Với mục đích nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng sinh và hoạt tính của enzyme invertase ngoại bào từ các chủng nấm men Saccharomyces spp., tôi đã tiến hành tuyển chọn các chủng nấm men Sacharomyces spp. có khả năng sinh enzyme invertase cao và đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố từ các chủng nấm men được cung cấp. Dựa vào điều kiện cho phép của phòng thí nghiệm, tôi tiến hành lựa chọn các chủng có khả năng cao thuộc chi Saccharomyces, thấy rằng trong 20 chủng được cung cấp có 6 chủng thuộc chi Saccharomyces. Bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch (Praveen Reddy và cộng sự, 2010), tôi đã tuyển chọn được 2 chủng 259 và 263 có khả năng sinh invertase ngoại bào cao. Tôi tiến hành đánh giá ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy như thời gian ủ, nguồn carbon, nguồn nitrogen, pH môi trường đến khả năng tổng hợp invertase ngoại bào và ảnh hưởng pH đệm, ion kim loại và nồng độ cơ chất khác nhau đến hoạt tính enzyme thô thu được. Kết quả cho thấy, cả 2 chủng 259 và 263 đều tổng hợp invertase ngoại bào tốt ở pH 6, nguồn carbon và nguồn nitrogen tốt nhất trong các nguồn được nghiên cứu là sucrose và pepton. Tuy nhiên, thời gian nuôi cấy thích hợp đối với chủng 259 là 48 giờ và 263 là 56 giờ. Enzyme thô thu được từ 2 chủng 259 và 263 hoạt động tốt ở pH 5 và ion Mn2+ làm tăng hoạt tính enzyme. Nồng độ sucrose thích hợp là 200mM.
Trang 1HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ ĐẾN KHẢ NĂNG SẢN XUẤT VÀ HOẠT TÍNH CỦA ENZYME INVERTASE NGOẠI BÀO CỦA CÁC
CHỦNG SACCHAROMYCES SPP.
HÀ NỘI – 2016
Trang 2HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ ĐẾN KHẢ NĂNG SẢN XUẤT VÀ HOẠT TÍNH CỦA ENZYME INVERTASE NGOẠI BÀO CỦA CÁC
Trang 3LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong khoá luận này là trungthực và chưa hề được sử dụng trong bất kỳ công bố nào
Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện khoá luận đã được cảm ơn
và các thông tin trích dẫn đã được chỉ rõ nguồn gốc
Hà Nội, ngày 31 tháng 12 năm 2016
Sinh viên
Phạm Thùy Trang
Trang 4Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Văn Giang đãtận tình hướng dẫn và dạy dỗ tôi trong suốt quá trình học tập cũng như nghiên cứu.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới TS Nguyễn Xuân Cảnh, ThS Trần Thị Đào, đãgiúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực tập
Qua đây tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể các Phòng, Ban của khoa Côngnghệ sinh học và toàn thể bạn bè đã giúp đỡ, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợicho tôi trong suốt quá trình học tập cũng như thực tập tốt nghiệp
Và cuối cùng, với tất cả lòng kính trọng và biết ơn vô hạn, tôi xin gửi lời cảm ơntới Bố, Mẹ, Ông, Bà và những người thân của tôi đã nuôi nấng, động viên và tạo độnglực cho tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu
Tôi xin chân thành cảm ơn !
Sinh viên
Phạm Thùy Trang
Trang 5MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN i
LỜI CẢM ƠN ii
MỤC LỤC iii
DANH MỤC HÌNH – ĐỒ THỊ v
TÓM TẮT vi
Phần I MỞ ĐẦU 1
1.1 Đặt vấn đề 1
1.2 Mục tiêu đề tài 1
1.3 Đối tượng và nội dung nghiên cứu của đề tài 1
Phần II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1 Enzyme invertase 3
- Tên hệ thống: 3
2.1.1 Phản ứng xúc tác 3
2.1.2 Động học của invertase 3
2.1.3 Vai trò và ứng dụng của invertase 5
2.2 Các vi sinh vật sử dụng để sản xuất enzyme invertase 7
2.3 Một số nét về Saccharomyces spp ( Lương Đức Phẩm, 2009) 11
Phần 3 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15
3.1 Vật liệu và hóa chất 15
3.1.1 Vật liệu 15
3.1.2 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị 15
3.1.3 Thành phần môi trường thí nghiệm 15
3.2 Phương pháp nghiên cứu 15
3.2.1 Nghiên cứu một số đặc điểm hình thái, hóa sinh của các chủng nấm men sử dụng trong nghiên cứu 15
3.2.2 Phương pháp lên men và xác định hoạt tính enzyme 18
3.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh invertase
22 3.2.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến hoạt tính enzyme 23
3.2.5 Phương pháp xử lý số liệu 23
Phần 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24
4.1 Định danh sơ bộ các chủng nấm men và khảo sát khả năng sinh invertase 24
4.1.1 Định danh sơ bộ các chủng nấm men 24
4.1.2 Đặc điểm khuẩn lạc và hình thái tế bào của các chủng nấm men có khả năng thuộc chi Saccharomyces 24
Trang 64.1.3 Hình thức nảy chồi 25
4.1.4 Khả năng tạo bào tử 26
4.1.5 Khả năng lên men đường sucrose và glucose 26
4.1.6 Khả năng đồng hóa urea 27
4.2 Tuyển chọn các chủng nấm men Saccharomyces spp có khả năng sinh enzyme invertase ngoại bào cao 28
4.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh invertase của các chủng nấm men Saccharomyces spp 29
4.3.1 Xây dựng đường chuẩn glucose 29
4.3.2 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh enzyme invertase của các chủng nấm men Saccharomyces spp 30
4.3.3 Ảnh hưởng của nguồn carbon 31
4.3.4 Ảnh hưởng của nguồn nitrogen 32
4.3.5 Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh enzyme invertase 33
4.4 Ảnh hưởng của một số điều kiện môi trường đến hoạt tính enzyme invertase 34
4.4.1 Ảnh hưởng của pH đệm 34
4.4.2 Ảnh hưởng của một số ion kim loại 35
4.4.3 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt tính enzyme invertase 36
Phần 5 KẾT LUẬN 38
5.1 Kết luận 38
5.2 Kiến nghị 38
Phần 6 TÀI LIỆU THAM KHẢO 39
PHỤ LỤC 44
Trang 7DANH MỤC HÌNH – ĐỒ THỊ
Hình 2.1 Cơ chế thủy phân của sucrose 3
Hình 2.2 Khả năng đồng hóa các nguồn hydratcacbon của nấm men 12
