ứng dụng kháng nguyên chẩn đoán bệnh viêm đường hô hấp mạn tính ở gia cầm (chronic respiratory disease ) trên đàn gà nuôi tại hà nội và vùng phụ cận

theo giống gà, lứa tuổi trên đàn gà nuôi tại ngoại thành Hà Nội và 2.1.2 Phân lập, xác định hình thái, tính chất nuôi cấy, đặc tính sinh vật hoá học và serotype của các chủng Mycoplasma

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

NGUYỄN THỊ NGA

ỨNG DỤNG KHÁNG NGUYÊN CHẨN ĐOÁN BỆNH VIÊM ĐƯỜNG HÔ HẤP MẠN TÍNH Ở GIA CẦM

(Chronic Respiratory Disease ) TRÊN ĐÀN GÀ NUÔI

TẠI HÀ NỘI VÀ VÙNG PHỤ CẬN

LUẬN VĂN THẠC SĨ

HÀ NỘI, NĂM 2015

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

NGUYỄN THỊ NGA

ỨNG DỤNG KHÁNG NGUYÊN CHẨN ĐOÁN BỆNH VIÊM ĐƯỜNG HÔ HẤP MẠN TÍNH Ở GIA CẦM

(Chronic Respiratory Disease ) TRÊN ĐÀN GÀ NUÔI

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa từng được sử dụng để bảo vệ một học vị nào

Tôi xin cam đoan rằng, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đã được chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày 24 tháng 09 năm 2015

Tác giả

Nguyễn Thị Nga

LỜI CẢM ƠN

Mở đầu của Luận văn cho tôi xin được chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của các thầy, cô giáo Bộ môn Vi sinh vật – Truyền nhiễm, các thầy cô giáo trong khoa Thú y, các cán bộ quản lý tại Viện Sau đại học, trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, cùng toàn thể các thầy giáo, cô giáo đã giảng dạy tôi trong thời gian học Cao học tại trường

Đặc biệt tôi xin chân thành cảm ơn Thầy giáo - PGS.TS Nguyễn Bá Hiên

đã tận tình hướng dẫn và TS Đào Thị Hảo đã đóng góp nhiều ý kiến quý báu, tạo

điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn này Tôi xin chân thành cảm ơn đồng nghiệp, bạn bè và gia đình đã giúp đỡ, động viên để tôi có thể hoàn thành chương trình học tập và hoàn thành Luận văn tốt nghiệp

Hà Nội, ngày 24 tháng 09 năm 2015

Tác giả

Nguyễn Thị Nga

MỤC LỤC

1.3.1 Tình hình nghiên cứu bệnh do Mycoplasma ở gia cầm trên thế

2.1.1 Ứng dụng chế phẩm kháng nguyên MG xác định tỷ lệ nhiễm CRD

theo giống gà, lứa tuổi trên đàn gà nuôi tại ngoại thành Hà Nội và

2.1.2 Phân lập, xác định hình thái, tính chất nuôi cấy, đặc tính sinh vật

hoá học và serotype của các chủng Mycoplasma phân lập được

2.3.2 Phương pháp làm phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính để

2.3.3 Phương pháp xác định bệnh CRD qua chẩn đoán lâm sàng và giải

2.3.4 Phương pháp phân lập, xác định hình thái, tính chất nuôi cấy, đặc

tính sinh vật hóa học của vi khuẩn MG từ mẫu bệnh phẩm gà nghi

3.1 Ứng dụng chế phẩm kháng nguyên MG xác định tỷ lệ nhiễm CRD theo giống gà, lứa tuổi trên đàn gà nuôi tại ngoại thành Hà Nội và tỉnh Bắc

3.1.1 Kết quả xác định tỷ lệ nhiễm CRD ở các giống gà bằng phản ứng

3.1.2 Kết quả xác định tỷ lệ nhiễm MG ở gà theo lứa tuổi bằng phản

3.2 Phân lập, xác định hình thái, tính chất nuôi cấy, đặc tính sinh vật hoá học

và serotype của các chủng Mycoplasma phân lập được trên gà có huyết

3.2.2 Kết quả phân lập và giám định một số đặc tính sinh học của vi khuẩn MG 44

DANH MỤC BẢNG

2.1 Thành phần các chất trong phản ứng PCR xác định MG 33

2.2 Điều kiện trong phản ứng PCR xác định MG 33

3.1 Kết quả xác định tỷ lệ nhiễm CRD ở các giống gà bằng phản ứng ngưng kết

3.2 Xác định tỷ lệ nhiễm CRD qua các giai đoạn tuổi của gà 37

3.3 Kết quả xác định tỷ lệ nhiễm MG theo dòng gà 38

3.4 Kết quả xác định tỷ lệ nhiễm CRD tại một số cơ sở chăn nuôi gà bằng kháng

3.5 Kết quả xác định tỷ lệ nhiễm CRD ở gà có biểu hiện bệnh CRD bằng phản ứng

3.6 Số lượng mẫu gà có huyết thanh dương tính 41

3.7 Triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể đặc trưng của gà mắc bệnh CRD 42

3.8 Kết quả phân lập vi khuẩn MG từ phổi gà theo lứa tuổi 44

3.9 Kết quả phân lập vi khuẩn MG từ phổi gà theo giống gà 45

3.10 Kiểm tra một số đặc tính sinh hoá và khả năng lên men đường của các chủng MG

3.11 Giám định vi khuẩn MG phân lập được bằng phản ứng PCR 52

3.12 Kết quả giám định serotype của các chủng MG phân lập 53

3.4 Hình thái vi khuẩn MG nhuộm Giemsa (100x) 49

3.5 Khuẩn lạc MG sau 5 ngày nuôi cấy (40x) 50

3.6 Vi khuẩn MG mọc trên MB sau 5 ngày nuôi cấy 50

3.7 Sản phẩm PCR giám định vi khuẩn MG (530 bp) 52

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

CRD : Chronic Respiratory Disease

DNA : Acid Deoxyribonucleic

ELISA : Enzyme Linked Immunosorbent Assey

EMB : Eosin Methylene Blue

PPLO : Pleuro – Pneumonia Like Organisms

RNA : Acid Ribonucleic

RSA : Rapid Slice Agglutination

SPA : Serum Plate Agglutination

TE : Tris -Acetie - EDTA

VSV – TN : vi sinh vật – truyền nhiễm

MỞ ĐẦU

Bệnh viêm đường hô hấp mạn tính của gà (CRD) hay viêm xoang truyền nhiễm ở gà tây, gây ra bởi vi khuẩn Mycoplasma gallisepticum (MG) là một trong số các bệnh quan trọng và gây thiệt hại kinh tế nghiêm trọng trong chăn nuôi gia cầm Thiệt hại chủ yếu do bệnh gây ra là làm giảm chất lượng thân thịt, giảm tiêu thụ thức ăn và năng suất trứng Ngoài ra, tăng các chi phí trong điều trị, các chương trình phòng và chống bệnh, bao gồm các chương trình giám sát ( huyết thanh học, nuôi cấy, phân lập và giám định) và tiêm phòng bằng vacxin góp phần làm tăng chi phí cho bệnh ở mức nhiều nhất trong ngành chăn nuôi ở Việt Nam nói chung cũng như các tỉnh phía bắc nói riêng Để hạn chế được dịch bệnh cần phải có những nghiên cứu sâu rộng về đặc điểm của bệnh cũng như cách phòng chống, đồng thời phải có sự phối hợp giải quyết nhiều khâu, từ những người chăn nuôi đến những người làm công tác thú y… mở rộng các chương trình phòng chống dịch và phát triển hệ thống theo dõi, báo cáo về dịch bệnh

