PCR là một trong những phát minh quan trọng nhất của thế kỉ 20. Phản ứng này nhằm sao chép tạo ra một lượng lớn phân tử ADN đích, giúp xác định, và phát hiện các mầm bệnh lây nhiễm như HIV, viêm gan hoặc phát hiện các thay đổi về mặt di truyền như đột biến. PCR được thực hiện thông qua 3 bước: biến tính (denaturing), gắn mồi (annealing), và kéo dài chuỗi (extending). ADN được sử dụng làm khuôn có cấu trúc xoắn kép, khi bị biến tính bởi nhiệt nó tách ra thành 2 mạch đơn, một mạch mang nghĩa (sense) và một mạch đối nghĩa (antisense). Khi nhiệt độ hạ xuống đến nhiệt độ gắn mồi, một mồi sẽ gắn đặc hiệu vào mạch mang nghĩa trong khi một mồi khác sẽ gắn vào mạch đối nghĩa. Trong đó, mồi là các trình tự oligonucleotide ngắn có thể bám đặc hiệu vào một vùng trình tự nhất định. Mồi sẽ là điểm khởi đầu để các polymerase có thể thực hiển tổng hợp mạch bổ sung mới cũng như xác định đoạn ADN được khuếch đại. Do đó, việc thiết kế mồi sẽ quyết định mức độ đặc hiệu và năng suất của phản ứng.
Trang 1Thiết kế mồi cho phản ứng PCR (Phần 1)
Nguồn: http://ibsgacademic.com/
Nguồn Ảnh: httpwww.yourgenome.orgfactswhat-is-pcr-polymerase-chain-reaction
PCR là một trong những phát minh quan trọng nhất của thế kỉ 20 Phản ứng này nhằm sao chép tạo ra một lượng lớn phân tử ADN đích, giúp xác định, và phát hiện các mầm bệnh lây nhiễm như HIV, viêm gan hoặc phát hiện các thay đổi về mặt di truyền như đột biến PCR được thực hiện thông qua 3 bước: biến tính (denaturing), gắn mồi (annealing),
và kéo dài chuỗi (extending) ADN được sử dụng làm khuôn có cấu trúc xoắn kép, khi bị biến tính bởi nhiệt nó tách ra thành 2 mạch đơn, một mạch mang nghĩa (sense) và một mạch đối nghĩa (antisense) Khi nhiệt độ hạ xuống đến nhiệt độ gắn mồi, một mồi sẽ gắn đặc hiệu vào mạch mang nghĩa trong khi một mồi khác sẽ gắn vào mạch đối nghĩa Trong
đó, mồi là các trình tự oligonucleotide ngắn có thể bám đặc hiệu vào một vùng trình tự nhất định Mồi sẽ là điểm khởi đầu để các polymerase có thể thực hiển tổng hợp mạch
bổ sung mới cũng như xác định đoạn ADN được khuếch đại Do đó, việc thiết kế mồi sẽ quyết định mức độ đặc hiệu và năng suất của phản ứng
Nguyên tắc thiết kế mồi
Trang 21 Độ dài của mồi: Nên nằm trong khoảng từ 15-30 base, độ dài tối ưu là khoảng từ
18-22base Điều này phụ thuộc vào việc mồi cần đủ dài để gắn đặc hiệu và đủ ngắn để có thể gắn dễ dàng vào khuôn tại nhiệt độ gắn mồi
2 Đầu 3’ và 5’ của mồi: Cần thiết kế sao cho đầu 3’ của mồi xuôi sẽ mở rộng về phía mồi
ngược và đầu 3’ của mồi ngược sẽ mở rộng về phía mồi xuôi khi được gắn vào 2 mạch
bổ sung Nếu ngược lại thì sản phẩm PCR sẽ không thể được tạo ra
Nguồn Ảnh: Antisense Science
