Đại học quốc gia hà nội Tr-ờng đại học khoa học tự nhiên ---***--- TRẦN THỊ THÙY LINH NGHIấN CỨU VÀ NÂNG CAO KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP CÁC CHẤT Cể HOẠT TÍNH KHÁNG NẤM TỪ CHỦNG Serratia
Trang 1Đại học quốc gia hà nội Tr-ờng đại học khoa học tự nhiên
-*** -
TRẦN THỊ THÙY LINH
NGHIấN CỨU VÀ NÂNG CAO KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP CÁC CHẤT Cể HOẠT TÍNH KHÁNG NẤM
TỪ CHỦNG Serratia marcescens DT3
LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC
Hà Nội – 2016
Trang 2Đại học quốc gia hà nội Tr-ờng đại học khoa học tự nhiên
-*** -
TRẦN THỊ THÙY LINH
NGHIấN CỨU VÀ NÂNG CAO KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP CÁC CHẤT Cể HOẠT TÍNH KHÁNG NẤM
TỪ CHỦNG Serratia marcescens DT3
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC
Giảng viên h-ớng dẫn: TS Đỗ Thị Tuyờn
TS Lờ Hồng Điệp
Hà Nội - 2016
Trang 3Trần Thị Thùy Linh 1 K22
MỞ ĐẦU
Hàng năm trên thế giới, bệnh cây gây ra những tổn thất to lớn cho sản xuất nông nghiệp Chúng phá hủy đến 537,3 triệu tấn các loại nông sản chủ yếu, chiếm 11,6% tổng sản lượng nông nghiệp trên thế giới Trong các loại bệnh cây thì bệnh do nấm gây ra
chiếm khoảng 83%, trong đó bệnh do nấm Fusarium và Rhizoctonia chiếm tỉ lệ tương đối lớn Nấm bệnh Fusarium và Rhizoctonia gây bệnh trên nhiều loại cây rau quả và cây
lương thực như lạc cà chua, khoai tây, cà phê, tiêu Chúng có khả năng tồn tại trong đất trong một thời gian dài, phát sinh và gây hại ngay từ giai đoạn cây con và kéo dài cho tới khi thu hoạch nếu không áp dụng các biện pháp phòng trừ triệt để
Biện pháp phòng trừ các bệnh hại cây trồng phổ biến nhất cho đến nay vẫn là sử dụng các loại thuốc hóa học.Mặc dù có ưu điểm là phổ tác dụng rộng, hiệu quả và tác dụng nhanh nhưng thuốc hóa học ngày càng bộc lộ rõ những nhược điểm như hiệu quả ngày càng kém và gây ra ô nhiễm môi trường Chính vì thế việc sử dụng các chế phẩm sinh học để phòng trừ các bệnh cây trồng do vi sinh vật gây ra đang là xu hướng chủ yếu Các chế phẩm này đang được sử dụng rộng rãi nhằm tạo ra một nền nông nghiệp hữu cơ
an toàn và bền vững
Serratia là một giống trực khuẩn Gram âm, kị khí tùy nghi,
họ Enterobacteriaceae.Chúng có khả năng sinh ra các chất có hoạt tính kháng nấm đã được sử trong kiểm soát nhiều bệnh hại cây trồng khác nhau.Trên thế giới đã có nhiều
công trình nghiên cứu ứng dụng Serratia để phòng trừ nấm để bảo vệ cây trồng, nhiều
sản phẩm được sản xuất và thương mại hóa.Tuy nhiên, kết quả đạt được trong nghiên cứu
và sử dụng các chế phẩm sinh học vẫn còn hạn chế Chi phí thuốc bảo vệ thực vật trên thế giới chỉ chiếm 1,9% tổng giá trị của các loại thuốc bảo vệ thực vật Vì vậy, việc tăng cường nghiên cứu phát triển chế phẩm sinh học diệt nấm là cần thiết
Xuất phát từ nhu cầu thực tế chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu và nâng cao
khả năng sinh tổng hợp các chất có hoạt tính kháng nấm từ chủng
Serratiamarcescens DT3’’ nhằm thực hiện các nội dung nghiên cứu:
Trang 4Luận văn thạc sĩ Khoa Sinh học
1 Chọn lọc được môi trường nuôi cấy chủng Serratia marcescensDT3 có khả năng
sinh tổng hợp các chất có hoạt tính kháng nấm cao nhất
2 Tối ưu môi trường và các điều kiện nuôi cấy làm tăng khả năng sinh tổng hợp các hoạt chất kháng nấm
3 Tách chiết, tinh sạch hoạt chất có hoạt tính kháng nấm từ chủng Serratia
marcescen DT3
Trang 5Trần Thị Thùy Linh 3 K22
CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Vi khuẩn Serratia
1.1.1 Khái quát về chủng Serratia marcescens
Serratia marcescens là một trong mười bốn loài đã được công nhận của chi Serratia Serratia marcescens được phát hiện vào năm 1819 tại Ý Các chủng vi khuẩn Serratia marcescens phân bố trong đất, nước, thực vật Chúng phát triển ở nhiệt độ từ 5-