Trên thực tế hiện nay, hầu hết các đàn gà công nghiệp đều bị nhiễm Mycoplasma, vì vậy việc tạo ra một đàn gà không bị nhiễm bệnh là một việc làm cần thiết nhưng gặp rất nhiều khó khăn Bên cạnh việc giữ gìn điều kiện vệ sinh môi trường, cách ly khỏi các nhân tố truyền lây, phát hiện sớm và loại thải những con mang mầm bệnh là biện pháp phòng bệnh quan trọng bậc nhất (Cannon và Roe, 1982), và một trong những biện pháp phát hiện sớm mầm bệnh đó là xét nghiệm huyết thanh học bằng phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính với

kháng nguyên MG

Tại Viện Thú y trong những năm gần đây đã nghiên cứu chế tạo thành

công kháng nguyên MG nhuộm màu với tím Violet và bước đầu được dùng trong chẩn đoán, để làm hoàn thiện được kháng nguyên MG và nhằm giúp cho công tác

chẩn đoán nhanh bệnh CRD chúng tôi tiến hành sử dụng kháng nguyên MG

giám sát sự lưu hành của vi khuẩn MG trên đàn gà tại một số tỉnh phía Bắc (Hà

Nội, Bắc Ninh, Hưng Yên, Hải Dương) để biết được tình hình nhiễm CRD trên

gà tại giai đoạn nghiên cứu và khẳng định kháng nguyên tự chế có chất lượng tương đương với kháng nguyên nhập khẩu, chi phí giảm so với việc sử dụng các chế phẩm tương tự ngoại nhập, sản phẩm kháng nguyên chế tạo tại Việt Nam được các trại và người chăn nuôi sử dụng trong công tác chẩn đoán kiểm tra định

kỳ Xuất phát từ nhu cầu thực tế và dựa trên cơ sở những kết quả nghiên cứu đã đạt được chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài :

“Ứng dụng kháng nguyên chẩn đoán bệnh Viêm đường hô hấp mạn tính ở gia cầm (Chronic Respiratory Disease) trên đàn gà nuôi tại Hà Nội và vùng phụ cận”,

MỤC TIÊU ĐỀ TÀI

- Ứng dụng chế phẩm kháng nguyên MG tự chế, xác định tỷ lệ nhiễm

CRD tại một số cơ sở chăn nuôi gà (n= 2.500)

- Phân lập, xác định hình thái, tính chất nuôi cấy, đặc tính sinh vật hóa học

và serotype của các chủng MG phân lập được từ bệnh phẩm gà có huyết thanh

dương tính với KN tự chế và trên gà nghi mắc CRD (n=100)

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Bệnh CRD (Chronic Respiratory Disease)

CRD là một bệnh hô hấp mạn tính của nhiều loại gia cầm, nhưng phổ biến hơn cả là gà và gà tây Bệnh có thể xảy ra ở mọi lứa tuổi, nhưng chủ yếu ở

gà con dưới 2 tháng tuổi, gà trưởng thành bệnh xảy ra ở thể mạn tính, tỷ lệ mắc bệnh trong đàn gà khá cao, có thể từ 30-50%

1.1.1 Nguyên nhân gây bệnh

Đối với gia cầm có nhiều bệnh do Mycoplasma gây nên Có bốn loài gây bệnh điển hình: Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma synoviae, Mycoplasma meleagridis , Mycoplasma iowae Trong đó Mycoplasma gallisepticum là nguyên

nhân tiên phát gây bệnh CRD và viêm xoang truyền nhiễm ở gà, gà tây và một số gia cầm khác

1.1.2 Loài mắc bệnh và nhân tố ảnh hưởng đến dịch tễ

Trong thiên nhiên, gà, gà tây là hai vật chủ dễ mắc bệnh Ngoài ra, người

ta cũng phân lập được mầm bệnh từ gà lôi, gà gô, công, trĩ, chim sẻ, chim cút, gà tây hoang, vịt, đà điểu (Ley và Yoder, 1997) và từ một số động vật khác như ngỗng, vẹt Amazon mỏ vàng, chim hồng hạc

Bệnh xảy ra chủ yếu ở gà 4 ÷ 8 tuần tuổi, gà lớn hơn bị bệnh, mang trùng suốt đời và truyền bệnh cho gà con qua trứng Do mầm bệnh lây lan qua đường

hô hấp, qua phôi trứng và sức đề kháng của gà thường thấp hơn khi nuôi theo phương thức công nghiệp nên khả năng mắc bệnh ở gà công nghiệp có tỷ lệ cao hơn khu vực chăn nuôi gia đình

Bệnh do Mycoplasma lây từ từ trong đàn và ở dạng mạn tính Một số loài

có khả năng lây truyền nhanh trong đàn qua tiếp xúc thông thường.Gà nhiễm

Mycoplasma sau 4 tuần đã có đáp ứng miễn dịch Một số trường hợp, cả đàn mắc bệnh chỉ sau 1 ÷ 2 tuần khi trong đàn có con xuất hiện triệu chứng lâm sàng đầu tiên, trong khi đó có những đàn khác thì lây truyền chậm, những biểu hiện của bệnh là rất khác nhau Có trường hợp gà không có triệu chứng lâm sàng nhưng chúng vẫn mang trùng và đây là nguồn lây lan bệnh

Bệnh có thể kết hợp với các mầm bệnh khác làm cho bệnh nặng hơn và tiến

triển nhanh hơn như virus Newcastle, cúm gà, virus viêm thanh khí quản truyền

nhiễm; một số vi khuẩn gây bệnh như Haemophilus paragallinarum, E.coli

Gà nuôi theo phương thức công nghiệp thì dễ mắc hơn gà nuôi theo

phương thức tự nhiên vì bệnh liên quan đến đường hô hấp nên khi nuôi theo

phương thức công nghiệp thì mật độ cao không khí dễ bị ô nhiễm sức đề kháng

của gà kém hơn khi chăn nuôi theo phương thức tự nhiên vì thế gà mắc bệnh cao

hơn, tốc độ lây lan nhanh và rất nguy hiểm (Nguyễn Bá Hiên và Nguyễn Thị

Hương, 2009)

1.1.3 Lứa tuổi và mùa vụ mắc bệnh

Gà mắc bệnh ở mọi lứa tuổi trong đó tỷ lệ mắc bệnh tập trung ở: 4- 8 tuần tuổi;

gà đẻ bói; gà đẻ khi tỷ lệ đẻ cao nhất Gà lớn, gà đẻ tỷ lệ mắc bệnh cao hơn gà con

Nước ta khí hậu nóng ẩm về mùa hè và gió lạnh về mùa đông là điều kiện

thuận lợi để cho bệnh phát triển, đặc biệt là những trang trại chăn nuôi theo hướng

công nghiệp có số lượng lớn và mật độ cao Mùa vụ cũng ảnh hưởng không nhỏ

tới sự phát bệnh, bệnh thường xảy ra quanh năm nhưng tập trung chủ yếu vào các

tháng 3, 4, bệnh có chiều hướng giảm dần vào tháng 6-7 (Đào Trọng Đạt và cộng

sự, 1978 ; Nguyễn Vĩnh Phước và Nguyễn Thị Như Nguyệt, 1985)

Bệnh xảy ra quanh năm do mầm bệnh luôn tồn tại trong môi trường và trong

các con vật mang trùng, đặc biệt trong các cơ sở đã ô nhiễm mầm bệnh.Tuy nhiên

đây là một bệnh có liên quan đến môi trường nên cứ khi nào thời tiết thay đổi đột

ngột, hoặc lúc giao mùa thì bệnh xảy ra mạnh Mặt khác, bệnh liên quan đến sức đề

kháng của con vật nên bệnh CRD còn được coi như một “thứ chỉ thị” cho sức khỏe

của đàn gà, khi con gà thay lông cũng là thời điểm con vật dễ mắc bệnh do sức đề

kháng của con vật bị suy giảm

1.1.4 Cách truyền lây và chất chứa mầm bệnh

Trong thiên nhiên, nguồn bệnh chủ yếu là gà bệnh, bệnh lây truyền chủ yếu

qua hai đường chính:

- Đường truyền ngang: do gia cầm khỏe tiếp xúc trực tiếp hoặc gián tiếp

với mầm bệnh từ con bệnh, vật mang trùng (nước mũi, nước mắt…) Mầm bệnh

xâm nhập chủ yếu vào đường hô hấp của gia cầm khỏe từ bụi, hơi nước trong không khí có chứa mầm bệnh hoặc qua dụng cụ chăn nuôi, người chăn nuôi…

