khảo sát một số đặc tính sinh học và giải mã gen đặc trưng của virus dịch tả vịt cường độc chủng 7 69

Sơ lược về lịch sử phân bố bệnh Dịch tả vịt * Lịch sử bệnh Bệnh dịch tả vịt xuất hiện lần đầu tiên vào năm 1923, tại Hà Lan ở một đàn vịt nhà với triệu chứng ủ rũ, khát nước và chết sa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

-

PHẠM VĂN RIỆM

KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC VÀ GIẢI MÃ GEN ĐẶC TRƯNG CỦA VIRUS DỊCH TẢ

VỊT CƯỜNG ĐỘC CHỦNG 7/69

LUẬN VĂN THẠC SĨ

HÀ NỘI, NĂM 2015

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

-

PHẠM VĂN RIỆM

KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC VÀ GIẢI MÃ GEN ĐẶC TRƯNG CỦA VIRUS DỊCH TẢ

VỊT CƯỜNG ĐỘC CHỦNG 7/69

CHUYÊN NGÀNH : THÚ Y

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS.TS NGUYỄN VĂN THANH

HÀ NỘI, NĂM 2015

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các kết quả nghiên cứu, số liệu được trình bày trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất cứ công trình nào khác cũng như chưa từng được sử dụng để bảo vệ một học vị nào Mọi sự giúp

đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày … tháng … năm 2015

Tác giả

PHẠM VĂN RIỆM

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên cho tôi được bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Đào tạo Sau đại học - Viện đào tạo sau đại học – Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam và các Thầy Cô giáo đã giảng dạy tôi trong suốt thời gian học tập tại trường

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn và sự kính trọng sâu sắc tới PGS TS Nguyễn Văn Thanh, người Thầy đã giành thời gian quý báu tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn tốt nghiệp Cho tôi được gửi lời cảm ơn chân thành tới Ts Tạ Hoàng Long - Giám đốc Trung tâm kiểm nghiệm thuốc thú y Trung ương I và tập thể cán bộ nhân viên trong Trung tâm đã động viên, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành đề tài tốt nghiệp

Qua đây tôi xin cảm ơn các bạn bè đồng nghiệp người thân và gia đình đã tạo điều kiện về vật chất và tinh thần cho tôi trong quá trình nghiên cứu và thực hiện đề tài

Một lần nữa tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn, cảm ơn chân thành tới những tập thể, cá nhân đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này

Tác giả

PHẠM VĂN RIỆM

MỤC LỤC

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục các bảng iii

Danh mục các hình vii

Danh mục các chữ viết tắt viii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Sơ lược về lịch sử phân bố bệnh Dịch tả vịt 3

1.1.1 Tình hình nghiên cứu bệnh Dịch tả vịt trên thế giới .4

1.1.2 Tình hình nghiên cứu bệnh Dịch tả vịt ở trong nước 5

1.2 Một số đặc điểm của virus dịch tả vịt và bệnh dịch tả vịt .6

1.2.1 Hình thái, kích thước 7

1.2.2 Sức đề kháng 8

1.2.3 Độc lực 8

1.2.4 Đặc tính nuôi cấy 9

1.2.5 Truyền nhiễm học 11

1.2.6 Triệu chứng 13

1.2.7 Bệnh tích 13

1.2.8 Chẩn đoán bệnh 14

1.2.9 Biện pháp can thiệp và phòng bệnh dịch tả vịt 20

1.2.10 Miễn dịch chống virus Dịch tả vịt 22

1.2.11 Vacxin và phòng bệnh bằng vacxin 25

1.2.12 Cấu trúc sinh học phân tử hệ gen của Herpesvirus 28

CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31

2.1 Nội dung nghiên cứu 31

2.1.1 Xác định đặc tính sinh học của giống virus Dịch tả vịt cường độc chủng 7/69 được lưu giữ tại Trung tâm kiểm nghiệm thuốc thú y TW1 31

2.1.2 Giải mã gen đặc trưng của virus dịch tả vịt cường độc chủng 7/69 31

2.2 Nguyên liệu nghiên cứu 31

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu 31

2.2.2 Động vật thí nghiệm 32

2.2.3 Các trang thiết bị và cơ sở vật chất 32

2.2.4 Địa điểm nghiên cứu 32

2.3 Phương pháp nghiên cứu 32

2.3.1 Phương pháp kiểm tra vô trùng của giống 32

2.3.2 Phương pháp kiểm tra độ thuần khiết của giống 32

2.3.3 Phương pháp thu nhận bảo quản mẫu, tiếp truyền vi rút giống 33

2.3.4 Phương pháp tách chiết ARN tổng số 34

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 45

3.1 Kết quả xác định đặc tính sinh học của vi rút Dịch tả vịt cường độc 7/69 45

3.1.1 Kiểm tra độ vô trùng của giống 45

3.1.2 Kiểm tra độ thuần khiết của giống 46

3.1.3 Kết quả xác định hiệu giá giống virus Dịch tả vịt cường độc 47

3.1.4 Kết quả xác định liều gây chết 50% động vật thí nghiệm (LD50) 49

3.1.5 Kết quả kiểm tra độ ổn định của giống virus Dịch tả vịt cường độc 51

3.2 Kết quả giải mã gen đặc trưng, xây dựng dữ liệu sinh học phân tử của giống vi rút Dịch tả vịt cường độc 7/69 55

3.2.1 Kết quả phân tích đoạn gen ADN-polymerase 55

3.2.2 Kết quả phân tích gen helicase (UL5) 56

3.2.3 Kết quả so sánh thành phần gen của các chủng dịch tả vịt cường độc 7/69 với các chủng của thế giới dựa trên gen Helicase (UL5) 59

3.2.4 Kết quả phân tích gen kháng nguyên (UL32) 60

3.2.5 Kết quả so sánh thành phần gen, mối quan hệ nguồn gốc phả hệ của các chủng dịch tả vịt Việt Nam với các chủng của thế giới dựa trên gen kháng nguyên UL32 63

KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ 65

1 Kết luận 65

1.1 Chủng virus Dịch tả vịt cường độc 7/69 đảm bảo vô trùng, thuần khiết, ổn định về đặc tính sinh học: 65

1.2 Kết quả giải mã gen đặc trưng 65

2 Đề nghị 65

TÀI LIỆU THAM KHẢO 66

DANH MỤC CÁC BẢNG

3.1 Kết quả kiểm tra vô trùng của giống vi rút Dịch tả vịt cường độc 45

3.2 Kết quả kiểm tra thuần khiết giống vi rút Dịch tả vịt cường độc 7/69 47

3.3 Kết quả xác định hiệu giá virus giống Dịch tả vịt cường độc 48

3.4 Kết quả xác định LD50 của vi rút Dịch tả vịt cường độc 7/69 50

3.5 Kết quả xác định chỉ số LD50 của giống virus cường độc qua 2 đợt thí nghiệm 51

3.6 Kết quả kiểm tra độ ổn định của giống virus Dịch tả vịt cường độc chủng 7/69 51

DANH MỤC CÁC HÌNH

1.1 Cấu tạo hạt virus Dịch tả vịt và phân bố của một số gen trong hợp phần

hệ gen UL24-UL30 ở vùng UL (unique long) của virus dịch tả vịt Ngoài cùng là các protein vỏ, hệ gen là ADN nằm bên trong capsid; chiều mũi tên chỉ hướng sao chép của gen (Liu và CS,

2007) 7

2.1 Giống Dịch tả vịt cường độc chủng 7/69 31

2.2 Cấu trúc của vector pCR®2.1TOPO (Invitrogen) 38

3.1 Vịt miễn dịch khỏe mạnh ăn uống bình thường 52

3.2 Vịt đối chứng 52

3.3 Vịt đối chứng ủ rũ 53

3.4 Vịt đối chứng chết sau 72 giờ 53

3.5 Gan xuất huyết có điểm hoại tử 54

3.6 Gan xuất huyết có điểm hoại tử 54

3.7 Vịt miễn dịch 55

3.8 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên thạch agarrose 1% 55

3.9 Trình tự đoạn đoạn gen ADN-polymerase của vi rút Dịch tả vịt cường độc chủng 7/69 56

3.10 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên thạch agarrose 1% 57

3.11 Trình tự gen helicase (UL5) của vi rút Dịch tả vịt cường độc 7/69 58

3.12 So sánh thành phần amino acid của các chủng dịch tả vịt cường độc 7/69 với các chủng của thế giới dựa trên gen Helicase (UL5) 59

3.13 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên thạch agarrose 1% 60

3.14 Trình tự gen UL32 của vi rút Dịch tả vịt cường độc chủng 7/69 62

3.15 So sánh thành phần amino acid của các chủng dịch tả vịt cường độc 7/69 với các chủng của thế giới dựa trên gen kháng nguyên (UL32) 63

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AGP Agar gel precipitation

ARN Acid ribonucleic

ELD50 50% Embryo Infective Dose

ELISA Enzime Linked Immunosozbent Assay

FAO Food and Agriculture Organisation

ICPI Intra-Cerebral-Pathogenicity-Index in day-old chicks IVPI Intra-Venous-Pathogencity-Index in 6-week-old chickens

HA Hemagglutination test

HI Hemagglutination Inhibition test

HGKTTB Hiệu giá kháng thể trung bình

MDT Mean Death Time-hr (Thời gian gây chết phôi trung bình)

LD50 50 Percent Lethal Dose

OIE Office International de Epizooties

PBS Phosphate Buffered Saline

RT - PCR Reverce Transcription Polymerase Chain Reaction TTKNTTYTW1 Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc Thú y Trung ương 1 WHO World Health Organisation

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Việt Nam là một nước nông nghiệp có truyền thống lâu đời, trong đó ngành chăn nuôi giữ vai trò hết sức quan trọng, góp phần vào việc phát triển kinh tế nông nghiệp và nâng cao chất lượng cho cuộc sống của người nông dân Cùng với sự phát triển của ngành kinh tế, chăn nuôi vịt đang dần trở thành ngành sản xuất hàng hóa, góp phần vào chương trình xóa đói giảm nghèo cho nông dân ở một số vùng nông thôn nước ta

