Nghiên cứu tổng hợp và hoạt tính sinh học của 6 (2 hydroxy 3 (pyrrolidin 1 yl)propyl) 5h indeno1,2 cisoquinoline 5,11(6h) dione

Tổng họp các dẫn chất indenoisoquinoline nhờ phản ứng ngưng tụ của homophtalic anhydride với các bazơ Schiff.... Tổng họp các dẫn chất indenoisoquinoline dựa trên phản ứng của indeno[l,2

TRƯỜNG ĐẠI HỌC s ư PHẠM HÀ NỘI 2

KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP ĐẠI HỌC

C huyên ngành: H óa học hữu Ctf

Người hướng dẫn khoa học

TS Lục Quang Tấn

HÀ NỘI - 2016

LỜI CẢM ƠN

Khóa luận tốt nghiệp này được hoàn thảnh tại phòng Hóa dược, Viện Hóa học, Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Với tất cả sự kính ừọng và biết ơn chân thành, sâu sắc em xin gửi lời cảm

ơn đến TS Lục Quang Tấn đã định hướng và hướng dẫn em tận tình trong suốt thời gian em làm đề tài khóa luận tốt nghiệp

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS TS Nguyễn Văn Tuyến và các Thầy Cô làm việc tại phòng Hóa Dược, Viện Hóa học, Viện Hàn Lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện giúp đỡ để em được nghiên cứu, học tập và hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp của mình

Em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến ban lãnh đạo trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, ban chủ nhiệm khoa cùng toàn thể các Thầy Cô trong Khoa Hóa học đã hết lòng quan tâm, dìu dắt và giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập tại trường và hoàn thiện khóa luận này

Em xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè đã luôn tạo điều kiện động viên, khích lệ giúp em hoàn thành tốt đề tài nghiên cứu khóa luận tốt nghiệp của mình

Hà Nội, tháng năm 2016

Sinh viên

Nguyễn Thị Phương

LỜI CAM ĐOAN

Em xin cam đoan các kết quả nghiên cứu, số liệu được trình bày trong khóa luận: “Nghiên cứu tổng họp và hoạt tính sinh học của 6-(2-hydroxy-3- (pyrrolidin-1 -yl)propyl)-5H-indeno [ 1,2-c]isoquinoline-5,11 (6H)-dione” dưới

sự hướng dẫn của TS Lục Quang Tấn là hoàn toàn trung thực và không trùng với kết quả của tác giả khác

Hà Nội, tháng năm 2016

Sinh viên

Nguyễn Thị Phưong

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Lí do chọn đề tài 1

2 Mục đích nghiên cứu 3

3 Nhiệm vụ nghiên cứu 3

CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN 5

1.1 Tổng quan về indenoisoquinoline 5

1.1.1 Công thức cấu tạo 5

1.1.2 Mô hình phân tử ttong không gian 5

1.1.3 Công thức phân tử: Ci6H8N 0 2R 5

1.2 Tổng quan về pyrrolidin 5

1.2.1 Công thức cấu tạo 7

1.2.2 Mô hình phân tử trong không gian 7

1.2.3 Công thức phân tử: C4H9N 7

1.3 Các phương pháp tổng họp indenoisoquinoline 7

1.3.1 Các phương pháp chính tổng họp indenoisoquinoline 7

1.3.2 Tổng họp các dẫn chất indenoisoquinoline nhờ phản ứng ngưng tụ của homophtalic anhydride với các bazơ Schiff 8

1.3.3 Tổng họp các dẫn chất indenoisoquinoline dựa trên phản ứng của indeno[l,2-c]isochromen-5,ll-dione với các amin bậc 1 9

1.4 Hoạt tính sinh học của một số dẫn xuất indenoisoquinoline 10

1.4.1 Các dẫn xuất indenoisoquinoline có vòng imdazolyl propyl 10

1.4.2 Các dẫn xuất indenoisoquinoline có vòng morpholinopropyl ở vòng B 11

1.4.3 Các dẫn xuất indenoisoquinoline có nhóm thế ethanol am ino 13

1.5 Tổng quan về các phương pháp nghiên cứu trong tổng họp hữu cơ 14

1.5.1 Phương pháp sắc kí bản m ỏng 14

1.5.2 Chiết 15

1.5.3 Loại bỏ dung môi ở áp suất thấp 16

1.5.4 Sắc kí cột 16

1.5.5 Phương pháp nhồi cột huyền phù 16

1.5.6 Phương pháp lựa chọn chất hấp phụ và dung môi chạy cột sắc k í 16

1.6 Tổng quan về các phương pháp xác định cấu trúc hợp chất hữu c ơ 19

1.6.1 Điểm nóng chảy (M p) 19

1.6.2 Độ quay cực ([a]D) 20

1.6.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonancespectroscopy, NM R) 20

