TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --- Nguyễn Thanh Tâm XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN MỘT SỐ CHỦNG HUMAN PAPILLOMAVIRUS NGUY CƠ CAO GÂY UNG THƯ CỔ TỬ CUNG Ở VIỆT NAM BẰNG KỸ THUẬT REALT
Trang 1TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
-
Nguyễn Thanh Tâm
XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN MỘT SỐ CHỦNG HUMAN PAPILLOMAVIRUS NGUY CƠ CAO GÂY UNG THƯ CỔ TỬ CUNG Ở VIỆT NAM BẰNG KỸ THUẬT
REALTIME PCR
LUẬN VĂNTHẠC SĨ KHOA HỌC
Hà Nội - 2016
Trang 2TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
-
Nguyễn Thanh Tâm
XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN MỘT SỐ CHỦNG HUMAN PAPILLOMAVIRUS NGUY CƠ CAO GÂY UNG THƯ CỔ TỬ CUNG Ở VIỆT NAM BẰNG KỸ THUẬT
REALTIME PCR
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60420114
LUẬN VĂNTHẠC SĨ KHOA HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS NGUYỄN VÂN TRANG
TS LÊ HỒNG ĐIỆP
Hà Nội – 2016
Trang 3LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Vân Trang, người thầy đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn này
Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn TS Lê Hồng Điệp cùng các thầy giáo,
cô giáo trong khoa Sinh học, đặc biệt là các thầy giáo, cô giáo trong bộ môn Sinh lý Thực vật và Hóa sinh học đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, giảng dạy
và dìu dắt tôi trong thời gian thực hiện luận văn cũng như trong suốt thời gian học tập tại trường
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các anh chị, các bạn làm việc tại Phòng Miễn dịch Vắc xin –Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương đã tận tình giúp
đỡ và chỉ bảo tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn tại phòng
Cuối cùng, tôi vô cùng biết ơn gia đình và bạn bè đã luôn khích lệđộng viên tôi trong suốt thời gian qua
Hà Nội, ngày tháng năm 2016
Học viên
Nguyễn Thanh Tâm
Trang 4BẢNG KÍ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ADN/ ARN (Deoxi)ribonucleic acid Vật chất di truyền
HPV Human Papillomavirus Papillomavirus gây bệnh trên người
LRC Long Control Region Vùng kiểm soát dài của gen
PCR Polymerase Chain Reaction
URR Upstream Regulatory Region Vùng điều hòa của gen
Trang 5MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC BẢNG………
DANH MỤC CÁC HÌNH………
MỞ ĐẦU 6
CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 8
1.1 Giới thiệu về Human Papillomavirus 8
1.1.1 Đặc điểm hình thái của HPV 8
1.1.2 Đặc điểm sinh học phân tử 8
1.1.3 Phân loại HPV Error! Bookmark not defined 1.2 HPV và ung thư cổ tử cung Error! Bookmark not defined 1.2.1 Tình hình nhiễm HPV tại Việt Nam và trên thế giới Error! Bookmark not defined 1.2.2 Đường lây truyền của HPV Error! Bookmark not defined 1.2.3 Các bệnh lý thường gặp do HPV, cách phòng nhiễm và điều trị Error! Bookmark not defined
1.2.4 Chu kỳ nhân lên và cơ chế gây bệnh của HPV Error! Bookmark not defined 1.2.5 Các phương pháp phát hiện HPV Error! Bookmark not defined
CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Error! Bookmark not defined