Với sự đi lên của ngành chăn nuôi nói chung và ngành chăn nuôi thủy cầm nói riêng, sự phát triển của các phương thức chăn nuôi công nghiệp hiện đại cũng không tránh khỏi dịch bệnh xảy ra Đặc biệt với điều kiện khí hậu nhiệt đới nóng

ẩm cùng với sự đa dạng trong phương thức chăn nuôi nước ta càng thuận lợi cho những bệnh truyền nhiễm nguy hiểm như Dịch tả vịt, Viêm gan vịt….phát triển và gây nhiều thiệt hại Trong đó bệnh Dịch tả vịt là một bệnh gây thiệt hại kinh tế lớn Đây là bệnh truyền nhiễm cấp tính do một loại Herpes virus thuộc họ Herpesviridae gây bệnh ở vịt trên mọi lứa tuổi

Các nghiên cứu dịch tễ học cho thấy, trong những năm gần đây bệnh Dịch

tả vịt xảy ra nhiều và trầm trọng hơn ở các nước châu Á, làm ảnh hưởng nghiêm trọng đến nền kinh tế và đời sống của người chăn nuôi

Cho đến nay, bệnh chưa có thuốc điều trị Biện pháp tốt nhất để kiểm soát dịch bệnh là thực hiện an toàn sinh học và sử dụng vacxin phòng bệnh

Hiện tại giống virus Dịch tả vịt cường độc đang được lưu giữ tại Trung tâm kiểm nghiệm thuốc thú y tư 1 bằng phương pháp truyền thống rồi đông khô và bảo quản -500C Trong quá trình giữ giống, tính kháng nguyên, đặc tính sinh học, độc lực và tính ổn định của virus có thể thay đổi do nhiều yếu tố ảnh

hưởng Chính vì vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “ Khảo sát một

số đặc tính sinh học và giải mã gen đặc trưng của virus Dịch tả vịt cường độc chủng 7/69.”

2 Mục tiêu của đề tài

- Khảo sát một số đặc tính sinh học của virus Dịch tả vịt cường độc chủng 7/69

- Đánh giá khả năng bảo hộ của vacxin

- Giải mã gen đặc trưng của virus Dịch tả vịt cường độc chủng 7/69

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Sơ lược về lịch sử phân bố bệnh Dịch tả vịt

* Lịch sử bệnh

Bệnh dịch tả vịt xuất hiện lần đầu tiên vào năm 1923, tại Hà Lan ở một đàn vịt nhà với triệu chứng ủ rũ, khát nước và chết sau 1 ngày (Baudet ,1923) khi nghiên cứu về bệnh này không tìm thấy vi khuẩn nhưng đã gây được bệnh cho vịt khỏe bằng nước chiết phủ tạng của vịt ốm sau khi qua nến lọc Chamberland L3 Sau đó ông tiếp tục gây bệnh cho thỏ và vịt nhưng không thành công Ông đã kết luận có thể nguyên nhân do một loại virus

Năm 1930, tại Hà Lan, De Zeeuw mô tả một trường hợp bệnh tương tự xảy ra ở một đàn vịt 150 con Năm 1942, dịch lại tái phát ở đất nước này làm chết 2600 trong tổng số 5700 vịt Vịt ốm ỉa phân xanh, mổ khám khi vịt chết thấy xuất huyết cơ tim, dạ dày tuyến, tá tràng, viêm kiểu bạch hầu ở cuống họng và lỗ huyệt Lần này( Boss, 1943) đã phân lập ra virus và cấy truyền 18 đời trên vịt Năm 1949, tại Hội nghị Thú y thế giới lần thứ XIV, căn cứ vào những kết quả nghiên cứu của mình về chủng virus do (Boss,1943) phân lập được, Jansen

và Kunst đã đề nghị gọi tên bệnh là Duck virus enteritis (DVE) (OIE, 2000) Bệnh dịch tả vịt còn có các tên gọi khác nhau như: Endenpest (Hà Lan), Pest du canard (Pháp), Enteupest (Đức) (Nguyễn Xuân Bình, 2006)

* Phân bố bệnh

Tại Châu Âu, bệnh Dịch tả vịt đã được Devos phát hiện ở Bỉ năm 1964 Năm 1970, Gaudry phát hiện bệnh dịch tả vịt ở Pháp; Asplin phát hiện bệnh ở Anh Bela Toth và Voxapeer Suwathanaviroij công bố bệnh dịch tả vịt xảy ra ở Đức Do

sự lan rộng của virus cúm gia cầm nên chính phủ các nước châu Âu, đặc biệt là Đức

đã đề cao biện pháp cách ly thuỷ cầm bằng lưới trong khoảng thời gian từ 20/10/2005-15/12/2005 Tuy nhiên tỷ lệ chết đã tăng đột biến trong những ngày này Tổng cộng có 17/124 (14%) loài chim trưởng thành và 149/184 (81%) loài chim 1 năm tuổi bị chết Phản ứng trung hoà sử dụng kháng huyết thanh dịch tả vịt đã phát hiện vịt và các loài chim chết do bệnh dịch tả vịt (Kaleta E.F & cs, 2007)

Tại Châu Mỹ, bệnh dịch tả vịt được chẩn đoán lần đầu tiên ở tây bán cầu vào năm 1967 từ một vùng sản xuất vịt thương phẩm tập trung tại hạt Suffolk, New York (Leibovitz & Hwang, 1967) Vụ dịch đầu tiên xảy ra trên đàn thuỷ cầm hoang ở Mỹ xuất hiện vào tháng 1 và 2 năm 1973, tại hồ Andes, miền nam Dakota Vụ dịch này đã tấn công với sự tàn phá nhanh chóng và khốc liệt Gần 40% của 100.000 loài thuỷ cầm trú đông, hầu hết là vịt trời đã bị chết Vào thời

kỳ cao điểm của dịch, mỗi ngày chết hơn 1000 chim Tất cả những loài thuỷ cầm đại diện tại hồ Andes đều bị gánh chịu bao gồm ngỗng Canada, vịt trời, vịt đen, vịt lai nhọn đuôi, vịt trời Mỹ, vịt gỗ, vịt mỏ nhọn Mỹ đầu đỏ mắt vàng, vịt Nga

và vịt Bắc Kinh Những loài chim còn sống sau vụ dịch ở hồ Andes đã phân tán rộng khắp vùng Bắc Mỹ Những mẫu máu được lấy từ những vịt sống sót ở hồ Andes đã chỉ ra rằng có tới 30% số vịt đã bị phơi nhiễm virus Tại tiểu bang Michigan (Mỹ) bệnh dịch tả vịt đã được báo cáo vào năm 1979 trên vịt Nga và vịt trời Brand C.J., and D.E (Docherty, 1984) đã xác nhận bệnh dịch tả vịt xảy

ra ở Mỹ Năm 1993 bệnh dịch tả vịt lại tái phát ở hồ Finger (Mỹ)

Tại Châu Á, năm 1944 bệnh xảy ra ở Ấn Độ và tái phát vào năm 1963 Năm 1968, Jansen công bố bệnh xảy ra ở Trung Quốc Khi nghiên cứu về bệnh này, Mukerji xác nhận chủng virus của Ấn Độ và chủng virus của Hà Lan có cùng tính chất kháng nguyên Năm 1976, 1977 bệnh đã phát ra ở Thái Lan gây thiệt hại tới 650.000 vịt (Voxapeer Suwathanaviroij, 1978) Năm 1979 đã có báo cáo về sự xuất hiện bệnh dịch tả vịt ở đàn vịt trời và vịt Muscovy

1.1.1 Tình hình nghiên cứu bệnh Dịch tả vịt trên thế giới

Nghiên cứu về miễn dịch và vacxin phòng bệnh

Những nghiên cứu về đáp ứng miễn dịch dịch thể, miễn dịch tế bào và xác định độ dài của tiêm chủng vacxin Dịch tả vịt qua từng qui trình cũng được nhiều tác giả nghiên cứu

(Balla, 1984) thực hiện tiêm phòng vacxin thương mại cho vịt ở nhiều lứa tuổi và công cường độc sau tiêm chủng 14 ngày bằng chủng KLM7 và KPV8 Kết quả cho thấy tiêm phòng giai đoạn từ 30 – 124 ngày tuổi bảo hộ đạt từ 88.9 – 100% Tiêm chủng lúc 2 tuần tuổi bảo hộ 76.5% và tiêm phòng ở vịt nhỏ hơn thì

Theo ( Tantaswasdi, 1987) dùng vacxin Dịch tả vịt chủng Hà Lan và loại vacxin chế từ chủng gây bệnh Dịch tả vịt ở địa phương thuộc tỉnh Chachoensao, Thái Lan để tiêm phòng cho vịt luc 3 – 4 tuần tuổi Kết quả kiểm tra bằng công cường độc cho thấy tỉ lệ bảo hộ đạt 100% đến 8 tháng tuổi

( Kulkarni, 1998) thí nghiệm đánh giá miễn dịch của vacxin Dịch tả vịt của 2 loại vacxin thị trường và vacxin nghiên cứu trong phòng thí nghiệm Kết quả cho thấy tiêm vacxin 2 lần đã làm tăng tỉ lệ bảo hộ so với tiêm liều đơn với

cả hai loại vacxin được khảo sát

Nhiều nghiên cứu báo cáo rằng, tiêm vacxin kịp thời vào ổ dịch sẽ hạn chế một phần thiệt hại do sự hình thành interferon chống lại virus Dịch tả vịt ( Zheng, 1983) nghiên cứu bệnh Dịch tả vịt trên ngỗng ở hạt Zhi – an, tỉnh Fujian, Trung Quốc vào các năm 1978, 1980 đã kết luận rằng, vacxin tạo sự bảo hộ đầy

đủ và được thực hiện như một phương pháp khẩn cấp khi bệnh đã xảy ra

Ngoài ra sự tác động của các chất gây ô nhiễm môi trường đến sức đề kháng và ức chế miễn dịch cũng được một số tác giả quan tâm nghiên cứu