3 Nhiệt độ nóng chảy của mồi Tm: Điểm nhiệt độ này được định nghĩa là điểm nhiệt mà
tại đó 50% sợi đôi ADN phân tách nhau và tạo sợi đơn Điểm nhiệt này rất quan trọng ở pha gắn mồi, Tm nên nằm trong khoảng 50-65oC Nhiệt độ nóng của mồi trên 65 độ dễ dẫn đến xu hướng mồi gắn không chính xác Nhiệt độ Tm của hai mồi không chênh lệch nhau quá 2oC, nhiệt độ chênh lệch quá 5oC có thể không thể tạo ra được sản phẩm Công thức tính Tm như sau:
Công thức đơn giản: Tm=4°C x (G + C) + 2°C x (A + T)
Công thức chứa nồng độ muối: Tm = 81.5 +16.6 x (log10[Na+]) + 0.41 x (%(G+C)) – 675/n
Trong đó: [Na+] là nồng độ phân tử muối, n là số base của mồi
Trang 34 Nhiệt độ gắn mồi (Ta): Được tính dựa vào nhiệt động nóng chảy của mồi Nhiệt độ gắn
mồi thấp có thể dẫn đến lượng sản phẩm PCR được tạo ra thấp, do không đủ số lượng
phức hợp lai giữa mồi và khuôn Ngược lại, sản phẩm không đặc hiệu sẽ được tạo ra
nhiều nếu nhiệt độ gắn mồi quá thấp Người ta thường tính nhiệt độ gắn mồi theo công
thức sau:
Ta = 0.3 x Tm(Mồi) + 0.7 Tm (sản phẩm) – 14.9
5 Mật độ GC: Ảnh hưởng đến Tm, do đó mật độ GC nên nằm trong khoảng 50 - 60%.
6 Kẹp GC: Nên có ít nhất một G hoặc C ở đầu 3’ của mồi để giúp cho đầu 3’ của mồi liên
kết mạnh hơn Tuy nhiên nên tránh việc trong 5 base đầu 3’ có nhiều hơn 3 G hoặc C do
có thể gây liên kết đầu 3’ quá mạnh khiến mồi bắt cặp không đặc hiệu
7 Lưu ý cấu trúc bậc 2 trong thiết kế mồi
a) Hình thành hiện tượng kết cặp (dimer): Là hiên tương mồi thay vì gắn vào khuôn sẽ gắn
vào mồi ngược với nó hoặc với chính nó, tạo ra các sản phẩm PCR có kích thước nhỏ
và làm giảm lượng mồi bắt cặp với khuôn Do đó cần tránh tạo ra hiện tượng kết cặp
Hình thành dimer giữa hai mồi
Nguồn ảnh: PREMIER Biosoft
b) Cấu trúc kẹp tóc: có thể được hình thành bởi sự tương tác bên trong chính đoạn mồi
Cần tránh điều này vì làm giảm hiệu quả của phản ứng PCR
8 Lặp: là hiện tượng lặp lại nhiều lần trong trình tự mồi của trình tự đôi (VD:
ATATATATAT) hoặc đơn (VD: GGGGG) Điều này có thể gây bắt cặp nhầm do đó số lần
lặp tối đa của một mồi là 4 lần lặp cho cả hai trường hợp
Trang 49 Tương đồng chéo: Là hiện tượng mà cặp mồi sẽ khuếch đại một gene khác có trong
hỗn hợp ban đầu Để tránh hiện tượng này, mồi sau khi thiết kế cần được đưa
lên BLAST để so sánh và kiểm tra độ đặc hiệu
Thiết Kế Mồi Cho Phản Ứng PCR (Phần
2)
Nguồn ảnh: wikimedia
Bài thiết kế mồi cho phản ứng PCR phần 1 đã nói về nguyên lý để giúp thiết kế cặp mồi
cho một phản ứng PCR Tuy vậy, việc thiết kế mối khó có thể được thực hiện thủ công
vì có quá nhiều thông số phải tính đến Do đó các nhà tin sinh học đã phát triển rất nhiều
phần mềm trợ giúp công việc thiết kế mồi Trong bài này sẽ hướng dẫn chi tiết cách sử