đó thì một số chủng Serratia marcescens lại được sử dụng trong các nghiên cứu về y học,
quân sự, nông nghiệp…[31]
Serratia marcescenslà các vi khuẩn hình que Màng có cấu trúc đặc trưng của vi
khuẩn Gram âm, di động sinh bào tử có thành tế bào mỏng được cấu tạo từ một lớp peptidoglycan được bao bọc bởi một lớp màng bên ngoài Các màng ngoài có lipopolysaccharides là một loại phospholipid đặc biệt gồm các axit béo được gắn vào một dimer phosphate glucosamine.Một glucosamine gắn liền với một polysaccharides cốt lõi
mà mở rộng đến các polysaccharides O Các màng ngoài cũng là một phương tiện để điều tiết sự hấp thụ chất dinh dưỡng và loại trừ các độc tố
Chủng Serratia marcescen DT3 được phân lập từ mẫu đất ở Việt Nam
Ngành: Proteobacteria
Lớp: Gamma Proteobacteria
Bộ: Enterobacteriales
Họ: Enterobacteriaceae
Chi: Serratia
Loài: Serratia marcescens
Hình 1.1 Hình ảnh chủng Serratia marcescens DT3 trên môi trường LB đặc
Trang 6Luận văn thạc sĩ Khoa Sinh học
1.2 Bệnh cây trồng do nấm Fusarium và Rhizoctoniagây ra
1.2.1 Đặc điểm sinh học của nấm Fusarium và Rhizoctoniahại cây trồng
Fusarium là một họ lớn của nấm sợi phân bố rộng rãi trong đất và gắn với thực
vật Hầu hết các loài đều sống kí sinh vô hại và là thành viên tương đối phong phú của
cộng đồng vi sinh vật đất Fusarium oxysporum là phân tán rộng nhất của các loài
Fusarium được tìm thấy trên toàn thế giới.F oxysporum không có giai đoạn sinh dục
điển hình, nhưng sản xuất ba loại bào tử vô tính: bào tử nhỏ, bào tử đính lớn và bào tử hậu.Bào tử nhỏ là các bào tử sản xuất nhiều nhất, nó có hình bầu dục, hình elip hoặc thận được định hình và sản xuất trên sợi nấm trên bề mặt.Bào tử đính lớn, có 3-5 tế bào và nhọn hai đầu hoặc cạnh cong, được tìm thấy trên khối bào tử phân trên bề mặt của cây bị bệnh Bào tử hậu được hình thành đơn lẻ hay theo cặp nhưng đôi khi được tìm thấy trong các cụm hoặc chuỗi ngắn Nó là bào tử tròn có vách dày được sản xuất trên một sợi nấm hoặc trong bào tử đính lớn.Bào tử hậu không giống như các bào tử khác có thể tồn tại trong đất một thời gian dài[4,19]
Hình 1.2 Hình thái nấm F oxysporum trên đĩa thạch PDA
Nấm F oxysporum là một tác nhân gây bệnh đất rất phổ biến với lá cây mầm, làm
chết và phân hủy chất hữu cơ trong cây.Nó tồn tại trong đất như sợi nấm và các loại bào
tử nhưng thường tồn tại trong đất như bào tử hậu Lây lan mầm bệnh theo hai cách cơ bản
lây lan khoảng cách ngắn qua bắn nước, bằng thiết bị trồng trọt và khoảng cách dài qua
Trang 7Trần Thị Thùy Linh 5 K22
KẾT LUẬN
đậu tương 2% chúng tôi đã chọn được môi trường LB để nuôi chủng S marcescens DT3
cho hoạt tính kháng nấm mạnh Dịch chiết ngoại bào ở nồng độ 50%, đã ức chế được
71%- 81% sự sinh trưởng và phát triển của chủng nấm F oxyporum và R solani
2 Tối ưu môi trường và một số điều kiện nuôi cấy chủng S marcescens DT3 cho
hoạt tính kháng nấm cao nhất Môi trườngLB sau tối ưu bao gồm: 1,25% pepton , 1%
kháng nấm ở môi trường tối ưu đã tăng so với môi trường trước tối ưu lên 15 lần đối với
nấm R solani và 2,6 lần đối với nấm F oxyporum
56 kDa từ chủng S marcescens DT3 Proteinkhá bền với nhiệt độ khi được ủ ở các nhiệt
triển của nấm F oxyporum và R solani Proteinase K không ảnh hưởng đến hoạt tính
kháng nấm với nồng độ ủ từ 0,5- 4 µg Đặc biệt protein tinh sạch có khả năng kháng nấm
F oxyporum mạnh
KIẾN NGHỊ
Hoàn thiện quy trình tinh sạch protein có hoạt tính kháng nấm ở quy mô lên men lớn ứng dụng tạo sản phẩm sinh học có khả năng kháng nấm phục vụ phát triển nông nghiệp bền vững
Trang 8Luận văn thạc sĩ Khoa Sinh học
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
độc thuốc bảo vệ thực vật.”