Hình 3.1 Phản ứng màu của DNS và đường khử 20
Hình 4.1 Hình ảnh khuẩn lạc của một số chủng nấm men 25
Hình 4.2 Hình thức nảy chồi của các chủng nấm men 25
Hình 4.3 Khả năng tạo bào tử của một số chủng nấm men 26
Hình 4.4 Tạo bọt khí trong ống Durham sau 24h nuôi cấy của các chủng nấm men 27
Hình 4.8 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh enzyme invertase 30
Hình 4.9 Ảnh hưởng của nguồn carbon đến khả năng sinh enzyme invertase 32
Hình 4.10 Ảnh hưởng của nguồn nitrogen đến khả năng sinh enzyme invertase 33
Hình 4.11 Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh enzyme invertase 34
Hình 4.12 Ảnh hưởng của pH đệm đến hoạt tính enzyme invertase 35
Hình 4.13 Ảnh hưởng của một số ion kim loại 36
Hình 4.14 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất 37
Trang 8TÓM TẮT
Với mục đích nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng sinh và hoạt tính
của enzyme invertase ngoại bào từ các chủng nấm men Saccharomyces spp., tôi đã tiến hành tuyển chọn các chủng nấm men Sacharomyces spp có khả năng sinh enzyme invertase cao và
đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố từ các chủng nấm men được cung cấp Dựa vào điều kiệncho phép của phòng thí nghiệm, tôi tiến hành lựa chọn các chủng có khả năng cao thuộc chi
Saccharomyces, thấy rằng trong 20 chủng được cung cấp có 6 chủng thuộc chi Saccharomyces Bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch (Praveen Reddy và cộng sự,2010), tôi đã tuyển chọn được 2 chủng 259 và 263 có khả năng sinh invertase ngoại bào cao
Tôi tiến hành đánh giá ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy như thời gian ủ,nguồn carbon, nguồn nitrogen, pH môi trường đến khả năng tổng hợp invertase ngoại bào vàảnh hưởng pH đệm, ion kim loại và nồng độ cơ chất khác nhau đến hoạt tính enzyme thô thuđược Kết quả cho thấy, cả 2 chủng 259 và 263 đều tổng hợp invertase ngoại bào tốt ở pH 6,nguồn carbon và nguồn nitrogen tốt nhất trong các nguồn được nghiên cứu là sucrose vàpepton Tuy nhiên, thời gian nuôi cấy thích hợp đối với chủng 259 là 48 giờ và 263 là 56 giờ
Enzyme thô thu được từ 2 chủng 259 và 263 hoạt động tốt ở pH 5 và ion Mn2+ làmtăng hoạt tính enzyme Nồng độ sucrose thích hợp là 200mM
Trang 9Phần I MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề.
Invertase (β.D fructofuranosidase, EC.3.2.1.26) thủy phân liên kết α-1,4glycosid giữa α-D-glucose và β-D-fructose của phân tử sucrose (Li và cộng sự, 1998;Mobini-Dehkordi và cộng sự, 2008) Invertase là một enzyme công nghiệp quan trọngđược ứng dụng nhiều trong công nghiệp sản xuất đồ uống, bánh kẹo do sản phẩm tạo
ra ngọt hơn, ổn định và không bị kết tinh Ngoài ra, nó còn được sử dụng trong sản
xuất dược phẩm, axit lactic và ethanol (Acosta và cộng sự, 2000; Sanchez và cộng sự,
Sử dụng enzyme invertase an toàn và hiệu suất cao hơn chất hóa học (Rossi-Alva vàRocha-Leao, 2003; Tomotani và Vitolo, 2004; Kaur và Sharma, 2005; Aranda và cộng
sự, 2006; Oztop và cộng sự, 2009; Celebi và cộng sự, 2009), nhưng nó chỉ là một phụ
phẩm của ngành công nghiệp sản xuất bia và enzyme được sản xuất qua quá trình này
thường không ổn định và tinh sạch (Chan và cộng sự, 1991).
Vì vậy thu nhận invertase ngoại bào từ quá trình lên men chìm các chủng nấm
men Saccharomyces spp như là một giải pháp cho các vấn đề trên.
Xuất phát từ những lý do trên, tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu ảnh hưởng
của một số yếu tố đến khả năng sản xuất và hoạt tính của enzyme invertase ngoại
bào của các chủng Saccharomyces spp.” làm xác định một số thông số thích hợp với
quá trình lên men chìm các chủng nấm men Saccharomyces spp và phát triển quy trình sản xuất invertase từ Saccharomyces spp.
1.2 Mục tiêu đề tài.
Tuyển chọn các chủng nấm men Saccharomyces spp có khả năng sinh enzyme
invertase ngoại bào cao và nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng sảnxuất ( thời gian ủ, nguồn carbon, nguồn nitrogen, pH môi trường nuôi cấy) và hoạt tínhcủa enzyme invertase ngoại bào của chúng ( pH đệm, ion kim loại, nồng độ cơ chất)
Trang 101.3 Đối tượng và nội dung nghiên cứu của đề tài.
Đối tượng nghiên cứu.
Các chủng nấm men được cung cấp bởi phòng thí nghiệm Công nghệ vi sinh –Khoa Công nghệ sinh học – Học viện Nông nghiệp Việt Nam
Nội dung nghiên cứu.
1 Tuyển chọn 1 – 2 chủng nấm men Saccharomyces spp có khả năng sinh
invertase cao từ các chủng được cung cấp
2 Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy, nguồn carbon, nguồn nitrogen,
pH đến khả năng sản xuất enzyme invertase
3 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số ion kim loại và pH đệm, nồng độ cơ chất đếnhoạt tính của enzyme invertase
Trang 11Phần II TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Enzyme invertase.
- Tên hệ thống: β-D-fructofuranoside fructohydrolase (EC 3.2.1.26)
- Tên gọi khác: Invertase, saccharase, glucosucrase, β-h-fructosidase, β- fructosidase, sucrose,maxinvert L 100, fructosylinvertase, alkaline invertase, acid invertase
- Phân loại enzyme: Theo IUMBMB, invertase thuộc nhóm hydrolase (nhóm enzyme xúc táccho phản ứng thủy phân)
ra, nó còn có khả năng thủy phân các cơ chất có đuôi fructosyl như sucrose, raffinose,
stachyose và inulin (Rubio và cộng sự, 2002; Rubio và Navarro, 2006; Gore và cộng
- Có thể biết được cơ chế phân tử của sự tác động của enzyme
- Cho phép ta hiểu biết được mối quan hệ về mặt lượng của quá trình enzyme
Trang 12- Là điều kiện cần thiết để thực hiện các bước tinh chế enzyme.