(Goldberg,1990) đã so sánh tỉ lệ vịt chết khi công cường độc vịt bị nhiễm dầu nhiên liệu, dầu thô và đối chứng dương với vịt được ức chế miễn dịch bằng cyclophosphamid( một chất được biết là gây ức chế miễn dịch) Kết quả cho thấy các hóa chất gây ô nhiễm môi trường mà vịt ăn phải có thể ảnh hưởng đến tình trạng miễn dịch, làm gia tăng nguy cơ bệnh Dịch tả vịt và tăng tỉ lệ chết trong đàn

1.1.2 Tình hình nghiên cứu bệnh Dịch tả vịt ở trong nước

Các nghiên cứu về Dịch tả vịt ở Việt Nam được bắt đầu từ những năm

1960 và tập trung nhiều ở các tỉnh phía Bắc Các nghiên cứu mở đầu góp phần đáng kể cho việc phòng chống bệnh Dịch tả vịt tại Việt Nam

Năm 1963, tại Cao Bằng, bác sỹ thú y Đặng Trần Dũng cho biết bệnh dịch

tả vịt đã xuất hiện làm thiệt hại trên 3000 vịt

Tháng 5/1969, trong vòng 3 tháng bệnh dịch tả vịt đã làm thiệt hại tới

15000 vịt ở 4 huyện ngoại thành Hà Nội

Năm 1989, Phạm Thị Lan Thu, Thân Thị Hạnh cho biết đàn vịt ở Phú Khánh trong những năm 1980-1986 thường phát ra bệnh và lây lan nhanh ở nhiều nơi Các tác giả đã tiến hành phân lập virus dịch tả vịt trên đàn vịt ở Phú Khánh

Nguyễn Đức Hiền (1997) đã chẩn đoán xác định virus gây bệnh dịch tả vịt

ở Cần Thơ Phương pháp ELISA được sử dụng để xét nghiệm 76 mẫu bệnh phẩm thu được từ 8 ổ dịch Kết quả đã xác minh được 26 mẫu dương ( 34.25%) Bệnh xảy ra nhiều vào tháng 3 với tỉ lệ mẫu dương tính là 65.4% so với 11.5% ở tháng khác Đây là thời gian cao điểm của mùa khô, mực nước sông rạch xuống thấp, nhiều đàn vịt cùng tập chung chăn thả trên một diện tích hẹp Thời tiết nắng gắt

và độ ô nhiễm cao đã làm cho dịch bệnh dễ phát sinh

Nguyễn Ngọc Huân (2006) khuyến cáo sử dụng vacxin dịch tả vịt đông khô của Navetco trong quy trình thú y an toàn dịch bệnh áp dụng cho vịt nuôi ở nông hộ

Virus Dịch tả vịt cường độc 7/69 được phân lập tại việt nam năm 1969, đang được lưu giữ tại Trung tâm kiểm nghiệm thuốc thú y TWI Giống được dùng để kiểm nghiệm vacxin Dịch tả vịt Định kỳ 3 năm 1 lần, giống được tăng cường để kiểm tra lại một số chỉ số sinh vật học: Kiểm tra thuần khiết và vô trùng, liều gây chết phôi, liều gây chết nhỏ nhất Đánh giá đầy đủ về các mặt đặc tính sinh học Nghiên cứu về cấu trúc sinh học phân tử của giống, cũng như

sự phá hủy của virus trên môi trường tế bào xơ phôi vịt

1.2 Một số đặc điểm của virus dịch tả vịt và bệnh dịch tả vịt

Virus gây bệnh Dịch tả vịt là loại DNA virus thuộc họ Herpesvirideae nhóm Herpesvirus Virus chỉ có một serotyp được biết đến nhưng có nhiều chủng

có độc lực khác nhau tồn tại trong tự nhiên (Nguyễn Như Thanh, 2001) Theo (Li H., Liu S., Kong X ,2006) virus gây bệnh dịch tả vịt có thể được phân loại vào phân họ Alphaherpesvirinae trong họ Herpesviridae

1.2.1 Hình thái, kích thước

Hình 1.1 Cấu tạo hạt

virus Dịch tả vịt và phân bố của một số gen trong hợp phần hệ gen UL24-UL30 ở vùng UL (unique long) của virus dịch tả vịt Ngoài cùng là các protein vỏ, hệ gen

là ADN nằm bên trong capsid; chiều mũi tên chỉ hướng sao chép của gen (Liu và CS, 2007)

Virus Dịch tả vịt có hình thái gần tròn, có lớp vỏ bọc bên ngoài và có một lõi ở giữa

Về kích thước, virus hoàn chỉnh (có màng nhân bao quanh) có đường kính trung bình 60nm Virus chưa hoàn chỉnh (không có màng nhân bao quanh) có đưòng kính trung bình là 100nm Virus có đường kính tăng dần khi cấu trúc dần được hoàn thiện Ở những tế bào được gây nhiễm virus, sau 24 giờ thấy các hạt vùi trong nhân và nguyên sinh chất Đó là những tập hợp không có hình thù, trông giống như bụi Trong nhân, hạt virus có đường kính là 93,5 nm; trong nguyên sinh chất có đường kính là 136 nm và thành thục ở không bào với đường kính 250 nm

Theo (Trần Minh Châu ,1980) , ở Việt Nam, virus Dịch tả vịt cường độc chủng 769 có hình thái và cấu trúc giống như virus mà (Proctor S.M., Pearson G.L., Leibovitz L,1975) đã mô tả

Virus dịch tả vịt qua được lọc Chamberland, BerkefEID nhưng không qua được màng lọc Seitz Bằng phương pháp lọc qua màng lọc( Hess và Dardini ,1968) đã nhận xét, virus Dịch tả vịt cường độc có kích thước 150 - 250 nm

1.2.2 Sức đề kháng

Với nhiệt độ, ở 220C virus giảm dần tính gây nhiễm đến 30 ngày thì chết Virus bị mất hoạt tính ở 500C sau 2 giờ 30 phút Nếu được sấy khô bằng CaCl2thì sau 9 ngày virus bị chết (Hess, 1968) Theo (Nguyễn Vĩnh Phước ,1978) ở

00C - 40C virus không bảo quản được 3 tháng nhưng ngâm trong dung dịch Glyxerin 50% thì virus giữ được độc lực trong thời gian trên Theo (Nguyễn Như Thanh , 2001) trong điều kiện lạnh từ -100C đến -200C, virus có thể tồn tại rất lâu Làm đông khô các chất chứa virus không những có thể giữ virus nhiều năm

mà còn không làm mất độc lực của virus

Với pH môi trường, virus ổn định ở pH từ 5-10 và bị bất hoạt khi pH < 3 hoặc pH > 10

Với một số nhân tố hoá học, virus Dịch tả vịt rất nhạy cảm với ete và chloroform Dưới tác dụng của 2 chất này, virus bị phá huỷ (Kunst ,1967) cho rằng Natri lauryl sulfate, Natridesoxycholate, Zephirol, Saponin có ảnh hưởng tới virus Theo(Nguyễn Thát ,1975) thì cồn 750 diệt virus trong 5-30 phút, acid phenic 0,5% diệt virus sau 30 phút NaOH 2% và NH4OH 0,5% ở 220C cũng giết chết virus sau 30 phút

Với một số enzym, virus Dịch tả vịt bị các men Trypsin, Chimotrypsin, Lypase của tuỵ phá huỷ (Dardini A.H and W.R Hess, 1968)

Ở môi trường ngoài, với điều kiện nhiệt độ phòng thí nghiệm, virus có thể tồn tại tới 30 ngày (OIE, 2006) Trong điều kiện tự nhiên, virus có thể tồn tại một thời gian khá dài, 5 ngày kể từ khi con vật cuối cùng chết vẫn có thể làm lây bệnh cho vịt khoẻ nếu nhốt chúng vào chuồng cũ (Trần Minh Châu, 1987)

1.2.3 Độc lực

Đã xác định được một số chủng virus Dịch tả vịt có độc lực khác nhau:

- Hà Lan có chủng O độc lực mạnh nhất, sau đó đến các chủng W59,

- Việt Nam có chủng 7/69, 880 có độc lực mạnh nhất, sau đó là các chủng

NH, NB, C, T (Trần Minh Châu, 1987)

(Nguyễn Đức Hiền ,2005) phân lập một chủng virus gây bệnh Dịch tả vịt

ở Cần Thơ và cho biết chủng virus này có độc lực cao, có khả năng gây bệnh và gây chết vịt ở phòng thí nghiệm khi tiêm bắp với liều 103EID50/ml

Năm 2005, tác giả ( Nguyễn Ngọc Điểm ,2005) đã phân lập thành công chủng virus cường độc Dịch tả vịt VG-2004 Qua bước đầu khảo sát đặc tính sinh học của chủng virus này tác giả cho biết virus Dịch tả vịt chủng VG-2004 có độc lực mạnh hơn virus Dịch tả vịt chủng 7/69 do tác giả Trần Minh Châu phân lập

1.2.4 Đặc tính nuôi cấy

Virus Dịch tả vịt không có khả năng gây ngưng kết hồng cầu, không hấp thụ hồng cầu Trong tế bào phôi vịt, vịt bị nhiễm virus, virus hình thành tiểu thể bao hàm Trong môi trường nuôi cấy tế bào, virus có khả năng hình thành Plague Khi có mặt bổ thể, kháng thể Dịch tả vịt có khả năng làm tan tế bào xơ phôi vịt bị nhiễm virus

* Nuôi cấy trên phôi

Theo (Jansen ,1968) virus Dịch tả vịt sau khi đã tiêm truyền trên phôi vịt

sẽ dễ dàng thích nghi trên phôi vịt

Tuy vậy, khi nuôi cấy trên phôi vịt, tỷ lệ chết của phôi không cao và theo kinh nghiệm thì virus Dịch tả vịt của Việt Nam có vẻ như khó nuôi cấy trên phôi vịt (Nguyễn Vĩnh Phước, 1978)

