc 3 lần

 Hòa tan CaCl2, MgCl2 hơặc MgSO4 trong 2 lít nước cất theo thứ tự

 Khử trùng trong Autoclace ở nhiệt độ 115oC 1atm trong 10-15 phút để nguội đến 30-40oC đổ hỗn hợp 2 lít vào 8 lít

 Hỗn hợp được thanh trung và bổ sung thêm

Na pyruvate, glucose, streptomycin sulphate,

Na penicillin Sau đó đóng gói bảo quản trong buồng lạnh

 Khi sử dụng giội rửa phải bổ sung thêm 1% huyết thanh thai bê hoặc 1 – 2g BSA/1 lit dung dịch

 Khi nuôi cấy, đông lạnh và cấy chuyển thì bổ sung thêm 10 – 20% FCS hoặc 4g BSA/1 lit dung dịch

Thành phần dung dịch PBS trong 10 lít dung dịch

Thành phần Số lượng (gram)

Vlahov và ctv,1987

HAFEZ,

1987 Seidel.E và M Seidel

1991

Norio Saito 1994

1,32 1,21

1,32 1,21 -

-

1 - -

1.000.0 UI

80 2 11,5 2 10 0,36 0,5

1.000.0 UI

80 2 11,5 2 10 0,36 0,5

1.000.0 UI

80 2 11,5 2 10 0,36 1

1.000.0UI

- Foley catherter 2 đường hoặc 3 đường, kích cỡ tùy

thuộc vào phương pháp giội rửa và kích thước tử cung của bò cho phôi.

- Lõi thép cho vào bên trong foley catherter (ruột của foley catherter

- Lõi thép làm nới rộng lỗ cổ tử cung

Khi giội rửa thu hoạch phôi cần có một số dụng cụ sau:

- Bình thủy tinh hoặc nhựa (tốt nhất là thủy tinh) để

đựng dung dịch giội rửa.

 Các ống nhựa hình chữ T hoặc chữ Y để nối các ống thông khi giội rửa, có các kẹp hoặc khóa đi cùng giúp

cho việc đóng mở để dung dịch vào ra thuận tiện.

 Các loại ống tiêm loại 5, 20, 50 ml.

 Kim tiêm loại 18G và các cỡ khác nếu cần.

 Dung dịch PBS pha sẵn trong túi nilon hoặc trong chai lọ.

 Các panh để kẹp khi cần thiết.

 Kim hoặc dụng cụ tiêm vào tử cung khi cần thiết

Găng tay nilon.

 Mỏ vịt và đèn soi âm đạo, lỗ tử cung khi cần thiết.

 Cồn sát trùng.

 Giấy vệ sinh, bông, thừng.

 Thuốc gây tê 2% Xylocaine.

 Vadơlin.

 Dung dịch Lugol khi cần thiết.

 Các loại hormon FSH, PMSG, PGH2,

Foley catherter để giội rửa lấy phôi có nhiều loại, nó cũng thay đổi theo lịch sử phát triển của công nghệ.

Foley catherter 2 đường

Foley catherter 3 đường

Các vị trí và giai đoạn phát triển của phôi có thay đổi chút ít.Tuy vậy theo Kanagawa,

Shimohira, Saitoh thì phôi nằm ở ống dẫn trứng 4 ngày sau khi thụ tinh, 1 ngày ở đoạn cuối ống dẫn trứng, giáp sừng tử cung, và từ ngày thứ

6 trở đi mới nằm ở chóp sừng tử cung

THỜI GIAN, VỊ TRÍ PHÁT TRIỂN CỦA PHÔI

SAU ĐỘNG DỤC, PHỐI GIỐNG

1 THU HOẠCH PHÔI QUA PHẪU THUẬT:

a) Phương pháp 1:

Dung dịch giội rửa được đưa vào chóp của sừng tử cung và lấy ra ở phía loa kèn ống dẫn trứng.

