Phân lập và nghiên cứu đặc điểm sinh học của xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng tang (Litsea cubeba (Lour.) Pers

Gần đây, một số nghiên cứu cho thấy các hợp chất chuyển hóa thứ cấp do các chủng xạ khuẩn nội sinh trên cây dược liệu sinh ra rất đa dạng về mặt số lượng và hoạt tính sinh học như: các c

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM -o0o -

VŨ THỊ THÙY

Tên đề tài:

PHÂN LẬP VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA XẠ KHUẨN

NỘI SINH TRÊN CÂY MÀNG TANG (Litsea cubeba (Lour.) Pers.)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy

Khoa : CNSH - CNTP Khóa học : 2012 – 2016

Thái Nguyên, năm 2016

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM -o0o -

VŨ THỊ THÙY

Tên đề tài:

PHÂN LẬP VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA XẠ KHUẨN

NỘI SINH TRÊN CÂY MÀNG TANG (Litsea cubeba (Lour.) Pers.)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy

Lớp : K44 - CNSH Khoa : CNSH - CNTP Khóa học : 2012 – 2016 Giảng viên hướng dẫn:

1 TS Phí Quyết Tiến Viện CNSH – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2 ThS Bùi Đình Lãm Khoa CNSH – CNTP – Trường ĐH Nông Lâm Thái Nguyên

Thái Nguyên, năm 2016

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu trong luận văn này, tôi đã nhận được sự giúp đỡ tận tình của các thầy cô và cán bộ Phòng Công nghệ Lên men, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Phí Quyết Tiến – Phó viện trưởng Viện Công nghệ Sinh học, Trưởng phòng Công nghệ Lên men, Viện Công nghệ Sinh học, người đã tận tình hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới NCS Vũ Thị Hạnh Nguyên – cán bộ phòng Công nghệ Lên men, người đã trực tiếp hướng dẫn tôi thực hiện đề tài nghiên cứu

Đồng thời tôi cũng xin cảm ơn CN Nguyễn Phú Tâm cùng các cán bộ Phòng Công nghệ Lên men đã chỉ bảo tôi nhiệt tình, giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện tốt nghiệp

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn ThS Bùi Đình Lãm cùng các thầy cô giáo trong Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, cùng các thầy cô, cán bộ trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã đồng hành cùng tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu

Cuối cùng, tôi cũng xin chân thành cám ơn bạn bè, gia đình, những người đã giúp đỡ, động viên và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực tập này

Thái Nguyên, ngày 20 tháng 6 năm 2016

Sinh viên

Vũ Thị Thùy

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Các chất kháng sinh mới từ xạ khuẩn nội cộng sinh trên cây dược liệu 11 Bảng 2.2 Tổng hợp một số nghiên cứu trên thế giới về các loài xạ khuẩn nội sinh trên thực vật 14 Bảng 3.1 Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 21 Bảng 3.2: Trình tự cặp mồi được sử dụng trong phản ứng PCR khuếch đại gen 16S rDNA 26 Bảng 4.1 Đặc điểm hình thái của một số chủng xạ khuẩn nội sinh điển hình phân lập từ các mẫu cây Màng tang 28 Bảng 4.2 Số liệu thống kê khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của 45 chủng xạ khuẩn nội sinh phân lập từ cây Màng tang 32 Bảng 4.3 Khả năng sinh anthracycline của các chủng xạ khuẩn 34 Bảng 4.4 Màu sắc khuẩn lạc của chủng MPT25 khi nuôi cấy trên các môi trường khác nhau 36 Bảng 4.5 Khả năng đồng hóa nguồn carbon, nguồn nitơ của chủng xạ khuẩn MPT25 sau 7-14 ngày nuôi cấy ở 30°C 37 Bảng 4.6 Ảnh hưởng của nồng độ NaCl, nhiệt độ, pH đến sinh trưởng của chủng MPT25 38 Bảng 4.7 Phân tích trình tự gen mã hóa gen mã hóa 16S rDNA của chủng xạ khuẩn MPT25 39

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 2.1 Cấu trúc của một số kháng sinh điển hình thuộc nhóm anthracycline: DOX, DNR, EPI, IDA 17 Hình 4.1 Hình ảnh khuẩn lạc đại diện của các chủng xạ khuẩn nội sinh trên

ba môi trường đặc hiệu và 3 bộ phận khác nhau sau 4 tuần nuôi cấy (A-Rễ, Thân, C-Lá) 27 Hình 4.2 Tỷ lệ xạ khuẩn nội sinh được phân bố trên các bộ phận của cây Màng tang 29 Hình 4.3 Tỷ lệ xạ khuẩn nội sinh phân theo các môi trường phân lập 30 Hình 4.4 Tỷ lệ các chủng xạ khuẩn nội sinh được phân theo nhóm màu 31

B-Hình 4.5 Hoạt tính kháng Bacillus cereus ATCC 11778 (A), Pseudomonas

aeruginosa CNLM (B) của các chủng xạ khuẩn nội sinh 33

Hình 4.6 Hình thái khuẩn lạc trên môi trường ISP4(A), hình ảnh bề mặt chuỗi bào tử dưới kính hiển vi có độ phóng đại 5.000 lần (B) và 20.000 lần (C) của chủng MPT25 36 Hình 4.7 Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen 16S rDNA trên gel agarose 1,0% 39

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

3 DNA Deoxyribonucleotide acid

8 NaOCl Sodium hypochlorite

10 SPA Sodium propionate-asparagine-salt agar

MỤC LỤC

PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích nghiên cứu 2

1.3 Mục tiêu nghiên cứu 2

1.4 Ý nghĩa của đề tài 2

1.4.1 Ý nghĩa khoa học 2

1.4.2 Ý nghĩa trong thực tiễn 3

PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Xạ khuẩn nội sinh trên cây dược liệu 4