1.6.4 Phổ khối lượng (Mass specừocopy, MS) 21

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 23

2.1 Đối tượng nghiên cứu: 23

2.2 Phương pháp nghiên cứu 23

2.3 Địa điểm nghiên cứu 24

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CÚƯ VÀ THẢO LUẬN 25

3.1 Quy trình tổng họp: 25

3.1.1 Tổng họp indeno[l,2-c]isochromen-5,ll-dione (43) 25

3.1.2 Tổng họp chất 6-allyl-5H-indeno[l,2-c]isoquinoline-5,ll(6H)-dione (44) 26

3.1.3 Tổng họp họp chất 6-(3’-bromo-2’-hydroxypropyl)-5H-indeno[l,2- c]isoquinoline-5,l l(6H)-dione (45) 26

3.1.4 Tổng hợp 6-(2’-hydroxy-3’-(pyrrolidin-l-yl)propyl)-5H-indeno[l,2-c]isoquinoline-5,ll(6H)-dione (46) 26

3.2 Hằng số vật lí và các dữ kiện phổ của các họp chất 27

3.2.1 Họp chất indeno[l,2-c]isochromen-5,ll-dione (43) 27

3.2.2 Họp chất 6-allyl-5H-indeno[l,2-c]isoquinoline-5,ll(6H)-dione

(44) 27

3.2.3 Hợp chất 6-(3’-bromo-2’-hydroxypropyl)-5H-indeno[l,2-c]isoquinoline-5,l l(6H)-dione (45) 28

3.2.4 Hợp chất indenoisoquinoline 4 6 32

3.3 Thử hoạt tính gây độc tế bào của các họp chất được tổng h ọp 32

3.4 Kết quả và thảo luận 34

3.4.1 Họp chất indeno[l,2-c]isochromen-5,ll-dione (43) 34

3.4.2 Họp chất 6-allyl-5H-indeno[l,2-c]isoquinoline-5,ll(6H)-dione (44) 37

3.4.3 Hợp chất 6-(3’-bromo-2’-hydroxypropyl)-5H-indeno[l,2-c]isoquinoline-5,l l(6H)-dione (45) 38

3.4.4 Hợp chất indenoisoquinoline 4 6 41

3.4.5 Hoạt tính gây độc tế bào của họp chất được tổng họp 44

KẾT LUẬN 46

E I-M S Phổ khối lượng va chạm elctron

E S I-M S

Electron Impact Mass Spectrometry Phổ khối lượng phun mù điện tử Electron Spray ionizasion Mass Spectra

IIMBC Heteronuclear Mutiple Bond Connectivity

IIMQC Heteronuclear Mutiple Quantum Coherence

IR Phổ hồng ngoại Infrared Spectroscopy

IC50 Nồng độ mẫu mà tại đó nó có thể ức chế 50% gốc tự do

MS Phổ khối lượng Mass Spectroscopy

NOESY Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy

PTSA p-Toluenesulfonic acid

THF T etrahidrofuran

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ BẢNG BIỂU

Hình 1 : Camptothecin và một số dẫn xuất 2

Hình 2: Indotecan (5) và Indimitecan (6) 3

Hình 3: Mô hình phân tử không gian của indenoisoquinoline 5

Hình 4: mô hình phân tử Pyrrolidin trong không gian 7

Hình 5: Các dẫn xuất indenoisoquinoline có vòng imdazolyl propyl 10

Hình 6: Các dẫn xuất indenoisoquinoline có vòng morpholinopropyl 12

Hình 7: Các dẫn xuất indenoisoquinoline có nhóm thế ethanol amino 13

Hình 8: cấu trúc X-ray đon tinh thể của hợp chất 45 29

Hình 9: Phổ 3H-NMR của họp chất 4 3 35

Hình 10: Phổ 3H-NMR giãn rộng của họp chất 4 3 35

Hình 11 : Phổ 13C-NMR của họp chất 4 3 36

Hình 12: Phổ 13C-NMR giãn rộng của họp chất 4 3 37

Hình 13: Phổ *H-NMR của hợp chất 4 5 39

Hình 14: Phổ 3H-NMR giãn rộng của họp chất 4 5 40

Hình 15: Mô hình cấu trúc phân tử của họp chất 45 theo phưong pháp X-ray tinh thể 41

Hình 16: Phổ *H-NMR của hợp chất 4 6 43

Hình 17: Phổ 3H-NMR giãn rộng của hợp chất 4 6 43

Hình 18: Phổ 13C-NMR của hẹp chất 4 6 44

Sơ đồ 1 : Các con đường tổng họp indenoisoquinoline 8

Sơ đồ 2: Tổng họp dẫn xuất indenoisoquinoline nhờ phản ứng ngưng tụ của homophthalic anhydride với các bazơ Schiff khác nhau 9