Nước sẽ đi từ gốc ống dẫn trứng đến đầu loa kèn và chảy xuống đĩa petri Trứng + nước theo dòng chảy được đưa ra ngoài.

c) Phương pháp 3:

Dung dịch giội rửa được đưa vào chóp sừng tử cung, lấy ra ở gốc sừng tử cung Nuớc dội rửa chảy từ đầu

sừng đến cuối sừng tử

cung kéo theo cả trứng,

phôi đang nằm tự do trong

đó ra ngoài.

Phương pháp này đòi

hỏi lượng lớn dung dịch

giội rửa tỷ lệ trứng và phôi thu được cũng thấp hơn các phương pháp trên.

2 THU PHÔI BẰNG PHƯƠNG PHÁP KHÔNG PHẪU THUẬT

Nguyên tắc:

Đưa dụng cụ lấy phôi foley catheter qua âm đạo,

cổ tử cung vào thân, sừng tử cung, cố định foley catheter tại một vị trí nhất định bằng một bóng khí.

Sau đó , dung dịch được đưa vào lấy ra theo hệ thống ống khép kín, hoặc trực tiếp bằng xilanh thông qua foley catheter Trứng và phôi được đưa ra ngoài trong quá trình rửa.

Phương pháp thu phôi không qua phẫu thuật được tiến hành từ ngày thứ 6 đến ngày thứ 9 sau thụ tinh, tốt nhất là ngày thứ 7 và 8

2.1 Chuẩn bị:

- Kiểm tra lại tất cả các dụng cụ.

- Đưa bò vào giá cố định tại điểm chuẩn bị sẵn, chú ý là

2 chân trước cao hơn 2 chân sau.

- Khám và xác định lại vị trí, hình dạng, kích thước của

tử cung.xác định số lượng thể vàng, nang trứng trên buồng trứng.

- Dung dịch giội rửa 1000ml/bò và được ngâm hoặc sưởi lên 37 o C Nối các hệ thống của Folry catheter cho đúng.

- Vệ sinh bò, đặc biệt là phần âm hộ, hậu môn, đuôi.

- Tiêm phong bế gây tê vùng đuôi.

Các dụng

cụ đã được chuẩn bị

sẵn và các

kĩ thuật viên đang

vệ sinh cho bò.

2.2 Kỹ thuật đưa dụng cụ Foley catheter và cố

định nó trong tử cung

- Lau khô sạch âm hộ bò, sau đó lau lại bằng cồn 70 o

- Các kĩ thuật viên, một người mở âm hộ, một người đưa

foley catheter vào trong Dụng cụ này đã được khử trùng

và có kích thước khác nhau tuỳ độ to nhỏ khác nhau của

bò cho phôi.

Xác định đúng vị trí cần cố định dụng cụ Foley catheter, bơm 10 - 15 ml khí, bóng

khí sẽ nổi lên.

2.3 Quá trình giội rửa

- Sau khi đã cố định Foley

catheter, nối Foley catheter

với hệ thống ống cho dung

dịch nước vào và ra.

- đóng khoá dung dịch chảy

ra, mở khoá chảy vào.

- Khi sừng tử cung đầy

dung dịch, đóng khoá,

massages nhẹ nhàng tử

cung Đặc biệt là chóp sừng

tử cung Mở khoá, dung

dịch sẽ được chảy vào một

bình hoặc phễu lọc phôi.

- Lượng dung dịch mỗi lần ra vào khoảng 20-50

ml tuỳ kích thước tử

cung và bóng khí.

- Lặp đi lặp lại khoảng

8-10 lần, lượng dung dịch chảy vào và ra khoảng

400-500 ml là đủ cho một lần lấy phôi ở một sừng.

- Nếu không dùng hệ

thống ống dẫn ra vào ta

có thể sử dụng xilanh

Sau khi được giội rửa ra ngoài, phôi dễ bị ảnh hưởng bất lợi của nhiều yếu tố như: nhiệt độ, ánh sáng, điều kiện dinh dưỡng, vô trùng của dung dịch nuôi…Vì vậy phải soi tìm phôi càng nhanh càng tốt.