2.1.1 Khái niệm xạ khuẩn nội sinh trên cây dược liệu 4

2.1.2 Đặc điểm sinh học và phân loại xạ khuẩn 5

2.1.3 Phân lập xạ khuẩn nội sinh 7

2.1.4 Cơ chế nội sinh của xạ khuẩn trong thực vật 8

2.1.5 Ứng dụng của xạ khuẩn nội sinh trên thực vật 9

2.2 Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh 13

2.2.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 13

2.2.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 15

2.3 Khả năng sinh các chất kháng sinh thuộc nhóm anthracycline 16

2.4 Cây Màng tang và tiềm năng phân lập xạ khuẩn nội sinh 18

PHẦN 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 20

3.1 Vật liệu nghiên cứu 20

3.1.1 Thu thập mẫu cây Màng tang, chủng gống vi sinh vật 20

3.1.2 Hóa chất 20

3.1.3 Thiết bị 21

3.1.4 Môi trường nuôi cấy 21

3.2 Địa điểm và thời gian tiến hành 21

3.3 Nội dung nghiên cứu 22

3.4 Phương pháp nghiên cứu 22

3.4.1 Lấy mẫu cây Màng tang 22

3.4.2 Phương pháp xử lý bề mặt mẫu 22

3.4.3 Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của xạ khuẩn 22

3.4.4 Đánh giá khả năng sinh anthracycline 23

3.4.5 Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng xạ khuẩn MPT25 23

3.4.6 Phân loại chủng xạ khuẩn MPT25 dựa trên phân tích trình tự gen 16S rDNA 25

PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27

4.1 Phân lập xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng tang thu thập tại tỉnh Phú Thọ 27

4.2 Sự đa dạng xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng tang 29

4.2.1 Đa dạng xạ khuẩn nội sinh theo bộ phận của cây Màng tang 29

4.2.2 Đa dạng xạ khuẩn trên cây Màng tang theo môi trường phân lập 30

4.2.3 Đa dạng xạ khuẩn nội sinh đánh giá theo nhóm màu khuẩn ty 31

4.3 Khả năng sinh kháng sinh của các chủng xạ khuẩn nội sinh 32

4.3.1 Khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của xạ khuẩn 32

4.3.2 Khả năng sinh tổng hợp chất thuộc nhóm anthracycline 34

4.4 Đặc điểm sinh học và phân loại của chủng xạ khuẩn MPT25 35

4.4.1 Đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn MPT25 35

4.4.2 Phân loại dựa trên xác định trình tự gen mã hóa 16S rDNA của chủng xạ khuẩn MPT25 38

PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHẦN 1

MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Ngày nay, con người đang phải đối mặt với nhiều dịch bệnh gây ra bởi

vi khuẩn, nấm, virus và các vi sinh vật khác Để điều trị các bệnh truyền nhiễm gây ra bởi vi sinh vật, kháng sinh được sử dụng là chủ yếu Tuy nhiên,

vi khuẩn gây bệnh có khả năng kháng thuốc kháng sinh đang là vấn đề nghiêm trọng và thu hút mối quan tâm hàng hàng đầu của cộng đồng Vì vậy, việc nghiên cứu lựa chọn các tác nhân kháng khuẩn mới từ tự nhiên là ưu tiên hàng đầu của các nhà khoa học và các công ty dược phẩm trên thế giới Cho đến nay, các nhà khoa học vẫn không ngừng tìm kiếm các nguồn hợp chất tự nhiên khác nhau để phát triển các loại thuốc kháng sinh cũng như các loại thuốc khác nhằm chăm sóc sức khỏe cộng đồng, giảm thiểu những tác dụng phụ tới sức khỏe của người bệnh do một số thuốc tổng hợp hóa học gây ra

Theo nghiên cứu của Berdy, 2005 ước tính khoảng 70% các kháng sinh

có nguồn gốc tự nhiên được sử dụng trong y học lâm sàng hiện nay được sản sinh bởi xạ khuẩn [10] Gần đây, một số nghiên cứu cho thấy các hợp chất chuyển hóa thứ cấp do các chủng xạ khuẩn nội sinh trên cây dược liệu sinh ra rất đa dạng về mặt số lượng và hoạt tính sinh học như: các chất kiểm soát sinh học, các chất kháng vi sinh vật, kháng ung thư, chống oxy hóa, chống sốt rét, chất diệt cỏ,chất kích thích sinh học và kiểm soát sinh học… [9, 48] Hơn nữa, nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh cho thấy vai trò chức năng của chúng đây

là một cách tiếp cận đầy hứa hẹn để khắc phục những mối đe dọa gia tăng của kháng thuốc, chống lại tác nhân gây bệnh cho con người và thực vật Tuy nhiên,

so với sự đa dạng của thế giới thực vật, số lượng các nghiên cứu về xạ khuẩn nội sinh trên thực vật vẫn còn rất hạn chế

Một trong những nguồn phân lập xạ khuẩn nội sinh là thực vật, đặc biệt

là cây dược liệu Trong số đó, cây Màng tang (Litsea cubeba) là loài dược liệu

đã được trồng lâu để khai thác với nhiều công dụng như: kháng khuẩn, kháng nấm, nhức đầu, đau dạ dày, đầy hơi, phong thấp… Ngoài giá trị khoa học do thành phần của cây mang lại, qua khảo sát ban đầu cho thấy cây Màng tang còn là môi trường cho các xạ khuẩn nội sinh có khả năng sinh tổng hợp chất kháng sinh, chất chống ung thư Tuy nhiên, số lượng các nghiên cứu về xạ khuẩn trên cây Màng tang nói riêng và cây dược liệu nói chung tại Việt Nam

vẫn còn rất hạn chế Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài: “Phân lập và nghiên cứu đặc điểm sinh học của xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng tang (Litsea cubeba (Lour.) Pers.)”

1.2 Mục đích nghiên cứu

Phân lập, tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có khả năng tổng hợp các chất kháng khuẩn và nghiên cứu đặc điểm sinh học, phân loại của một chủng

xạ khuẩn sinh tổng hợp kháng sinh cao

1.3 Mục tiêu nghiên cứu

Phân lập và đánh giá khả năng sinh tổng hợp kháng sinh một số các

chủng xạ khuẩn nội sinh trên cây Màng tang (Litsea cubeba (Lour.) Pers.) thu

ung thư Từ đó, đưa ra một số cơ sở khoa học về mặt lý thuyết và cơ chế nội sinh của các chủng xạ khuẩn trên mô tế bào cây Màng tang Đồng thời, đánh giá khả năng kháng vi sinh vật gây bệnh của các chủng xạ khuẩn nhằm tìm ra chất kháng sinh, kháng ung thư mới

1.4.2 Ý nghĩa trong thực tiễn

- Kết quả nghiên cứu là tiền đề cho nghiên cứu tìm kiếm các chất có hoạt tính sinh học ứng dụng trong lĩnh vực y học, hóa dược

- Giúp sinh viên củng cố và hệ thống hóa lại kiến thức đã học và nghiên cứu khoa học, tác phong và kỹ năng làm việc sau này

- Giúp sinh viên biết cách đặt vấn đề, đưa ra phương pháp nghiên cứu,

xử lý, phân tích số liệu và trình bày một đề tài khoa học

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Xạ khuẩn nội sinh trên cây dƣợc liệu