Sơ đồ 3: Tổng họp các indenoisoquinoline bằng phản ứng ngưng tụ 2- carboxybenzaldehyde và phthalide 10

Sơ đồ 4: Quy trình tổng hợp họp chất 6(2’hydroxy3 ’(pyưolidin1

-yl)propyl)-5H-indeno[l,2-c]isoquinoline-5,l l( 6H)-dione 25

Sơ đồ 5: Tổng họp indeno[l,2-c]isochromen-5,ll-dione (43) 34

Sơ đồ 6: Sơ đồ tổng họp indenoisoquinoline (44) 38

Sơ đồ 7: Indenoisoquinoline (46) được tổng họp đi từ 6-allyl-5H-indeno[l,2-c]isoquinoline-5,l l( 6H)-dione 38

Sơ đồ 8: Tổng họp các indenoisoquinoline 46 chứa nhóm thế dị vòng n o 42

Bảng 1 : Hoạt tính gây độc (GI50 pM) của các dẫn chất từ 2 9 - 3 1 11

Bảng 2: Hoạt tính gây độc (GI50 |iM) của các dẫn chất từ 32 - 35 13

Bảng 3: Hoạt tính gây độc (GI50 pM) của các dẫn chất từ 36 - 39 14

Bảng 4: Độ dài các liên kết trong họp chất 45 30

Bảng 5: Các góc liên kết ừong họp chất 45 31

Bảng 6: Kết quả hoạt tính gây độc tế bào của các họp chất 45, 4 6 45

MỞ ĐẦU

1 Lí do chon đề tài

Ung thư ngày càng trở nên phổ biến với tốc độ gia tăng nhanh chóng đã

ừở thành mối lo sợ cho bất kỳ ai khi phải đối mặt với căn bệnh này Ung thư

có thể có ở bất kỳ bộ phận nào của cơ thể và phát triển nhanh chóng cùng với nhiều diễn biến bất thường Hiện khoa học đã phát hiện hơn 200 dạng ung thư khác nhau, mỗi loại đều có các triệu chứng, phương pháp điều trị và chuẩn đoán riêng Tại các nước phát triển ung thư là nguyên nhân gây tử vong đứng hàng thứ hai sau tim mạch Ở các nước đang phát triển ung thư đứng hàng thứ

ba sau bệnh nhiễm trùng, ký sinh trùng và tim mạch Theo thống kê của ngành ung thư và Bộ Y tế, mỗi năm Việt Nam có khoảng 150 ngàn ca mới mắc và trên 75 ngàn trường hợp tử vong do ung thư Ước tính trong năm 2020

sẽ có ít nhất gàn 200.000 ca ung thư mới mắc [11]

Hiện nay có rất nhiều phương pháp điều trị ung thư như: phẫu thuật, hóa tri liệu, xạ tri liệu, gene trị liệu, proton tri liệu, miễn dịch trị liệu và một số liệu pháp khác Trong đó, hóa trị liệu đã sử dụng một đích đến là topoisomerase vì topoisomerase bị ức chế sẽ gây chết tế bào ung thư do tế bào này phân chia rất nhanh chóng

Ở sinh vật nhân chuẩn, topoisomerase I (Topl) là một enzym cần thiết cho nhiều quá trình quan trọng của tế bào như phiên mã, sao mã và phân ly vào nhiễm sắc thể Vai trò của Topl là giúp giãn xoắn DNA sợi kép khi DNA thực hiện các quá trình tái bản và phiên mã, trong đó enzym sẽ liên kết cộng hóa trị với DNA cho đến khi đóng xoắn Do đó, nó là mục đích trị liệu tiềm năng trong việc điều trị chống ung thư Có hai con đường có thể ức chế Topl

đó là mất khả năng tháo xoắn các sợi DNA của Top 1 và con đường thứ hai là gây “ngộ độc” enzym bằng cách tạo liên kết cộng hóa trị với DNA dưới dạng phức [5]

Camptothecin (1) được biết đến là chất có khả năng gây ức chế topoisomerase I Các sản phẩm tan trong nước được bán tổng hợp từ campothecin như Topotecan (2), Irinotecan (3) là các chất gây ức chế Topl duy nhất hiện được Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (The Ư.s Foodand Drug Administration) cấp phép làm thuốc chống ung thư [7] Tuy nhiên, hai hợp chất thuốc này còn có nhiều nhược điểm như rất nhanh mất hoạt tính do thủy phân vòng E (vòng lacton) ngay cả trong môi trường pH sinh lý và gây độc với tủy xương [3].