Gà mắc bệnh ở thể ẩn tính, mang trùng đóng vai trò quan trọng về mặt dịch tễ học của bệnh,từ nguồn bệnh này mà mầm bệnh được thải ra ngoài môi trường

- Đường truyền dọc: có ý nghĩa dịch tễ quan trọng ở bệnh do Mycoplasma

gây ra, truyền lây mầm bệnh qua trứng do vòi trứng và tinh dịch gà trống nhiễm bệnh, dẫn đến truyền lây bệnh cho thế hệ sau (Yoder và Hofstad, 1964)

Trong một số trường hợp, sự lây nhiễm có thể thông qua việc sử dụng vacxin virus chế từ trứng bị nhiễm Mycoplasma

Cơ chế sinh bệnh

Sau khi xâm nhập vào cơ thể, MG đến ký sinh và làm viêm nhẹ niêm mạc

đường hô hấp, niêm mạc mũi và các xoang xung quanh, thành túi khí Khi đó niêm mạc phù nhẹ, lớp dưới bị thâm nhiễm các tế bào lympho và tế bào đơn nhân tạo nên các hạt nhỏ lấm tấm Nếu sức đề kháng của cơ thể tốt, các bệnh này nhẹ

có khi không nhìn thấy Nếu sức đề kháng của cơ thể giảm, bệnh tích sẽ nặng lên, lan tràn; bệnh nổ ra rất mạnh, lây lan toàn đàn, toàn trại Trường hợp này thường thấy khi niêm mạc đường hô hấp bị tổn thương do các virus viêm phế quản, đậu

và thanh khí quản Bệnh càng thể hiện rõ khi niêm mạc đường hô hấp có một số

vi khuẩn E coli ký sinh, con vật thường bị kiệt sức rồi chết (Nguyễn Bá Hiên và Nguyễn Thị Hương, 2009) Thông qua đường máu mầm bệnh đi đến các cơ quan trong cơ thể, có thể phân lập được mầm bệnh trong tủy xương là 26,6%, lách 18,3%, hồng cầu 11,5%, gan 33,7% nhưng có một thời gian mầm bệnh khu trú ở phổi, túi khí, buồng trứng, tinh hoàn

1.1.5 Triệu chứng của bệnh

Triệu chứng lâm sàng của bệnh do Mycoplasma có thể biểu hiện khác

nhau, tuỳ thuộc vào độc lực của mầm bệnh và sức đề kháng của cơ thể Có rất nhiều yếu tố ngoại cảnh như nhiệt độ, độ ẩm, độ thông thoáng, vệ sinh chuồng trại, stress, mật độ gà/m2, giống gà, tuổi gà hay việc sử dụng kháng sinh để phòng bệnh cũng ảnh hưởng đến thời gian nung bệnh

Trong trường hợp đàn gà bị nhiễm từ trứng bệnh nhưng được xử lý bằng

kháng sinh và được nuôi trong điều kiện tốt thì những biểu hiện lâm sàng không thể hiện cho đến khi đàn bị kết hợp với những mầm bệnh khác hoặc các yếu tố stress xuất hiện

Trong tự nhiên, thời kỳ nung bệnh ở các đàn gà khác nhau từ 3 đến 38 tuần (Stipkovits và Kempf, 1996)

Bệnh thường xuất hiện sau khi nhiễm mầm bệnh từ 6 ÷ 21 ngày và kéo dài

từ 4 ÷ 8 tuần hoặc hơn

Sau thời gian nung bệnh những biểu hiện đầu tiên của bệnh là gà kém ăn, có

âm ran khí quản, lúc đầu ở một số con, sau đó lây lan sang nhiều con Gà kém ăn, lông xơ xác, sút cân nhanh, thường bị viêm kết mạc mắt, mí mắt sưng phù, đầu sưng, mũi tiết ra chất nhày hoặc nhày lẫn mủ, gà hay vẩy mỏ hoặc quệt mỏ, viêm niêm mạc đường hô hấp và các túi khí Gà thường hắt hơi, ho khan hay lắc đầu, thở nhanh và khó, có thể vươn cổ ra để thở, mỏ nửa kín nửa hở, ho cũng như thở đều có âm ran ướt và tiếng kêu rít, khò khè thường xuất hiện vào ban đêm (Ley, 2003)

Một số trường hợp khác gà bị sưng khớp, què, mất điều hoà thần kinh, sưng đầu, kém ăn, mỏ và chân khô, chân kém bóng láng

Những dấu hiệu không đặc trưng phổ biến như: Giảm tốc độ sinh trưởng

và năng suất đẻ trứng, giảm khả năng chuyển hoá thức ăn

Triệu chứng lâm sàng của những đàn bị nhiễm bệnh qua trứng khi chuyển thành bệnh thứ cấp CRD biểu hiện từ lúc 3÷6 tuần tuổi, còn những trường hợp khác thì phát triển ở giai đoạn chuẩn bị sinh sản

*Ở gà con

Nếu trứng ấp mang mầm bệnh, gà con nở ra từ 1÷10 ngày tuổi đã có biểu hiện lâm sàng

Nếu bệnh xảy ra trong giai đoạn 3÷8 tuần tuổi thì đó là bệnh do sơ nhiễm

Gà bị bệnh đầu tiên chảy nước mắt, nước mũi Nước mũi lúc đầu loãng sau đó đặc dần, màu trắng sữa bám đầy khóe mũi làm cho gà phải há miệng để thở Nước mắt quánh dần, fibrin tích tụ ngày càng nhiều tạo thành những khối tia bằng hạt ngô, hạt lạc nổi lồi trên tròng mắt Đôi khi giác mạc bị viêm loét viêm

mủ toàn mắt, lòng mắt đặc lại, con vật bị mù Trong khi đó có hiện tượng viêm lan từ mũi ra các xoang xung quanh,vách các xoang, đặc biệt là xoang dưới mắt viêm sưng Mặt gà bị biến dạng nên đầu gà giống như đầu chim cú đặc biệt là ở

gà tây Các xoang lúc đầu chứa thanh dịch loãng sau đó biến thành fibrin đặc

Gà có hiện tượng rất khó thở nên thường xuyên phải há miệng để thở Gà thường xuyên lắc vẩy mỏ, lúc vẩy mỏ xong thì liền theo đó là tiếng “khoẹt” một lúc sau lại lặp lại như thế Tiếng “khoẹt” rất rõ, nhiều khi về đêm và sáng sớm

Có con có triệu chứng đi lệch khớp

Gà ăn ít nên tăng trọng giảm rõ rệt lông gà xơ xác, đàn gà có nhiều con bị còi cọc Phân gà có màu xanh loãng hơi nhớt hoặc màu xanh trắng

Ở gà con tỷ lệ chết cao hơn ở gà lớn Có khi chết mà chưa có bệnh tích đặc trưng Bệnh kéo dài 10 ngày tỷ lệ chết khoảng 5- 12%, có khi 20- 50% (Nguyễn Thị Hương, Lê Văn Năm, 1997)

*Ở gà lớn:

Gà lớn mắc bệnh chủ yếu ở thể ẩn tính, triệu chứng lâm sàng không rõ Bệnh hay xảy ra chậm và kéo dài nhiều tháng Dấu hiệu đặc trưng nhất là thở khó, thở khò khè, viêm mũi một bên hoặc hai bên Gà vẫn ăn tốt nhưng tăng trọng chậm

Ở gà bệnh còn có hiện tượng viêm khớp, viêm bao hoạt dịch (10÷15%)

Cá biệt có trường hợp gà có triệu chứng thần kinh Gà trống mắc bệnh thường có tiếng kêu khàn

Bệnh xảy ra chậm và kéo dài nhiều tháng, dấu hiệu đặc trưng nhất ở gà lớn là khi thở có tiếng ran, thở khò khè, viêm mũi một bên hoặc hai bên Gà chảy nước mắt, nước mũi, vảy mỏ, tiêu hoá kém và gầy sút (Ley, 2003)