- Khi lựa chọn các đơn vị hoạt động của enzyme cần phải biết những điều kiện tốt nhấtcho hoạt động của enzyme, cũng như cần phải biết được các yếu tố ảnh hưởng đếnhoạt động của chúng
Các enzyme thường bị ức chế bởi sự có mặt của một số yếu tố như kim loạinặng Ví dụ như Pb2+ dễ dàng liên kết với nhóm –SH trong một phân tử protein
protein-SH + Pb ++ + HS-protein -> protein S-Pb-S-protein + 2H +
Các mối liên kết disulfide rất quan trọng trong việc tạo cấu trúc 3 chiều của mộtprotein, nó sẽ xác định enzyme đó có hoạt động hay không Việc phá hủy các cầu nốidisulfide sẽ gây bất lợi cho enzyme Ví dụ: ion Ag+ gắn vào chuỗi bên histidine củaphân tử enzyme invertase và làm cho nó bị bất hoạt
Có rất nhiều các nghiên cứu liên quan đến động học của enzyme invertase trongđó:
Mona M Rashad và Mohamed U Nooman (2009) khi nghiên cứu về invertase ngoại
bào thu nhận từ Sacchromyces cerevisiae NRRL Y -12632 bằng phương pháp lên men
trên cơ chất là chất thải của carrot đỏ cho thấy pH tối ưu của nó là 6 Hoạt tính củaenzyme thể hiện cao nhất ở 50oC và giảm dần hoạt tính khi nhiệt độ cao hơn 50oC Sự
ổn định của enzyme được duy trì ở 40oC trong 1 giờ và chỉ còn 85% hoạt tính được giữlại ở 50oC Ảnh hưởng của một số ion kim loại cũng được tác giả báo cáo cụ thể ởnồng độ 1mM Hg2+ ức chế hoàn toàn, trong khi đó ức chế một phần có Ba2+, Zn2+, Fe2+
ngược lại Co2+ lại làm hoạt tính của enzyme tăng dù không nhiều
Cùng đối tượng nghiên cứu là Saccharomyces cerevisiae, Shankar và cộng sự,
2014 chỉ ra rằng invertase thu nhận từ chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae
MTCC170 ổn định trong khoảng pH từ 2 đến 9, tối ưu ở pH = 6 và giữ lại trung bìnhđược 63% hoạt tính sau 24 giờ Nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của enzyme được ghinhận ở 30oC khác với báo cáo của Mona M Rashad và Mohamed U Nooman (2009).Hoạt tính của enzyme được tăng lên khi có sự có mặt của 5mM CaCl2 Ngoài ra,nghiên cứu còn chỉ ra ảnh hưởng của các chất ức chế hóa học đến hoạt tính củaenzyme invertase như DMSO, β-mercaptoethanol, H2SO4, H2O2 (0,1mM) Kết quả chothấy rằng hoạt độ tối đa của enzyme được ghi nhận khi có sự có mặt của EDTA(25,58%)
Trang 13Ngoài Saccharomyces cerevisiae được nghiên cứu nhiều thì invertase thu nhận
từ các chi, loài khác cũng được chú ý như Canadida utilis, Pichia anomala,
Rhodotorula glutinis- Rubio và cộng sự,(2002) nghiên cứu invertase thu nhận từ Rhodotorula glutinis thấy hoạt tính của nó ổn định trong khoảng pH từ 2,6 - 5,5, hoạt
tính cao nhất được quan sát ở pH= 4,5 và khoảng nhiệt độ ổn định là từ 20oC – 60oC.Ion Mg 2+ và Ca 2+ tăng hoạt tính invertase 3 lần, trong khi Fe 2+ , K + , Co 2+, Na + và
Cu 2+ tăng hoạt tính khoảng 2 lần
Trong khi đó, nghiên cứu invertase thu nhận từ nấm mốc Aspergillus flavus sử dụng
vỏ trái cây bỏ đi làm cơ chất lên men Uma và cộng sự, (2010) thấy rằng enzyme này
hoạt động trong khoảng pH từ 5-7 và tối ưu ở pH 6, enzyme ổn định ở nhiệt độ 50oCtrong 30 phút , khi nhiệt độ tăng lên 70oC thì sự ổn định giảm tới 50% Ngoài ra, nócòn được kích thích bởi Ca2+, Na+ và bị ức chế bởi Zn2+
Shankar và cộng sự,(2010)cũng thu nhận invertase từ nấm mốc Aspergillus nhưng sử dụng Aspergillus niger và cơ chất là Cympopogan caecius (lemon grass) như
nguồn carbon thì thấy rằng hoạt tính của enzyme ổn định ở pH=5,5 trong 30 phút, dảinhiệt độ ổn định của enzyme là từ 20 - 55oC và tối ưu là ở 50oC Các ion kim loại hóatrị 2 như Cu2+, Fe2+, Co2+ ở nồng độ 10mM ảnh hưởng nhất định đến hoạt tính enzyme,