Hình 1: Camptothecin và một số dẫn xuất

Để khắc phục những nhược điểm của Camptothecin và các dẫn xuất, các nhà khoa học đã nghiên cứu tìm kiếm các lớp chất mới có khả năng gây ức chế Topl, trong đó indenoisoquinoline là lớp chất đang được các nhà khoa học quan tâm bởi có tính chất ổn định, khồng bị thủy phân và không gây độc giống như Camptothecin Một số dẫn xuất của indenoisoquinoline như

Indotecan (4) và Indimitecan (5) đã được đưa vào nghiên cứu thử nghiệm lâm

sàng ở giai đoạn II cho thấy có hoạt tính cao hơn so với thuốc chống ung thư

hệ camptothecin nhưng không gây hiệu ứng phụ, đặc biệt bền và không bị thủy phân vì không có vòng lacton

Hình 2: Indotecan (5) và Indimitecan (6)Trên cơ sở đó, khoá luận đã đưa ra mục tiêu là thiết kế tổng hợp các indenoisoquinohne mới có nhóm thế khác nhau ở vòng B khi đưa thêm nhóm hydroxyl vào vị trí thứ 2 của mạch nối propyl còn vị trí thứ 3 là dị vòng pyrrolidin với hy vọng sẽ làm tăng khả năng gây độc tế bào ung thư.

Vói những ý nghĩa cấp thiết và thực tiễn trên, tôi chọn đề tài cho khóa luận tốt nghiệp là: “Nghiên cứu tổng hợp và hoạt tính sinh học của 6-(2- hydroxy-3-(pyrrolidin-1 -yl)propyl)-5H-indeno[l ,2-c]isoquinoline-5,11 (6H)- dione”

2 Mục đích nghiên cứu

Nghiên cứu tổng hợp ra dẫn xuất của indenoisoquinoline nhằm tăng hoạt tính sinh học của các indenoisoquinoline Từ đó tạo cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo ừong lĩnh vực tổng hợp các hợp chất hữu cơ nói chung và nâng cao hoạt tính sinh học cho các dẫn chất của indenoisoquinoline nói riêng, góp phàn vào sự phát triển của y học thế giới cũng như y học Việt Nam hiện đại

về lĩnh vực chống ung thư

3 Nhiệm vụ nghiên cứu

- Nghiên cứu các tài liệu tham khảo liên quan đến đề tài (các đề tài, bài báo cáo khoa học, các công trình khoa học đã làm thành công về đề tài)

- Nghiên cứu các hưởng tổng hợp và xác định cấu trúc của sản phẩm tổng hợp

- Nghiên cứu tổng hợp và hoạt tính sinh học của 6-(2-hydroxy-3-(pyrrolidin- l-yl)propyl)-5H-indeno[l,2-c] isoquinoline-5,1 l( 6H)-dione”

m ' Á _ 1_ Ị _1_ 4 1 Á 3 _ • ? • _ 1_ A 4 Á 1 • A J _ _ Á ỉ _ ĩ _ _ ? _ _ 2 _ _ 1_ A j A _ _ 1 _ _ _

- Tiên hanh đo pho và giải phô đe kiêm tra câu trúc của sản phâm tong hợp

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về indenoisoquinoline

1.1.1 Công thức cẩu tạo

Khung cacbon bao gồm vòng A và B là vòng isoquinoline

và vòng c và D là vòng indeno Danh pháp: 6-R-indeno[l,2-c]isoquinoline-5,ll-dione

1.1.2 Mô hình phân tử trong không gmn

Hình 3: Mô hình phân tử không gian của indenoisoquinoline

1.1.3 Công thức phân tử: C16HsN02R

1.2 Tổng quan về pyrrolidin

Pyrrolidin, còn được gọi là tetrahydropyrrole, là một họp chất hữu cơ với công thức phân tử (CH2)4NH Nó là một amin thứ cấp có vòng, cũng được phân loại như một dị vòng bão hòa Gồm bốn nguyên tử cacbon và một nguyên tử nitơ Vòng Pyrrolidin là cấu trúc trung tâm của amino axit proline

và các dẫn xuất của nó cấu trúc vòng của Pyrrolidin có mặt ở nhiều alkaloid thiên nhiên nhu nicotin và hygrin Nó cũng là cơ sở hình thành các họp chất racetam (ví dụ pừacetam, aniracetam) Các axit amin proline và hydroxyprolin về mặt cấu trúc là các dẫn xuất của Pyrrolidin.