2.1 Vật liệu Error! Bookmark not defined 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu Error! Bookmark not defined 2.1.2 Sinh phẩm và vật tư tiêu hao Error! Bookmark not defined 2.1.3 Máy móc và thiết bị Error! Bookmark not defined 2.2 Phương pháp nghiên cứu Error! Bookmark not defined 2.2.1 Xây dựng kỹ thuật realtime PCR phát hiện các chủng HPV 16, 18 và 33/52 Error! Bookmark not defined
2.2.2 Tạo chứng dương và xác định giới hạn phát hiện của kỹ thuật realtime PCR phát hiện
các chủng HPV 16, 18 và 33/52 Error! Bookmark not defined 2.2.3 Thẩm định phương pháp phát hiện chủng HPV16, 18, và 33/52 Error! Bookmark not defined
2.3 Nội dung thực hiện Error! Bookmark not defined
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Error! Bookmark not defined
3.1 Xây dựng kỹ thuật Realtime PCR phát hiện các chủng HPV 16, 18 và 33/52 Error! Bookmark not defined
3.1.1 Kỹ thuật realtime PCR đơn cặp primer và probe Error! Bookmark not defined 3.1.2 Kỹ thuật realtime PCR đa cặp primer và probe Error! Bookmark not defined 3.2 Tạo chứng dương và xác định giới hạn phát hiện của kỹ thuật realtime PCR phát hiện các chủng HPV 16, 18 và 33/52 Error! Bookmark not defined 3.2.1 Khuếch đại trình tự đích Error! Bookmark not defined 3.2.2 Nhân dòng gen tạo chứng dương Error! Bookmark not defined 3.2.3 Xác định giới hạn phát hiện của kỹ thuật Realtime PCR Error! Bookmark not defined
3.3 Thẩm định phương pháp phát hiện các chủng HPV16, 18 và 33/52Error! Bookmark not defined
3.3.1 Xác định độ chính xác của kỹ thuật realtime PCR phát hiện các chủng HPV16, 18 và
33/52 Error! Bookmark not defined
3.3.2 Xác định độ chụm (hệ số tái lâp và hệ số lặp lại) của kỹ thuật realtime PCR phát hiện
các chủng HPV16, 18 và 33/52 Error! Bookmark not defined 3.3.2.1 Xác định hệ số lặp lại của phương pháp Error! Bookmark not defined 3.3.2.2 Xác định hệ số tái lập của phương pháp Error! Bookmark not defined
Trang 63.3.3 Xác định độ đặc hiệucủa kỹ thuật realtime PCR phát hiện các chủng HPV16, 18 và
33/52 Error! Bookmark not defined
3.3.4 Xác định độ nhạycủa kỹ thuật realtime PCR phát hiện các chủng HPV16, 18 và 33/52
Error! Bookmark not defined
KẾT LUẬN Error! Bookmark not defined KIẾN NGHỊ Error! Bookmark not defined
TÀI LIỆU THAM KHẢO 9
DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Các type HPV và các bệnh có liên quan 11
Bảng 1.2 Tỷ lệ nhiễm HPV trên một số tỉnh thành phố tại Việt Nam 13
Bảng 1.3 Các cặp mồi dùng cho PCR phát hiện HPV……… 22
Bảng 2.1 Thành phần kỹ thuật realtime PCR đơn cặp primer và probe 29
Bảng 2.2 Thành phần kỹ thuật realtime PCR đa cặp primer và probe……….29
Bảng 2.3 Thành phần phản ứng khuếch đại trình tự đích 30
Bảng 2.4 Chu kì nhiệt của phản ứng khuếch đại trình tự đích 30
Bảng 3.1 Kết quả kỹ thuật realtime PCR đơn cặp primer và probe phát hiện HPV16….34 Bảng 3.2 Kết quả kỹ thuật realtime PCR đơn cặp primer và probe phát hiện HPV18….36 Bảng 3.3 Kết quả kỹ thuật realtime PCR đơn cặp primer và probe phát hiện HPV33/52.37 Bảng 3.4 Kết quả kỹ thuật realtime PCR đơn cặp primer và probe IC……… 38
Bảng 3.5 Kết quả kỹ thuật realtime PCR 4 cặp primer và probe phát hiện HPV16, HPV18 và HPV33/52……… 39
Bảng 3.6 Kết quả phản ứng Realtime PCR đa cặp primer và probe với chứng dương….47 Bảng 3.7.Kết quả thí nghiệm xác định độ chính xác của phương pháp………50