2.1.1 Khái niệm xạ khuẩn nội sinh trên cây dược liệu

Khái niệm xạ khuẩn nội sinh được đưa ra khi Smith và cộng sự (1957)

đã phân lập thành công xạ khuẩn Micromonospora sp có khả năng ức chế mạnh nấm Fusarium oxyporum f sp Lycopersici [55] Từ đó, có rất nhiều

định nghĩa khác nhau về vi sinh vật (VSV) nội sinh, theo Bacon và White (2000) định nghĩa: “VSV nội sinh là những VSV sinh trưởng trong mô tế bào thực vật, không gây ra hiệu ứng xấu tới cây chủ” đã được các nhà VSV học thừa nhận [9]

Xạ khuẩn nội sinh ngày càng thu hút sự quan tâm của các nhà phân loại học, sinh thái học, nông học, hóa học và sinh học tiến hóa bởi khả năng sản xuất ra một loạt các chất chuyển hóa thứ cấp bao gồm: kháng sinh, kháng u và kích thích sự tăng trưởng của thực vật - yếu tố quan trọng trong ngành công nghiệp dược phẩm và nông nghiệp [21] Xạ khuẩn cũng đã được chứng minh khả năng tăng cường, thúc đẩy tăng trưởng của cây chủ, giảm nguy cơ nhiễm mầm bệnh và tăng cường khả năng sống sót của cây chủ trong các điều kiện khác nhau [3]

Sự đa dạng của xạ khuẩn nội sinh trong mô thực vật là rất phong phú, hứa hẹn tiềm năng khai thác các hợp chất có hoạt tính sinh học do các chủng

xạ khuẩn này sinh ra trong nhiều lĩnh vực của đời sống Các hợp chất có hoạt tính sinh học từ xạ khuẩn nội sinh được chứng minh là rất đa dạng về mặt số lượng Vì vậy, nghiên cứu sàng lọc các hợp chất có hoạt tính sinh học nói chung và hoạt tính kháng sinh nói riêng từ xạ khuẩn nội sinh trên cây dược liệu tự nhiên đang là hướng nghiên cứu triển vọng của các nhà khoa học trên thế giới

2.1.2 Đặc điểm sinh học và phân loại xạ khuẩn

Theo hệ thống phân loại hiện nay xạ khuẩn thuộc ngành Tenericutes

(gồm vi khuẩn Gram dương và xạ khuẩn), thuộc giới vi khuẩn thật

(Eubacteria) và siêu giới nhân sơ nhóm Prokaryota [51] Xạ khuẩn nội sinh

sống trong các cơ quan khác nhau (rễ, thân, lá, hoa, quả và hạt) của cây chủ

và chủ yếu cư trú trong khoảng không giữa các mô hoặc nội bào Đáng chú ý, trong số gần 300.000 loài thực vật trên trái đất, mỗi loài thực vật là nơi cư trú của một hoặc nhiều loài xạ khuẩn nội sinh tạo ra sự đa dạng sinh học rất lớn [56] Tuy nhiên, mới chỉ có một vài loài thực vật được nghiên cứu để tìm ra các loài xạ khuẩn mới

2.1.2.1 Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn

* Đặc điểm hình thái tế bào, bào tử

Năm 1957, Gauze và cộng sự đã công bố hệ thống phân loại mới Hệ thống này dựa vào màu sắc khuẩn ty khí sinh (KTKS), khuẩn ty cơ chất (KTCC), hình dạng bào tử và cuống sinh bào tử Hệ thống này cũng được chỉnh lí và tái bản năm 1983 [26] Số lượng hệ thống phân loại xạ khuẩn ngày một tăng trong những năm gần Đó là hình thức phân loại truyền thống dựa trên đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy

Theo Pridham và cộng sự chia cuống sinh bào tử xạ khuẩn chia thành 3 nhóm: RF cho những cuống sinh bào tử thẳng và lượn sóng; RA cho những cuống sinh bào tử xoắn, thô sơ và ngắn; S cho những cuống sinh bào tử phát triển mạnh và xoắn Bề mặt bào tử thành 5 dạng chính Sm (trơn nhẵn), sp (gai), wa (xù xì), ru ( nếp nhăn), ha (tóc) [42]

* Đặc điểm sinh lý – sinh hóa

Đặc điểm sinh lý, sinh hóa là khả năng đồng hóa các nguồn cacbon và nitơ, nhu cầu các chất kích thích sinh trưởng, khả năng biến đổi các chất khác

nhau nhờ hệ thống enzyme Ngoài ra còn có nhu cầu về oxy, giới hạn pH, nhiệt độ tối ưu, khả năng chịu muối và các yếu tố khác của môi trường, mối quan hệ với chất kìm hãm sinh trưởng và phát triển khác nhau, tính chất đối kháng và nhạy cảm với chất kháng sinh, khả năng tạo thành chất kháng sinh

và các sản phẩm trao đổi chất đặc trưng khác của xạ khuẩn

2.1.2.2 Phân loại xạ khuẩn bằng phân tích trình tự gen 16S rDNA

Từ những năm 80 trở lại đây, với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học phân tử, các nhà khoa học đã có một công cụ mới để phân loại sinh vật đó là phân loại học phân tử Phương pháp này có ưu điểm là thời gian ngắn và có

độ chính xác cao Phân loại học phân tử có thể dựa trên các gen hoặc các sản phẩm của gen Trong hệ thống phân loại xạ khuẩn hiện nay, thường sử dụng 3 phương pháp chính là lai DNA, lai RNA và phân tích trình tự gen mã hóa 16S rDNA [1]

Hiện nay, việc nghiên cứu rDNA là phương pháp hữu hiệu nhất để xác định mối quan hệ trên cây phát sinh chủng loại, vì rDNA có mặt trong tất cả các sinh vật, có chức năng xác định và có tính bảo thủ cao [41] Chúng chỉ khác nhau rất ít giữa các nhóm sinh vật Tuy nhiên, dựa vào sự khác nhau này người ta có thể đánh giá được mối quan hệ phát sinh chủng loại và phân loại các chủng VSV Trong tế bào VSV nhân sơ, ribosome tồn tại trong tế bào chất Ribosome có cấu trúc gồm 2 tiểu phần, mỗi tiểu phần gồm có rDNA và protein riêng rẽ Ribosome ở VSV nhân sơ có hằng số lắng 70S gồm 2 tiểu đơn vị 50S (gồm rDNA 5S, rDNA 23S và 31 phân tử protein) và 30S (gồm rDNA 16S và 21 phân tử protein) [1]