Pyưolidin là một chất lỏng không màu có thể trộn với nước và hầu hết các dung môi hữu cơ Nó được tìm thấy trong lá của thuốc lá, cà rốt và ừong nhiều loại thuốc dược phẩm như procyclidin và bepridil Pyrrolidin được sử dụng rộng rãi trong tổng họp hữu cơ, được sử dụng để kích hoạt các xeton và andehit hình thành các enamines [12]

Pyrrolidin là một amin dị vòng được sử dụng như khối họp chất hoặc cơ

sở để sản xuất hóa chất dược phẩm tinh khiết Nó là một trung gian cơ bản được sử dụng trong phạm vi rộng các ứng dụng ừong tổng họp hữu cơ, hóa chất, dược phẩm, chất màu, chất hóa dẻo, hóa chất chụp ảnh, chất nhũ hoá, chất ức chế ăn mòn, hóa chất cao su và chất đóng rắn cho các nhựa epoxy Nó được sử dụng trong sản xuất Polyurethan như một chất xúc tác Các dẫn xuất của đoạn methylpyrrolidinyl là mô típ cấu trúc phổ biến hiện nay ở một số chất ức chế và đối kháng, bao gồm một loạt các chất ức chế HIV-1 sao chép ngược và histamin thụ thể H3 và dopamin D4 đối kháng Sigma-Aldrich có một lựa chọn lớn Pyrrolidin như khối họp chất dị vòng cho các tổng họp hữu

cơ và hóa dược phẩm, phần lớn trong số đó là có sẵn như racemates hoặc một trong hai dạng enantiomeric [10]

Trong công nghiệp Pyrrolidin được sản xuất bằng cách xử lí 1,4- butanediol với amoniac trên một chất xúc tác oxit

1.2.1 Công thức cấu tạo

H

Pyrrolidin

1.2.2 Mô hình phân tử trong không gian

Hình 4; mô hình phân tử Pyrrolidin ữong không gian

Sơ đồ 1 : Các con đường tổng hợp indenoisoquinoline Phương pháp thứ nhất: Tổng hợp các dẫn chất indenoisoquinoline thông qua phản ứng ngưng tụ của homophthalic anhydride với các bazơ Schiff.Phương pháp thứ hai: Tổng hợp các dẫn chất indenoisoquinoline dựa trên phản ứng của indeno[l,2-c]isochromen-5,ll-dione (28) với các amin bậc 1.Phương pháp thứ ba: Tổng họp các dẫn chất indenoisoquinoline thông qua phản ứng đóng vòng của 3-arylisoquinoline.

Phương pháp thứ tư: Tổng họp các dẫn chất indenoisoquinoline dựa trên phản ứng đóng vòng của dẫn chất styrenic enamit

1.3.2 Tổng hợp các dẫn chất ỉndenoỉsoquỉnolỉne nhờ phản ứng ngưng tụ của homophthalỉc anhydride với các bazơ Schiff

Mark Cushman và các cộng sự đã nghiên cứu tổng họp các dẫn chất của indotecan (4) và indimitecan (5) như mô tả trong sơ đồ 2 Bước chìa khóa tổng họp khung indenoisoquinoline là phản ứng ngưng tụ homophthalic anhydride (19) với bazơ Schiff (21) nhận được axit 22 chọn lọc ở dạng cis

Tiếp theo, cis axit phản ứng với SOCl2 tạo thành clorua axit, sau đó nhờ phản ứng axyl hóa Friedel-Crafts (axyl hóa nội phân tử) nhận được chất 23 Sau cùng họp chất 23 được phản ứng với các amin nhận được các dẫn chất của indotecan (4) và indimitecan (5).

Sơ đồ 2: Tổng họp dẫn xuất indenoisoquinoline nhờ phản ứng ngưng tụ của

homophthalic anhydride với các bazơ Schiff khác nhau

Sơ đồ 2: Tác nhân và điều kiện phản ứng: a) H2CO, H20 , HC1, AcOH, 120°c đến nhiệt độ phòng; (b) (i) KOH, H20 , nhiệt độ phòng, (ii) KMn04, H20 , 0°c đến nhiệt độ phòng, (iii) EtOH, đun hồi lưu; (c) AcCl, đun hồi lưu; (d) 3- bromopropylamine, HBr, Et3N, Na2S 0 4, CHCI3, nhiệt độ phòng; (e) CHCI3, 0°c đến nhiệt độ phòng; (g) S0C12, nhiệt độ phòng; (f) imidazole hoặc morpholine, Nai, DMF, 70°c

1.3.3 Tổng hợp các dẫn chất ỉndenoỉsoquỉnolỉne dựa trên phản ứng của ỉndeno[l,2-c]ỉsochromen-5,ll-dỉone với các amỉn bậc 1

Trước hết để tổng họp các indenoisoquinoline theo phương pháp này, Andrew Morrell, Mark Cushman và cộng sự đã tiến hành tổng hợp indeno[l,2-c]isochromen-5,ll-dione nhờ phản ứng ngưng tụ của 2-

cacboxybenza!dehyde (25) và phthalide (26) với sự có mặt của NaOMe, MeOH tạo thành sản phẩm trung gian (27), sau đó chuyển hóa thành indeno[l,2-c]isochromen-5,ll-dione (28) nhờ phản ứng vòng hóa ừong môi

trường axít chỉ trong một bước phản ứng nhờ thiết bị loại nước Dean-Stark

Tiếp đó, indeno[l,2-c]isochromen-5,ll-dione (28) được chuyển thành

indenoisoquinoline khi phản ứng với amin bậc một (sơ đồ 3)