Bảng 3.8.Kết quả thí nghiệm xác định hệ số lặp lại của phương pháp……… 52
Bảng 3.9 Giá trị trung bình và độ lệch chuẩn của thí nghiệm đánh giá hệ số lặp lại…….53
Bảng 3.10.Kết quả thí nghiệm xác định hệ số tái lập của phương pháp………55
Bảng 3.11 Giá trị trung bình và độ lệch chuẩn của thí nghiệm đánh giá hệ số tái lập….57 Bảng 3.12 Kết quả thí nghiệm xác định độ đặc hiệu của phương pháp………58
Bảng 3.13.Kết quả thí nghiệm xác định độ nhạy của phươngpháp……… 61
Trang 7DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1 Hạt vi rút của HPV ……… 3
Hình 1.2 Cấu trúc bộgen của Papillomavirus và HPV 16 ……….4
Hình 1.3 Cây phả hệ của 118 genotype của Papilomavirus dựa trên trình tự gen vùng L1 ORF 9
Hình 1.4 Tỷ lệ nhiễm HPV ở nữ giới trên thế giới 12
Hình 1.5 Chu kỳ nhân lên của HPV ……….16
Hình 1.6 Phương pháp lai phân tử phát hiện HPV 21
Hình 3.1 Đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang của phản ứng Realtime PCR đơn cặp primer và probe phát hiện HPV16 ……….35
Hình 3.2 Đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang của kỹ thuật realtime PCR đơn cặp primer và probe phát hiện HPV18 ………36
Hình 3.3 Đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang của kỹ thuật realtime PCR đơn cặp primer và probe phát hiện HPV33/52 ……… 37
Hình 3.4 Đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang của kỹ thuật realtime PCR đơn cặp primer và probe IC ………39
Hình 3.5 Đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang của kỹ thuật realtime PCR 4 cặp primer và probe phát hiện HPV16, 18 và 33/52 ………40
Hình 3.6 Ảnh điện di sản phẩm khuếch đại trình tự HPV16E6-E7, HPV18L1 …………41
Hình 3.7 Ảnh điện di sản phẩm khuếch đại trình tự HPV52L1 ……… 42
Hình 3.8 Kiểm tra kết quả nhân dòng trình tư HPV16E6-E7 43
Hình 3.9 Kết quả tinh sạch Plasmid mang đoạn chèn HPV16E6-E7 44
Hình 3.10 Kiểm tra kết quả nhân dòng trình tự HPV18L1 44
Hình 3.11 Kết quả tinh sạch Plasmid mang đoạn chèn HPV18L1 45
Hình 3.12 Kiểm tra kết quả nhân dòng trình tự HPV52L1 46
Hình 3.13 Kết quả tinh sạch Plasmid mang đoạn chèn HPV52L1 46
Hình 3.14 Kết quả kỹ thuật realtime đa cặp primer và probe với chúng dương ……… 48
Hình 3.15 Đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang của thí nghiệm xác định độ chính xác ……….51
Hình 3.16 Đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang của thí nghiệm xác định hệ số lặp lại ……….52
Hình 3.17 Biến động giá trị Ct của thí nghiệm đánh giá hệ số lặp lại ……… 53
Hình 3.18.Đường tín hiệu huỳnh quang của thí nghiệm xác định hệ số tái lập của kỹ thuật viên 1 ……… 56
Hình 3.19.Đường tín hiệu huỳnh quang của thí nghiệm xác định hệ số tái lập của kỹ thuật viên 2 ……… 56
Hình 3.20.Đường tín hiệu huỳnh quang của thí nghiệm xác định hệ số tái lập của kỹ thuật viên 3 ……… 56
Hình 3.21 Biến động giá trị Ct của thí nghiệm đánh giá hệ số tái lập ……… 57
Hình 3.22.Đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang của thí nghiệm đánh giá độ đặc hiệu ……….59
Hình 3.23 Đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang của thí nghiệm đánh giá độ nhạy … 62
Trang 8MỞ ĐẦU