cụ thể là nó đã làm tăng hoạt tính so với enzyme không được bổ sung
2.1.3 Vai trò và ứng dụng của invertase.
Invertase phân bố rộng rãi trong sinh quyển đặc biệt là trong thực vật và vi sinhvật
Đối với thực vật, invertase là rất cần cho quá trình chuyển hóa, điều hòa áp suất
thẩm thấu và bảo vệ tế bào ( Samarth và cộng sự,2013)
Đối với nấm men, invertase giúp các tế bào nấm men chống chịu với ethanol(Osho, 2005), có vai trò quan trọng trong quá trình lên men
Nhờ các đặc tính của mình invertase còn được tách chiết và tinh chế để sản xuấtđường nghịch đảo ứng dụng trong nhiều ngành công nghiệp đặc biệt là ngành côngnghiệp sản xuất bánh kẹo, đồ uống…
Dung dịch đường nghịch đảo và HFS (high fructose syrup) có thể sản xuấtcông nghiệp bằng cách thủy phân sucrose bằng axit thủy phân Tuy nhiên, phươngpháp này có hiệu suất thấp, thiếu vị ngọt, chứa nhiều sản phầm không mong muốn và
Trang 14không kinh tế Trong khi đó, sản xuất bằng enzyme invertase cho sản phẩm có độ tinhkhiết cao, ổn định, không bị kết tinh và không chứa các sản phẩm không mong muốn(Rossi-Alva và Rocha-Leao, 2003; Tomotani và Vitolo, 2004; Kaur và Sharma, 2005;
Aranda và cộng sự, 2006; Oztop và cộng sự, 2009; Celebi và cộng sự, 2009) nên được
ưu tiên hơn
Một số đặc tính của hỗn hợp đường khử được tạo thành từ sự thủy phân của invertase:
Hỗn hợp gồm 50% đường đôi và 50% đường khử có độ ngọt cao hơn 20% so vớiđường sucrose tinh khiết, rất thích hợp trong sản xuất nước trái cây và sẽ giảm được20% lượng đường sử dụng
Điều khiển sự tạo thành tinh thể
Đường sucrose rất dễ tạo thành tinh thể (còn gọi là sự lại “đường”) Hỗn hợpđường khử được sử dụng nhằm làm chậm và giảm tối thiểu sự tạo thành tinh thể có thểxảy ra của sản phẩm trong suốt thời gian sử dụng
Sự hoạt động của nước là yếu tố chính được sử dụng để xác định thời gian sử dụngcủa sản phẩm Nếu khả năng hoạt động của nước cao, sản phẩm sẽ dễ dàng bị tấn côngbởi vi sinh vật, do vậy thời gian sử dụng sẽ ngắn đi Hỗn hợp đường khử có ái lực caovới nước, nên làm giảm thiểu lượng nước tự do mà vi sinh vật có thể sử dụng, hạn chếđược sự tấn công của vi sinh vật
Chính ái lực của nước tròn đường khử ngăn chặn sự tạo thành tinh thể nước đá lớn,đặc tính này rất thuận lợi cho một số sản phẩm như kem trái cây, bánh nướng có thểbảo quản lạnh để phân phối cho người bán lẻ…
Hỗn hợp đường khử tạo ra nhờ enzyme invertase thủy phân sucrose có nhiều ứngdụng quan trọng
Trang 15 Sản xuất bánh mì, bánh biscuist, bánh nướng giúp tạo lớp caramen, tăng chấtlượng vỏ bánh, gây kích thích vị giác, tạo màu và củng cố kết cấu của bánh.
sucrose có trộn một lượng nhỏ invertase Lúc đầu nhân khá cứng nên rất dễ đểbọc lớp chocolate bên ngoài Sau một thời gian, enzyme hoạt động, sucrose đãchuyển đổi thành hỗn hợp đường khử nên nhân kẹo trở nên mềm hơn, dẻo hơn
và có độ ngọt cao hơn
Chế biến nước trái cây: Đồ uống giàu năng lượng, cung cấp năng lượng tức thì.Hỗn hợp đường khử giúp tăng thời gian bảo quản trong chế biến trái cây, tăngmùi vị và kích thích vị giác
Mật ong: sử dụng cho ong ăn, trộn vào mật ong, hạn chế hoạt động của vikhuẩn tốt và thay thế thành phần hóa học thuần túy của mật ong làm mật ongnhân tạo
Trong y dược: là thành phần trong thuốc ho dạng siro, Ngoài ra fructose tronghỗn hợp đường khử còn được sử dụng cho bệnh nhân bệnh tiểu đường, vì sựchuyển hóa fructose độc lập với sự tiết isulin
Ngoài ra, nó còn được sử dụng trong sản xuất axit lactic, ethanol (Acosta và cộng sự,
2000; Sanchez và cộng sự, 2001)
2.2 Các vi sinh vật sử dụng để sản xuất enzyme invertase.
Invertase được tìm thấy ở trong cả động vật, thực vật bậc cao và vi sinh vậtnhưng vi sinh vật là lựa chọn tốt nhất do vi sinh vật sinh trưởng nhanh và dễ thao tác
(Matrai và cộng sự, 2000; Luxhoi và cộng sự, 2002; Gangadhara và cộng sự, 2008).
Hầu hết các loại vi sinh vật đều có khả năng sản xuất enzyme này như vi khuẩn
Arthrobacter globiformis (Win và cộng sự, 2004), Lactobacillus reuteri (de Gines và
cộng sự, 2000), Azotobacter chroococum (de la Vega và cộng sự, 1991), nấm kể cả nấm men có Fusarium oxysporium (Nishizawa và cộng sự, 1980), Aureobasidium
pullulans (Yoshikawa và cộng sự, 2006), Fusarium solani (Bhatti và cộng sự, 2006), Aspergillus niger (Zhang và Ge, 2006), Aspergillus ochraceus (Ghosh và cộng sự,
2001), Aspergillus oryzae (Kurakake và cộng sự, 2010), Thermomyces lanuginosus (Chaudhuri và cộng sự, 1999), Pichia anomala (Perez và cộng sự, 2001), Rhodotorula
glutinis (Rubio và cộng sự, 2002), Rhodotorula dairenensis (Gutierrez-Alonso và cộng
Trang 16sự, 2009), Kluyveromyces fragilis (Workman và Day, 1983), Schizosaccharomyces
pombe (Moreno và cộng sự, 1990), Schwanniomyces occidentalis (Klein và cộng sự,
1989), Candida utilis (Belcarz và cộng sự, 2002a) và Saccharomyces cerevisiae
Các điều kiện lên men cụ thể tùy thuộc vào từng vi sinh vật Tuy nhiên có hai phươngpháp lên men chính là lên men trên cơ chất rắn và lên men chìm Hầu hết các quá trìnhsản xuất enzyme từ vi sinh vật đều sử dụng cách lên men chìm do nó kiểm soát tốt cácđiều kiện sinh trưởng của vi sinh vật hơn là lên men rắn Đối với sản xuất invertase từnấm men cũng vậy, lên men chìm được ưa chuộng hơn do nó có sản lượng cao hơn,
đòi hỏi ít nhân lực hơn và thân thiện với môi trường (Lambert và cộng sự, 1983; Arguelles và cộng sự, 1995; Koo và cộng sự, 1998; Romero-Gomez và cộng sự,
2000)
Lựa chọn môi trường lên men phù hợp cũng là rất cần thiết để hiệu suất sảnxuất enzyme đạt tối đa Trên thế giới có rất nhiều công trình thực nghiệm đã được thựchiện để tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy và dinh dưỡng cho sự sản xuất enzyme
invertase từ nấm men đặc biệt là từ Saccharomyces cerevisiae.
Nấm men có thể sử dụng 1 được nhiều các hợp chất chứa các nguồn nitrogen vàcarbon như yeast extract, pepton, carbonhydrate hay các muối hoặc vitamin làm môitrường cơ bản để sản xuất invertase(Walker 1998; Arfi và cộng sự, 2003) Mật đường
có bổ sung thêm ethanol và NaCl cũng được sử dụng để sản xuất invertase (Zech vàGoerisch, 1995)
Carbon không chỉ là yếu tố cơ bản của tế bào nó còn giúp duy trì quá trình trao
đổi chất của vi sinh vật sống (Costaglioli và cộng sự, 1997) Sự hiện diện của nguồn
carbon thích hợp trong môi trường đóng vai trò dinh dưỡng kích thích tăng trưởng và
Trang 17có ảnh hưởng trực tiếp đến sự sản xuất của nhiều enzyme (Rodriguez và cộng sự,1997; Herwig và cộng sự, 2001).