Các gen mã hóa 5S rSNA, 16S rDNA, 23S rDNA nằm cạnh nhau, có cùng một operon và có cơ chế điều hòa chung Trong các loại rDNA thì 16S rDNA là phù hợp nhất cho nghiên cứu phân loại xạ khuẩn vì gen mã hóa 16S

rDNA có kích thước khoảng 1540 bp phù hợp cho nghiên cứu phân loại; còn gen mã hóa 5S rDNA có kích thước khoảng 120 bp, tuy dễ xác định trình tự nhưng lại không đặc hiệu cho phân loại; còn gen mã hóa 23S rDNA cũng là một gen tiềm năng cho phân tích so sánh trình tự để phân loại sinh vật nhân

sơ nhưng trình tự của gen này lại tương đối lớn 2900 bp, gây khó khăn cho tách dòng và phân tích trình tự nên ít được sử dụng hơn

Keswani và cộng sự đã chứng minh rằng nếu sự tương đồng giữa hai trình tự 16S rDNA là 98,6% thì xác suất để mức độ giống trong phép lai DNA thấp hơn 70% sẽ là 99% [57] Vì thế giá trị tương đồng 98,6% của trình tự 16S rDNA được coi là ngưỡng để phân biệt hai loài khác nhau Tuy nhiên, cũng có nhiều nhà khoa học lấy giá tri này là 98%

2.1.3 Phân lập xạ khuẩn nội sinh

Xạ khuẩn cư trú trong mô thực vật bị ảnh hưởng lớn bởi các yếu tố môi trường như: pH của đất, thành phần chất vô cơ và chất hữu cơ trong đất, lượng mưa, cường độ ánh sáng mặt trời, không khí, nhiệt độ

Trên bề mặt tế bào thực vật chứa rất nhiều vi khuẩn, nấm Do đó, trong quá trình phân lập xạ khuẩn nội sinh, ta cần xử lý bề mặt mẫu thực vật thật

kỹ, tránh bị nhiễm VSV cũng như tăng độ thuần chủng của loài xạ khuẩn nội sinh phân lập Trong quá trình khử trùng bề mặt mẫu, đầu tiên ta rửa mẫu dưới vòi nước chảy liên tục để rửa trôi vi khuẩn, vi nấm bề mặt, để khô, cắt nhỏ mẫu bằng dụng cụ đã được khử trùng trước khi phân lập Sodium hypochlorite (NaOCl) là một trong những tác nhân oxy hóa phổ biến được sử dụng để khử trùng bề mặt Mẫu thực vật được ngâm trong ethanol 70-99% từ 1-5 phút và 1-5% NaOCl trong khoảng 3-20 phút, tiếp theo rửa nhiều lần bằng nước vô trùng nhằm loại bỏ lượng NaOCl còn dư Ngoài ra, hydro peroxide và clorua thủy ngân cũng được sử dụng như chất khử trùng bề mặt

hiệu quả [38] Qua nhiều nghiên cứu thực nghiệm cho thấy xử lý bề mặt chỉ với ethanol không hiệu quả với quá trình phân lập VSV nội sinh Nếu tăng gấp hai hoặc ba lần các bước khử trùng bề mặt bằng hỗn hợp ethanol và một

số chất khử trùng khác thì không phân lập được xạ khuẩn nội sinh Hiệu quả khử trùng bề mặt được tăng cường bằng việc sử dụng các chất hoạt hóa bề mặt như Tween 20 và Tween 80, làm tăng hiệu quả tác động của chất khử trùng với bề mặt thực vật [11]

Phần mẫu đã khử trùng được đặt vào trên môi trường thạch thích hợp, nuôi cấy ở nhiệt độ thích hợp từ 25-30°C Trong quá trình phân lập, hai tuần đầu tiên VSV phát triển mạnh là vi khuẩn hoặc nấm tạp nhiễm trên phần mẫu thực vật Để ngăn chặn sự sinh trưởng của vi khuẩn và nấm không mong muốn cũng như tìm kiếm loài xạ khuẩn mới, một số môi trường chọn lọc đã được sử dụng như: môi trường thạch humic acid-vitamin, môi trường thạch casein tinh bột, cao nấm men,… [12, 32, 36] Ngoài ra, bổ sung các hợp chất kháng sinh như acid nalidixic và trimethoprim, nystatin hoặc cycloheximide

để ức chế vi khuẩn, nấm nội sinh và nâng cao khả năng phát triển chọn lọc của xạ khuẩn vì xạ khuẩn phát triển chậm hơn so với vi khuẩn và nấm [27]

2.1.4 Cơ chế nội sinh của xạ khuẩn trong thực vật

Trước những lợi ích mà xạ khuẩn nội sinh mang lại, ngày càng có nhiều nhà khoa học nghiên cứu về mối quan hệ giữa xạ khuẩn và thực vật cũng như cơ chế nội sinh của chúng trong thực vật Theo nhiều nghiên cứu cho thấy vi khuẩn thường xâm nhập vào mô thực vật qua lỗ khí, vết thương,

lỗ hổng trên bề mặt, khu vực rễ phụ và biểu bì bị phân cắt bằng cách hình thành cụm tế bào của chúng [28] Hầu hết xạ khuẩn hình thành hệ sợi mọc trên bề mặt cây và xâm nhập vào vật chủ thông qua lỗ hở tự nhiên và các vết

thương do cơ học hoặc côn trùng Chủng xạ khuẩn Streptomyces scabies hình

thành mạng lưới phủ trên bề mặt khoai tây Sợi nấm xâm nhập vào củ khoai tây thông qua lỗ hổng trên bề mặt cây non và các vết thương khi khoai tây đang ở giai đoạn phát triển mạnh Sau khi xâm nhập, các tác nhân gây bệnh phát triển trong các khoảng trống của tế bào và phý hủy các tế bào mà chúng

tiếp xúc Ngoài ra, chủng Streptomyces ipomoeae cũng gây bệnh thối ở củ

khoai tây bằng cách phát triển trên bề mặt rễ và xâm nhập vào rễ thông qua các mô ở vị trí liên kết giữa các tế bào [15] Loài này hình thành hệ sợi phân nhánh từ sợi chính và xâm nhập trực tiếp vào thành tế bào chủ