* Ở gà đẻ:

Sản lượng trứng giảm (50% – 60%), một số trường hợp không có biểu hiện lâm sàng nhưng vẫn thấy tăng tỷ lệ chết phôi và gà nở ra chậm lớn, đôi khi thấy có triệu chứng thần kinh

Tỷ lệ chết ở đàn gà lớn không đáng kể, nhưng ảnh hưởng tới tăng trọng và tỷ

lệ đẻ Tỷ lệ chết ở gà thịt thấp nếu không kết hợp với các bệnh khác, chết nhiều nhất là 30% nếu có bệnh ghép và bệnh xảy ra vào những tháng thời tiết lạnh

Những triệu chứng trên biểu hiện ở cường độ khác nhau và kéo dài hàng tháng, bệnh vào mùa hè thường nhẹ hơn mùa đông Tỉ lệ chết ở gà con từ 10% ÷ 25% Gà bệnh thường giảm khả năng sản xuất từ 10% ÷ 40%

Bệnh CRD thường xuất hiện ghép với các bệnh khác như Tụ huyết trùng, Ecoli Tỷ lệ chết có thể lên đến 30%, nếu bệnh xảy ra độc lập thì tỷ lệ chết thường thấp hơn (Ley, 2003)

1.1.6 Bệnh tích

* Bệnh tích đại thể:

Quan sát bệnh tích mổ khám gà bị bệnh CRD thấy xác gà gầy, có dịch viêm chảy ở mũi, khí quản, phế quản, các túi khí viêm, viêm xoang thường điển hình nhất ở gà tây, túi khí chứa chất bã đậu là những hạt nhỏ hoặc nang trắng, thành túi khí phù nề dày lên và trắng đục

Biến đổi bệnh tích ở phổi có thể thấy: Viêm màng phổi, trong phổi có các vùng cứng, đôi khi hình thành u hạt, mặt phổi phủ fibrin, rải rác một số vùng bị hoại tử Trong trường hợp điển hình, có hiện tượng viêm ngoại tâm mạc, viêm quanh gan, mặt ngoài gan có viêm tơ huyết mủ, viêm màng bụng (Nguyễn Bá Hiên và Nguyễn Thị Hương, 2009)

Những trường hợp bệnh ghép, trên màng bao tim, gan, lách đều phủ lớp màng giả trắng đục, phù nề các khớp, xuất tiết dịch viêm ở khớp, thoái hoá bề mặt của khớp, viêm bao gân, ổ khớp và viêm màng hoạt dịch Gà con bị viêm bao tim, viêm quanh gan và lách có hiện tượng sưng Đối với gà trống có hiện tượng viêm tinh hoàn, viêm khớp Gà mái bị viêm buồng trứng và viêm ống dẫn trứng (Ley, 2003)

* Bệnh tích vi thể:

Bệnh tích vi thể biểu hiện rõ ở khí quản và phổi

- Khí quản: Tăng sinh và tróc tế bào biểu mô, có sự thâm nhiễm các tế bào đơn nhân và tăng sinh các tuyến nhầy Hình thành các vùng tăng sinh tế bào

lympho dưới màng nhầy niêm mạc, các ống huyết dịch của biểu mô dài ra rõ rệt

- Phổi: Có các vùng viêm, xuất hiện các nang lympho cũng như các tổn thương dạng hạt Mô phổi có sự tăng sinh lympho dạng nang, có hiện tượng viêm phổi (Nguyễn Bá Hiên và Nguyễn Thị Hương, 2009)

Hình 1.1 Gà bị bệnh CRD viêm khớp gối, gầy và chết

* Bệnh tích khi có bệnh ghép:

Khi bị nhiễm MG sẽ nhanh chóng lan tỏa toàn đàn gà làm giảm sức đề

kháng của con vật và dễ nhiễm các bệnh khác Khi bị nhiễm bệnh thứ phát thì

bệnh sẽ tiến triển theo hướng phức tạp hơn

Khi đã bị Mycoplasma, nếu đưa vacxin chống bệnh Newcastle vào thì khả

năng tạo miễn dịch cũng bị hạn chế, cơ thể yếu làm cho gà không chống được

virus cường độc và dễ nhiễm Newcastle

Khi có bệnh ghép với E.coli thì có bệnh tích của viêm ruột, viêm cata bại

huyết, có xuất huyết từng chấm vành mỡ bao tim, gan xuất huyết và nhiều khi

gan, tim, phổi hình thành một khối có phủ lớp màng trắng đục

Khi cơ thể đã nhiễm bệnh, hệ thống miễn dịch bị suy giảm gà sẽ bị nhiễm hàng loạt bệnh khác: phó thương hàn, viêm phế quản truyền nhiễm, viêm thanh

khí quản truyền nhiễm…

Thực tế, nếu chỉ mắc riêng Mycoplasma thì tỷ lệ chết ít và rải rác, song

khi đã ghép bệnh tỷ lệ chết sẽ tăng rất cao trong đàn

1.1.7 Chẩn đoán

Để chẩn đoán và kết luận chính xác về bệnh do MG gây ra, cần kết hợp

nhiều phương pháp khác nhau như: phân lập mầm bệnh, dựa trên những dẫn liệu về đặc điểm dịch tễ, các triệu chứng lâm sàng, kết quả mổ khám bệnh tích

và chẩn đoán huyết thanh học Ngày nay với sự phát triển của khoa học công nghệ đặc biệt là sự phát triển của công nghệ sinh học ở mức độ phân tử, để chẩn đoán chính xác bệnh người ta dùng kỹ thuật PCR, hoặc bằng cách phát hiện DNA của chúng trong các mô nhiễm bệnh hoặc các mẫu bệnh phẩm

Chẩn đoán dựa vào đặc điểm dịch tễ, triệu chứng, bệnh tích

Bệnh thường xảy ra ở gà, gà tây, gà sao, chim bồ câu Vịt, ngan, ngỗng ít cảm thụ với bệnh Bệnh xảy ra ở mọi lứa tuổi, mùa vụ nhưng thường mắc khi thời tiết thay đổi đột ngột, chủ yếu vào tháng 3, 7 và tháng 11, 12 trong năm Bệnh xảy ra với gà 1 – 3 ngày tuổi hoặc sau 15 – 42 ngày tuổi do bệnh lây qua trứng từ mẹ sang Thời gian ủ bệnh từ 6 – 21 ngày sau đó phát bệnh với những triệu chứng điển hình như gà chảy nhiều nước mắt, nước mũi, thức ăn dính vào

mỏ, vươn cổ để thở, hay vảy mỏ nghe được âm ran ở đoạn khí quản, đặc biệt âm ran nghe rõ về đêm và sáng sớm cùng với tiếng kêu đột ngột (khẹc) trong đàn Khi mổ khám thấy bệnh tích điển hình như đã mô tả ở phần bệnh tích

Ngoài ra nếu bệnh ghép với E.coli thì còn quan sát thấy có màu trắng bạc bao

phủ cơ quan nội tạng (Đào Trọng Đạt, 1975)

Chẩn đoán phân biệt

Theo Nguyễn Bá Hiên và Nguyễn Thị Hương, 2009, khi xác định bệnh

đường hô hấp gia cầm gây ra do MG người ta cần phân biệt với bệnh viêm phế

quản truyền nhiễm, viêm mũi truyền nhiễm, viêm thanh khí quản truyền nhiễm,

bệnh đậu gà, bệnh Newcastle, Aspergillosis thiếu vitamin A…

Bệnh viêm phế quản truyền nhiễm: thường chỉ xảy ra ở những đàn gà con dưới 6 tuần tuổi Nếu gà đẻ bị bệnh sẽ có triệu chứng cấp tính, tỷ lệ mắc bệnh cao Triệu chứng hô hấp của gà bệnh không phải thể hiện ở phần trên mà ở phần sâu hơn của đường hô hấp Một số trường hợp gà bị sưng hầu, sản lượng trứng tụt đột ngột