Đối với nấm men Saccharomyces cerevisiae, các nguồn carbon khác nhau bao
gồm glucose, fructose, maltose, glycerol, ethanol, xylose, sucrose được sử dụng cho sựtăng trưởng và sản xuất enzyme (Dworschack và Wickerham, 1961; Zhang và Ge,2006; Martinezforce và Benitez, 1995)
Invertase ngoại bào được tiết ra bởi S.cerevisiae khi môi trường có chứa cơ chất
là sucrose hay raffinose (Carlson, 1999; Mwesigye và Barford, 1996; Dynesen và cộng
sự, 1998)
Trong quá trình lên men sucrose, invertase ngoại bào thủy phân sucrose thànhglucose và fructose, tế bào thu nhận và chuyển hóa chúng(Batista và cộng sự, 2004).Việc sử dụng sucrose sẽ bị ức chế khi nồng độ glucose hoặc fructose vượt quá 5g/l vàchúng có khả năng ngang nhau trong việc ức chế chất dị hóa (Dynesen và cộng sự,1998) Robledo-Olivo và cộng sự (2009) đề xuất rằng bổ sung thêm glucose ở nồng độthấp sẽ tăng sự tiết enzyme invertase ở nấm
Ngoài nguồn carbon thì nguồn nitrogen là thành phần cơ bản của môi trườngnuôi cấy.Nó đóng một vai trò quan trọng trong việc tổng hợp enzyme vì cung cấp cácamino acid Trong tự nhiên, nấm men gặp nhiều nguồn nitrogen trong môi trườngsống Tuy nhiên, không phải nguồn nitrogen nào cũng hỗ trợ tốt như nhau cho sự tăngtrưởng Việc sử dụng nguồn nitrogen thích hợp thúc đẩy sự tăng trưởng tốt hơn cácnguồn nitrogen không thích hợp (Magasanik, 1992)
Nhiều nghiên cứu sử dụng kết hợp nhiều hơn một nguồn nitrogen giúp tăngcường sự sản xuất invertase trong nấm men Sự kết hợp của các nguồn nitrogen hữu cơnhư pepton và cao nấm men (yeast extracts) với nguồn carbon thích hợp cho năng suấtsản xuất invertase cao hơn so với sự bổ sung nguồn nitrogen vô cơ (Rodriguez và cộng
sự, 1995; Belcarz và cộng sự, 2000) Các nguồn nitrogen hữu cơ khác nhau có ảnh
hưởng đáng kể đến sự tổng hợp invertase của nấm men Cao nấm men được cô đặc từcác thành phần hòa tan của tế bào nấm men và có thể là một nguồn bổ sung tốt cho chế
độ dinh dưỡng thiếu protein (Sommer, 1998) Trong trường hợp chỉ có sucrose màthiếu nguồn nitrogen, hoạt độ invertase trong các tế bào hoang dại từ giai đoạn giữa
Trang 18của pha log giảm 3 lần trong khi đó ở trạng thái nuôi tĩnh giảm 8 lần (Silveira và cộng
sự, 2000)
Thời gian nuôi cấy quyết định tính hiệu quả của toàn bộ quá trình và sự hìnhthành sản phẩm Thời gian tích lũy đường khử là đặc trưng cho loài Ví dụ đối với nấm
men Saccharomces cerevisiae thời gian ủ tốt nhất cho quá trình sản xuất invertase là
48 giờ (Mizunaga và cộng sự, 1981) Cũng có báo cáo khác cho rằng khoảng thời gian đó là từ 48-96 giờ là tốt nhất đối với S cerevisiae (Barlikova và cộng sự, 1991).
Giá trị pH ban đầu và nhiệt độ cũng ảnh hưởng tới sự sản xuất và ổn định củaenzyme invertase Nhiệt độ của hỗn hợp phản ứng xác định tỷ lệ đường sucrose bị thủyphân bởi enzyme (Yusa và Enokida, 1953; Vrabel và cộng sự, 1997).Môi trường đượcđiều chỉnh để đáp ứng các hoạt động trao đổi chất của các tế bào nấm men thực hiệnbằng sự thay đổi pH vì nó cho phép đạt mật độ tế bào với năng suất và sản lượng cao(Porro và cộng sự, 1991) Hơn nữa, các enzyme chỉ hoạt động trong một phạm vi giớihạn của độ pH và trong hầu hết các trường hợp có một giá trị pH cho hoạt động tối đa(Dixon và Webb, 1979; Segel, 1975)
T Shankar và cộng sự, 2013 khi nghiên cứu tối ưu hóa quá trình sản xuất enzyme invertase từ chủng Saccharomyces cervisiae MK bằng phương pháp lên men chìm
thấy rằng trong 13 nguồn carbon khảo sát là trehalose, maltose, galactose, mannose,fructose, glucose, raffinose, arabinose, lactose, xylose, starch, carboxy methylcellulose và sucrose với nồng độ bổ sung là 1% thì sucrose được ghi nhận là nguồn
carbon cho sự tổng hợp enzyme invertase là lớn nhất (0.36 ± 0.005 IU/ml) Trong khi
đó, không có sự sản xuất invertase được ghi nhận khi bổ sung xylose và trehalose.Đối với nguồn nitrogen, tác giả nghiên cứu ảnh hưởng của cả nguồn nitrogen vô
cơ và nitrogen hữu cơ với nồng độ 0,5% Nguồn nitrogen vô cơ được khảo sát gồmammonium nitrate, ammonium chloride, ammonium molybdate, potassium nitrate vàsodium nitrate Ammonium chloride là nguồn nitrogen vô cơ tốt nhất cho sự tổng hợpenzyme (0.28 ± 0.11 IU/ml) Trong khi đó nguồn nitrogen hữu cơ tốt nhất cho sự tổnghợp enzyme là yeast extract (0.25 ± 0.005 IU/ml)
Saccharomyces cerevisiae MK có khả năng sinh invertase trong một khoảng pH
khá rộng từ 4 đến 8 trong đó tối ưu tại pH = 6 và nhiệt độ tối ưu cũng đã được ghinhận là 30oC
Trang 19Ngoài các yếu tố môi trường trên, tác giả cũng đã nghiên cứu ảnh hưởng của rất nhiềuyếu tố khác như thời gian ủ, mật độ tiếp giống, nồng độ sucrose
Ngoài Saccharomyces cervisiae thì các loài khác trong chi Saccharomyces cũng được nghiên cứu như Saccharomyces carlsbergensis Trong báo cáo của Muhammad Umar Hayyat và Sikander Ali (2013) các chủng Saccharomyces
carlsbergensis sau khi được gây đột biến bằng tia UV thì chủng UV-dg4 đã cải thiện
được khả năng sản xuất invertase ngoại bào lên khoảng 17,86 lần so với chủng hoangdại Và các điều kiện của môi trường nuôi cấy chủng UV-dg4 đã được nghiên cứu tiếp
để hiệu quả sản xuất invertase ngoại bào được cao nhất
Cụ thể trong nghiên cứu này thì nguồn carbon tốt nhất được sử dụng để chủngUV-dg4 sinh enzyme là sucrose và nồng độ 10g/l được ghi nhận là cho sự tổng hợpinvertase ngoại bào cao nhất (14.69 U/ml/min) Trong các nguồn nitrogen được nghiêncứu gồm urea, pepton, soybean, (NH4)2SO4, NH4NO3 và NH4Cl thì soybean cho hiệuquả sản xuất invertase cao 29,657 (U/ml/min) , có thể thấy rằng đây là 1 nguồn rấtgiàu dinh dưỡng với 42% proteins, 29.9% carbohydrates , 4% fats, 0.25% calcium,0.25% magnesium , 0.63% phosphorous, 1.75% potassium, 0.32% sulphur và nồng độthích hợp nhất cũng được ghi nhận là 5g/l
Ngoài ra, tác giả cũng đã báo cáo rằng pH=6, nồng độ tiếp giống 12% (v/v) vàthời gian ủ 72 giờ là các thông số thích hợp cho quá trình lên men chìm đối với chủng
Saccharomyces carlsbergensis UV-dg4.