Human papillomavirus (HPV) là tác nhân thường gặp nhất trong các nhiễm trùng lây truyền qua đường tình dục và là nguyên nhân quan trọng dẫn tới ung thư cổ tử cung (UTCTC), loại ung thư xếp thứ tư trong các loại ung thư mà nữ giới thường mắc phải và xếp thứ hai với nữ giới độ tuổi 15-44[41]
HPV không chỉ có mối liên quan mật thiết với UTCTC mà còn có vai trò quan trọng trong các nguyên nhân dẫn đến ung thư hậu môn, âm đạo, dương vật, ung thư phổi
và một số ung thư vùng hầu họng Đồng thời, HPV còn là nguyên nhân của nhiều bệnh lý lâm sàng trên da và niêm mạc như hạt cơm, sùi mào gà sinh dục-hậu môn, u nhú thanh quản trẻ sơ sinhv.v…[32]
Hàng năm trên thế giới ước tính có khoảng 529.000 ca mắc mới UTCTC, tử vong khoảng 275.000 trường hợp, trong đó 85% tổng số các trường hợp bệnh gặp ở những nước đang phát triển[21] Mỗi năm, Châu Á có thêm khoảng 312.000 bệnh nhân UTCTC, chiếm 59% trường hợp mắc mới trên toàn thế giới – đặc biệt ở khu vực Nam Á và Đông Nam Á, nơi có tỷ lệ nhiễm HPV cao nhất trong châu lục[21, 34].Cùng với sự lây nhiễm HPV trong cộng đồng, UTCTC thực sự trở thành gánh nặng bệnh tật toàn cầu, gây ảnh hưởng nặng nề đến sức khỏe và tâm lý của nữ giới
Tại Việt Nam, theo thống kê của Tổ chức Y tế thế giới năm 2012, UTCTC hiện đang là loại ung thư chiếm tỷ lệ cao ở nữ giới, xếp thứ 2 trong số các loại ung thư mà nữ giới độ tuổi 15-44 hay mắc phải, với hơn 5000 ca nhiễm mới (tỷ lệ: 8.1/100.000 phụ nữ)
và tử vong hơn 2000 trường hợp mỗi năm[40] Điều đặc biệt quan tâm là phần lớn các trường hợp UTCTC thường được phát hiện ở giai đoạn muộn, trong khi quá trình diễn biến từ nhiễm virus đến ung thư thường trải qua thời gian dài Quá trình tiến triển từ mức
dộ loạn sản nhẹ, loạn sản vừa, loạn sản nặng đến ung thư tại chỗ (giai đoạn tổn thương có thể phục hồi) đến giai đoạn ung thư xâm nhập có thể kéo dài từ 10 – 25 năm[22].Đây chính là cơ hội cho việc phát hiện nhiễm HPV, sàng lọc người có nguy cơ mắc ung thư cổ
tử cung nhằm giúp quá trình điều trị hiệu quả các tổn thương tiền ung thư và ung thư giai đoạn sớm.Hiện nay ở Việt Nam, xét nghiệm tế bào mô bệnh học (Pap smear) đã được đưa vào thành thường quy trong chương trình sàng lọc UTCTC, các xét nghiệm HPV cũng đã phổ biến tuy nhiên chi phí còn cao đối với các kit chẩn đoán đã thương mại hóavà yêu cầu đảm bảo chất lượng xét nghiệm với các xét nghiệm trong nước[8]
Trang 9Với tầm quan trọng và ý nghĩa của việc xác định genotype HPV, cũng như xuất
phát từ thực tiễn nêu trên, đề tài “Xây dựng phương pháp phát hiện một số chủng Human Papillomavirus có nguy cơ cao gây ung thư cổ tử cung ở Việt Nam bằng kỹ thuật Realtime PCR” được thực hiện với mục tiêu sau:
1 Xây dựng phương pháp phát hiện chủng HPV 16, 18 và 33/52 bằng kỹ thuật multiplex Realtime PCR
2 Thẩm định phương pháp phát hiện các chủng HPV 16, 18, 33/52 bằng kỹ thuật multiplex realtime PCR trên mẫu dịch quét cổ tử cung
Đề tài nàyđược chúng tôi thực hiện tại phòng Miễn dịch Vắc xin,ViệnVệ sinh Dịch tễ Trung ương
Trang 10CHƯƠNG1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu về Human Papillomavirus
Papillomaviruslàcác thành viên trong họ Papillomaviridae, được tìm thấy trong rất
nhiều loài động vật có vú trong đó có con người Các loài vật chủ khác nhau sẽ nhiễm các loại Papillomavirus đặc thù cho loài đó.CácPapillomavirusgây bệnh cho người gọi là Human papillomavirus(HPV)