một số cây trồng vùng Hà Nội năm 2005-2006 ”
(2011), “Tinh sạch protein có hoạt tính kháng nấm từ chủng Bacillus subtilis XL62”, Tạp chí Công Nghệ Sinh Học, 3, pp 1811-4989
4 A Đoàn Thị Thanh (2005), “Nghiên cứu đa dạng sinh học của các isolates nấm
Fusarium spp”, Tập san BVTV 1
gây hại bắp cải và bước đầu khảo sát biện pháp phòng trừ ”, Tạp chí BVTV, 192,
pp 18-21
Ngọc Dũng (2006), “Nghiên cứu cơ chế kháng nấm Fusarium oxysporum gây bệnh ở cây trồng của một số chủng vi khuẩn Pseudomonas huỳnh quang chọn lọc”, Tc Sinh học, 28, pp 77-81
Nhung (2015), “Nghiên cứu tách chiết, tinh sạch và đánh giá hoạt tính của hoạt
chất chống khuẩn và chống nấm Prodigiosin từ chủng Seratia marcescens M6”, Y
Học Việt Nam, 433, pp 190-195
phytopathology, 30, pp 603-635
(2012), “Characterization of a chitinase (Chit62) from Serratia marcescens B4A and its efficacy as a bioshield against plant fungal pathogens”, Biochemical
genetics, 50 (9-10), pp 722-735
10 Bach E, Sant’anna V, Daroit D, Corrêa A P F, Segalin J, and Brandelli A
(2012), “Production, one-step purification, and characterization of a keratinolytic
protease from Serratia marcescens P3”, Process Biochemistry, 47 (12), pp
2455-2462
Soil.”, Gaudeamus,Moscow
12 Bradford, M.M (1976), “A rapid and sensitive method for the quantitation of
microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding”,
Analytical biochemistry, 72, pp 248-254
14 Chitarra, G.S., P Breeuwer, M.J Nout, A.C Van Aelst, F.M Rombouts, and T
Abee (2003), “An antifungal compound produced by Bacillus subtilis YM 10-20
Trang 9Trần Thị Thùy Linh 7 K22
inhibits germination of Penicillium roqueforti conidiospores”, Journal of applied
microbiology, 94 (2), pp 159-166
15 David, P and H Kelsey (2007), “Public Health and Costs of Pesticides”, in
Encyclopedia of Pest Management, Taylor & Francis, pp 677-680
B Boom (1990), “Fungi on plants and plant products in the United States ”,
Brittonia, 42 (3), pp 243-246
biotechnology, 20 (8), pp 338-343
novel medium for the enhanced cell growth and production of prodigiosin from
Serratia marcescens isolated from soil”, BMC microbiology, 4, pp 11
oxysporum”, Annual review of phytopathology, 35, pp 111-128
solubility in aqueous solutions of salts and organic solvents”, Methods Enzymol, 1,
pp 67-90
Huerta-Palacios G (2015), “Antifungal activity of Serratia marcescens CFFSUR-B2 purified chitinolytic enzymes and prodigiosin against Mycosphaerella fijiensis,
causal agent of black Sigatoka in banana (Musa spp.)”, BioControl, 60 (4), pp
565-572
Herstellung von Kulturlösungen mikrobieller Antagonisten zur Unterdrückung
phytopathogener Bodenpilze”, Journal of Basic Microbiology, 27 (9), pp
497-503
(2011), “Production of Chitinase and its Optimization from a Novel Isolate
Serratia marcescens XJ-01”, Indian J Microbiol, 51 (3), pp 301-306
24 Kalbe, C., P Marten, and G Berg (1996), “Strains of the genus Serratia as
beneficial rhizobacteria of oilseed rape with antifungal properties”,
Microbiological Research, 151 (4), pp 433-439
of Serratia plymuthica with multiple mechanisms of antifungal activity provides
biocontrol of Botrytis cinerea and Sclerotinia sclerotiorum diseases”, Soil Biology
and Biochemistry, 35 (2), pp 323-331
head of bacteriophage T4”, Nature, 227 (5259), pp 680-685