Về khả năng nhân lên trên phôi của virus Dịch tả vịt, (Trần Minh Châu ,1980) cho rằng màng nhung niệu là đường tiêm truyền tốt nhất Theo (Nguyễn Như Thanh ,2001) , nuôi cấy virus trên màng niệu đệm hoặc xoang niệu mô của thai vịt ấp 12 ngày, thai sẽ chết sau 4-6 ngày với các bệnh tích xuất huyết trên da vùng lưng, rìa cánh, đầu; gan và quả tối có điểm xuất huyết và hoại tử Một số phôi có biểu hiện phù, một số phôi có hiện tượng màng nhung niệu sưng dày Virus Dịch tả vịt có thể cảm nhiễm với phôi ngỗng ấp 12 ngày tuổi và giết phôi chết sau 3-5 ngày Virus cường độc dịch tả vịt ít mẫn cảm ở những lần cấy truyền đầu tiên trên phôi vịt Đối với phôi vịt 9-10 ngày tuổi phải tiếp truyền virus sau ít nhất 12 đời liên tiếp virus mới thích nghi

* Nuôi cấy trên tế bào

Virus Dịch tả vịt có thể nuôi cấy trên môi trường tế bào phôi vịt, phôi vịt một lớp và gây ra biến đổi bệnh lý cho tế bào (Jansen, 1968), ( Burgess ,1981) công bố virus Dịch tả vịt có khả năng nhân lên trên loại tế bào xơ phôi vịt, xơ phôi ngan, gan phôi ngan, xơ phôi vịt Theo Ronald Atlanasio thì không quan sát thấy biến đổi bệnh lý tế bào khi nuôi cấy virus trên tế bào thận lợn dòng PK 15, tế bào WI-38, RD Hela, Hep-2, Vero, LleMK, BGM và

BD (Trần Minh Châu, 1987)

Ở Việt Nam, khi nghiên cứu nuôi cấy virus cường độc trên tế bào xơ phôi vịt, sau 36 giờ có hiện tượng tế bào co tròn lại, thoái hoá và rụng khỏi thành bình tạo thành khoảng trống, xung quanh là những hợp bào (synciticum) như những dải đăng ten Lớp tế bào này sẽ bị phá huỷ hoàn toàn vào ngày thứ 4 Trong các bình nuôi cấy virus ở nồng độ loãng, có thể phát hiện được Plague (những ổ tế bào bị virus gây thoái hoá bằng cách nhuộm lớp tế bào với dung dịch fushin kiềm hoặc đỏ trung tính hoặc tím kết tinh (Nguyễn Lân Dũng, 1972) Nếu nhuộm bằng fushin kiềm trong vài giây, sẽ quan sát thấy Plague hiện ra trên nền đỏ, hình tròn, bờ không gọn và

có đường kính 1-2 mm (Trần Minh Châu, 1987)

Theo( Dardini và Hess ,1968) Plague của virus Dịch tả vịt cường độc hình tròn, to nhỏ không đều, có đường kính từ 1-8 mm Sự xuất hiện Plague trên các môi trường nuôi cấy khác nhau là khác nhau Virus cường độc thì nhân lên và hình thành các Plague đẹp theo thứ tự các môi trường sau: tế bào

xơ phôi ngan và uyên ương, xơ phôi vịt Bắc Kinh, vịt đen, vịt đầu đỏ; còn Plague trên tế bào xơ phôi vịt mốc và vịt bãi là kém nhất

* Nuôi cấy trên động vật cảm thụ

Có thể dùng vịt con 1 ngày tuổi để nuôi cấy virus, 3-12 ngày sau vịt chết với triệu chứng, bệnh tích điển hình của bệnh Ngoài vịt con có thể dùng ngan con, ngỗng con để gây bệnh

Trong phòng thí nghiệm, vịt con là cảm nhiễm nhất đối với bệnh Virus Dịch tả vịt có khả năng nhân lên ở gà nhỏ hơn 2 tuần tuổi (Jansen, 1968)

- Sự truyền lây

Trong thí nghiệm, có thể gây bệnh bằng cách tiêm dưới da, bắp thịt, tiêm tĩnh mạch hoặc nhỏ mũi Trong tự nhiên, virus Dịch tả vịt lây truyền trực tiếp từ vịt bệnh sang vịt khỏe hoặc lây truyền gián tiếp qua tiếp xúc với dụng cụ chăn nuôi, phân, chất độn chuồng và một trường nuôi bị nhiễm virus Mội trường nước được xem là yếu tố quan trọng trong sự lan truyền của bệnh vì loài thủy cầm sống phụ thuộc vào môi trường nước như ăn, uống, di chuyển Mật độ nuôi cao

và nuôi liên tục cũng là yếu tố làm gia tăng sự lan truyền bệnh và tỉ lệ chết cao Nhiều nghiên cứu cho thấy các thủy cầm trong hoang dã là vật mang trùng

và gieo rắc virus định kỳ khi di trú tạo thành những ổ bệnh Dịch tả vịt cho thủy cầm nuôi do sử dụng chung nguồn nước

Việc nhập khẩu con giống từ những nơi từng xảy ra bệnh cũng có thể là nguyên nhân làm bộc phát dịch bệnh tại những quốc gia chưa từng có bệnh do thủy cầm có thể mang virus trong cơ thể có thể kéo dài tới 4 năm

- Cơ chế sinh bệnh

Đường xâm nhập của virus vào cơ thể sẽ ảnh hưởng đến khả năng gây chết động vật cảm thụ Theo Spriker và cộng sự ( 1996) tiêm truyền bằng đường tiêm bắp thịt chỉ cần một lượng virus thấp để gây bệnh, qua đường mũi, niêm mạc mắt cần nhiều virus hơn và qua đường miệng cần lượng virus lớn nhất

Theo Tantasswasdi ( 1987), Lê Huy Chính và Cộng sự ( 2003) cơ chế sinh bệnh có thể tóm lược như sau

Khi Herpesvirus xâm nhập vào cơ thể, nó sẽ hấp phụ vào bề mặt tế bào cảm thụ nhờ các thụ thể của tế bào Trong khoảng 6-8 giờ đầu tiên, virus xâm nhập vào nguyên tương tế bào do sự hòa màng, sau đó là sự cởi vỏ và phức hợp DNA – protein sẽ di chuyển vào nhân tế bào vật chủ trong vòng 12 giờ Sau khi tập hợp trong nhân, DNA virus sao mã thành mRNA và nucleocapsid sẽ di chuyển đến tế bào chất để thu nhận vật chất tổng hợp protein virus Sự lắp ráp hình thành capsid của virus xảy ra trong nhân tế bào Khi capsid đi ra khỏi nhân tế bào vật chủ, áo ngoài virus sẽ được tạo thành

từ nhân tế bào Sau cùng nhờ hệ thống enzyme, virus phá vỡ tế bào thoát ra ngoài và theo máu lưu hành tác động toàn cơ thể Theo Bernard Roizman ( 2001) chu kỳ sinh sản của Alpha Herpesvirus khoảng 18 giờ, nhanh nhất trong họ Herpesvirus, cho thấy bệnh Dịch tả vịt có thời gian nung bệnh tương đối ngắn

Những tổn thương ban đầu xuất hiện trong thành mạch máu bao gồm những mạch máu nhỏ và những tiểu tĩnh mạch Kết quả của sự tổn thương mạch máu tách ra, nhu mô bị thoái hóa và biến đổi gây viêm hoại tử và xuất huyết ở hầu hết các cơ quan nội tạng

Từ hệ thống mạch máu, virus xâm nhập vào tế bào thần kinh, định vị và phát triển gây hủy hoại tế bào thần kinh, gây hiện tượng co giật, bại liệt ở thủy cầm mắc bệnh

Thủy cầm ủ bênh từ 2-8 ngày, có thể chết trong vòng 8 ngày, hoặc có thể kéo dài làm kế phát các bệnh nhiễm khuẩn khác

Trong một số điều kiện nhất định, bệnh có thể ở thể ẩn hoặc duy trì, lúc này virus trở thành hình thái tiềm tàng trong tế bào Dù vịt không thể hiện triệu chứng bệnh nhưng do một số tế bào nhiễm virus vẫn tổng hợp và giải phóng virus nên mang trùng sẽ là nguồn gieo rắc mầm bệnh trong bầy đàn Trạng thái tiềm tang có thể làm bệnh phát ra từng đợt theo chu kỳ

có màu vàng như mủ đóng đầy khoé mắt và có khi làm 2 mi mắt dính lại với nhau Vịt bệnh có khi khó thở, tiếng thở khò khè Từ mũi chảy ra chất niêm dịch lúc đầu trong, sau đặc lại Nước mũi khô, quánh lại quanh khoé mũi Nhiều con đầu sưng to,

sờ nắn có cảm giác đầu mềm như quả chuối chín Hầu, cổ cũng có thể sưng do tổ chức liên kết dưới da bị phù thũng Lúc mới bị bệnh, vịt khát nên uống nhiều nước Sau vài ngày vịt ỉa chảy, phân rất loãng, có mùi khắm và có màu trắng xanh Hậu môn bẩn, lông dính bết đầy phân (Nguyễn Như Thanh, 2001)

Ngoài ra, bệnh Dịch tả vịt còn có một số triệu chứng khác đáng chú ý như: Vịt sợ ánh sáng, có biểu hiện thần kinh Vịt tì mỏ xuống đất Vịt đực bị sa dương vật, niêm mạc có những vết loét Vịt đẻ giảm sản lượng trứng mạnh (Phạm Quang Hùng, 2003) Sau khi xuất hiện triệu chứng được 5 - 6 ngày, vịt bệnh gầy rạc, tứ chi liệt, nằm một chỗ, rũ cánh, thân nhiệt giảm dần rồi chết

1.2.7 Bệnh tích

Xác chết gầy, bẩn; da vùng đầu, cổ, ngực, bụng, đùi xuất huyết lấm tấm

Tổ chức liên kết dưới da vùng đầu, cổ thuỷ thũng, có dịch trong suốt hơi hồng hoặc hơi vàng Mổ khám các cơ quan nội tạng như gan, lách, thận, cơ tim thì thấy ở các cơ quan này đều biểu hiện bệnh tích sưng, tụ huyết hoặc xuất huyết, ở gan có những điểm hoại tử màu trắng đục, to bằng đầu đinh ghim hoặc to hơn (Trần Kim Anh, 2004)