Bệnh viêm thanh khí quản truyền nhiễm: Bệnh khó chẩn đoán và dễ nhầm

với bệnh Mycoplasma ở thể nhẹ Trường hợp này có thể kiểm tra tổ chức học

bệnh tích niêm mạc khí quản để phát hiện thể bao hàm, đồng thời có thể phân lập virus để định bệnh

Bệnh đậu gà: Có thể nhầm với bệnh đậu yết hầu Nhưng trong bệnh đậu màng giả niêm mạc miệng, hầu thường dầy, tràn lan và khó bóc Ngoài ra trong ổ dịch đậu, sớm muộn trên một số con cũng có biểu hiện triệu chứng mụn đậu ngoài da

Chẩn đoán huyết thanh học

Phản ứng huyết thanh học được dùng để phát hiện sự có mặt của kháng

thể kháng lại MG ở trong cơ thể vật chủ, qua đó xác định được mức độ nhiễm

MG và đưa ra biện pháp xử lý sớm Các phản ứng này thường áp dụng trong việc điều tra tình hình nhiễm bệnh ở các đàn gà nuôi tập trung

Các phương pháp chẩn đoán huyết thanh học được sử dụng trong chẩn đoán Mycoplasma:

Phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính

Phản ứng ngưng kết chậm trong ống nghiệm

Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu gà

Phản ứng ELISA

Trong đó, phản ứng huyết thanh được sử dụng thường xuyên nhất là

phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính (Serum plate agglutination - SPA)

Đây là một phản ứng được sử dụng như một kĩ thuật thường quy để chẩn đoán, xác định gà bị bệnh

Theo quy định của Cuba (1989) về tỷ lệ nhiễm MG cho phép với đàn gà

giống là dưới 2%, OIE (2004) cho phép dưới 5%

Đàn gà bị coi là nhiễm bệnh khi có trên 50% số mẫu kiểm tra cho phản ứng dương tính Nếu trong trường hợp tỷ lệ ít hơn nhưng khi kiểm tra gà có biểu hiện triệu chứng, bệnh tích của bệnh thì đàn gà được coi là không an toàn về bệnh CRD

Phản ứng dương tính khi huyết thanh pha loãng là 1/8 hay cao hơn có thể kết luận gà bị nhiễm CRD (OIE, 2000)

Phân lập mầm bệnh

Phân lập và xác định mầm bệnh là phương pháp chính xác nhất trong chẩn

đoán bệnh do MG gây ra Các mẫu bệnh phẩm được lấy từ khe mũi, vòm họng,

thực quản, khí quản, mắt, lỗ huyệt, túi khí Các dịch rỉ có thể lấy từ các xoang hốc mắt và các ổ khớp Các mẫu còn có thể thu được từ mặt trong của màng noãn hoàng, từ vòm họng hay túi khí của phôi thai

Với gà bị bệnh còn sống có thể dùng tăm bông lấy dịch ở mũi, họng

để phân lập (Branton et al., 1984) Môi trường nuôi cấy phải có các chất bổ

trợ gồm 10÷15% huyết thanh lợn (ngựa), chất chống tạp khuẩn Thalium Acetat (Freud, 1983) Mầm bệnh được nuôi cấy ở 370C từ 3 ÷ 5 ngày trong tủ

Khuẩn lạc Mycoplasma rất nhỏ như bụi sương nên phải quan sát dưới kính hiển vi

quang học có độ phóng đại 20 ÷ 50 lần Bằng mắt thường chỉ có thể quan sát được khuẩn lạc dưới ánh sáng xiên (Razin, 1998) Khuẩn lạc điển hình có đường kính 1nm ÷ 3nm

Do có nhiều loại Mycoplasma cư trú trong đường hô hấp của gà nên khi

phân lập cần tiến hành các bước kiểm tra và xác định vi khuẩn để định loại, typ Cho đến nay, miễn dịch huỳnh quang (Talkington và Kleven, 1985) hoặc oxy hóa khử miễn dịch là những phương pháp tối ưu được sử dụng trong việc xác định

nhanh Mycoplasma trong môi trường nuôi cấy

Phương pháp chẩn đoán phát hiện MG bằng phản ứng nhân gen Polymerase Chain Reaction (PCR)

Những công trình của Kempf và cộng sự (1993) sử dụng cặp mồi đặc hiệu khuếch đại đoạn gen 330 bp từ nucleotide 172 đến 502 ở vùng V2 đến vùng S giữa V6 và U3 của gen 16s rRNA MG mà không nhân lên ở các loài vi khuẩn khác Một công trình khác của Kiss và cộng sự (1997) đã thiết kế cặp mồi đặc hiệu với mầm bệnh MG cho phép khuếch đại từ vị trí 702 đến vị trí 1242 trên gen 16s rRNA Tuy cặp mồi này không nằm trọn vẹn trên vùng biến đổi nhưng nó nằm trên vùng bán bảo tồn và cũng được các tác giả kiểm tra và khẳng định tính đặc hiệu của phản ứng đối với mầm bệnh MG

Năm 2002, Nhữ Văn Thụ và cộng sự lần đầu tiên đã thiết lập phản ứng PCR lồng dựa trên trình tự gen 16S rRNA của MG Với độ nhạy rất cao (có thể phát hiện ở nồng độ nhỏ hơn một đơn vị khuẩn lạc trong một phản ứng) đã có thể khắc phục được vấn đề chẩn đoán bệnh ở bệnh phẩm và cho phép phát hiện mầm bệnh ở các loại mẫu khác như nền chuồng, nước uống, phôi gà… mà các phương pháp khác khó hoặc không thể pháp hiện được

1.1.8 Biện pháp phòng bệnh

* Quy trình quản lý đàn gà và vệ sinh phòng bệnh

+ Khi chưa có dịch

Hiện nay, hầu hết các đàn gà công nghiệp đều bị nhiễm Mycoplasma, vì

vậy việc tạo ra một đàn gà không bị nhiễm bệnh là một việc làm cần thiết nhưng khó khăn Giữ gìn điều kiện vệ sinh môi trường, cách ly khỏi các nhân tố truyền

lây là biện pháp phòng bệnh quan trọng bậc nhất

Đối với chăn nuôi gà, thực hiện tốt phương thức “cùng vào, cùng ra” Sau mỗi đợt xuất gà, phải tiêu độc cẩn thận trước khi đưa gà mới vào chuồng, ở các đàn gà giống, gà đẻ thường xuyên quan sát phát hiện gà bị bệnh mạn tính, gà mang vi khuẩn để loại thải, hạn chế nguồn gieo rắc mầm bệnh Mật độ chuồng nuôi phải thích hợp cho từng loại gà, chuồng trại phải thoáng mát

Điều trị dự phòng đàn giống bằng các loại kháng sinh và hoá dược có hiệu quả cao để giảm thiểu sự truyền lây qua trứng Xử lý trứng trên đàn gà đẻ bằng các biện pháp như tiêm kháng sinh, nhúng kháng sinh hoặc đun nóng trứng (Yoder, 1990)

Khi có bệnh cần nhanh chóng cách ly gà ốm với gà khoẻ Sau mỗi lứa cần phải dọn vệ sinh, tẩy uế, sát trùng và phải có thời gian trống chuồng thích hợp

+ Khi có dịch xảy ra

Với đàn không bệnh, nuôi riêng trong điều kiện an toàn, vệ sinh phòng

bệnh nghiêm ngặt, từ đó nhân lên hay thay thế đàn có bệnh

Đối với đàn có bệnh, cần loại thải thành đàn thương phẩm, hoặc có thể để đàn nhiễm nhẹ làm đàn thương phẩm nhưng phải được kiểm tra chặt chẽ và có

dùng Tylosin phòng bệnh

Mặt khác, trong suốt thời gian đẻ của gà mẹ, nếu kiểm tra thấy kháng thể trong trứng hoặc trong máu của gà con, tiến hành kiểm tra đàn gà sinh sản theo nguyên tắc: nếu kiểm tra âm tính hoàn toàn thì đàn gà mới được coi là không mắc bệnh và vẫn tiếp tục kiểm tra