Từ đó, nhiều nhà khoa học đã đưa ra các hình ảnh mô tả sự hiện hiện của các sợi nấm trong thực vật, tuy nhiên phương thức xâm nhập và cơ chế nội sinh của VSV nội sinh vẫn là một ẩn số Năm 2003, Coombs và Franco đã

gắn protein huỳnh quang xanh vào chủng Streptomyces sp EN27 cấy vào hạt

lúa mì để nghiên cứu sự hình thành, phát triển của chúng trong cây chủ [17] Kết quả, tuy không chứng minh được giai đoạn xâm nhập ban đầu của xạ khuẩn nội sinh vào vật chủ nhưng cũng khẳng định được xạ khuẩn nội sinh xâm nhập vào cây chủ từ rất sớm, và có thể xâm nhập qua phôi của vỏ hạt rồi

mở rộng ra các nội nhũ của hạt Năm 2007, Franco tiếp tục quan sát khuẩn lạc của chủng EN27 tại các vết nứt xung quanh rễ và quá trình hình thành bảo tử trong 3-4 tuần [20] Kết quả cho thấy sự lây nhiễm của chúng vào rễ thông qua các vết nứt để xâm nhập và nhân lên trong các mô tế bào

2.1.5 Ứng dụng của xạ khuẩn nội sinh trên thực vật

Phần lớn xạ khuẩn nội sinh có thể sống trong các mô thực vật và không gây bệnh hoặc tác động bất lợi tới quá trình phát triển bình thường của cây Ngoài ra, xạ khuẩn nội sinh còn được nhiều nhà khoa học nghiên cứu về khả năng sinh kháng sinh, chất kháng ung thư, enzyme, chất kích thích sinh trưởng thực vật, ức chế và kiểm soát bệnh thực vật…

2.1.5.1 Kháng ung thư, kháng sinh

Trong những năm gần đây, nhu cầu tìm kiếm chất có hoạt tính kháng, ức chế

tế bào ung thư từ xạ khuẩn nội sinh đang là hướng nghiên cứu mới của các nhà khoa học trên thế giới Li J và cộng sự khi nghiên cứu chất chống ung thư và hoạt tính kháng khuẩn của xạ khuẩn nội sinh trên cây dược liệu trong rừng nhiệt đới đã

xác định được 41 chủng xạ khuẩn nội sinh Streptomyceps có khả năng kháng ung

thư 31,7% trong số chúng biểu hiện hoạt động gây độc trên các tế bào A549, 29,3% trên các tế bào HL-60, 85,4% trên các tế bào BEL-7404 và 90,2% trên các

tế bào P388D1 [34]

Chất kháng sinh đã được phát hiện và ứng dụng để chữa bệnh cho con người Nhờ kháng sinh mà chúng ta đã đẩy lùi được nhiều bệnh và dịch bệnh nguy hiểm do vi khuẩn hay nấm gây ra như: thương hàn, tả, đậu mùa… Xạ

khuẩn, đặc biệt là các loài thuộc chi Streptomyces được xem là nguồn sản

xuất chất kháng sinh nhiều nhất [44] Trong số các tác kháng sinh được biết trên thế giới, 80% là do xạ khuẩn sinh ra [18] Nhiều loại xạ khuẩn nội cộng sinh, đặc biệt là những loài từ cây dược liệu có khả năng ức chế, tiêu diệt nhiều loại VSV gây bệnh như vi khuẩn, nấm, virus Do đó, xạ khuẩn nội sinh

có tiềm năng để phát triển các loại thuốc kháng sinh mới Bảng dưới đây cho thấy tiềm năng sinh chất kháng sinh của xạ khuẩn nội sinh phân lập từ cây dược liệu (Bảng 2.1)

Bảng 2.1 Các chất kháng sinh mới từ xạ khuẩn nội sinh trên

24-demethyl-Kháng sinh Kháng ung thư

Do vậy, hiện nay xạ khuẩn nội sinh là nguồn tiềm năng cần được quan tâm nhằm khai thác các chất có hoạt tính sinh học mới và thúc đẩy tìm kiếm các

loại thuốc mới

2.1.5.2 Kháng nấm, kháng viêm

Hoạt tính kháng nấm của các chủng xạ khuẩn nội sinh đã được nghiên cứu

19 chủng xạ khuẩn được phân lập từ lá nim, bạch đàn và hat cà phê đã được sử dụng để xác định hoạt tính chống nấm Chủng NEK5 (từ lá nim), EE9 (bạch đàn)

và CE1 (hạt cà phê) cho thấy hoạt tính chống nấm tốt Dịch chiết ethyl acetate thu

nhận từ môi trường thạch nuôi cấy với chủng NEK5, EE9 và CE1 ức chế sự tăng

trưởng của các mầm bệnh như Fusarium sp, Pythium sp, Curvularia sp và

Cercospora sp [62]

Các chất chuyển hóa từ 23 chủng Streptomycetes cho thấy hoạt tính kháng nấm Nấm men (S cerevisiae) nhạy cảm với hầu hết các chất chiết từ xạ khuẩn nội sinh, mặc dù Candida albicans kháng với hầu hết các sản phẩm Các hợp chất

từ xạ khuẩn nội sinh Streptomycetes có thể ngăn chặn sự phát triển của nấm: (F

oxysporum, Cladosporium fulvum, và R Solani [33]

2.1.5.3 Kiểm soát sinh học

Trong những năm gần đây, xạ khuẩn nội sinh đã thu hút sự chú ý của các nhà VSV bởi khả năng kiểm soát sinh học đối với mầm bệnh do đặc tính nội sinh và tổng hợp sản phẩm trao đổi chất kháng VSV gây bệnh Cơ chế kiểm soát sinh học tập trung chủ yếu vào các sản phẩm trao đổi chất như chất kháng sinh, enzyme thủy phân, phytohormone Ngoài ra, các chủng xạ khuẩn giúp tăng cường hệ thống miễn dịch đối với thực vật nhờ kích thích các thụ thể tế bào

Conn và cộng sự (2008) công bố kết quả nghiên cứu gây nhiễm

Streptomyces sp EN27 và Micromonospora sp EN43 trên hạt giống cây Arabidopsis thaliana nhằm làm tăng sức đề kháng chống lại nấm bệnh Erwinia carotovora và F oxysporum; kích hoạt biểu hiện gen tổng hợp acid

jasmonic, acid salicilic và etylen [16] Mối liên hệ giữa xạ khuẩn nội sinh với các cây chủ và các sản phẩm tự nhiên có hoạt tính sinh học được sinh ra bởi

xạ khuẩn nội sinh giúp tìm ra các loại thuốc đặc hiệu có tiềm năng ứng dụng trong bảo vệ và tăng năng suất cây trồng