Bệnh tích của bệnh dịch tả vịt đặc trưng là ở đường tiêu hoá có những chấm xuất huyết, nhiều nhất là ở cuống mề và trực tràng, bên trên phủ lớp màng giả khó bóc Ruột non xuất huyết thành những vòng nhẫn nhìn từ ngoài vào thấy có màu nâu hoặc tím rất đặc trưng (Trần Minh Châu, 1996) Phạm Quang Hùng (2003) cho biết ở mỗi lứa tuổi vịt, bệnh lại thể hiện những đặc trưng riêng: Vịt bố mẹ bệnh tích chủ yếu là ở tuyến ức, xuất huyết mô

và tổn thương bộ máy sinh sản Còn ở vịt con thì bệnh tích chủ yếu ở các Lymphoid

Nguyễn Đức Hiền (2005) công bố tỷ lệ bệnh tích đặc trưng trên vịt thực nghiệm, trong đó: Niêm mạc mắt xuất huyết (95,45%); phổi viêm, tụ máu, thuỷ thũng (95,45%); dạ dày tuyến xuất huyết (100%); ruột non xuất huyết viêm loét (100%); ruột già xuất huyết viêm loét (97,73%); lách tụ máu có nốt hoại tử và gan xuất huyết có nốt hoại tử (100%)

1.2.8 Chẩn đoán bệnh

Để chẩn đoán bệnh dịch tả vịt có nhiều phương pháp được sử dụng, dưới đây là sơ đồ chẩn đoán bệnh Dịch tả vịt theo tiêu chuẩn ngành của Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn 10 TCN 815-2006

* Chẩn đoán lâm sàng

Kiểm tra một số đặc điểm dịch tễ học, bệnh sử và truyền lây của bệnh như: Bệnh xảy ra ở vịt, ngan, ngỗng mọi lứa tuổi; bệnh lây lan nhanh và trầm trọng trong khoảng 2-3 ngày

Kiểm tra triệu chứng: Vịt giảm ăn, mất thăng bằng, ỉa phân loãng, xù lông Mắt vịt có dử, mí mắt sưng, sợ ánh sáng, chảy nước mũi

Kiểm tra bệnh tích: Vịt trưởng thành có hiện tượng gan bị bạc màu Con đực trưởng thành có thể xảy ra hiện tượng dương vật bị thay đổi vị trí Ở con cái quan sát thấy các nang trứng bị xuất huyết Mạch máu bị tổn thương, tổn thương

hệ bạch huyết, thoái hoá nhu mô, ống tiêu hoá có nhiều chất nhờn Đối với bệnh tích vi thể thấy xuất hiện các thể vùi nội nhân, thể vùi tế bào chất trong các biểu

mô của hệ thống tiêu hoá

Chẩn đoán phân biệt bệnh Dịch tả vịt với một số bệnh sau:

Bệnh viêm gan do virus: Bệnh chỉ tập trung ở vịt con từ 1-3 tuần tuổi Gan chủ yếu bị viêm, xuất huyết thành điểm, thành vệt, ít có hiện tượng hoại tử

Bệnh tụ huyết trùng và phó thương hàn: Do Pasteurella và Salmonella gây nên Đây là những vi khuẩn thường trú trong cơ thể vịt, ngay cả ở vịt khoẻ Cho nên bệnh Dịch tả vịt dễ ghép với hai bệnh này và gây khó khăn cho công việc chẩn đoán bệnh Tuy nhiên nếu là ổ dịch tụ huyết trùng hoặc phó thương hàn đơn thuần thì khi điều trị bằng kháng sinh đặc hiệu có thể nhanh chóng dập tắt dịch

- Ly tâm 2.000 vòng/15ph

- Lấy dịch trong ở trên

- Kiểm tra vô trùng: Trên môi trường nước thịt BHI, hoặc trên môi trường thạch máu

b Phân lập virus

* Phân lập trên vịt con

Tiêm huyễn dịch bệnh phẩm đã được xử lý như trên cho vịt con (0,7-1 kg) với liều 0,5 ml/con vào dưới da hay bắp lườn Nếu bệnh phẩm có virus dịch tả vịt, vịt sẽ biểu hiện triệu chứng, bệnh tích đặc trưng của bệnh Dịch tả vịt giống như đã mô tả ở phần 2.1.3

* Phân lập trên trứng vịt có phôi

- Tiêm 0,2ml huyễn dịch bệnh phẩm đã xử lý vào xoang niệu mô hoặc màng nhung niệu phôi vịt 11-12 ngày: 5 phôi/mẫu bệnh phẩm

- Trứng được ấp tiếp ở tủ ấp 370C Soi trứng Loại bỏ những phôi chết trong khoảng 24h sau khi tiêm

- Virus Dịch tả vịt gây phôi chết sau 4-10 ngày với đặc trưng: Xuất huyết lan rộng

- Thu hoạch gan phôi và nước niệu để giám định virus

* Phân lập trên tế bào xơ phôi vịt (Duck Embryo Fibroblast-DEF)

- Cấy tế bào DEF trên các lọ nuôi cấy T25 hoặc đĩa nuôi cấy (đĩa nuôi cấy

6 lỗ, 24 lỗ), sau 2-3 ngày tế bào mọc thành thảm (khoảng 70%) thì gây nhiễm huyễn dịch bệnh phẩm đã xử lý: 500µl/lỗ hoặc lọ Việc cấy chuyển 2 lần là cần thiết trong quá trình phân lập

- Quan sát bệnh tích tế bào (CPE-Cytopathic pathogene effect): đặc trưng với đám tế bào to, tròn và trở nên hoại tử sau 2-4 ngày sau đó

- Thu hoạch hỗn dịch tế bào, đông tan, ly tâm và thu phần nước trong cho giám định virus

c Phương pháp giám định virus

* Phương pháp trung hoà trên trứng vịt có phôi (VN-Virus Neutralization):

- Chuẩn bị:

+ Pha loãng virus phân lập: Nồng độ 10-1-10-9 với dung dịch PBS

+ Lô đối chứng dương: Trộn kháng huyết thanh dương tính Dịch tả vịt với các nồng độ virus đã pha loãng theo tỷ lệ 1:1

+ Lô đối chứng âm: Trộn huyết thanh âm tính với các nồng độ virus đã pha loãng theo tỷ lệ 1:1

lập và giám định dương tính với kháng huyết thanh chuẩn (bằng phương pháp trung hoà VN), kết luận có virus Dịch tả vịt

* Phương pháp trung hoà trên tế bào xơ phôi vịt (DEF):

- Chuẩn bị:

+ Tế bào DEF trên đĩa nuôi cấy tế bào 96 lỗ đã nuôi cấy được 2-3 ngày + Pha loãng virus phân lập: các nồng độ 10-1-10-9 với môi trường nuôi cấy MEM + Lô đối chứng dương: Trộn kháng huyết thanh dương tính Dịch tả vịt với các nồng độ virus đã pha loãng theo tỷ lệ 1:1

+ Lô đối chứng âm: trộn huyết thanh âm tính với các nồng độ virus đã pha loãng theo tỷ lệ 1:1

- Tiến hành:

+ Gây nhiễm hỗn hợp trên vào đĩa đã nuôi cấy tế bào DEF (đĩa 96 lỗ), 100µl/lỗ, 8 lỗ/nồng độ

+ Ủ đĩa nuôi cấy ở tủ ấm CO2 ở 370C/1h

+ Đổ bỏ hỗn hợp trên, cho môi trường nuôi cấy MEM 100µl/lỗ

+ Tiếp tục ủ đĩa nuôi cấy ở tủ ấm CO2 ở 370C

+ Kiểm tra bệnh lý tế bào (CPE) trong 3-7 ngày với biểu hiện tế bào co tròn và tụ lại thành đám, thời gian lâu tế bào có hiện tượng hoại tử

- Đánh giá kết quả:

+ Tính toán chỉ số trung hoà NI (neutralization index) Nếu thuỷ cầm chưa tiêm phòng, phát hiện có kháng thể Dịch tả vịt (bằng phương pháp trung hoà SN), kết luận thủy cầm đã nhiễm virus Dịch tả vịt

* Chẩn đoán bằng phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)

Năm 1999, Pritchard L.I và Cộng sự đã phát triển phương pháp PCR để phục vụ cho việc phân lập virus dịch tả vịt ở Việt Nam Phương pháp này cho phép phân biệt nhanh và chính xác giữa bệnh dịch tả vịt với một số bệnh do Herpesvirus gia cầm khác gây nên như bệnh Marek, bệnh viêm thanh khí quản truyền nhiễm và bệnh do Herpesvirus gây ra ở ngỗng

Phương pháp PCR hay phản ứng chuỗi polymerase là một phương pháp tạo dòng invitro, không cần sự hiện diện của tế bào PCR là một phản ứng sinh

hoá phụ thuộc nhiệt độ, dựa trên nguyên tắc sử dụng đoạn mồi chuyên biệt để tổng hợp nên một mạch DNA mới bổ sung với đoạn DNA khuôn mẫu Phương pháp PCR dựa trên hoạt động của DNA polymerase trong quá trình tổng hợp DNA mới tử mạch khuôn Tất cả những DNA polymerase đều cần những đoạn mồi, là những đoạn DNA ngắn có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn Đoạn mồi này sau đó sẽ được nối dài ra nhờ hoạt động của DNA polymerase để hình thành một mạch mới hoàn chỉnh (Hồ Huỳnh Thuỳ Dương, 2003); (Võ Thị Thương Lan, 2002)

Một phản ứng PCR gồm có 6 thành phần tham gia:

1) DNA làm khuôn;

2) Hai đoạn mồi (bao gồm mồi xuôi và mồi ngược);

3) Enzym DNA-polymerase chịu nhiệt;

4) Môi trường đệm cung cấp ion Magiê (Mg++);

5) Phần nucleotid ở dạng deoxynucleotid (ký hiệu dNTP);

6) Nước tinh khiết

Có 3 giai đoạn (ba bước điều chỉnh nhiệt độ) cho 1 chu kỳ:

1) Bung liên kết của DNA: Được thực hiện ở nhiệt độ 90°C- 98°C trong

vài giây đến vài phút, các phân tử DNA xoắn kép sẽ bị tách ra, tạo nên các sợi đơn dùng để làm khuôn cho các đoạn mồi bám vào và enzym DNA- polymerase xúc tác tổng hợp

2) Mồi bám (hay còn gọi là ủ với mồi): Nhiệt độ được hạ xuống 37- 68°C,

để các đoạn mồi bám vào với các trình tự bổ sung tương ứng trên các phân tử DNA làm khuôn