* Phòng bệnh bằng kháng sinh

Mycoplasmosis thường là bệnh kế phát của một số bệnh khác, vì vậy muốn phòng bệnh có hiệu quả thường sử dụng phối hợp với một số kháng sinh như: Gentamycin, Kanamycin, Tylosin, Oxytetracylin, Chlortetracylin…

Stipkovits và Kempf (1996) đã dùng Lincomycin và Spectinomycin tiêm vào túi khí tuy đạt được hiệu quả khống chế sự lây truyền qua trứng nhưng phương pháp này tốn nhiều công sức và cũng không ngăn chặn triệt để được sự

lây lan của mầm bệnh Mycoplasma

Tuy nhiên nhiều tác giả không đồng ý với cách dùng kháng sinh để phòng

bệnh vì với liều phòng bằng một nửa liều điều trị thì có thể gây hiện tượng nhờn thuốc và tồn dư kháng sinh trong trứng Vì vậy, những gà được tiêm vacxin có thể chống lại bệnh đường hô hấp

* Phòng bệnh bằng vacxin

Hiện nay trên thị trường cũng có nhiều hãng sản xuất vacxin phòng bệnh CRD:

Vacxin vô hoạt được chế từ MG do công ty VINELAND của Mỹ sản xuất

có quy trình phòng bệnh như sau:

- Lần 1: Vào lúc 3 tuần tuổi tiêm dưới da hay bắp liều 0,5ml/ con

- Lần 2: Trước khi đẻ 2÷4 tuần liều 0,5ml/ con Khi tiêm cho gà đẻ kháng thể truyền vào lòng đỏ của trứng nên phòng được bệnh cho gà con trong vòng 2 ÷

Talovac 104 của Đức là vaxin nhược độc tiêm dưới da cho mỗi con 0.5ml

từ 6 -8 tuần tuổi và tiêm nhắc lại lúc gà 16 ÷ 20 tuần tuổi (Nguyễn Hữu Vũ và Phan Lục,1996)

*Sử dụng kháng nguyên (Antigen MG) chẩn đoán Mycoplasmosis và loại thải gà nhiễm bệnh

Kháng nguyên MG được sử dụng để chẩn đoán nhanh xác định tỷ lệ nhiễm trong đàn, kịp thời loại thải những con có khả năng gây bệnh, góp phần tạo nên những đàn gà giống sạch bệnh

Hiện nay, chủng MGS6 của Mỹ trở thành chủng chuẩn để chế kháng nguyên (KN) bán sẵn trên thị trường, nhưng chúng có thể khác nhau về độ nhạy

và độ đặc hiệu, theo nhà sản xuất và theo các lô, chúng phải được bảo quản theo hướng dẫn của nhà sản xuất (Levisohn, 1995)

Theo Ross et al (1990) có thể hạn chế phản ứng không đặc hiệu khi pha

loãng huyết thanh 4 ÷ 8 lần

Phản ứng này được sử dụng rộng rãi do thao tác đơn giản và độ nhạy cao

Đây là phản ứng rất có giá trị để phát hiện sự nhiễm bệnh trong giai đoạn đầu (Kleven, 1997) (Roberts và Howes, 1992)

* Sử dụng kháng huyết thanh MG để xác định vi khuẩn

Kháng huyết thanh MG được sử dụng để xác định nhanh mầm bệnh bằng

phương pháp kết hợp trực tiếp giữa kháng huyết thanh (KHT) và KN tương đồng

hoặc xác định trực tiếp vi khuẩn qua phản ứng nhuộm Immunoperoxidaza Việc xác định được vi khuẩn sẽ làm cơ sở cho việc lựa chọn chủng để chế vacxin phòng bệnh và góp phần phục vụ tốt cho công tác chẩn đoán

1.1.9 Điều trị

Do Mycoplasma mẫn cảm với các loại kháng sinh không tác động lên thành

tế bào vi khuẩn, nên trước đây người ta dùng các loại kháng sinh có phổ rộng để điều trị bệnh CRD như: Tetracyclin, Erythromycin, Oxytetracyclin, Kanamycin, Spiramycin, Tylosin, Lincomycin và Spectinomycin nhưng hiệu quả thấp Ngày nay, với sự tiến bộ về khoa học công nghệ dược thú y, có nhiều loại hoá dược được

sử dụng phối chế cùng một số loại kháng sinh để tránh sự kháng thuốc (Valks và Burch, 2002) Trong đó, thuốc Tylosin chiếm phần lớn sau đó là Tiamulin, là những thuốc có hiệu quả điều trị (Phạm Văn Đông, 2002) Nhiều tác giả đã khẳng định việc bổ sung vào thức ăn, nước uống một lượng thuốc nhất định có khả năng phòng bệnh, giảm thiệt hại kinh tế, tạo khả năng phát triển bình thường của gà con

Bệnh do Mycoplasma thường trở nên trầm trọng do kế phát và kết hợp với

các loại vi khuẩn khác Do vậy chúng ta nên dùng các loại kháng sinh có phổ rộng như Enrofloxacin, Danofloxacin hoặc Lincospectin sẽ có hiệu quả điều trị cao hơn Sử dụng một lượng rất thấp Tylosin trộn vào thức ăn của gà đẻ có nguy

cơ nhiễm bệnh hoặc trong hệ thống nuôi nhiều lứa tuổi có hiệu quả chống lại sự tụt giảm sản lượng trứng (Stipkovist and Kempf, 1996)

đầu chóp nhô ra và được gọi là “bleds” trên có các cơ quan bám dính giúp chúng

có khả năng bám vào thành tế bào vật chủ (Razin et al., 1998)

* Cấu tạo:

MG là vi sinh vật có khả năng tự nhân lên có kích thước nhỏ nhất Lớp vỏ ngoài cùng có cấu tạo là màng nguyên sinh chất dầy 75A0 ÷ 100A0 Trong tế bào

có các hạt Riboxom có đường kính 0,2µm và các sợi nhân

Trong cấu tạo của MG người ta thấy có các chất đặc trưng với các tế bào vi khuẩn là các mucoit nhưng khác vi khuẩn ở hai đặc điểm là kích thước genome và thành phần các bazơ nitơ của DNA MG có cả DNA và RNA, nó mang bộ gen nhỏ nhất trong tất cả các cơ thể sống tự do Các cơ thể sống của lớp này có ít hơn 300 gen, tổng thành phần Guanine (G) và Cystosine trong DNA thấp và tỷ lệ đó phân bố không đều trong bộ gen, có vùng rất cao, có vùng rất thấp Một cơ thể sống có kích thước và số lượng nhỏ như vậy nhưng nó cũng thể hiện là một mầm bệnh tương đối hoàn chỉnh và thực hiện rất nhiều chức năng của một cơ thể sống chứng tỏ tính tổ

chức và sự điều hành của bộ gen của MG khá hoàn chỉnh

4 ÷ 8 ngày với bệnh tích điển hình: phôi còi cọc, phù, gan hoại tử, lách sưng to

Các loài Mycoplasma gây bệnh cho gia cầm đều cần một loại môi trường được

làm giàu bằng protein chứa từ 10 ÷ 20% huyết thanh động vật Huyết thanh lợn được

sử dụng phổ biến hơn huyết thanh ngựa Một số chất bổ trợ là hợp phần chiết xuất từ

các loại nấm men có lợi trong việc nuôi cấy phân lập Mycoplasma có sức đề kháng

khá tốt với Thalium acetat và Penicillum, là hai chất thường được sử dụng trong pha chế môi trường nhằm loại bỏ sự phát triển của tạp khuẩn và nấm mốc