Sơ đồ 3: Tổng hợp các indenoisoquinoline bằng phản ứng ngưng tụ 2-

carboxybenzaldehyde và phthalideChúng tôi tiến hành tổng hợp hợp chất 6-(2-hydroxy-3-(pyrrolidin-l- yl)propyl)-5H-indeno[l,2-c] isoquinoline-5,ll(6H)-dione theo phương pháp thứ hai này với ưu điểm là ít tạo phản ứng phụ với hiệu suất cao

1.4 Hoạt tính sinh học của một số dẫn xuất ỉndenoỉsoquỉnolỉne

1.4.1 Các đẫn xuất inđenoừoquỉnolỉne có vòng ỉmdazolyl propyl

Hợp chất gốc 6-(3-(lH-imidazol-l-yl)propyl)-6H-indeno[l,2-c]

isoquinoline-5,ll-dione (29) có chứa nhóm thế imidazolyl propyl và hợp chất

có khả năng gây độc tế bào khá thấp (MGM l ,86pM>lpM) Tuy nhiên họp chất gốc này lại có khả năng ức chế Top I khá cao tương đương hoặc hơn Camptothecin

Họp chất 6-(3-(lH-imidazol-l-yl)propyl)-10-methoxy-3-nitro-6H-

indeno[l,2-c]isoquinoline-5,ll-dione (30) đính nhóm thế nitro và nhổm thế

methoxy vào vị trí số 3 và vị trí số 10 của họp chất gốc có khả năng gây độc

tế bào gấp 97 lần so với họp chất chuẩn với giá trị MGM 0,019(iM và là chất gây ức chế Top I cực mạnh

Một số nồng độ ức chế tăng trưởng GI50 của một số loại tế bào ung thư

đã được kiểm nghiệm và chứng minh đối các dẫn xuất có nhóm thế imidazolyl propyl (bảng 1) [5]

Bảng 1: Hoạt tính gây độc (GI50 pM) của các dẫn chất từ 29 - 31

Khối u

ác tính

Buồngtrứng

Tuyên tiền liệt

(ịiM)

Toplcleavage

29 2,69 1,41 2,34 0,79 1,66 1,66 1,41 2,75 1,86 ++++

30 <0,010 <0,010 <0,010 <0,010 0,02 <0,010 <0,010 <0,010 0,019 ++++

31 0,056 0,11 0,178 0,071 1,66 0,676 0,204 0,646 0,416 +++

Khả năng ức chế Top I so với Camptothecin được thể hiện: 0/+ không

phát hiện được hoạt tỉnh, ++ hoạt động yểu, +++hoạt động tương tự

camptothecỉn, ++++VÀ + + + + + hoạt động mạnh hơn rất nhiều so với

camptothecin.

1.4.2 Các dẫn xuất ỉndenoừoquỉnoline có vòng morpholỉnopropyl ở vòng B

Hình 6: Các dẫn xuất indenoisoquinoline có vòng morpholinopropyl Họp chất (9-methoxy-6-(3-morpholinopropyl)-3-nitro-6H-indeno[l,2-c]

isoquinoline-5,ll-dione) (34) có nhóm thế vòng morpholine, đính vị trí số 3

nhóm thế methoxy và vị trí số 9 nhóm thế nitro làm tăng khả năng gây độc tế

bào lên gấp 1000 lần so với họp chất gốc (32) (MGM 0,014pM) và nó là một

chất ức chế Top I mạnh hơn Camptothecin

Một số nồng độ ức chế tăng trưởng GI50 của một số loại tế bào ung thư đã

được kiểm nghiệm và chứng minh đối với họp chất 32 - 35 (bảng 2) [5].

Bảng 2: Hoạt tính gây độc (GI50 |iM) của các dẫn chất từ 32 - 35.

Khối

ác tính

Buồngtrứng

Thận Tuyến tiền liệt

(pM)

Toplcleavage

1.4.3 Các dân xuất indenoừoquinoline có nhóm thê ethanol amino

Hình 7: Các dẫn xuất indenoisoquinoline có nhóm thế ethanol amino

Tất cả các hợp chất ừên đều có chứa nhóm thế ethanol amino mà hoạt tính sinh học lại thể hiện kém hom so với các họp chất vừa đề cập ở trên Khi

đính nhóm thế nitro ở vị trí số 3 ( hợp chất 38) có rất ít ảnh hưởng đến khả

năng gây độc tế bào (MGM 0,296(iM) trong khi thay thế vị trí số 9 bằng

nhóm thế methoxy (hợp chất 39) làm gia tăng đáng kể trong hoạt tính gây độc

nhưng khả năng ức chế Top I rất ít Thêm vào đó là hợp 6-(3- (ethylamino)propyl) -9-methoxy- 3-nitro-6H-indeno [ 1,2-c] isoquinoline-5,11-

dione (37) là đính cả nhóm ni tro ở vị trí số 3 và nhóm methoxy vào vị trí số 9

là tăng đáng kể khả năng gây độc tế bào lên gấp 21 lần so vói hợp chất gốc

(36) với giá trị MGM 0,016(iM và là chất ức chế Top I khá mạnh.