3) Tổng hợp (hay còn gọi là kéo dài): Nhiệt độ được nâng lên 68°C- 72°C

trong vài chục giây đến vài chục phút, để các sợi DNA vừa được tổng hợp xoắn vào nhau tạo nên DNA sợi kép, chính là sản phẩm PCR

Cứ như vậy, phản ứng xảy ra trong 25- 35- 40 chu kỳ Sau chu kỳ cuối cùng, có một chu kỳ bổ sung được duy trì ở nhiệt độ 72°C trong 5- 10 phút sao cho tất cả các sợi đơn DNA mới xoắn lại, tạo nên sản phẩm PCR là hỗn hợp các

chuỗi xoắn kép DNA Cuối cùng, nhiệt độ hạ xuống 4°C để bảo quản sản phẩm Kết quả là từ một đoạn DNA bất kỳ có thể được nhân lên nhanh chóng hàng tỷ lần (2n sau n chu kỳ) mà không cần đến tế bào sinh vật

Sản phẩm của PCR là hỗn hợp các chuỗi xoắn kép DNA được kiểm tra bằng cách chạy điện di trên thạch agarose nồng độ 0,8%-2%,

Kỹ thuật điện di trên gel là hết sức quan trọng đối với người làm kỹ thuật

di truyền, vì đó là cách chủ yếu làm cho các đoạn acid nucleic hiển thị trực tiếp Phương pháp này dựa trên một đặc tính là các phân tử acid nucleic ở pH trung tính, chúng tích điện âm nhờ các nhóm phosphat nằm trên khung phosphodiester của các sợi acid nucleic Khi đặt chúng vào điện trường, các phân tử acid nucleic

sẽ chuyển dịch về cực dương Khi tiến hành trên môi trường thạch agarose hay các loại thạch đặc biệt khác, các phân tử acid nucleic tuỳ theo kích thước sẽ chuyển dịch với các tốc độ khác nhau: loại có phân tử lượng lớn chuyển dịch chậm, loại bé hơn sẽ chuyển dịch nhanh hơn Kiểu loại gel dùng trong điện di có tác dụng rất quan trọng đối với mức độ phân tách các phân tử acid nucleic, nó phụ thuộc vào cấu trúc và kích cỡ của các lỗ có trong gel Có hai loại gel được sử dụng phổ biến là agarose và polyacrylamid Agarose được chiết xuất từ tảo biển,

có thể mua ở dạng bột khô, bị nóng chảy ở nhiệt độ trên 45°C, trong dung dịch đệm ở nồng độ thích hợp, thường trong khoảng 0,3-2,0% (w/v) Khi làm nguội (dưới 45°C), agarose đông lại thành gel Gel agarose thường được dùng để chạy trong máy điện di Gel polyacrylamid thường được dùng để phân tách các phân

tử acid nucleic có kích thước nhỏ hơn Điện di được thực hiện bằng cách đưa các mẫu acid nucleic vào gel và đặt một điện áp vào đó Trạng thái đó được duy trì cho đến khi chất nhuộm đánh dấu (xanh Bromophenol) bổ sung vào mẫu trước khi đưa vào gel chạy tới đầu cuối của gel Các acid nucleic ở trên gel thường hiển thị ở dạng băng màu trắng, có thể chụp ảnh được và ghi nhận lại khi nhuộm bằng Ethidium bromide và được quan sát dưới ánh sáng tia tử ngoại Kích thước các băng DNA được so sánh với chỉ thị di truyền DNA (DNA marker) được cho vào cùng lúc với sản phẩm PCR ở một giếng riêng biệt, cạnh các giếng dùng phát hiện các sản phẩm PCR (Lê Thanh Hoà, 2002)

Theo (Vũ Minh Thục, 2004) nhược điểm chính của phương pháp PCR là

sự nhạy cảm khác thường của chúng, làm cho chúng rất dễ có kết quả “dương tính sai”, và thường diễn ra bởi một số lượng nhỏ DNA bị nhiễm chéo trong phòng thí nghiệm Tuy nhiên, riêng với bệnh dịch tả vịt,(Hansen, 1999) đã khẳng định sự đặc trưng của đoạn mồi đã được kiểm tra với bộ gen khuôn mẫu của các loại Herpesvirus gây bệnh ở gia cầm khác như đại bàng, chim câu, vịt, Kết quả cho thấy sự khuếch đại vẫn không cho sản phẩm Điều này có nghĩa là phản ứng này đặc hiệu rất cao cho DNA của virus dịch tả vịt Với hai đoạn mồi sẽ có khả năng phát hiện 1 fg của DNA từ virus dịch tả vịt và phản ứng PCR được đánh giá là nhạy bén hơn gấp 20 lần so với việc chẩn đoán bệnh dịch tả vịt bằng nuôi cấy tế bào

1.2.9 Biện pháp can thiệp và phòng bệnh dịch tả vịt

1.2.9.1 Biện pháp can thiệp

Bệnh Dịch tả vịt là bệnh không chữa được Nên giết chết và chôn sâu những vịt bị bệnh chết hoặc bệnh quá nặng Tuy nhiên với đàn vịt mới chớm mắc vài con thì có thể can thiệp bằng cách vacxin nhược độc cho toàn đàn Những vịt nào đã bị nhiễm virus thì sẽ phát bệnh ngay, còn những vịt chưa bị nhiễm virus

sẽ được bảo hộ bằng hiện tượng cản nhiễm Nếu tiêm sớm và kết hợp với chăm sóc đàn vịt tốt thì có thể cứu được tới 90% vịt (Trần Minh Châu, 1980) Nên tăng cường thêm các biện pháp chăm sóc bồi dưỡng nhằm tăng cường sức đề kháng cho vịt (sử dụng chất điện giải và vitamin)

Theo (Archie Hunter , 2002) nếu có ổ dịch xảy ra, vịt khoẻ mạnh có tiếp xúc với mầm bệnh phải được tiêm phòng vì vịt phát triển miễn dịch chỉ trong một ngày sau khi tiêm phòng

1.2.9.2 Phòng bệnh

* Vệ sinh phòng bệnh

Đối với những nơi chưa có bệnh tốt nhất nên tự túc con giống Khi tạo đàn không nên nhập chung nhiều đàn nhỏ lại Lò ấp trứng cũng không nên ấp trứng của quá nhiều đàn Sau mỗi lần ấp trứng cần tẩy uế lò ấp rồi sát trùng kỹ bằng hơi formol (Nguyễn Vĩnh Phước, 1978)

(Lê Hồng Mận, 2005) khuyến cáo: Không chăn vịt, ngan, ngỗng từ nơi có nhiều nguồn nước chảy tới để đề phòng sự lây nhiễm qua nguồn nước Tuyệt đối không cho các loại gia cầm, thuỷ cầm khác vào trại Nên tẩy uế sát trùng định kỳ chuồng nuôi

(Phạm Quang Hùng, 2003) nêu một số nguyên tắc phòng bệnh bằng vệ sinh như sau:

- Chuồng trại vịt cách xa khu dân cư Cổng trại phải có hố sát trùng (thường sát trùng bằng Cloramin 3%) Hạn chế người đi lại, người ra vào trại phải sát trùng giày dép, tay chân

- Điều kiện nuôi dưỡng tốt, máng ăn, máng uống phải sạch sẽ Thức ăn, nước uống phải vệ sinh Thực hiện tiêu độc, sát trùng dụng cụ, chuồng trại giữa hai lứa vịt Chú ý tiêu diệt chuột và các loài gặm nhấm quanh khu vực trại

- Vịt mới mua về phải nuôi cách ly ít nhất 3 tuần lễ

* Tiêm phòng bằng vacxin

- Vacxin để phòng bệnh Dịch tả vịt có 2 loại là vacxin vô hoạt và vacxin nhược độc

+ Vacxin vô hoạt:

Để vô hoạt virus Dịch tả vịt, trước đây thường dùng hoá chất là formol, gần đây sử dụng chất BPC Tại Việt Nam đã chế thử vacxin vô hoạt như: vacxin dịch tả vịt gan máu glyxerin tím, vacxin formol gan Theo (OIE, 2000) vacxin

vô hoạt tạo được miễn dịch cho đàn vịt nhưng hiệu lực thấp hơn so với vacxin nhược độc, hiện nay vacxin vô hoạt chỉ sử dụng trong phòng thí nghiệm, chưa được áp dụng trong sản xuất

+ Vacxin nhược độc:

Ngày nay người ta thường sử dụng chủng virus vacxin là virus nhược độc Dịch tả vịt thích nghi trên phôi vịt và virus Dịch tả vịt chủng Jansen thích nghi trên phôi vịt và trên nuôi tế bào Fibroblast phôi vịt một lớp Đây là 2 loại vacxin

có độ an toàn cao và hiệu lực tốt, thời gian miễn dịch dài, sau khi tiêm vacxin 9 tháng vịt vẫn còn miễn dịch Vacxin sử dụng an toàn với cả vịt con một ngày tuổi Vacxin được chế biến dưới 2 dạng vacxin tươi và vacxin đông khô (Lê Hồng Mận, 1999)

+ Theo Quyết định số 63/2005/QĐ-BNN của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn việc tiêm phòng vacxin bắt buộc đối với bệnh Dịch tả vịt gồm:

Đối tượng tiêm phòng: Vịt, ngan các lứa tuổi

Phạm vi tiêm phòng: Các cơ sở chăn nuôi tập trung, chăn nuôi hộ gia đình trong phạm vi cả nước

Tiêm phòng định kỳ mỗi năm 2 lần, tuỳ theo lứa tuổi

Liều lượng, đường tiêm, gia cầm trong diện tiêm theo sự hướng dẫn của nhà sản xuất vacxin

+ Đối với trường hợp đàn vịt bố mẹ được tiêm vacxin phòng bệnh dịch tả vịt, (Nguyễn Xuân Bình, 2006) cho rằng không cần tiêm cho vịt con trước 2 tuần tuổi Do trong thời gian này, trong vịt con vẫn còn tồn tại kháng thể được truyền qua lòng đỏ trứng nên có khả năng xảy ra phản ứng trung hoà làm giảm hiệu lực của vacxin