1.1.1Đặc điểm hình thái của HPV
HPV là nhóm virus có kích thước nhỏ, không vỏ.Hạt virus có đường kính 52-55nm, vỏ gồm 72 đơn vị capsomer.Mỗi đơn vị capsid gồm một pentamer của protein cấu trúc L1 kết hợp với một protein L2 (protein này là thành phần kháng nguyên được sử dụng trong phản ứng miễn dịch đặc hiệu)
Hình 1.1.Hạt vi rút của HPV[14]
Cả hai protein cấu trúc đều do virus tự mã hóa: Protein capsid chính (L1) có kích thước khoảng 55 kDa và chiếm khoảng 80% tổng số protein của virus Protein capsid phụ (L2) có kích thước khoảng 70 kDa[14]
1.1.2Đặc điểm sinh học phân tử
1.1.2.1 Cấu trúc hệ gen
HPV là virus có vật liệu di truyền là ADN, mạch đôi không hoàn chỉnh, tồn tại dạng siêu xoắn hình vòng (circular ds-ADN).ADN của virus liên kết với histone tạo
Trang 11TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt
1 Dung N T N D (2004), "Khảo sát sự liên quan giữa mẹ nhiễm HPV và con bệnh u nhú
thanh quản," Thời sự Y Dược học, 4, 4
2 Hiếu N T H (2004), "Tần xuất nhiễm HPV ở phụ nữ thành phố Hồ Chí Minh," Thời sự
Y Dược học, 4, 5
3 Trung N T H (2007), "HPV và tổn thương cổ tử cung," Y Học TP Hồ Chí Minh, 3, 4
4 Vân P H V (2009), "PCR và real-time PCR: Các vấn đề cơ bản và các áp dụng thường
gặp Sinh học phân tử," Nhà xuất bản Y học, 27
5 Văn T T V (2010), "PCR và một số kỹ thuật Y sinh học phân tử Sinh học phân tử,"
Nhà xuất bản Y học, 68
Tài liệu tiếng Anh
6 A B.-P (2009), "Molecular Signature of HPV-Induced Carcinogenesis: pRb, p53 and
Gene Expression Profiling," Current genomics, 10, 9
7 Anco M B K., Wim Q., Leen-J.D (2005), "Molecular diagnosis of human
papillomavirus (HPV) infections," Journal of Clinical Virology, 32, 9
8 Bao Y.P S J S., Qiao Y.L., ACCPAB members (2008), "Human papillomavirus type
distribution in women from Asia: a meta-analysis," International Journal of
Gynecologycal cancer, 18, 10
9 Bernard H.U B R D., de Villiers E.M, et al (2010), "Classification of papillomaviruses
(PVs) based on 189 PV types and prodương tínhal of taxonomic amendments," Virology,
401, 10
10 Boccardo E L A V L (2010), "The role of inflammation in HPV carcinogenesis,"
Carcinogenesis, 31, 8
11 Bodaghi S W L V., Roby G., Ryder C., et al (2010), "Could human papillomaviruses be
spread through blood?," Journal of Clinical Microbiology, 43, 7
12 Bontkes H J., T.D deGruijl, J.M.Walboomers, J.T.Schiller, J Dillner, T.J Helmerhorst,
R.H.Verheijen, R.J.Scheter, and C.J.Meijer (1999), "Immune responses again human papillomavirus (HPV) type 16 virus-like particles in a cohort study of women with cervical intraepithelial neoplasia II Systemic but not local IgA responses correlate with
clearance of HPV-16," J.Gen Virol, 80, 9
13 Burchell AN W R., de Sanjose S, FrancoEL (2006), "Chapter 6 epiderniology and
transmission dynamics of genital HPV infection vaccine 2006," Vaccine, 24, 10
14 Burd E M (2003), "Human papillomavirus and cervical cancer," Clin Microbiol Rev, 16,
1-17
15 Chan P K., M.Y Chan, W.W.Li, D.P.Chan, J.L.Cheung, and A.F.Cheung (2001),
"Association of human beta-herpesvirus with the development of cervical cancer; by