Nếu thấy phôi phải chuyển ngay sang dung dịch dưỡng phôi vô trùng đã bổ sung 10 - 20% FCS.

Nếu dung dịch nước chảy ra thông qua hệ thống phễu lọc phôi ta có thể tiến hành soi, tìm phôi ngay trên đĩa hệ thống lọc hoặc đổ ra đĩa petri

Nếu dung dịch nước chảy

ra đựng vào bình ta có thể thực hiện theo 2 cách :

 Thanh lọc liên tục

 Phương pháp lắng đọng

1/ Thanh lọc liên tục

Mục đích làm giảm số

lượng dung dịch giội rửa

đã thu được và tiến hành

soi tìm phôi ngay.

 Cách lọc:

Cho dung dịch chảy qua 1 màng lưới bằng thép không rỉ chảy thẳng ra ngoài Phôi và mảnh vụng của mô sẽ được màng lọc giữ lại trong phểu.

1

Giữ lại trong phểu lọc 1 lượng dung

dịch nhất định.

Tiếp theo đổ vào 1 đĩa petri có chia ô vuông.

Sau đó tiến hành soi

2/ Phươ thể ng pháp lắng

đọng

 Để dung dịch giội rửa lắng đọng trong bình

 Sau 20-30 phút, phôi và mảnh vụn của

mô, dịch nhờn đã lắng đọng xuống đáy bình.

 Dùng hệ thống lọc phôi theo nguyên tắc bình thông nhau, trên dưới Dung dịch không phôi ở phía trên sẽ chảy ra ngoài.Đổ dung dịch còn lại ra đĩa petri

đã chia ô và đem di soi tìm phôi.

3/ Soi tìm phôi

Đưa đĩa petri lên kính

hiển vi soi nổi để tìm

phôi Để thấy phôi

Các dụng cụ cầu về môi n chuẩn bịch cho soi tìm phôi.

Tủ giữ phôi Kính hiển vi và các dụng

cụ cần thiết khác.

1 Thời gian tiến hành giội rửa.

Kết quả giội rửa ở các ngày khác nhau sau khi rụng trứng sẽ có những kết quả không giống nhau Điều này được Sreenan và Beehan chứng minh qua bảng sau:

66,6(15)

64,1(68)

50(55)

45,9(15)

Tỷ lệ trứng, phôi giội rửa thu hoạch được (%)

Ghi chú: số trong ngoặc là số bò được giội rửa

2 Phương pháp giội rửa.

Thu hoạch phôi bằng phương pháp phẩu thuật thì cho kết quả cao hơn một chút so với phương pháp không phẩu thuật Tuy nhiên nó còn phụ thuộc vào từng cá thể và thời điểm giội rửa

17 2,2 1,8 79,2

17 10,7 6,2 63,9

Kết quả so sánh giội rửa lấy phôi giữa phương pháp

mổ và không mổ của Newcomb và Ctv (1978) vào ngày thứ 7 sau động dục được thể hiện như sau:

Loại foley catherter

Nếu giội rửa ở ngày thứ 7, foley catheter 3 đường cho kết quả cao hơn, nhưng sang ngày thứ 8 sau động dục foley catheter 2 đường cho kết quả cao hơn

Cathter Giống nói chung Giống thuần

Ngày 7 Ngày 8 Ngày 7 Ngày 8

3 đường

2 đường 64,0 59,0 61,0 44,3 73,6 52,8 50,0 76,0

3 Loại foley catherter và vị trí của chúng.

Về độ dài ngắn:

Độ dài của foley catheter khác nhau thì kết quả thu phôi cũng khác nhau Loại 3 đường

có đường kính 5,8mm, độ dài là 3,2cm thì thu được 27% phôi còn loại có độ dài 70cm thì thu được 54% phôi

Tỉ lệ trứng phôi giội rửa (%)