1.2.10 Miễn dịch chống virus Dịch tả vịt

* Đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu

Khả năng đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu của vịt đối với virus Dịch tả vịt thể hiện bằng sự sản sinh các chất miễn dịch không đặc hiệu, bao gồm:

* Interferon: Là một chất do tế bào sinh ra có tác dụng ức chế sự nhân lên của virus bằng cách giải thoát sự khống chế việc tổng hợp protein kháng virus Protein này có khả năng khống chế sự phiên dịch các thông điệp của virus ở Ribosome của tế bào (Nguyễn Đường, 1990)

(Jansen, 1968) khi nghiên cứu về vai trò của Interferon và hiện tượng cản nhiễm đã chứng minh vacxin còn phát huy tác dụng ngay cả khi vịt đã bị nhiễm virus dịch tả vịt cường độc trước khi tiêm vacxin Nếu nhiễm virus cường độc Dịch tả vịt trước 4 giờ thì trong 10 vịt được can thiệp bằng vacxin sẽ sống 8 con Nếu can thiệp vacxin lúc vịt nhiễm virus trước 8 giờ, 15 vịt phát bệnh nhưng còn sống 3 con Nếu vịt bị nhiễm bệnh từ 16 giờ trở lên, dù tiêm vacxin vịt vẫn không được bảo hộ Như vậy rõ ràng interferon có vai trò quan trọng trong việc chống lại sự nhân lên của virus Dịch tả vịt và hiện tượng cản nhiễm là cơ sở khoa học cho việc can thiệp vacxin vào ổ dịch để nhanh chóng dập tắt dịch

* Tế bào NK: Tăng cường hoạt động diệt những tế bào đã bị nhiễm virus

do chúng có một phần tử KIR (Killer cell Inhibitory Receptor) có tác dụng giúp chúng tiếp xúc với tế bào đích (tế bào bị nhiễm virus) làm ức chế tín hiệu hoạt hoá và dung giải tế bào đích (Vũ Triệu An, 1997)

* Các loại bổ thể có vai trò khởi phát viêm và opsonin hoá các yếu tố gây

bệnh Từ đó tạo điều kiện cho các tế bào thực bào bắt nuốt, tiêu diệt và trình diện kháng nguyên

* Đáp ứng miễn dịch đặc hiệu

Biểu hiện của đáp ứng miễn dịch đặc hiệu là sự sản sinh ra kháng thể đặc hiệu chống virus khi cơ thể bị virus xâm nhập Các công trình nghiên cứu về đáp ứng miễn dịch đặc hiệu trong bệnh dịch tả vịt đều tập trung xác định vai trò của các loại kháng thể được sinh ra và nguyên nhân, cách thức sản sinh ra các kháng thể đó

+ Sự hình thành kháng thể kháng virus Dịch tả vịt

* Miễn dịch chủ động tự nhiên: Sau khi vịt mắc bệnh Dịch tả vịt và đã

khỏi bệnh thì vịt sẽ có kháng thể kháng virus Dịch tả vịt trong cơ thể Theo kết quả nghiên cứu của một số tác giả thì vịt khỏi bệnh có thể bị mắc trở lại Bệnh tái phát thường ở thể ẩn, không có triệu chứng rõ Nếu khám vịt ốm, chỉ thấy

bên dưới lưỡi có nốt rộp, từ nốt rộp có tác giả đã phân lập được virus Dịch tả vịt Do mang đặc tính của một virus Herpes, nên khi gặp điều kiện thuận lợi, virus lại tiếp tục phát triển và gây bệnh làm thành nốt rộp mới Tác giả đã đề xuất phương pháp kiểm tra bệnh Dịch tả vịt ẩn tính bằng cách khám nốt rộp ở mặt dưới của lưỡi (Trần Minh Châu, 1987)

* Miễn dịch chủ động nhân tạo: Vịt có được khả năng miễn dịch này nhờ

được tiêm vacxin Hiệu lực và độ dài đáp ứng miễn dịch phụ thuộc vào nhiều yếu

tố như loại vacxin, đường đưa vacxin vào cơ thể, Trên thực tế, khả năng đáp ứng miễn dịch của đàn vịt khi sử dụng vacxin dịch tả vịt vô hoạt thấp hơn khi dùng vacxin nhược độc Việc tiêm nhắc lại nhiều lần hoặc tiêm nhắc lại với số lượng lớn kháng nguyên làm sản sinh ra một lượng kháng thể lớn hơn (Fenner, 1974) Về đường đưa vacxin, (Shawky S.A & Sandhu T.S, 1997) cho rằng đường đưa vacxin vào cơ thể tốt nhất là tiêm bắp hoặc tiêm dưới da Phương pháp nhỏ mắt, nhỏ mũi đòi hỏi nhiều thời gian mà hầu như không gây được miễn dịch Tuy nhiên tại Việt Nam, nghiên cứu về hiệu lực miễn dịch phòng bệnh của vacxin Dịch tả vịt khi áp dụng quy trình tiêm chủng khác nhau trong sản xuất, (Nguyễn Đức Hiền ,1999) cho biết với phương pháp nhỏ mắt hay tiêm bắp hoặc phối hợp cả hai phương pháp trên đều cho đáp ứng miễn dịch không khác nhau nhiều Tuổi tiêm chủng đầu tiên

là 14 ngày tuổi thì có ảnh hưởng tốt đến hiệu quả sử dụng vacxin

* Miễn dịch bị động tự nhiên: Đối với bệnh Dịch tả vịt, kháng thể của vịt mẹ

được truyền cho vịt con qua lòng đỏ trứng Lượng kháng thể Dịch tả vịt ở trong lòng

đỏ cao hay thấp phụ thuộc vào hàm lượng kháng thể trong huyết thanh vịt mẹ Ở những vịt con một ngày tuổi, hàm lượng kháng thể dịch tả vịt trong máu xấp xỉ bằng hàm lượng kháng thể trong lòng đỏ Theo thời gian, hàm lượng kháng thể sẽ giảm dần và chỉ tồn tại ở vịt con tối đa là tới ngày 21 Ngoài ra, dù vịt con có được hưởng kháng thể từ vịt mẹ, nhưng nếu bị nhiễm nhiều virus thì vẫn có thể bị chết vì bệnh Dịch tả vịt Như vậy, kháng thể do vịt mẹ truyền cho chỉ có thể bảo vệ được vịt con trong những ngày đầu sau khi nở nếu chúng bị nhiễm một lượng virus rất ít (Fenner, 1974) , (Leibovitz, 1991)

Ở vịt một tháng tuổi, sự hình thành kháng thể chủ động kháng virus Dịch

tả vịt sẽ bị ảnh hưởng bởi sự có mặt của kháng thể do tiêm huyết thanh miễn dịch Đối với vịt con có kháng thể tiếp thu của vịt mẹ thì sự hình thành kháng thể chủ động bị hạn chế khi được tiêm vacxin lúc 1 ngày tuổi (Trần Minh Châu, 1986) cho biết ở vịt con được tiêm vacxin nhược độc Dịch tả vịt lúc một ngày tuổi thì tỷ lệ miễn dịch bảo hộ giai đoạn 20-30 ngày tuổi đạt 25-50% (nếu là con của vịt mẹ được tiêm vacxin trước 6 tháng) Tỷ lệ miễn dịch bảo hộ của vịt con chỉ đạt 20-40% trong giai đoạn 10-20 ngày tuổi (nếu là con của vịt mẹ đã được tiêm vacxin 1 hay 2 lần) Còn với vịt con mà vịt mẹ không được tiêm vacxin thì

tỷ lệ bảo hộ đạt 100% cho đến 45 ngày tuổi

* Miễn dịch bị động nhân tạo: Là trường hợp can thiệp vào đàn vịt (đã bị

mắc bệnh Dịch tả vịt tự nhiên) bằng kháng thể Dịch tả vịt Tuy nhiên, việc tạo miễn dịch dạng này không tồn tại lâu trong cơ thể và cũng không mang lại nhiều

ý nghĩa trong thực tiễn

1.2.11 Vacxin và phòng bệnh bằng vacxin

* Khái niệm vacxin

Khái niệm “Vacxin” được bắt nguồn từ chữ latin “Vacca” có nghĩa là “bò cái” Nhờ có vacxin phòng bệnh đã cứu hàng triệu người không chết vì bệnh đậu mùa, bệnh dại, bệnh lao, Nhiều bệnh truyền nhiễm, nguy hiểm đối với con người và động vật được khống chế và từng bước được loại trừ khỏi từng phần Tuy nhiên, cuộc đấu tranh với bệnh tật, đặc biệt là bệnh truyền nhiễm để bảo vệ sức khoẻ của con người và động vật vẫn còn khá gay go, phức tạp, cho nên việc nghiên cứu, chế tạo các loại vacxin mới và cải tiến nâng cao hiệu lực phòng bệnh các loại vacxin đã có, vẫn còn đòi hỏi các nhà khoa học phải quan tâm

* Những yêu cầu về chất lượng vacxin

Vacxin phải có một số tính chất (hoá, lý, kháng nguyên) nhất định, sau khi đưa vào cơ thể gia súc, gia cầm một liều lượng chuẩn sẽ tạo cho chúng một sức miễn dịch chủ động chống lại bệnh Một vacxin đáng tin cậy, thuần khiết, an toàn, có hiệu lực và hiệu quả là nhu cầu tối thiểu để duy trì sức khoẻ động vật và

là hoạt động thành công của những chương trình bảo vệ sức khoẻ động vật Miễn

dịch cho gia súc, gia cầm bằng những vacxin có chất lượng cao là phương tiện chủ yếu để khống chế dịch bệnh Mặt khác vacxin còn được sử dụng trong các chương trình khống chế, thanh toán bệnh dịch trong một quốc gia (OIE, 2008) Xác định độ thuần khiết, an toàn, hiệu lực và hiệu quả của mỗi loại vacxin theo các phương pháp khác nhau nhưng cơ bản phải đảm bảo đưa ra một sản phẩm có hiệu lực chắc chắn, chất lượng cao Bên cạnh đó, người sử dụng vacxin phải có một kiến thức và hiểu biết về mầm bệnh, đặc điểm dịch tễ của bệnh cũng như khả năng phòng chống bệnh của vacxin được sử dụng Một trong những điều kiện đưa tới thành công của việc khống chế bệnh là phải có một vacxin phòng bệnh ổn định, bền vững và đạt chất lượng cao về mọi mặt