2.3 Một số nét về Saccharomyces spp ( Lương Đức Phẩm, 2009)
Theo hệ thống phân loại, nấm men thuộc vào giới nấm ( Kingdom Fungi theo
Whitaker, 1969; Takhtakjan 1970) Nấm men là nhóm nấm cơ thể đơn bào hoặc tập
hợp đơn bào, nhân chuẩn, hiển vi Nấm men có thể là nấm túi (Ascomycetes) hoặc nấm bất toàn ( Fungi imperfect).
Từ rất lâu, con người đã biết sử dụng nấm men để lên men rượu, bia.Ngày naynấm men được ứng dụng trong sản xuất công nghiệp không chỉ có rượu bia mà cònnhiều ngành khác Phần lớn nấm men được sử dụng trong công nghiệp thuộc giống
Saccharomyces trong lớp nấm túi và vài giống thuộc lớp nấm bất toàn.
Nấm men Saccharomyces thuộc ngành Ascomycota, lớp Saccharomycetes, bộ
Saccharomycetales, họ Saccharomycetaceae
Trang 20Theo Kudrêyxeva, giống này có 18 loài Chúng không khác nhau về hình tháinhưng lại khác nhau nhiều về quan hệ với các loại đường
Hình 2.2 Khả năng đồng hóa các nguồn hydratcacbon của nấm men
( Lương Đức Phẩm, 2009)
Các loài của giống này phổ biến rộng rãi trong tự nhiên, đặc biệt một số loàiđược nghiên cứu và biết khá rõ Các men này có vai trò to lớn trong sản xuất các sảnphẩm lên men có chứa cồn Một số chủng của nấm men này dùng làm men nở bánh
mì, một số khác dùng trong công nghiệp rượu, bia, rượu vang, sản xuất glyxerol hoặcenzyme invertase
Giống Saccharomyces có hình dáng tế bào là hình cầu, hình ovan hay hình elip.
Sinh sản vô tính bằng hình thức nảy chồi Thường có 1-4 bào tử trong nang, ít khi có 8bào tử Thế hệ sinh dưỡng của các giống này trong điều kiện bình thường là các thểlưỡng bội Khi già chúng thường kết thành vòng và mọc trên dịch lên men sợi giả, cóthể kết thành màng nổi Lên men đường tốt nhưng nồng độ đường không quá 30%(chính vì điều này những nấm men này được gọi là giống “nấm đường”) và tạo thànhtới 18% cồn etylic
Trong 18 loài có 7 loài có nhiều ý nghĩa và đóng góp trong sản xuất lên men
1 Saccharomyces vini Meyen ( Theo Lodder – S cerevisiae Hansen)
Đây là loài nấm men rất phát triển ở các loại quả ngọt, ở dịch rau quả Chúng lênmen dịch quả, đặc biệt là dịch quả nho tạo thành những rượu nho và thường gọi là
rượu vang Tên của loài này trước đây được gọi là Saccharomyces ellipsoideus, bắt nguồn từ hình dáng tế bào của chúng là hình ellip.
Trang 21Trong dịch quả lên men ta thấy giống Saccharomyces chiếm tới 80% số tế bào vi
sinh vật có mặt Dịch lên men được phủ một lớp bọt trên bề mặt Men này có hai dạng:dạng bụi dễ làm đục và dạng bông dễ kết tủa, dễ lắng làm trong dịch lên men
Nói chung các nòi thuộc loại này cần các nguồn dinh dưỡng là đường, rượu và axithữu cơ Các nguồn chất sinh trưởng của chúng là axit pantothenic (Vitamin B3), biotin(Vitamin H và B7), mezoinzoit, tiamin (Vitamin B1) và pyridoxin (Vitamin B6)
2 Saccharomyces cerevisiae Meyen ( Theo Lodder- S.cerevisiae Hansen)
Loài nấm men này được dùng trong công nghiệp cồn etylic, men bánh mì và bia.Hình dáng các chủng của nó không khác nhau nhiều lắm so với các chủng cùng giống
Khả năng tạo thành bào tử túi của S.cerevisiae kém hơn S.vini, S.uvarum Loài này có
đặc điểm lên men đường từ tinh bột sâu xa hơn so với các loài khác, vì rằng nó có thểlên men được những dextrin đơn giản
3 Saccharomyces uvarum Beijerinck ( Theo Lodder- S uvarum Beijerinck)
Các chủng của loài này được phân lập từ dịch quả phúc bồn tử, dịch nho lên men
và dịch bia Một số chủng được dùng làm men bánh mì, chúng có độ lắng tốt (loại menchìm) được dùng trong sản xuất bia
Hình thái loài này có dáng chung của các loài thuộc giống Saccharomyces Sự tạo
thành bào tử của loài này xảy ra mạnh mẽ khi nuôi trên môi trường thạch – malt trongkhoảng thời gian đầu sau khi tách được chúng từ điều kiện tự nhiên Có một số chủngloài này để tạo thành dạng bông trong lên men Vì vậy, chúng có thể dùng trong sảnxuất rượu vang và có thể tích tụ trong dịch lên men được 12 – 13o cồn
4 Saccharomyces carlsbergenis Hansen ( Theo Lodder- S.uvarum Beijerinck)
Các chủng của loài này được dùng nhiều trong sản xuất bia Chúng là loại menchìm, hình thái tế bào cũng tương tự các loài men khác cùng giống Khả năng sinh bào
tử yếu và ít gặp
Khả năng lên men đường không kém các loài Saccharomyces khác, nhưng loàimen này có thể phát triển và lên men ở nhiệt độ thấp (5- 10oC) Vì lẽ này Kudreyxevaxếp chúng thành một loài riêng
Trong dịch nho ít gặp loài này Vì vậy, trong sản xuất rượu nho các chủng thuộcloài này không có vai trò gì đặc biệt, nhưng chúng là giống chủ lực trong lên men bia
5 Saccharomyces chevalieri Guillermond
Trang 22Các chủng loài này thường được phân lập từ dịch quả nho tự lên men và từ vangnon của dịch quả cọ dừa.