2.1.5.4 Một số dược chất khác từ xạ khuẩn nội sinh

Ngoài đóng vai trò quan trọng trong chu trình tuần hoàn vật chất thông qua các enzyme thủy phân ngoại bào và khả năng sinh chất kháng sinh đã

được khoa học biết đến từ lâu Gần đây, các nghiên cứu trên xạ khuẩn còn phát hiện ra nhiều sản phẩm trao đổi chất của nhóm VSV này có ý nghĩa rất quan trọng đối với sức khỏe con người

Một số chủng xạ khuẩn có khả năng sinh chất phá hủy tế bào hồng cầu

của động vật (như haemolysin ở Rhodococcus equi) Các nhà khoa học đã

phát hiện tiềm năng rất lớn của các hợp chất này trong xạ khuẩn có tác dụng làm tan những phần máu đông tụ ở những người bị bệnh tim mạch Trong phòng thí nghiệm, việc sàng lọc các chất có hoạt tính chống đông máu (phá hủy hồng cầu) từ xạ khuẩn được tiến hành trên mẫu máu động vật như máu ngựa, máu thỏ [50]

Mặc dù ý nghĩa khoa học của các hợp chất trao đổi chất kể trên đối với

sự sinh trưởng và cạnh tranh của xạ khuẩn trong môi trường tự nhiên còn chưa rõ ràng nhưng tác dụng mà chúng mang lại trong lĩnh vực y dược, dược phẩm, nông nghiệp đã được chứng minh Chính vì lý do này, các nhà khoa học hiện nay rất quan tâm tới việc sàng lọc các hợp chất có hoạt tính sinh học cao từ xạ khuẩn nói chung và xạ khuẩn nội sinh nói riêng

2.2 Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh

2.2.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Trong vài thập kỷ qua đã chứng kiến nhiều thành tựu trong tìm kiếm các loài xạ khuẩn và các hợp chất mới có hoạt tính sinh học từ xạ khuẩn trong

mô tế bào thực vật Sơ lược về tình hình nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh trên thực vật trong hơn 10 năm gần đây được thể hiện trong bảng 2.2

Bảng 2.2 Tổng hợp một số nghiên cứu trên thế giới về các loài xạ khuẩn

nội sinh trên thực vật

Cam thảo nam (Scoparia

Thanh hoa hoa vàng

[64]

Xạ khuẩn đã được phân lập từ thân và rễ của nhiều loài thực vật như: lúa mì, gạo, khoai tây, cà rốt, cà chua và cam quýt [8], [40]… các loài cây thân gỗ khác nhau [53], [64]… dương xỉ và rêu [31] 2174 chủng xạ khuẩn đã được thu nhận trên các môi trường khác nhau từ 90 loại cây dược liệu tại rừng nhiệt đới Xishuangbanna và xác định chúng đại diện cho 10 bộ khác nhau và

32 chi trong đó có 19 loài xạ khuẩn mới [46] Các chủng xạ khuẩn được phân

lập thì chi Streptomyces spp chiếm ưu thế nhiều nhất sau đó lần lượt là các

chi: Microbispora, Micromonospora, Nocardioides, Nocardia và

Streptosporangium [48] Từ 36 cây dược liệu ở Thái Lan, nhóm nghiên cứu

của Taechowisan đã phân lập được 330 chủng xạ khuẩn thuộc 4 chi khác

nhau (Streptomyces, Microbispora, Nocardia, Micromonospora) [58] Tuy

nhiên, Lee và cộng sự (2008) đã phân lập được 81chủng xạ khuẩn nội sinh từ

rễ bắp cải Trung Quốc, các chủng phân lập được thuộc chi Microbispora spp

là phổ biến, chiếm 67%; tiếp theo là Streptomyces spp chiếm 12% và

Micromonospora spp chiếm 11% [33] So với thân cây và lá thì rễ cây chứa

xạ khuẩn nội sinh đa dạng hơn Cho đến nay, hơn 40 loài xạ khuẩn mới đã được tìm thấy bằng nhiều phương pháp phân lập và phân loại khác nhau, bao

gồm 4 chi mới thuộc nhóm Plantactinospora, Actinophytocola, Phytohabitans

và Jishengella [48]

Sự đa dạng của xạ khuẩn nội sinh trong mô thực vật rất phong phú hứa hẹn tiềm năng ứng dụng các hợp chất có hoạt tính sinh học do các chủng xạ khuẩn này sinh ra trong nhiều lĩnh vực đời sống

2.2.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

Ở Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu về VSV nội sinh nói chung và

xạ khuẩn nói riêng

Nhóm nghiên cứu của PGS.TS Lê Mai Hương tại Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên đã thăm dò khả năng tạo chất taxol từ cây thông đỏ

(Taxus sp.) ở Việt Nam và tách chiết một chất gần giống 10-deacetil baceatin

III (10-DAB)-chất chuyển hóa thành taxol Từ lõi cây, nhóm nghiên cứu đã

phân lập được 6 chủng nấm, trong đó một chủng thuộc loài Mucor

circinolloides var tieghem Chất tách chiết từ dịch lên men của chủng nấm

nội sinh có đặc điểm gần giống với 10-DAB từ cây thông đỏ Từ kết quả đó,

có thể khẳng định những sản phẩm trao đổi chất có hoạt tính sinh học không chỉ được tạo ra từ cây chủ mà còn có thể tạo ra bởi VSV nội sinh [2]

Quách Ngọc Tùng và các cộng sự tại Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã phân lập được 78 chủng xạ khuẩn nội sinh trên các mẫu cây quế thu thập tại tỉnh Hòa Bình, trong đó tỷ lệ

xạ khuẩn từ thân, rễ, lá chiếm lần lượt là 66,7%; 24,3%; 9,0% Kiểm tra khả năng kháng VSV gây bệnh cho thấy 16 chủng thể hiện hoạt tính ức chế ít nhất một loại VSV kiểm định [4]

2.3 Khả năng sinh các chất kháng sinh thuộc nhóm anthracycline

Trong quá trình nội sinh với cây chủ, thực vật nội sinh không chỉ sinh

ra các chất chuyển hóa sinh học có khả năng kháng khuẩn mà còn sản xuất ra các hợp chất chống ung thư Gần đây, các nhà khoa học đã chú ý hơn đến việc nghiên cứu các hợp chất sinh học mới từ xạ khuẩn nội sinh có khả năng chống ung thư và đã thu hoạch được kết quả rất tốt Các chất chuyển hóa thứ cấp mang hoạt tính kháng ung thư sản xuất từ xạ khuẩn nội sinh cản trở sự nhân lên, làm giảm hoặc phát triển tế bào ung thư