*Cơ sở của việc tiêm phòng bằng vacxin

Nguyên lý của việc tiêm phòng bằng vacxin là gây ra trong cơ thể sống một đáp ứng chủ động của hệ thống miễn dịch nhằm tạo ra kháng thể dịch thể hay tế bào chống lại những nhóm quyết định kháng nguyên của yếu tố có khả năng gây bệnh và nhờ đó làm mất khả năng này Biện pháp tiêm phòng bằng vacxin đã mang lại cho y học, thú y học những thành tựu lớn trong phòng bệnh

do virus và vi khuẩn gây ra

Gần đây, do sự hiểu biết về lý thuyết miễn dịch, sự không ngừng cải tiến trong kỹ thuật chẩn đoán, sự phát triển liên tục của những sản phẩm mới và phương thức sử dụng vacxin mới đã làm cho việc phòng bệnh bằng vacxin được giải quyết một cách hoàn thiện

Tiêm phòng bằng vacxin đóng vai trò có ích nhưng nó không phải là thuốc trị bệnh và càng không thể thay thế cho việc chăm sóc con vật thường ngày

Cơ sở của việc tiêm phòng bằng vacxin là phải nhận thức được vacxin không loại trừ mối đe doạ nào của tất cả các bệnh truyền nhiễm do virus, vi khuẩn gây ra, vacxin chỉ có ích trong việc giúp con vật tránh sự tấn công ồ ạt của những dịch bệnh nghiêm trọng Tiêm phòng bệnh bằng vacxin có tác dụng duy trì sức khoẻ đối với cả một quần thể gia súc, gia cầm và ít có ý nghĩa phòng trước mắt cho một cá thể

Để tiêm phòng có hiệu quả, việc chọn thời điểm sử dụng vacxin là vô cùng quan trọng Những trường hợp sử dụng vacxin một cách vội vã trong khi thông tin về những vacxin này không đầy đủ gây nên sự bất lợi cho việc nghiên cứu lưu hành bệnh trong đàn, bởi vì khi đã dùng vacxin rồi thì việc phân biệt kháng thể do tiêm vacxin kích thích tạo ra hay kháng thể do bản thân gia súc đã nhiễm bệnh mà có rất khó khăn, đặc biệt là trong trường hợp sử dụng vacxin virus nhược độc

Vì vậy, muốn sử dụng vacxin có hiệu quả, hạn chế được tổn thất do dịch bệnh gây ra, người sử dụng vacxin phải có sự hiểu biết về các bệnh truyền nhiễm cũng như dịch tễ học của bệnh

Việc thành công trong tiêm phòng bằng vacxin không chỉ phụ thuộc vào vacxin mà bên cạnh đó các biện pháp vệ sinh cần được tiến hành đồng thời Cải thiện điều kiện sinh thái, vệ sinh chuồng trại, vệ sinh môi trường xung quanh sẽ góp phần đáng kể vào việc làm giảm tỷ lệ nhiễm bệnh và tăng tác dụng của việc dùng vacxin phòng bệnh

* Một số vacxin phòng bệnh Dịch tả vịt đang lưu hành tại Việt Nam

Vacxin phòng bệnh Dịch tả vịt có 2 loại: vacxin nhược độc và vacxin vô hoạt

- Vacxin nhược độc:

Virus cường độc dưới tác động của các yếu tố sinh học: tiêm truyền nhiều lần qua động vật ít cảm thụ, qua phôi, thì độc lực của virus giảm đi Virus vẫn có khả năng nhân lên trong cơ thể vật chủ nhưng không gây bệnh nên được dùng để làm vaccine Có hai cách để sản xuất vacxin nhược độc, bao gồm: tiếp truyền giống virus trên phôi và nuôi cấy virus trên môi trường tế bào xơ phôi vịt một lớp Cả hai loại vacxin trên đều có độ an toàn cao và hiệu lực tốt, thời gian miễn dịch dài sau khi tiêm vacxin (9 tháng vịt vẫn còn miễn dịch) Vacxin sử dụng an toàn với cả vịt con một ngày tuổi Vacxin được chế biến dưới 2 dạng vacxin tươi và vacxin đông khô

- Vacxin vô hoạt:

Để vô hoạt virus Dịch tả vịt, trước đây thường dùng hoá chất là formol, gần đây sử dụng chất BPC (Beta propiolactore) Tại Việt Nam đã chế thử vacxin

vô hoạt như: vacxin Dịch tả vịt gan máu glyxin tím, vacxin formol gan Theo

(OIE, 2000) vacxin vô hoạt tạo được miễn dịch cho đàn vịt nhưng hiệu lực thấp hơn so với vacxin nhược độc, hiện nay vacxin vô hoạt chỉ sử dụng trong phòng thí nghiệm, chưa được áp dụng trong sản xuất

Những vacxin dịch tả vịt hiện đang được lưu hành ở Việt nam:

1 Vacxin Dịch tả vịt nhược độc đông khô do phân viện thú y miền trung - Viện thú y sản xuất

2 Vacxin Dịch tả vịt nhược độc do Công ty TNHH một thành viên thuốc

thú y trung ương NAVETCO 2 (Thành phố Hồ Chí Minh) sản xuất

3 Vacxin Dịch tả vịt nhược độc do Công ty TNHH một thành viên thuốc

thú y trung ương NAVETCO 2 (Thành phố Hồ Chí Minh) sản xuất trên môi

trường tế bào xơ phôi vịt một lớp

4 Vacxin Dịch tả vịt nhược độc đông khô Nobilis Duck Plague nhập khẩu

từ Hà Lan

5 Vacxin Dịch tả vịt đông khô Vaxiduk chủng Jansen nhập khẩu từ Pháp

1.2.12 Cấu trúc sinh học phân tử hệ gen của Herpesvirus

Về cấu trúc phân tử, hệ gen của DEV chia làm hai vùng gen quan trọng hay còn gọi là vùng độc nhất (unique region, U), bao gồm UL (vùng dài) và US (vùng ngắn), và bao bọc hai đầu của vùng ngắn là hai vùng lặp ký hiệu IR và TR Cho đến nay, cấu trúc và sắp xếp gen của toàn bộ hệ gen DEV chưa được giải mã và phân tích cụ thể Tuy nhiên, đã có một số hợp phần gen đã được giải

mã, bao gồm:

i)Hợp phần 1: đó là vùng gen có độ dài 9.172 bp, của virus vacxin Dịch

tả vịt thương mại chủng clone-03, nguồn gốc Trung Quốc, gồm các tổ hợp gen gồm các tổ hợp gen UL1, UL2, UL3, UL3.5, UL4, UL5, UL6, UL7 (Chen S, Liu

S, Li H và Kong X (2007); Ngân hàng gen số: EF449516)

ii) Hợp phần 2: đó là vùng gen có độ dài 6.165 bp, của virus vacxin Dịch

tả vịt thương mại chủng clone-03, nguồn gốc Trung Quốc, gồm các tổ hợp gen gồm các tổ hợp gen UL8, UL9, UL10 (GaoY, Liu S, Kong X và Chen S (2007); Ngân hàng gen số: EF449515)

iii) Hợp phần 3: đó là vùng gen có độ dài 6.822 bp, của virus vacxin Dịch

tả vịt thương mại chủng clone-03, nguồn gốc Trung Quốc, gồm các tổ hợp gen gồm các tổ hợp gen UL11, UL12, UL13, UL14, UL15, UL16 (GaoY, Liu S và Kong X (2007); Ngân hàng gen số: EF524094)

iv) Hợp phần 4: đó là vùng gen có 41.431 bp, gồm các tổ hợp gen UL15

(exon 2), UL17, UL18, UL19, UL20, UL21 (Li và Huang (2007); Ngân hàng gen số: EF417996)

v) Hợp phần 5: đó là vùng gen có độ dài 5.021 bp, của virus vacxin Dịch

tả vịt thương mại chủng clone-03, nguồn gốc Trung Quốc, gồm các tổ hợp gen gồm các tổ hợp gen UL22, UL23, UL24 (Zhang C, Zhang X và Ye W (2006); Ngân hàng gen số: EF053033)

vi) Hợp phần 6: đó là vùng gen có độ dài 17.386 bp, của virus vacxin

Dịch tả vịt thương mại chủng clone-03, nguồn gốc Trung Quốc, gồm các tổ hợp gen UL25, UL26, UL26.5, UL27, UL28, UL29, UL30 (Liu và cs, 2007; Ngân hàng gen số: EF203709)

vii) Hợp phần 7: đó là vùng gen có độ dài 4.741 bp, của virus vacxin

Dịch tả vịt thương mại chủng clone-03, nguồn gốc Trung Quốc, gồm các tổ hợp gen gồm các tổ hợp gen UL31, UL32, UL33, UL34, UL35 (An R, Liu S và Kong

X (2007); Ngân hàng gen số: EF203708)

viii) Hợp phần 8: đó là vùng gen có độ dài 67.789 bp, của virus vacxin

Dịch tả vịt thương mại chủng clone-03, nguồn gốc Trung Quốc, gồm các tổ hợp gen LORF11, UL55, LORF9, UL54, UL53, UL52, UL51, UL50, UL49, UL48, UL47, UL46, UL45, UL44.5, UL44, UL43; UL8, UL7, UL6, UL5, UL4, UL3.5, UL3, UL2, UL1, LORF3, LORF2, ICP4, US1, US10, SORF3, US2, US3, US4, US5, US6 (Li và Huang (2008); Ngân hàng gen số: EU082088)

Ngoài ra, một số vùng gen ngắn khác chứa các khung đọc mở mã hoá cho một số protein chức năng như Thymidine kinase (TK), ADN-polymerase (DNA-pol), Phosphoprotein, glycoprotein H (gH) và một số gen khác cũng đã được giải

mã Hiện nay đã có 72 công trình giải trình trình tự và phân tích từng vùng gen hay gen đơn lẻ của hệ gen virus Dịch tả vịt, hầu như tất cả là chuỗi gen thu nhận