Loài men này phát triển tốt trên dịch nho và có thể tích tụ tới 16o cồn, song không
vượt được Saccharomyces vini trong lên men rượu vang.
6 Saccharomyces oviformis Osterwalder ( Theo Lodder – Saccharomyces
bayanus Saccardo)
Các chủng thuộc loài men này được phân lập từ dịch quả nho lên men tự nhiênthường dùng trong sản xuất rượu sâm panh (champagne)
Những giống S oviforrmis thuần chủng có tế bào tương tự như các loài khác, phát
triển tốt ở dịch nho, lên men gần như toàn bộ đường trong dịch quả và có thể tích tụ tới
18o cồn (nếu dịch quả có hàm lượng cao hoặc quá trình lên men được bổ sung đường)
Nhu cầu về chất sinh trưởng của loài men này cũng giống như S.vini Trong giai đoạn đầu S.oviformis thường phát triển chậm so với S.vini, nhưng sức chịu đựng cồn lại cao
hơn và như vậy ở giai đoạn cuối lại phát triển tốt hơn Do vậy, nó thường được dùng
kết hợp với S.vini trong lên men rượu vang có hàm lượng đường cao và để sản xuất
vang “khô” (lên men hết đường)
Các chủng S oviformis khi kết thúc lên men thường tạo thành một màng trên bề mặt
dịch Chúng thường được dùng trong sản xuất rượu vang từ dịch quả có hàm lượngđường cao, đặc biệt trong sản xuất sâm panh để có sản phẩm lên men để có nồng độcồn cao tự nhiên
Sacharomyces oviformis cheresiensis
Loài này lên men đường mạnh, có thể tạo thành tới 16,5o cồn trong dịch lên men.Khi kết thúc lên men cũng tạo thành lớp màng trên mặt dịch Trong quá trình bị rượu
bị oxy hóa và kết quả sẽ tạo thành chất axetaldehyt (tới 700mg/l) cùng với các este bayhơi làm cho vang có hương thơm quả anh đào
Điều kiện thích hợp cho men Cheres phát triển tốt là nhiệt độ 18- 20oC và phải đủkhông khí Có thể dùng men này để chữa các loại vang có tích tụ axit axetic và axitlactic (vang có hai loại axit này thường có mùi chuột)
7 Saccharomyces chodati Steiner ( theo Lodder- S.italicus Casteli)
Men này được phân lập từ nước nho lên men tự nhiên ở Thụy Sĩ, không lên menđược sucrose, nhưng lên men tốt glucose và fructose
Trang 24Phần 3 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Các loại đường: Sucrose, maltose, fructose, D-glucose, lactose
Các loại muối: (NH4)2SO4, (NH4)2HPO4, NH4Cl, KNO3.
Các loại cao: yeast extract, meat extract, pepton
Các loại hóa chất khác: agar
Dụng cụ và thiết bị.
- Bể ổn nhiệt JSWB – 22T (Hàn Quốc)
- Cân kỹ thuật PB 602 – S (Thụy Sỹ)
- Cân phân tích AB204 – S (Thụy Sỹ)
- Kính hiển vi LEICA DM750 (Trung Quốc)
- Lò vi sóng EM – G4777S (Nhật Bản)
- Máy cất nước WSC/4D (Anh)
- Máy đo pH bàn Meter S20 (Thụy Sỹ)
- Máy khuấy từ gia nhiệt ARE (Italy)
- Máy vortex ZX3 (Italy)
- Máy ly tâm lạnh Centrifure 5810R(Đức)
3.1.3 Thành phần môi trường thí nghiệm.
Môi trường hoạt hóa và cấy chuyền và thử khả năng sinh enzyme ngoại bào của
Saccharomyces spp.
Thành phần môi trường (g/l): yeast extract 3, pepton 5,sucrose 20 , agar 20, pH 6
3.2 Phương pháp nghiên cứu
3.2.1 Nghiên cứu một số đặc điểm hình thái, hóa sinh của các chủng nấm men sử
dụng trong nghiên cứu.
Trang 25Các dòng nấm men được định danh sơ bộ đến mức độ giống dựa vào các đặcđiểm như: đặc tính nuôi cấy, hình thái tế bào nấm men và kích thước, quá trình nẩychồi của tế bào nấm men, sự hình thành bào tử của tế bào nấm men, hoạt tính phân giảiurea, khả năng đồng hóa đường của nấm men.
3.2.1.1 Đặc điểm khuẩn lạc và hình thái tế bào.
Hình dạng của tế bào nấm men và khuẩn lạc được quan sát sau 2 ngày nuôi cấytrên môi trường YPS
Quan sát đặc điểm khuẩn lạc: mô tả hình dạng, màu sắc, bề mặt, mép viền khuẩn
Mục đích: Quan sát xem nảy chồi đơn cực, lưỡng cực hay nhiều hướng.
Môi trường: Mạch nha – cao nấm men – glucose – pepton.
Cao mạch nha (malt extract) 3g
Cao nấm men (yeast extract) 3g
Nuôi cấy ở 300C sau hai đến ba ngày tiến hành lấy mẫu quan sát quá trình nảy chồi
3.2.1.3 Quan sát khả năng tạo bào tử (Nguyễn Lân Dũng, 2009).
Mục đích: Xác định một chủng có khả năng hình thành bảo tử hay không.