Tỷ lệ trứng ohôi giội rửa (%) 100ml

đầu tiên thứ hai 100ml thứ ba 100ml

56,2 61,3 38,4 23,5

81,4 69,4 66,9 81,5

18,3 27,8 29,8 18,5

0,3 3,3 3,2 0 Dựa vào bảng trên thì vị trí foley catheter cách chóp sừng tử cung 2,5cm - 5,0cm là thích hợp nhất

Vị trí foley catherter và tỷ lệ trứng , phôi

giội rửa thu được

4 Số lượng dung dịch nước giội rửa

Quá trình giội rửa tốt nhất chỉ cần lượng dung dịch 200 - 400ml ra vào là đủ.

Khi trứng rụng, tế bào

trứng đang phân bào giảm

nhiểm lần thứ 2 ở kì giữa,

sự phân bào này hoàn

thành khi tinh trùng vào tế

bào trứng tạo thành hợp

tử Hợp tử sau này là phôi

sẽ di chuyển xuống tử cung

I- Sự phát triển của các tế bào trứng sau khi gây rụng trứng

Phôi dâu già

Phôi nang sớm

Phôi nang

1 t/b 2 t/b 4 t/b 8 t/b 16 t/b Phôi dâu

Sau khi được thụ tinh một thời gian ngắn trứng bắt đầu phân chia theo cấp số nhân, thông thường phôi ở ngày thứ 5 – 6

có 16 – 32 phôi bào trở lên gọi là phôi dâu (Morula)

Những tế bào phôi dâu sau đó tiết ra một ít dịch và hình thành nên xoang Phôi đã tạo thành xoang gọi là phôi nang

Xoang phôi lớn lên đẩy khối tế bào dồn về một cực, khối tế bào này gọi là mầm phôi, mầm phôi sau này hình thành nên các bộ phận cơ thể

Khối tế bào bao bọc mầm phôi gọi là lớp màng nuôi, sau này hình thành nên hệ thống nhau thai

II- Đánh giá – phân loại phôi

1/ Cơ sở đánh giá phân loại phôi

Căn cứ vào 3 mặt sau:

a)Hình thái chung của phôi:

- Kích thước của phôi: kích thước bình thường 100 – 200 micromet

- Hình dáng phôi: có hình cầu dẹt, nhìn qua kính hiển vi

có hình tròn, giới hạn phôi là màng trong suốt

b) Mức độ phân chia tế bào

- Số lượng phôi bào: số lượng này

phụ thuộc vào giai đoạn phát triển:

đầu tiên là 1 tế bào rồi 2, 4, 8, 16

tế bào cho đến giai đoạn phôi dâu,

phôi nang

c) Màu sắc của tế bào

Màu sắc có liên quan đến mức độ sống, chết hay thối hóa của

- Độ tâp trung, phân tán và mối liên kết của tế bào phôi: số lượng tế bào tách rời cho thấy mối liên kết lỏng lẻo của các phôi bào

2/Phân loại phôi: có 2 cách phân loại phôi

a) Phân loại phôi theo giai đoạn phát triển

Phương pháp này dựa vào giai đoạn phát triển của phôi, ứng với từng giai đoạn là tuổi của phôi và vị trí của nó trong đường sinh dục con cái

Các sự kiện Vị trí Thời điểm tính từ khi bắt đầu động

Phôi nang ra khỏi màng

Phôi nang dài

Tiếp xúc với thành tử

cung

Làm tổ

Buồng trứng Vòi trứng Vòi trứng Vòi trứng Vòi trứng Vòi – tử cung

3 – 4

4 – 5

5 – 6 7

8 – 9 10 11 23 35

Trình tự phát triển của phôi bò

- Phôi dâu: là những phôi đã phân chia nhiều lần tào thành nhiều phôi bào (> 16 phôi bào) giới hạn giữa các phôi bào rất khó phát hiện, khối tế bào chiếm phần lớn khoảng trống trong phôi;