dụng một phần mềm thiết kế mồi phổ biến và miễn phí là Primer-Blast để thiết kế cặp mồi
mong muốn Hơn nữa, bài viết còn giới thiệu và đưa ra sự so sánh giữa một số phần
mềm thiết kế mồi khác nhau
1 Hướng dẫn sử dụng phần mềm thiết kế mồi Primer – Blast
Primer-BLAST là một công cụ được phát triển bởi NCBI giúp người dùng thiết kế mồi đặc
hiệu cho một phản ứng PCR cụ thể Primer-BLAST sử dụng mã nguồn mở Primer3 để
thiết kế mồi, sau đó dùng công cụ BLAST và thuật toán định tuyến tổng quát (global
alignment) để kiểm tra trong cơ sở dữ liệu của NCBI nhằm tránh các sai sót kết cặp,
tương đồng chéo là nguyên nhân dẫn đến phản ứng PCR không hiệu quả
Trang 5Quá trình thiết kế đoạn mồi sử dụng Primer-BLAST thường diễn ra theo 2 bước:
Thu thập khuôn mẫu
Thiết kế đoạn mồi
1.1 Thu thập khuôn mẫu
Một ưu điểm khá lớn khi sử dụng Primer-BLAST là người dùng có thể tận dụng tối đa nguồn cơ sở dữ liệu từ NCBI
Ví dụ sau đây chúng tôi sẽ hướng dẫn thiết kế mồi cho đoạn gen YP_009173871.1 quy định cấu trúc vỏ nhỏ protein của virus viêm gan siêu vi B
Bước 1: Truy cập cơ sở dữ liệu của NCBI ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) chọn “Nucleotide database” và tìm kiếm sử dụng từ khóa “Hepatitis B virus genome”
Bước 2: Kết quả trả về là hàng loạt các dữ liệu bộ gen khác nhau của virus viêm gan siêu
vi B Chúng ta sẽ chọn kết quả đầu tiên Ở phần kết quả số 1 này, sẽ có 3 định dạng là: GenBank, FASTA và Graphics Để thu chuỗi khuôn mẫu chúng ta có thể chọn FASTA hoặc Graphics nhưng chúng tôi có lời khuyên nên sử dụng Graphics của NCBI thì sẽ hiệu quả hơn rất nhiều Vì vậy ở mục này chúng ta sẽ chọn Graphics để đánh giá trực quan toàn bộ bộ gen của virus (xem hình 1)
Trang 6Bước 3: Bộ gen của virus được biểu diễn dưới dạng hình ảnh trực quan (Hình 2) Toàn
bộ các gen đều được chú thích và khi click vào từng gen sẽ hiện ra thông tin chi tiết về
gen đó
Trong ví dụ này, chúng ta sẽ chọn gen YP_009173871.1 quy định cấu trúc vỏ nhỏ protein
Trang 7Bước 4: Bảng nhỏ hiện lên sau khi chúng ta chọn gen có chứa dòng “FASTA View” Click
vào vào mục 1 bắt đầu bằng ký hiệu NC_ sẽ hiện ra chuỗi của gene này dưới dạng file
FASTA (hình) Vậy bước đầu thu thập khuôn mẫu đã hoàn thành trên cơ sở dữ liệu NCBI
Lưu ý: Như ở phần Graphics trên còn cung cấp cho chúng ta những đoạn gen theo chiều
ngược lại (Gen mang màu đen) Vì vậy trước khi thực hiện thiết kế mồi, chúng ta cần
phải đảo ngược đoạn khuôn mẫu này lại cho đúng chiều 5’-3’
Trang 81.2 Thiết kế đoạn mồi
Bước 1: Truy cập trang chủ của phần mềm Primer-BLAST tại địa
chỉ:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ Giao diện chính của
Primer-BLAST như hình
(1) Khung nhập dữ liệu chuỗi khuôn mẫu: Nhập chuỗi dưới dạng file FASTA