Môi trường: Môi trường Gorodkowa
Trang 26tử thì lại tiếp tục giữ và quan sát từng tuần cho đến 6 tuần liền.
3.2.1.4 Khả năng đồng hóa sucrose và glucose (Nguyễn Lân Dũng, 2009).
Khả năng lên men các loại đường là một trong những chỉ tiêu quan trọng được
sử dụng để phân loại nấm men
Nguyên tắc: Vi sinh vật có khả năng lên men đường tạo ra các sản phẩm: rượu,
các acid hữu cơ, CO2 CO2 được tạo thành sẽ được bẫy lại tạo thành bọt khí trong cácống chuông Durham
Môi trường :
M1: 0.5% cao nấm men
M2: 0.5% cao nấm men + 1% sucrose
M3: 0.5% cao nấm men + 1% glucose
Cách tiến hành:
- Mỗi chủng sẽ được nuôi trong 3 môi trường M1, M2, M3
- Đặt ngược một ống Durham vào trong một ống nghiệm chứa môi trường nuôi cấy.Sau đó hấp khử trùng môi trường
- Cấy 100μl dung dịch huyền phù nấm men có mật độ 10l dung dịch huyền phù nấm men có mật độ 107 tế bào/ml vào các ốngnghiệm chứa môi trường đã được khử trùng Nuôi các ống nghiệm này ở 300C, quansát trong 1 tuần
Trang 27- Nếu có khả năng đồng hóa sucrose và glucose thì ở đáy ống Durham sẽ quan sát thấyviệc tạo CO2 ( Xuất hiện bọt khí trong ống Durham) Nếu khả năng đồng hóa mạnhsinh nhiều CO2 sẽ đẩy các ống Durham nổi lên.
3.2.1.5 Khả năng đồng hóa urea (Nguyễn Lân Dũng, 2009).
Mục đích: Xác định xem một chủng nấm men có khả năng sinh enzyme urease.
Nguyên tắc: Nếu nấm men có khả năng sinh urease sẽ phân giải urea làm giảm pH
môi trường Chất chỉ thị phenol red sẽ chuyển từ màu vàng sang màu hồng
Môi trường: môi trường Christensen
Cách tiến hành: Bổ sung 6ml dung dịch đỏ phenol (phenol red) có nồng độ 0,2%
trong cồn vào môi trường Khử trùng môi trường Đợi nguội đến 500C rồi bổ sung urea(20g urea/ 1100ml môi trường) Sau đó cấy nấm men và giữ ở 260C trong 7 ngày.Quan sát màu môi trường nuôi cấy
3.2.2 Phương pháp lên men và xác định hoạt tính enzyme.
3.2.2.1 Phương pháp lên men chìm.
Trang 28Theo mô tả của Sikander Ali và Ikram Ul-Haq (2007):
- Chuẩn bị giống: 1ml tế bào nấm men ( 1,2.107 tế bào/ ml) được chuyển vàobình vô trùng chứa 25ml môi trường YPS lỏng (-agar) sau đó được nuôi lắc ở
30oC trong 1 ngày với tốc độ lắc 160 vòng/ phút
- Sản xuất invertase được thực hiện bằng phương pháp lên men chìm: 25 ml môitrường lên men được chuẩn bị trong các bình 250ml được vô trùng Một mldịch nấm men đã được nuôi sau 1 ngày được chuyển vào mỗi bình Sau đó, cácbình được lắc với tốc độ 200 vòng/ phút, ở nhiệt độ phòng trong 2 ngày
3.2.2.2 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme invertase.
Phương pháp khuếch tán đĩa thạch:
Xác định hoạt tính của invertase ngoại bào sử dụng phương pháp khuếch tántrên đĩa thạch (Praveen Reddy và cộng sự, 2010) Chủng nấm men được nuôi theophương pháp lên men chìm được trình bày ở mục 3.2.2.1 Dịch nuôi lỏng được li tâm
ở 1000 vòng/ phút ở 4oC trong 10 phút, thu dịch bên trên, nhỏ 100µl dịch enzyme thôvào giếng thạch trên môi trường có bổ sung cơ chất sucrose 3% trong sodium acetate5mM, pH 5.Ủ qua đêm ở nhiệt độ phòng, đĩa thạch được nhuộm bằng dung dịch TTC1% (2,3,5- triphenyl tetrazolium chloride trong NaOH 0,5M) để quan sát vòng màuhồng quanh giếng thạch Nấm men có khả năng sinh invertase ngoại bào sẽ tạo vònghồng quanh giếng thạch Vòng hồng càng lớn thì hoạt tính invertase ngoại bào càngmạnh
Hoạt tính invertase ngoại bào được xác định bằng công thức: r = D – d
Trong đó : r (mm) : Hoạt tính invertase ngoại bào
D (mm): Đường kính vòng có màu hồng
D (mm): Đường kính giếng thạch
Phương pháp so màu DNS.
Nguyên lý : Dựa trên khả năng thủy phân sucrose của invertase thành đường
khử, phản ứng tạo phức màu đỏ sậm với thuốc thử DNS (2–hydroxy–3,5–dinitrobenzoic acid ) Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độđường trong dung dịch
Trang 29Hình 3.1 Phản ứng màu của DNS và đường khử.
Nguồn: The isolation of invertase from baker’s – An introduction to protein
purification strategies (Anthony P Timerman,2012)
Sản phẩm sau phản ứng được xác định bằng phương pháp đo mật độ quang ởbước sóng 540 nm Hàm lượng đường sau phản ứng được xác định thông qua đồ thịđường chuẩn glucose
Cách tiến hành :
Dung dịch cơ chất sucrose 300 mM: cân chính xác 10,26 gam sucrose hòa tantrong 80 ml dung dịch đệm acetate 0,03M ( pH 5) chuyển vào bình định mức, thêmdung dịch đệm tới vạch rồi lắc đều
Dung dịch DNS 1% ( Prakash S Bisen, 2014):
Dung dịch 1.Sodium potassium tartrate: hòa tan 300g sodium potassium tartratetrong 500ml nước
Dung dịch 2 3,5-DNS: hòa tan 10g 3,5-DNS trong 200ml dung dịch NaOH2mol/l
Trộn dung dịch 1 và 2 với nhau rồi lên thể tích 1 lít
Dựng đường chuẩn dung dịch glucose( Prakash S Bisen, 2014)
Hòa tan 500mg glucose vào 80 ml nước cất và chuyển vào bình định mức 100
ml, thêm nước cất đến vạch và lắc đều
- Hút lần lượt 0, 1, 2, 4, 6, 8 và 1 ml dung dịch đường này vào 6 bình định mức50ml Thêm nước cho đến vạch định mức