MG hình thành khuẩn lạc trên môi trường thạch ở điều kiện đủ độ ẩm trong thời gian 3 ÷ 10 ngày Khuẩn lạc nhỏ, đường kính xấp xỉ 0,2 ÷ 0,3 mm Khuẩn lạc trơn, rìa gọn, ở giữa hơi lồi lên (dạng trứng ốp lếp) Trong lần nuôi

cấy đầu tiên Mycoplasma thường mọc kém, các lần cấy kế tiếp sẽ làm tăng khả

năng mọc của chúng Khi nuôi cấy trên các môi trường dinh dưỡng cao, chúng tiết ra dịch nhầy, số lượng dịch nhầy tùy thuộc vào cường độ mọc

Đặc tính sinh hóa:

Mycoplasma có khả năng lên men đường khác nhau: không lên men đường lactoza, ít lên men saccroza, lên men đường glucoza, kết quả lên men

galactoza, fructoza, maltaza cũng rất khác nhau Với hầu hết các Mycoplasma lên

men đường, phản ứng thử đơn giản dựa trên sự sụt giảm pH của môi trường nuôi

cấy là đủ Tuy nhiên trong một số trường hợp các Mycoplasma phát triển chậm hoặc một số ít trường hợp các Mycoplasma vừa có khả năng phân hoá glucoza

vừa có khả năng thuỷ phân Arginine, phải tiến hành những test cụ thể hơn về sự chuyển hoá glucoza (Edward và Moore, 1974)

- Không phân hủy gelatin, không làm thay đổi sữa

- Phản ứng Arginin âm tính

- Phản ứng Indol dương tính

Một số đặc tính sinh hóa của Mycoplasma Chủng mycoplasma Đối tượng mắc Lên men

đường Sinh hơi hydro

M.gallisepticum Gà tây, gà ta + Không sinh (-)

Các chủng Mycoplasma gây bệnh tạo ra độc tố (hemasilin) có tính chất ngưng kết nguyên, có chứa nguyên huyết cầu.MG gây dung huyết một phần hồng cầu gà và gà Tây, gây dung huyết hoàn toàn hồng cầu ngựa trong môi trường thạch

1.3 Tình hình nghiên cứu bệnh do Mycoplasma ở gia cầm

1.3.1 Tình hình nghiên cứu bệnh do Mycoplasma ở gia cầm trên thế giới

Mầm bệnh Mycoplasma ở gia cầm được Dodd mô tả lần đầu tại Anh năm

1905 trên gà tây với tên gọi “Bệnh viêm phổi địa phương” Sau đó, năm 1907 cũng tại Anh, Graham Smith mô tả bệnh phù đầu ở gà tây

Tại Mỹ, năm 1926 Tyzzer mô tả bệnh viêm xoang ở gà tây và đến năm

1938 bệnh này được Dickinson và Hinshow đặt tên là “Bệnh viêm xoang truyền nhiễm” của gà tây.(Dickinson và Hinshow, 1926)

Tại Bắc Mỹ, Nelson (1935) khi phân lập được những thể cầu trực khuẩn (Coccobacili form) từ những gà con mắc bệnh hen suyễn, đã mô tả chi tiết triệu chứng bệnh và hình thái khuẩn lạc, nhưng ông lại đem gộp căn bệnh với tác nhân gây bệnh viêm đường hô hấp trên do virus vào cùng một loại và cho rằng căn bệnh chỉ có thể nuôi cấy trong môi trường tế bào và trong bào thai trứng

Năm 1943, J.P Delaplane và H O Stuart đã mô tả bệnh và gọi là bệnh viêm đường hô hấp mạn tính Hai ông đã phân lập được mầm bệnh và nuôi cấy chúng từ phôi gà đã mắc bệnh, rồi sau đó lại phân lập được mầm bệnh từ những con gà tây bị bệnh viêm túi khí (Ley và Yoder, 1997)

Vào đầu những năm 50, Markham và Wong, Van Rockell và Olesiuk đã gần như cùng lúc thông báo việc nuôi cấy thành công tác nhân gây bệnh từ dịch thanh quản của gà mắc bệnh đường hô hấp mạn tính và từ gà tây mắc bệnh viêm xoang mũi và chính thức đề nghị xếp mầm bệnh ở gà vào nhóm các vi sinh vật gây bệnh viêm phổi – màng phổi Đó là những khuẩn lạc nhỏ có dạng hình cầu mà Nelson đã

mô tả và thừa nhận là các thể Coccobacilli form được tìm thấy trước kia chính là PPLO (Pleuro – Pneumonia Like Organisms)

Năm 1954, Serman và cộng sự cũng phát hiện ra bệnh và gọi tên bệnh là

“bệnh viêm túi khí truyền nhiễm” Năm 1957, Adler đã thực hiện các thí nghiệm và

thấy trong tự nhiên có nhiều chủng Mycoplasma nhưng không phải chủng nào cũng

gây bệnh Chủng không gây bệnh được gọi tên là Mycoplasma gallinarum Còn chủng gây bệnh gọi là Mycoplasma gallisepticum

Tháng 5 năm 1961, tổ chức thú y thế giới (OIE) đã đổi tên “Bệnh viêm phổi

màng phổi” thành “Bệnh Mycoplasma ở gia cầm” hay “Bệnh viêm đường hô hấp mạn tính” (Chronical respiratory disease, viết tắt là CRD) Hiện nay, bệnh do MG

ở gia cầm được OIE xếp vào danh sách các bệnh truyền nhiễm nguy hiểm của gia cầm nhóm B Những tổn thất của bệnh gây ra là rất lớn Đối với gà thịt, giảm khả năng tăng trọng từ 20÷30%, tỷ lệ chết từ 5÷10% Ở đàn gà giống và gà đẻ, bệnh có thể làm giảm 10÷20% sản lượng trứng, tăng 5÷10% tỷ lệ chết phôi cao (Sato, 1996) Trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về nguyên nhân gây bệnh

và thiệt hại kinh tế do bệnh gây ra cũng như xây dựng biện pháp phòng trị bệnh có hiệu quả

Trong xác định và phân loại mầm bệnh, các tác giả đã ứng dụng triệt để

kỹ thuật sinh học phân tử (đặc biệt là PCR) đối với bệnh do Mycoplasma ở gia

cầm Trình tự gen của phân tử 16S rARN của hầu hết các loài các loài

Mycoplasma đã được giải mã và công bố trên ngân hàng dữ liệu, và đây cũng là nguồn thông tin quan trọng trong việc xác định mối quan hệ phân loại của các

loại Mycoplasma cũng như đối với các loại vi khuẩn khác

Nacimento và cộng sự (1991) đã thiết lập cặp mồi đặc hiệu đối với MG

dựa trên thông tin của đoạn gen đặc hiệu với MG phân lập từ thư viện gen Những công trình của Kempf và cộng sự (1993) sử dụng cặp mồi đặc hiệu khuếch đại đoạn gen 330bp từ nucleotide 172 đến 502 ở vùng V2 đến vùng S giữa V6 và U3 của gen 16S rARN MG và tác giả cũng chứng minh

rằng cặp mồi trên đặc hiệu và chỉ nhân lên đoạn gen của MG mà không nhân

lên ở các loài vi khuẩn khác

Một công trình khác của Kiss và cộng sự (1997) đã thiết kế cặp mồi đặc hiệu với mầm bệnh MG cho phép khuếch đại từ vị trí 702 đến vị trí 1242 trên gen 16s rRNA Tuy cặp mồi này không nằm trọn vẹn trên vùng biến đổi nhưng nó nằm trên vùng bán bảo tồn và cũng được tác giả kiểm tra và khẳng định tính đặc

hiệu của phản ứng đối với MG

Liu và cộng sự (2001) đã sử dụng đoạn gen đặc hiệu cho MG để xác định

sự khác biệt giữa các chủng của gen pvpA (phase-variable putative adhesin protein) bằng kỹ thuật PCR-RFLP Pang và cộng sự (2002) đã phối hợp 6 cặp mồi

sử dụng trong chẩn đoán các mầm bệnh gây bệnh đường hô hấp cho gia cầm trong

1.3.2 Tình hình nghiên cứu bệnh CRD ở Việt Nam

Vào những năm 70, ở Việt Nam, ngành chăn nuôi gà theo phương thức công nghiệp bắt đầu hình thành và phát triển Hầu hết các bác sĩ thú y ở các xí nghiệp chăn nuôi gà lúc đó đều ghi nhận những dấu hiệu lâm sàng và bệnh tích