Tuổi phôi khoảng 5 ngày sau thụ tinh (5 ngày tuổi),

có vị trí nằm ở vòi trứng hay tử cung

- Phôi dâu già: là những phôi chứa nhiều hơn 64 phôi bào, chúng liên kết chặt chẽ tạo thành khối, ít

có tế bào tách rời Khối tế bào này chiếm 60 – 70% khoảng trống trong phôi

Phôi khoảng 6 ngày tuổi, nằm ở tử cung

- Phôi nang: là những phôi có xoang lớn

hơn 50% diện tích khối tế bào và đẩy ép khối

tế bào về một cực, màng nuôi đã được nới rộng, tiến sát về phía màng trong suốt

Phôi khoảng 7 ngày tuổi, có vị trí ở tử cung

- Phôi nang trương

Phôi có độ tuổi khoảng

8 ngày sau thụ tinh,

nằm ở tử cung

- Phôi nang vở màng trong suốt: lúc này màng trong suốt vỡ ra, phôi chui ra ngoài hoặc đã chui ra khỏi màng trong suốt, hình dáng của phôi lúc này không cố định

b) Phân loại phôi theo chất lượng

Phương pháp này là dựa vào chất lượng của phôi trong từng giai đoạn phát triển mà phân thành 4 loại: A, B, C, D hay rất tốt, tốt, trung bình, kém hoặc 1, 2, 3, 4

Nhưng trên thực tế người ta thường phân loại như sau:-Trứng không thụ tinh:

- Phôi chậm phát triển:

- Phôi thối hóa:

Tất cả đều không sử dụng được trong cấy truyền

Trứng không thụ tinh Phôi 4 t/b bị thối hóa

- Phôi có thể sử dụng được:

Gồm có phôi dâu, phôi nang đang ở các giai đoạn phát

triển khác nhau Chia làm 3 loại:

đoạn phát triển Màng trong suốt tròn đẹp Khối tế bào đậm, phân chia đều, rõ Các phôi bào liên kết chặt chẻ với nhau

và không có mảnh vụn tế bào

Phôi 8 t/b loại A Phôi dâu loại A

+ Loại tốt – B: Phôi có hình dáng kích thước tốt, đúng giai đoạn phát triển nhưng khối tế bào không đẹp, không đều, không rõ nét như loại A Đôi khi

có các mảnh vụn tế bào hoặc một số tế bào rời

2 phôi dâu loại B

+ Loại trung bình – C:

Phôi loại này có màu

sắc phân bổ không đều,

Trong đó loại A và B đem cấy khả năng đậu ít kém thua nhau Hai loại này đều có thể đông lạnh để bảo quản Loại C là loại phải đem cấy ngay, chúng không thể đông lạnh được, tỉ lệ đậu thai của loại này chỉ đạt dưới 30%

Một số hình ảnh tương phản của phôi

Phôi 4 tế bào tốt Phôi 4 tế bào thối hóa

Phôi 8 t/b tốt Phôi 8 tế bào xấu

Phôi dâu loại A Phôi dâu loại B Phôi dâu loại C

Phôi nang tốt Phôi nang xấu

3/ Ghi chép, theo dõi

a) Trong sổ: ghi chép các thông tin về phôi như

- Ngày lấy phôi

- Vị trí lấy phôi

- Số hiệu của bò cho phôi và giống bò cho phôi

- Số hiệu và giống của đực giống

- Số phôi thu được

- Chất lượng phôi (A, B, C theo từng giai doạn phát triển)

- Phôi đóng trong bao nhiêu cọng rạ, từng loại, từng màu của nút cọng rạ và số lượng phôi trong mỗi cọng rạ

- Qui trình đông lạnh bảo quản

Các thành viên thực

hiện:

Nguyễn thị hoa Nguyễn thùy Linh Trương Thi Trinh Nguyễn thị Cẩm Trang Nguyễn Hà Phương

Lê Trung Kiên Đinh Đằng Phi

CẢM ƠN THẦY VÀ CÁC BẠN ĐÃ CHÚ Ý LẮNG NGHE