“Purification and characterization of a novel antifungal protein from Bacillus
subtilis strain B29”, J Zhejiang Univ Sci B, 10 (4), pp 264-272
Trang 10Luận văn thạc sĩ Khoa Sinh học
28 Liu, X., M Bimerew, et al (2007), “Quorum-sensing signaling is required for
production of the antibiotic pyrrolnitrin in a rhizospheric biocontrol strain of
Serratia plymuthica”, FEMS microbiology letters, 270 (2), pp 299-305
29 Liu, X., J Jia, et al (2010), “Biocontrol potential of an endophytic Serratia sp G3
and its mode of action”, World J Microbiol Biotechnol, 26 (8), pp 1465-1471
the endophytic Serratia plymuthica strain G3: differential control of motility and biofilm formation according to life-style”, BMC microbiology, 11 (1), pp 26
31 Mahlen S D (2011), “Serratia infections: from military experiments to current
practice”, Clinical microbiology reviews, 24 (4), pp 755-791
rhamnolipids produced by Serratia rubidaea SNAU02 under solid-state fermentation and its application as biocontrol agent”, Bioresource technology,
173, pp 231-238
33 Okay, S., M Özdal, and E.B Kurbanoğlu (2013), “Characterization, antifungal
activity, and cell immobilization of a chitinase from Serratia marcescens MO-1”,
Turk J Biol, 37, pp 639-644
SR1 as a Source of Chitinase Having Potentiality of Using as a Biocontrol Agent”,
Indian J Microbiol, 51 (3), pp 247-250
fluorescens strains on the different growth phases of Phytophthora capsici, foot rot pathogen of black pepper (Piper nigrum L.)”, Arch Phytopathol Plant Protect, 39,
pp 311–314
Economic Impacts of Pesticide Use”, in The Pesticide Question, D Pimentel and
H Lehman, Editors, Springer US, pp 47-84
“Inhibition of shrimp pathogenic vibrios by extracellular compounds from a
Biotechnology, 13
Teimourian (2015), “The inhibitory effect of a Lactobacillus acidophilus derived
biosurfactant on biofilm producer Serratia marcescens”, Iranian journal of basic
medical sciences, 18 (10), pp 1001-1007
“Synergistic Antifungal Activity of Chitinolytic Enzymes and Prodigiosin
Produced by Biocontrol Bacterium, Serratia marcescens Strain B2 against Gray Mold Pathogen, Botrytis cinerea”, J Gen Plant Pathol, 67 (4), pp 312-317
Trang 11Trần Thị Thùy Linh 9 K22
characterization of 56 kDa cold-active protease from Serratia marcescens”, Afr J
Microbiol Res, 5, pp 5841-5847
cloning of a solvent-tolerant protease from Serratia marcescens MH6”, Journal of
microbiology and biotechnology, 20 (5), pp 881-888
43 Wang, K., P.-S Yan, L.-X Cao, Q.-L Ding, C Shao, and T.-F Zhao (2013),
“Potential of chitinolytic Serratia marcescens strain JPP1 for biological control of Aspergillus parasiticus and aflatoxin”, BioMed research international, 2013
44 Zarei M, Aminzadeh S, et al (2011), “Characterization of a chitinase with
antifungal activity from a native Serratia marcescens B4A”, Brazilian journal of
microbiology : [publication of the Brazilian Society for Microbiology], 42 (3), pp
1017-1029
“Optimization of catalase production and purification and characterization of a
novel cold-adapted Cat-2 from mesophilic bacterium Serratia marcescens SYBC-01”, Ann Microbiol, 60 (4), pp 701-708
46 Zhou P, Zhao Y, et al (2012), “Dietary exposure to persistent organochlorine
pesticides in 2007 Chinese total diet study”, Environment international, 42, pp
152-159