Theo một số nghiên cứu cho thấy có rất nhiều nhóm kháng sinh có khả năng điều trị ung thư như anthracycline, actinomycin và bleomycin Trong

đó, anthracycline được sử dụng rộng rãi trong điều trị ung thư như ung thư máu, ung thư bạch huyết, ung thư tiền liệt tuyến, ung thư vú, ung thư bàng quang [24] Do có mặt của vòng anthraquinone trong cấu tạo hóa học, các anthracycline thay đổi màu sắc tùy theo pH của môi trường, cụ thể là có màu

da cam ở pH acid và màu tím khi ở pH kiềm Đặc tính này được dùng để sàng lọc sơ bộ các chủng sinh anthracycline trong số các chủng xạ khuẩn phân lập được Nhóm chất kháng ung thư này cho đến nay được ghi nhận gồm daunorubicin (DNR), doxorubicin (DOX1), epirubicin (EPI) và idarumycin (IDA) Daunorubicin và idarumycin gắn vào các cặp base do đó kìm hãm tổng hợp RNA và DNA Mithramycin và chromomycin A3 (là các actinomycin), kìm hãm tổng hợp RNA phụ thuộc DNA Bleomycin tương tác và làm đứt gãy DNA

Hình 2.1 Cấu trúc của một số kháng sinh điển hình thuộc nhóm

anthracycline: DOX, DNR, EPI, IDA

Sự khác nhau về cấu trúc của DOX và DNR là chuỗi của DOX kết thúc

ở gốc alcohol, còn DNR kết thúc ở gốc methyl Chính sự khác biệt này tạo nên sự khác biệt trong phổ điều trị ung thư của hai hợp chất này DOX có tác dụng trong điều trị ung thư vú, hình thành các khối u Trong đó, DNR lại có tác dụng trong điều trị bệnh bạch cầu cấp tính Tuy nhiên, cả DOX và DNR đều gây tác dụng phụ như gây đau cơ tim mãn tính hay suy tim [25]

Trước những nhược điểm của DNR và DOX cùng với nhu cầu trong việc tìm kiếm chất kháng ung thư, các nhà khoa học đã biến đổi cấu trúc hóa học của 2 hợp chất trên, thu được EPI và IDA EPI là doxorubicin được epime hóa tại vị trí C-4 hydroxyl trên phân tử đường, được sử dụng nhiều trong điều trị ung thư dạ dày, ung thư vú, IDA là dẫn xuất của daunorubicin, bị khuyết thiếu nhóm methoxyl tại vị trí C-4 dẫn đến làm tăng khả năng hòa tan trong chất béo, dung môi cũng như ức chế tế bào ung thư

2.4 Cây Màng tang và tiềm năng phân lập xạ khuẩn nội sinh

Màng tang tên khoa học là Litsea cubeba (Lour.) Pers ,thuộc họ Long não: Lauraceae Màng tang có đặc trưng là cây bụi hoặc gỗ nhỏ, cao 7-10m,

đường kính 7-15 cm, thân vỏ xanh, có lỗ bì, già thì có màu nâu xám, cành nhỏ Lá mọc so le, phiến lá hình mác dài độ 10cm, rộng 1,5-2,5cm, dày, mặt trên màu xanh lục,mặt dưới trắng xám, mép nguyên, cuống lá mảnh, gân lá rõ Màng tang thường mọc rải rác hay tập trung thành đám nhỏ trong rừng thứ sinh hoặc rừng phục hồi sau nương rẫy, ở độ cao 100-150m Ra hoa tháng 2-

3, có quả tháng 7-8 Hoa nhỏ khác gốc, màu vàng nhạt, mọc thành từng chùm

ở nách lá Qủa mọng hình tròn hay hình trứng khi chín màu đen, mùi rất thơm Cây Màng tang chủ yếu phân bố ở khu vực Đông Nam Á Ở Việt Nam, cây Màng tang được tìm thấy ở một số tỉnh như: Lào Cai, Sơn La, Cao Bằng, Thái Nguyên, Phú Thọ, Vĩnh Phúc, Lạng Sơn, Bắc Cạn, Ninh Bình, Nghệ An, Gia Lai, Lâm Đồng…

Theo Đông y, Màng tang có vị cay, tính ấm, có tác dụng khu phong tán hàn, ôn trung hạ khí, trừ thấp giảm đau Rễ được dùng trị cảm mạo phong hàn, đau dạ dày, đầy hơi, phong thấp, đau nhức xương, kinh nguyệt không đều Qủa chữa ăn uống không tiêu Lá trị nhọt viêm mủ đỏ, viêm vú, chữa rắn cắn Linlin Si và cộng sự (2012) đã công bố 59 hợp chất từ cây Màng tan (41 hợp chất monoterpenes, 15 hợp chất sesquiterpenes và 3 hợp chất non-terpene) Các hợp chất chủ yếu là Neral và geranial, α-pinen, β-pinen, methyl heptenone, β-myrcene, D-limonene, cineole, linalool, citronellal, verbenol, isopulegone, α-tecpineol, (R) -citronellol, piperitone, geraniol, β-caryophyllene và caryophyllene oxit … [35] Tinh dầu của Màng tan được nghiên cứu từ khá sớm khi năm 1977 theo một công bố ở Trung Quốc đã xác định tinh dầu của Màng tan có khả năng kháng khuẩn, chống viêm, kháng nấm [7] Tinh dầu của Màng tan được sử dụng như một nguyên liệu thô sản

xuất các citral, vitamin A, E, và K, ionine, methylionone, và nước hoa [30]

Để xác định khă năng chống ung thư của tinh dầu từ cây Màng tan, Chen-Lung

Ho và các cộng sự đã tiến hành nghiên cứu với 3 dòng tế bào ung thư: tế bào ung thư miệng OEC-M1, tế bào ung thư phổi A549, tế bào ung thư gan J5 Kết quả cho thấy tinh dầu của Màng tan gây độc cho tất cả các tế bào đó [14]

Bên cạnh đó, Màng tang còn là loài thực vật chứa rất nhiều loài VSV nội sinh, trong đó có xạ khuẩn nội sinh Đồng thời vẫn chưa có nhiều nghiên cứu về xạ khuẩn nộị sinh trên cây Màng tang được công bố trên thế giới cũng như Việt Nam Do vậy đây là một loài cây hứa hẹn nhiều tiềm năng trong việc khai thác các loài nội sinh cũng như các chất có hoạt tính sinh học được sản xuất từ các loài nội sinh đó

PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Vật liệu nghiên cứu

3.1.1 Thu thập mẫu cây Màng tang, chủng gống vi sinh vật

Mẫu cây Màng tang (Litsea cubeba (Lour.) Pers.) gồm các bộ phận: rễ,

thân, lá được thu thập tại tỉnh Phú Thọ (tọa độ: 21024’25’’N;105004’05’’E)

vào tháng 1/2016 Mẫu thực vật Litsea cubeba (Lour.) Pers được phân loại

bởi TS Nguyễn Thế Cường tại Viện sinh thái và Tài nguyên sinh vật - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Các chủng vi sinh vật kiểm định: Salmonella enterica ATCC 14028,

Escherichia coli ATCC 11105, Sarcina lutea CNLM, Bacillus cereus ATCC

11778, Proteus vulgaris CNLM, Peudomonas auroginosa CNLM, Candida

albicans ATCC 10231, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Enterobacter aerogenes ATCC 13048 nhận từ Bộ sưu tập giống VSV của

Phòng Công nghệ Lên men, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa

học và Công nghệ Việt Nam

3.1.3 Thiết bị

Bảng 3.1 Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

Cân điện tử (AB 201, Mettler Toledo) Thụy Sỹ

Nồi hấp khử trùng (ALP MC-40DP) Nhật Bản

3.1.4 Môi trường nuôi cấy

Các môi trường được sử dụng trong đánh giá khả năng kháng vi sinh vật kiểm định và xác định đặc điểm sinh học của chủng xạ khuẩn nội sinh (Phụ lục 1)

3.2 Địa điểm và thời gian tiến hành

- Địa điểm nghiên cứu: Phòng Công nghệ Lên men, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

- Thời gian nghiên cứu: Từ 12/2015 đến 5/2016

3.3 Nội dung nghiên cứu

- Nội dung 1: Phân lập và đánh giá sự đa dạng của xạ khuẩn nội sinh trên các mẫu cây Màng tang thu thập tại tỉnh Phú Thọ

- Nội dung 2: Đánh giá khả năng kháng vi sinh vật kiểm định và khả năng sinh anthracycline của các chủng xạ khuẩn nội sinh

- Nội dung 3: Nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại của 01 chủng

xạ khuẩn có tiềm năng ứng dụng

3.4 Phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Lấy mẫu cây Màng tang

Dụng cụ lấy mẫu như dao và túi nilông lấy mẫu đã được khử trùng bằng cồn Mẫu cây được chia thành 3 phần riêng biệt: rễ, thân và lá sau đó đựng trong túi nilông có ghi đặc điểm và địa điểm lấy mẫu

Mẫu được bảo quản trong tủ lạnh ở 4oC cho đến khi xử lí và phân tích Các mẫu nếu không được xử lý ngay được bảo quản trong tủ lạnh ở -20o

C

3.4.2 Phương pháp xử lý bề mặt mẫu

Mẫu cây Màng tang được rửa sạch dưới vòi nước để loại bỏ đất, tạp chất và làm khô mẫu tại nhiệt độ phòng trong 20 phút Các mẫu được khử trùng bề mặt bằng cách ngâm trong NaClO 5,0% (v/v) từ trong 5 phút Rửa mẫu một lần bằng Na2S2O3 2,0% (w/v) trong 1 phút để loại bỏ NaClO dư Tiếp tục xử lý mẫu bằng ethanol 70% trong 10 phút, rửa lại bằng nước cất khử trùng

để loại bỏ Ethanol Tiến hành nghiền mẫu trong tủ cấy vô trùng

Bổ sung các hợp chất kháng sinh như acid nalidixic (15 mg/mL) và nystatin (15 mg/mL) vào 8 loại môi trường phân lập để nâng cao tính chọn lọc xạ khuẩn và ức chế phát triển của vi khuẩn và nấm cộng sinh

3.4.3 Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của xạ khuẩn

Chủng xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường YIM38 lỏng ở nhiệt độ

30oC, trên máy lắc, tốc độ 200 vòng/phút trong 5 ngày Môi trường thạch sau

khi khử trùng xong để nguội đến nhiệt độ 30-37oC, hút dịch vi sinh vật kiểm định có mật độ tế bào đạt 5.108

CFU/ml lên trên bề mặt đĩa Petri hoặc các khay và trải đều bằng que chang thủy tinh Khi thạch đông dùng dụng cụ đục

lỗ thạch vô trùng đục lỗ và lấy các thỏi thạch ra Sau 5 ngày nuôi cấy, thu hồi

và ly tâm dịch nuôi cấy các chủng xạ khuẩn với tốc độ 6.000-8.000 vòng/phút

ở 4o

C, trong vòng 10 phút Bổ sung 100 μL dịch vào các giếng thạch trên đĩa Petri và đặt các đĩa trong tủ lạnh khoảng 5-6 giờ để dịch từ các giếng khuếch tán ra môi trường nuôi cấy vi sinh vật Sau đó, đặt các đĩa vào tủ ấm 28-30oC trong 14-18 giờ, quan sát vòng kháng khuẩn

Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được xác định theo kích thước vòng kháng khuẩn (Vkk) theo công thức:

Vkk = D - d (mm), Trong đó: D: Đường kính vòng kháng khuẩn (mm)

d: Đường kính lỗ thạch (mm)

3.4.4 Đánh giá khả năng sinh anthracycline

Các chủng xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường thạch YIM 38 ở

nhiệt độ 30°C Sau 5 ngày, đục 2 giếng nhỏ trên đĩa thạch và nhỏ vào mỗi giếng 50 µl NaOH 2N và 50 µl HCl 1N để khoảng 15 phút để hóa chất khuếch tán trên bề mặt thạch Sau đó ta quan sát màu sắc quanh bề mặt khuẩn lạc có nhỏ 2 dung dịch trên Chủng nào thể hiện phản ứng chuyển màu da cam khi pH acid và màu tím khi có pH kiềm chứng tỏ có khả năng sinh anthracycline

3.4.5 Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng xạ khuẩn MPT25

3.4.5.1 Quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc, khả năng sinh melanin

Đặc điểm hình thái của các chủng xạ khuẩn được quan sát, so sánh trên các môi trường ISP1, ISP2, ISP3, ISP4, ISP5, ISP6, ISP7 ở nhiệt độ 28-30o

C [1] Sau 7, 14 và 21 ngày lấy mẫu quan sát màu sắc khuẩn ty khí sinh, khuẩn