của bệnh hô hấp mạn tính do Mycoplasma gây ra trên các đàn gà giống Tuy

nhiên, do thiếu phương tiện, nên phải đến năm 1972, một số nghiên cứu có tính khai phá mới được các tác giả như Đào Trọng Đạt, Nguyễn Văn Quang, Nguyễn Đức Dụ nghiên cứu và bước đầu xác định tỷ lệ nhiễm Mycoplasmosis ở các hộ gia đình là khá cao Các tác giả đã phân lập được mầm bệnh và đề ra một chương trình

phòng chống bệnh Mycoplasma bằng kháng sinh áp dụng cho các cơ sở chăn nuôi

gà tập trung ở phía Bắc Việt Nam

Để chẩn đoán bệnh này người ta thường dùng phản ứng huyết thanh học Nhiều tác giả như Nguyễn Vĩnh Phước, Hồ Đình Chúc (1989), Phan Lục và cộng

sự (1994), Nguyễn Tăng Huy (1996) đã xác định được tỷ lệ mắc bệnh CRD trong các cơ sở chăn nuôi gà công nghiệp bằng phản ứng này, bước đầu đánh giá về khả năng mắc bệnh giữa các giống gà khác nhau, cũng như đề ra một số biện pháp phòng trừ tổng hợp bệnh CRD

Tác giả Trần Thị Lan Hương (1995) đã xác định tỷ lệ nhiễm CRD trên đàn

gà giống Leghorn, Hybro, Avian và hiệu quả phòng trị bệnh của Pharmasin

Cũng sử dụng phương pháp chẩn đoán huyết thanh học, các tác giả Trương Hà Thái, Nguyễn Ngọc Đức, Chu Thị Thanh Hương, Nguyễn Văn Giáp

đã xác định tỷ lệ nhiễm MG ở 2 giống gà hướng thịt ROSS 308 và ISA màu nuôi

công nghiệp tại một số tỉnh miền Bắc Việt Nam

Phản ứng huyết thanh học có độ nhạy cao và dễ thực hiện, tuy nhiên, các chủng thường phản ứng chéo và không đặc hiệu Các kháng nguyên đặc hiệu cho các chủng không có sẵn trên thị trường Các tác giả Đào Thị Hảo, Cù Hữu Phú, Nguyễn Ngọc Nhiên, Nguyễn Xuân Huyên, Trần Việt Dũng Kiên đã tiến hành nghiên cứu quy trình chế tạo kháng nguyên MG dùng để chẩn đoán bệnh viêm hô hấp mạn tính (CRD) ở gà

Ngoài việc sử dụng phương pháp chẩn đoán huyết thanh học, Nhữ Văn Thụ và Võ Văn Sự đã ứng dụng phương pháp PCR trong chẩn đoán nhanh và bước đầu điều tra dịch tễ bệnh do MG trên gà và đã đạt được những kết quả đáng ghi nhận

Chương 2 NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nội dung nghiên cứu

2.1.1 Ứng dụng chế phẩm kháng nguyên MG xác định tỷ lệ nhiễm CRD theo giống gà, lứa tuổi trên đàn gà nuôi tại ngoại thành Hà Nội và các tỉnh Bắc Ninh, Hải Dương, Hưng Yên

2.1.2 Phân lập, xác định hình thái, tính chất nuôi cấy, đặc tính sinh vật hoá học và serotype của các chủng Mycoplasma phân lập được trên gà có huyết thanh dương tính với KNMG

- Phân lập MG từ các mẫu dịch họng và bệnh phẩm của gà có biểu hiện bệnh CRD và có huyết thanh dương tính với KNMG

- Xác định hình thái, tính chất nuôi cấy, đặc tính sinh vật hoá học của vi khuẩn MG phân lập được

- Kiểm định các chủng phân lập được bằng phương pháp PCR

- Xác định serotype của các chủng phân lập được

2.2 Nguyên liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Các giống gà hướng thịt( Đông tảo thuần, Đông tảo lai, Từ hồ, Hub, Sasso, Rod, HB7, Hub, Kabir ), và gà hướng trứng( Lương phượng, Isab) ở 3 giai đoạn: 0- 9 tuần tuổi (Gà con), >9- 21 tuần tuổi (Gà dò), > 22 tuần tuổi (Gà sinh sản), tại các cơ sở chăn nuôi gia cầm ở ngoại thành Hà Nội và các tỉnh Bắc Ninh, Hưng Yên, Hải Dương

2.2.2 Nguyên liệu

- Các mẫu máu, dịch họng gà, gà thí nghiệm được lấy từ các trại gà: thuộc cơ

sở chăn nuôi ngoại thành Hà Nội và các tỉnh Bắc Ninh, Hưng Yên, Hải Dương

- Kháng nguyên MG của Nhật Bản

- KHT MG chuẩn đơn giá và đa giá do Viện Thú y Nhật Bản cung cấp

- Kháng nguyên MG và KHTMG tự chế của Bộ môn Vi trùng Viện Thú y

- Các chủng MG do Malaixia và Nhật Bản cung cấp, có khả năng gây

bệnh cho gà được nghiên cứu bao gồm: chủng MGS6, MGPG31, MG10687 và các chủng MG phân lập tại Bộ môn Vi trùng

- Các loại hoá chất sử dụng trong phản ứng PCR như Taq-DNA polymerase, dNTP, các cặp mồi (Primer) cho MG, đệm phản ứng, đệm điện di TAE (Tris - Acetic - EDTA), nhuộm điện di (Gel loading buffer), nhuộm ADN (Ethidium Bromide 0,5%) do Nhật Bản sản xuất

- Hồng cầu gà được lấy từ gà trống khỏe có phản ứng HI âm tính với KN

MG, nước muối sinh lý 0,85%

- Dụng cụ phục vụ mục đích lấy mẫu bệnh phẩm: Panh, kéo, dao mổ, tăm bông, ống lấy mẫu, túi đựng bệnh phẩm, bơm tiêm, phiến kính, bút viết kính, găng tay, đá khô, hộp bảo quản mẫu

- Dụng cụ sử dụng cho việc nuôi cấy, phân lập và giám định đặc tính sinh học của vi khuẩn: panh, kéo, bông cồn, đèn cồn, que cấy, hộp lồng, ống nghiệm

- Dụng cụ sử dụng cho phương pháp PCR: que cấy, micropipet, micopipet tip, găng tay không bột, ống eppendoft

- Môi trường, hóa chất sử dụng cho phân lập, giám định đặc tính

Mycoplasma và các loại đường dùng cho phản ứng sinh hóa do hãng Oxoid của

Anh sản xuất Các loại môi trường lỏng và đặc thích hợp cho sự phát triển của MG

là môi trường Frey được chuẩn hóa theo quy trình của tổ chức dịch tễ thế giới

+ Môi trường Frey dành cho phân lập MG:

Môi trường nước thịt (Mycoplasma Broth - MB)(1000 ml):

Thành phần A: Môi trường nước thịt gồm:

PPLO broth base ( Difco) 21g

Nước cất hoặc nước khử ion 700ml

Hấp ở 121oC/15 phút, sau đó làm mát để bổ sung vào thành phần B

Thành phần B:

Huyết thanh lợn (ngựa) ủ ở 56oC/30h 150ml

Sau khi hoàn thiện trộn đều phần 1 và phần 2, đổ đĩa

Chế Fresh Yeast Extract 25%:

Cho 400 ml vào bình lớn (2 lít)

Nhỏ từ từ Nitten Dry Yeast (100g), lắc hoặc dùng khuấy từ làm tan đều

Đun cách thủy ở nhiệt độ 800C trong vòng 20 phút

Làm lạnh

Ly tâm 12.000 v/p trong vòng 20 phút ở 200C

Lấy phần nước trong, chỉnh pH = 7 (dùng NaOH 1N)