Một số nồng độ ức chế tăng trưởng GI50 của một số loại tế bào ung thư

đã được kiểm nghiệm và chứng minh đối với các dẫn xuất có nhóm thế ethanol amino (bảng 3) [5]

Bảng 3: Hoạt tính gây độc (GI50 pM) của các dẫn chất từ 36 - 39

Khối u

ác tính

Buồngtrứng

tĩnh là chất hấp phụ được chọn phù họp theo từng yêu cầu phân tích, được trải thành lớp mỏng đồng nhất và được cố định trên các phiến kính hoặc phiến kim loại Pha động là một hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần được trộn với nhau theo tỷ lệ quy định trong từng chuyên luận Trong quá trình di chuyển qua lớp hấp phụ, các cấu tử trong hỗn hợp mẫu thử được di chuyển trên lớp mỏng, theo hướng pha động, với những tốc độ khác nhau Kết quả, ta thu được một sắc ký đồ trên lớp mỏng Cơ chế của sự chia tách có thể là cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, sàng lọc phân tử hay sự phối hợp đồng thời của nhiều cơ chế tùy thuộc vào tính chất của chất làm pha tĩnh và dung môi làm pha động Đối với những chất có u v ta kiểm tra ƯV có thể nhận được các vết khác nhau Dựa vào các vết trên bản mỏng cùng với giá thị Rf tương ứng ta có thể nhận biết được phản ứng đã xảy ra hay chưa, nguyên liệu đàu còn hay hết Dựa vào tính chất đó chúng ta có thể tìm được dung môi hoặc hỗn họp dung môi để các chất tách ra khỏi nhau (Rf khác nhau) tìm được hệ dung môi cần để tinh chế các chất.

1.5.2 Chiả

Chiết là quá trình tách và phân li các chất dựa vào quá trình chuyển một chất hòa tan trong một pha lỏng (thường là nước) một pha lỏng khác không hòa tan vào nó (thường là dung môi hữu cơ không hòa tan với nước) Như vậy

ta có quá trình chiết lỏng

Chiết là phương pháp có ứng dụng rất có hiệu quả vào các mục đích tách, phân ly, làm giàu các chất đặc biệt khi cần tách một lượng nhỏ các tạp chất ra khỏi một lượng lớn các chất khác Ưu điểm của quá trình là thực hiện nhanh, thiết bị chiết đơn giản Chọn được dung môi (dung môi chiết CH2C12)

và điều kiện chiết thích họp với chất thử người ta có thể tách được bất kì cấu

tử nào ra khỏi hỗn họp bất kì Trường hợp chất chiết có màu ta có thể sử dụng

phần chiết vào mục đích phân tích định lượng theo các phương pháp đo quang.

1.5.3 Loại bỏ dung môi ở áp suất thấp

Dừng máy cất quay chân không Sau khi loại bỏ dung môi để thu được chất khô hoàn toàn ta dừng máy hút chân không hút làm khô chất

1.5.4 Sắc k í côt m

Nguyên tắc sắc kí cột dựa trên ái lực hấp phụ khác nhau của các chất thử đối với chất hấp phụ để tách các chất riêng ra Nhưng ừong sắc kí cột, chất làm nền cho pha cố định được nhồi ừong ống hình trụ và vì thế mà gọi là sắc

kí cột Với cột hấp phụ người ta có thể triển khai một dung môi liên tục, hoặc một hệ thống các dung môi từ phân cực yếu đến phân cực mạnh

Dụng cụ chủ yếu là cột để nhồi chất hấp phụ để làm thành cột kí Cột có thể là những ống hình trụ dài 30 - 100cm, đường kính từ 1 - 8cm tùy theo chiều dài cột tỉ lệ giữa đường kính

1.5.5 Phương pháp nhồi cột huyền phù

Cột đem dùng phải thật sạch, khi đối với chất hấp phụ là nhôm oxit, có thể dùng phương pháp nhồi cột khô, nghĩa là lắp cột thẳng đứng, chắc chắn

Đổ lượng A120 3 qua phễu, theo một ống đổ vào đáy cột Rót từ từ đều đặn để tạo nên một cột liên tục đều đặn, bằng phẳng không có chỗ rỗng, chỗ dày, chỗ mỏng sau khi rót hết chất nhồi vào cột người ta có thể dùng một đũa thủy tinh đầu gắn với một nút cao su và gõ nhẹ đều vào thảnh cột cho đến khi nhận được một chiều cao nhất định