(2) Thông số về nhiệt độ nóng chảy (Tm )của đoạn mồi : điều chỉnh giống với thông số
của nguyên tắc thiết kế mồi ở phần 1 của loạt bài viết về thiết kế mồi cho phản ứng PCR
Ngoài ra còn rất nhiều các thông số nâng cao khác nhưng ở bài này chúng ta sẽ chỉ đi
về mặt cơ bản Vì thế hầu hết các thông số sẽ ở dạng mặc định
Bước 2: Đánh giấu bỏ dòng “Enable search for primer pairs specific to the intended PCR
template” để bỏ qua việc tìm kiếm cặp mồi có sẵn trong cơ sở dữ liệu của NCBI Sau đó
chúng ta thu về thiết kế primer bằng cách ấn vào ô “Get Primers”
Trang 9Cuối cùng, kết quả đoạn mồi thu được sẽ ở 2 dạng: hình ảnh trực quan và thông tin chi
tiết về kết quả
Trang 102 Đánh giá các phần mềm phổ biến hiện nay
Phần mềm FastPCR là công cụ tích hợp hàng loạt các tính năng toàn diện và chuyên nghiệp dùng để thiết kế mọi loại mồi cho PCR Mặc dù vậy, điểm yếu của phần mềm này là sự quá phức tạp khi sử dụng
Primer-BLAST là một phần mềm online được cung cấp bởi The National Center forBiotechnology Information (NCBI) Phần mềm này được tạo nên nhờ sự kết hợp giữa Primer3 và BLAST Nổi trội nhờ khả năng sử dụng cơ sở dữ liệu lớn của NCBI bằngBLAST nhưng là một công cụ online, Primer-BLAST không tránh khỏi những hạn chế
Primer3 là một phần mềm mã nguồn mở cực kỳ nổi tiếng và BatchPrimer3 là bản phát triển sau này Đặc điểm nổi bật của BatchPrimer là việc chạy trên nền web online và khả năng chạy thông lượng lớn đầu vào giúp BatchPrimer3 là một trong những công cụ phổ biến trong thiết kế mồi cho PCR nhằm thay thế cho người anh Primer3
Đặc điểm
jPCR Tool & FastPCR
NCBI/Primer-BLAST (Primer3)
BatchPrimer3 (Primer3)
IDT SciTools:
PrimerQuest, OligoAnalyzer
Giới hạn độ dài khuôn
mẫu (nt) Không giới hạn 50,000 Chưa rõ Không giới hạn Không giới hạn
Cho phép chạy thông
lượng lớn với hàng loạt
khuôn mẫu và hàng loạt
mục tiêu trên khuôn cùng
Tùy chọn PCR cho khuôn
Degenerated nucleotides
at all operation (Tm
calculation, searches and
Cho phép sửa đổi LNA
(Nucleotide đã khóa)
Tính toán nhằm tối ưu
hóa nhiệt độ anneal sử
Trang 11Đặc điểm
jPCR Tool & FastPCR
NCBI/Primer-BLAST (Primer3)
BatchPrimer3 (Primer3)
IDT SciTools:
PrimerQuest, OligoAnalyzer
Kiểm tra đầu 3’ kết thúc
của mồi giao và tự tạo
Kiểm tra mồi nội giao và
Tìm kiếm khuôn mẫu sử
Kiểm tra khuôn mẫu dựa
Bảng 1: So sánh các công cụ thiết kế Primer và phân tích oligonucleotide phổ biến hiện
nay (http://primerdigital.com/tools/soft.html)
Ghi chú: Bảng so sánh trên mang tính chất tương đối vì do công ty cung cấp phần mềm
jPCR Tool &FastPCR thống kê, vì thế khả năng các đặc điểm mang tính chất có lợi hơn
so với các công cụ khác Mặc dù vậy, đây là tài liệu đáng để tham khảo