1.5.6 Phương pháp lựa chọn chất hấp phụ và dung môi chạy cột sắc kí

1.5.5.1 Chọn chất hấp phụ

Thông thường ta sử dụng chất hấp phụ là Silicagel, ngoài ra còn dùng Sephadex, sắc kí ừao đổi ion

1.5.5.2 Lựa chọn dung môi chạy cột sẳc kí

Để lựa chọn dung môi hay hệ dung môi chạy cột sắc kí Silicagel ta phải dựa vào sắc kí lớp mỏng với các bước cơ bản sau:

- Hoà tan hoàn toàn một lượng nhỏ mẫu chạy cột trong dung môi thích họp

- Chuẩn bị 4-H) tấm bản mỏng rồi chấm dung dịch mẫu trên lên mỗi tấm với lượng tương đương nhau

- Mỗi bản mỏng được chạy với loại dung môi có độ phân cực khác nhau Tiếp theo hiện hình dưới đèn ƯV hoặc thuốc thử Với đơn dung môi sẽ dễ dàng thấy được dung môi nào thích họp Từ kết quả đó tìm được hệ dung môi (trong đó có một dung môi kém phân cực và một dung môi phân cực, (ví dụ n-hexan/EtOAc) phù họp để chạy cột sắc kí

- Với mẫu chất được chiết từ cây cỏ (có chứa nhiều chất từ không phân cực đến phân cực), lựa chọn dung môi chạy cột ban đầu là dung môi đẩy vết kém phân cực nhất lên Rf khoảng 0,5 và dung môi chấm dứt sắc kí là dung môi đẩy vết phân cực nhất lên Rf khoảng 0,2 trên bản mỏng

Sau khi chọn được hệ dung môi phù họp ta thực hiện chạy cột sắc kí với hệ dung môi từ kém phân cực tăng dàn đến phân cực

1.5.5.3 Tỉ lệ giữa lượng mẫu chất cần tách với kích thước cột

Các khảo sát thực nghiệm cho thấy muốn tách chất tốt thì khối lượng silicagel (chất hấp phụ) phải lớn hơn khoảng 25 - 50 lần khối lượng của mẫu chất càn tách Với mẫu chất cần tách là những hỗn hợp chất khó tách riêng thì

tỉ lệ này còn cao hơn (khoảng 100 - 200 lần)

1.5.5.4 Tỉ lệ giữa chiều cao lượng Silicagel và đường kính trong của cột sắc kí

Các khảo sát thực nghiệm cũng cho thấy muốn tách chất tốt thì chiều cao của silicagel trong cột và đường kính trong của cột cần đạt tỉ lệ khoảng

10:1.

Muốn biết lượng Silicagel có phù hợp với cột hay không thì cho Silicagel dạng khô (chưa có dung môi) vào cột để quan sát.

1.5.6.5 Cách nạp Silicagel vào cột

Đe việc tách chất được tốt, Silicagel phải được nạp vào cột một cách đồng nhất để hạn chế việc “nứt” cột, bất thường Silicagel được nạp vào cột theo hai cách

a, Nạp Silicagel ở dạng sệt

Cố định cột trên giá Nếu đầu ra của cột không có lớp thuỷ tinh xốp thì

ta cho một lớp bông mỏng vào đáy để ngăn không cho silicagel chảy xuống bình hứng Cho hệ dung môi chạy cột ban đầu vào bình đựng (cốc, ca nhựa) Cân lượng Silicagel cần thiết (đã tính toán xác định được ở trên) cho vào bình đựng đều đặn, mỗi lần một lượng nhỏ và khuấy đều

b, Nạp Silicagel dạng khô

- Cột được giữ thẳng đứng trên giá Cho miếng bông nhỏ vào đáy cột (nếu cột không có lớp thuỷ tinh xốp), rót dung môi chạy cột ban đàu vào khoảng hai phần ba cột

- Cho từ từ Silicagel dạng khô vào cột qua phễu lọc, vừa cho vào vừa gõ nhẹ thành cột Khi lớp Silicagel trong cột cao khoảng 2 cm thì mở nhẹ khoá và cho dung môi chảy xuống bình hứng (dung môi này tiếp tục được rót trở lại đầu cột)

- Sau khi nạp xong, cho dung môi chảy qua vài ba lần để cột được ổn định trước khi nạp mẫu vào

- Thông thường người ta nạp silicagel vào cột ở dạng sệt

c, Cách nạp mẫu vào cột

Có hai phương pháp nạp mẫu vào cột sắc kí là phương pháp khô và phương pháp ướt

* Phương pháp nạp cột khô: