Ứng dụng sóng siêu âm để nâng cao hiệu quả quá trình thủy phân tinh bột khoai mì (manihot esculenta crantz)

57 Bảng 3.2 Các hệ số của phương trình hồi quy mô tả ảnh hưởng của nhiệt độ, công suất và thời gian siêu âm đến hoạt độ α – amylase trong chế phẩm enzyme Termamyl 120L theo biến mã hóa .

v

MỤC LỤC

MỤC LỤC v

DANH MỤC HÌNH viii

DANH MỤC BẢNG xi

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT xiii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

Quá trình thủy phân tinh bột 2

Các giai đoạn của quá trình thủy phân 2

Động học quá trình thủy phân tinh bột 7

Amylase 10

Enzyme  - amylase 11

Enzyme glucoamylase 13

Các hiện tượng xảy ra khi sóng siêu âm tác động vào môi trường lỏng 15

Ứng dụng sóng siêu âm vào quá trình thủy phân tinh bột 18

Cơ sở khoa học 18

Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất thủy phân tinh bột dưới tác động đồng thời của enzyme và sóng siêu âm 19

Những kết quả nghiên cứu đã thu được 21

Xác định hướng nghiên cứu của đề tài 24

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

Nguyên liệu 25

Chế phẩm enzyme 25

Tinh bột khoai mì 25

Các hóa chất phân tích 26

Nội dung nghiên cứ u 26

Phương pháp nghiên cứu thực nghiê ̣m 27

Phương pháp cổ điển 27

Phương pháp quy hoa ̣ch thực nghiê ̣m 27

Bố trí thí nghiệm 28

vi

Phần 1: Xử lý siêu âm huyền phù tinh bột khoai mì – Ảnh hưởng của sóng

siêu âm đến giai đoạn hồ hóa 28

Phần 2: Xử lý siêu âm chế phẩm enzyme amylase 29

Phần 3: Xử lý siêu âm hỗn hợp huyền phù tinh bột khoai mì có chứa enzyme – Ảnh hưởng của sóng siêu âm đến giai đoạn dịch hóa 32

Phần 4: So sánh các giải pháp sử dụng sóng siêu âm để nâng cao hiệu quả thủy phân tinh bột khoai mì 33

Phương pháp phân tích, phương pháp tính toán và thiết bị sử dụng 35

Phương pháp phân tích 35

Phương pháp tính toán 35

Thiết bị sử dụng 41

Xử lý số liệu 42

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 43

Phần 1: Xử lý siêu âm huyền phù tinh bột khoai mì – Ảnh hưởng của sóng siêu âm đến giai đoạn hồ hóa 43

Ảnh hưởng của hàm lượng tinh bột khoai mì trong huyền phù ban đầu 43

Ảnh hưởng của nhiệt độ bắt đầu siêu âm 47

Ảnh hưởng của công suất siêu âm 49

Ảnh hưởng của thời gian siêu âm 51

Phần 2: Xử lý siêu âm chế phẩm enzyme amylase 53

Phần 2.1: Ảnh hưởng của sóng siêu âm đến chế phẩm enzyme Termamyl 120L 53 Phần 2.2: Ảnh hưởng của sóng siêu âm đến hoạt độ glucoamylase trong chế phẩm Dextrozyme GA 74

Phần 3: Ảnh hưởng của sóng siêu âm đến giai đoạn dịch hóa huyền phù tinh bột khoai mì 84

Ảnh hưởng của hàm lượng tinh bột khoai mì trong huyền phù ban đầu 84

Ảnh hưởng của nhiệt độ bắt đầu siêu âm 87

Ảnh hưởng của công suất siêu âm 90

Ảnh hưởng của thời gian siêu âm 93

Ảnh hưởng đồng thời của nhiê ̣t đô ̣, công suất và thời gian siêu âm trong giai đoa ̣n dịch hóa đến độ thủy phân tinh bột khoai mì 96

vii

Phần 4: So sánh các giải pháp sử dụng sóng siêu âm để nâng cao hiệu quả

thủy phân tinh bột khoai mì 100

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 105

Kết luận 105

Về mặt khoa học 105

Về mặt ứng dụng 105

Kiến nghị 106

CHƯƠNG 5 TÀI LIỆU THAM KHẢO 107

viii

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Đường cong mô tả giai đoạn hồ hóa tinh bột khoai mì của một số giống khoai mì trồng tại Brazil 3Hình 1.2 Phân loại enzyme amylase dựa vào vị trí và cơ chế xúc tác 11Hình 1.3 Cấu trúc của α-amylase 12Hình 1.4 Cơ chế phản ứng thủy phân nhóm glycosyl của α-amylase từ vi khuẩn

Bacillus 13

Hình 1.5 Mô phỏng cấu trúc của glucoamylase từ Aspergillus niger 14

Hình 1.6 Cơ chế thủy phân liên kết glycoside của glucoamylase 14Hình 1.7 Sự hình thành, phát triển của bong bóng trong lòng chất lỏng dưới tác dụng

của sóng siêu âm 16

Hình 2.1 Phương pháp xác định vmax và Km dựa vào phương trình Linewearver và Burk 36Hình 2.2 Phương pháp xác định năng lượng hoạt hóa Ea theo phương pháp của

Arrhenius 37

Hình 3.1 Ảnh hưởng của hàm lượng tinh bột trong huyền phù ban đầu đến độ nhớt ở

65oC, nồng độ tinh bột hòa tan và độ hòa tan tinh bột sau 60 phút hồ hóa 43Hình 3.2 Hình chụp dưới kính hiển vi điện tử quét (SEM) hạt tinh bột khoai mì trong giai đoạn hồ hóa 44Hình 3.3 Ảnh hưởng của hàm lượng tinh bột trong huyền phù ban đầu đến kích thước hạt tinh bột sau xử lý siêu âm 45Hình 3.4 Ảnh hưởng của hàm lượng tinh bột trong huyền phù đến độ hòa tan tinh bột tại thời điểm cân bằng 46Hình 3.5 Sự thay đổi độ nhớt của huyền phù tinh bột khoai mì 20% theo nhiệt độ 47Hình 3.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ bắt đầu siêu âm đến độ hòa tan tinh bột sau 60 phút

hồ hóa của mẫu siêu âm và mẫu đối chứng 48Hình 3.7 Ảnh hưởng của công suất siêu âm đến kích thước hạt tinh bột sau quá trình

xử lý và độ hòa tan tinh bột 49Hình 3.8 Ảnh hưởng của thời gian siêu âm đến độ hòa tan tinh bột 51Hình 3.9 Ảnh hưởng của thời gian siêu âm đến sự gia tăng độ hòa tan tinh bột của mẫu siêu âm so với mẫu đối chứng và kích thước trung bình của hạt tinh bột sau siêu âm 52Hình 3.10 Ảnh hưởng của nhiệt độ siêu âm đến hoạt độ α – amylase trong chế phẩm Termamyl 120L 53Hình 3.11 Ảnh hưởng của công suất siêu âm đến hoạt độ α – amylase trong chế phẩm Termamyl 120L 55Hình 3.12 Ảnh hưởng của thời gian siêu âm đến hoạt độ α – amylase trong chế phẩm Termamyl 120L 56Hình 3.13 Mối tương quan giữa hoạt độ α - amylase xác định bằng thực nghiệm và theo phương trình hồi quy 58

ix

Hình 3.14 Mức độ ảnh hưởng của nhiệt độ, công suất, thời gian siêu âm và tương tác giữa chúng đến hoạt độ α – amylase trong chế phẩm enzyme Termamyl 120L 59Hình 3.15 Bề mặt đáp ứng của hoạt độ α- amylase khi thay đổi đồng thời công suất và thời gian siêu âm 60Hình 3.16 Phổ UV – VIS của mẫu chế phẩm Termamyl 120L siêu âm và đối chứng 61Hình 3.17 Kết quả điện di của mẫu chế phẩm Termamyl 120L siêu âm và đối chứng 62Hình 3.18 Phổ 1H-NMR của mẫu chế phẩm Termamyl 120L siêu âm và đối chứng 63Hình 3.19 Phổ IR của mẫu chế phẩm Termamyl 120L siêu âm và đối chứng 63Hình 3.20 Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ α- amylase của mẫu siêu âm và mẫu đối chứng 65Hình 3.21 Ảnh hưởng của pH đến các thông số động học của chế phẩm enzyme

Termamyl 120L 66Hình 3.22 Giản đồ Dixon và Webb để xác định hằng số phân ly pKa1, pKa2 của mẫu siêu âm và mẫu đối chứng 67Hình 3.23 Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng đến hoạt độ α- amylase của mẫu siêu âm

và mẫu đối chứng 68Hình 3.24 Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng đến các thông số động học của chế phẩm enzyme Termamyl 120L 69Hình 3.25 Biến đổi hoạt độ α – amylase của mẫu siêu âm (SA) và mẫu đối chứng (ĐC) theo thời gian 72Hình 3.26 Ảnh hưởng của nhiệt độ siêu âm đến hoạt độ glucoamylase trong chế phẩm Dextrozyme GA 75Hình 3.27 Ảnh hưởng của công suất siêu âm đến hoạt độ glucoamylase trong chế phẩm Dextrozyme GA 75Hình 3.28 Ảnh hưởng của thời gian siêu âm đến hoạt độ glucoamylase trong chế phẩm Dextrozyme GA 76Hình 3.29 Mối tương quan giữa hoạt độ glucoamylase xác định bằng thực nghiệm và theo phương trình hồi quy 78Hình 3.30 Mức độ ảnh hưởng của nhiệt độ, công suất, thời gian siêu âm và tương tác giữa ba thông số này đến hoạt độ glucoamylase trong chế phẩm Dextrozyme GA 79Hình 3.31 Bề mặt đáp ứng của hoạt độ glucoamylase khi thay đổi đồng thời nhiệt độ, công suất và thời gian siêu âm 81Hình 3.32 Kết quả điện di của mẫu chế phẩm Dextrozyme GA siêu âm và đối chứng 82Hình 3.33 Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ glucoamylase của mẫu siêu âm và mẫu đối chứng 83Hình 3.34 Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng đến hoạt độ glucoamylase của mẫu siêu

âm và mẫu đối chứng 83Hình 3.35 Ảnh hưởng của hàm lượng tinh bột ban đầu đến nồng độ đường khử và độ thủy phân tinh bột sau 80 phút dịch hóa 85

x

Hình 3.36 Hình chụp hạt tinh bột của mẫu đối chứng và mẫu siêu âm trong giai đoạn dịch hóa dưới kính hiển vi điện tử quét (SEM) 86Hình 3.37 Ảnh hưởng của hàm lượng tinh bột trong huyền phù đến độ thủy phân tinh bột tại thời điểm cân bằng 87Hình 3.38 Ảnh hưởng của nhiệt độ bắt đầu siêu âm đến độ thủy phân tinh bột sau 80 phút dịch hóa của mẫu siêu âm so với mẫu đối chứng 88Hình 3.39 So sánh giản đồ phân bố kích thước hạt giữa mẫu siêu âm và mẫu đối chứng tại các nhiệt độ siêu âm khác nhau 89Hình 3.40 Ảnh hưởng của nhiệt độ siêu âm đến độ thủy phân tinh bột tại thời điểm cân bằng của mẫu siêu âm và mẫu đối chứng 90Hình 3.41 So sánh giản đồ phân bố kích thước hạt của các mẫu xử lý siêu âm ở các công suất khác nhau 91Hình 3.42 Ảnh hưởng của công suất siêu âm đến độ thủy phân tinh bột sau 80 phút dịch hóa 92Hình 3.43 Ảnh hưởng của thời gian siêu âm đến độ thủy phân tinh bột sau 80 phút dịch hóa và tại thời điểm cân bằng của mẫu siêu âm và mẫu đối chứng 93Hình 3.44 So sánh giản đồ phân bố kích thước hạt của các mẫu xử lý siêu âm ở các thời gian khác nhau 95Hình 3.45 Mối tương quan giữa độ thủy phân tinh bột được xác định bằng thực

nghiệm và theo phương trình hồi quy 97Hình 3.46 Mức độ ảnh hưởng của nhiệt độ, công suất, thời gian siêu âm và tương tác giữa chúng đến hoạt độ glucoamylase trong chế phẩm enzyme Dextrozyme GA 98Hình 3.47 Bề mặt đáp ứng của độ thủy phân sau 80 phút dịch hóa khi thay đổi đồng thời nhiệt độ, công suất và thời gian siêu âm 99Hình 3.48 Sự thay đổi độ thủy phân tinh bột khoai mì theo thời gian 101Hình 3.49 Ảnh hưởng của hàm lượng chế phẩm Termamyl 120L đã qua xử lý siêu âm đến độ thủy phân tinh bột khi kết thúc giai đoạn dịch hóa 104

xi

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Kết quả nghiên cứu động học quá trình thủy phân tinh bột khoai mì bằng

enzyme 10

Bảng 1.2 Một số tính chất của các α-amylase từ chủng vi khuẩn Bacillus 13

Bảng 1.3 Một số tính chất của glucoamylase từ nấm mốc 15

Bảng 1.4 Ứng dụng sóng siêu âm trong giai đoạn hồ hóa tinh bột 23

Bảng 2.1 Bố trí thí nghiê ̣m khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố trong quá trình xử lý siêu âm đến hàm lượng tinh bột hòa tan trong giai đoạn hồ hóa 28

Bảng 2.2 Bố trí thí nghiê ̣m theo phương pháp cổ điển về ảnh hưởng của các yếu tố xử lý siêu âm đến hoạt độ amylase của chế phẩm enzyme thương mại 29

Bảng 2.3 Bố trí thí nghiê ̣m khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố quá trình siêu âm đến độ thủy phân tinh bột trong giai đoạn dịch hóa 33

Bảng 3.1 Ma trâ ̣n quy hoa ̣ch thực nghiê ̣m và kết quả thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng đồng thời của nhiệt độ, công suất và thời gian siêu âm đến hoạt độ α- amylase trong chế phẩm Termamyl 120L 57

Bảng 3.2 Các hệ số của phương trình hồi quy mô tả ảnh hưởng của nhiệt độ, công suất và thời gian siêu âm đến hoạt độ α – amylase trong chế phẩm enzyme Termamyl 120L theo biến mã hóa 58

Bảng 3.3 Hàm lượng protein hòa tan của mẫu chế phẩm Termamyl 120L siêu âm và đối chứng 61

Bảng 3.4 Biến đổi cấu trúc bậc hai của chế phẩm enzyme trước và sau siêu âm 64

Bảng 3.5 Các thông số nhiệt động của phản ứng thủy phân tinh bột với xúc tác là mẫu enzyme siêu âm và mẫu enzyme đối chứng 71

Bảng 3.6 Hằng số tốc độ vô hoạt enzyme kin và thời gian bán hủy t1/2 của mẫu siêu âm và mẫu đối chứng ở các giá trị nhiệt độ khác nhau 73

Bảng 3.7 Các thông số nhiệt động của quá trình vô hoạt enzyme của mẫu siêu âm và mẫu đối chứng ở các giá trị nhiệt độ khác nhau 73

Bảng 3.8 Ma trâ ̣n quy hoa ̣ch thực nghiê ̣m và kết quả thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng đồng thời của nhiệt độ, công suất và thời gian siêu âm đến hoạt độ glucoamylase của chế phẩm Dextrozyme GA 77

Bảng 3.9 Các hệ số của phương trình hồi quy mô tả ảnh hưởng của nhiệt độ, công suất và thời gian siêu âm đến hoạt độ glucoamylase trong chế phẩm enzyme Dextrozyme GA theo biến mã hóa 78

Bảng 3.10 Hàm lượng protein hòa tan của mẫu chế phẩm Dextrozyme GA siêu âm và đối chứng 81

Bảng 3.11 Ma trâ ̣n quy hoa ̣ch thực nghiê ̣m và kết quả 96

Bảng 3.12 Các hệ số của phương trình hồi quy mô tả ảnh hưởng của nhiệt độ, công suất và thời gian siêu âm đến ΔRS sau 80 phút dịch hóa theo biến mã hóa 97

xii

Bảng 3.13 Năng lượng siêu âm cần sử dụng để tăng hoạt độ chế phẩm amylase và xử

lý huyền phù tinh bột 103Bảng 3.14 Năng lượng siêu âm cần sử dụng tính cho 100g tinh bột 103

xiii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

DE Chỉ số đương lượng dextrose (Dextrose equivalent)

DH Độ thủy phân (degree of hydrolysis)

DNS 3,5- dinitrosalisylic acid

DP Mức độ polymer hóa của phân tử tinh bột (Degree of Polymerization)

DSC thiết bị đo nhiệt lượng (differential scanning calorimetry)

DSOL Độ hòa tan tinh bột (degree of solubilization)

SEM Kính hiển vi điện tử quét (scanning electron microscopy)

SP Độ trương nở của hạt (swelling power)

T paste Nhiệt độ bắt đầu hồ hóa

T peak Nhiệt độ khi độ nhớt của hỗn hợp bột – nước trong giai đoạn hồ hóa đạt cực đại ηpeak Độ nhớt cực đại của hỗn hợp bột – nước trong giai đoạn hồ hóa

- 1 -

MỞ ĐẦU

Quá trình thủy phân tinh bột được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm

và công nghiệp lên men Hiệu suất thủy phân tinh bột phụ thuộc chủ yếu vào giai đoạn phá vỡ hạt tinh bột để giải phóng các phân tử amylose và amylopectin, nhờ đó enzyme tiếp xúc được với cơ chất để chuyển hóa tinh bột thành đường Hiện nay, các nhà sản xuất ở trong và ngoài nước đều sử dụng nhiệt kết hợp với chế phẩm α – amylase để phá

vỡ hạt tinh bột Phương pháp này có nhược điểm là cần sử dụng chế phẩm enzyme với hàm lượng cao và thời gian xử lý dài [1]

Trong mười năm gần đây, nhiều giải pháp công nghệ mới đã được nghiên cứu nhằm giảm lượng chế phẩm enzyme cần dùng và rút ngắn thời gian thủy phân, từ đó làm tăng hiệu quả kinh tế của quy trình sản xuất Trong số đó, sử dụng sóng siêu âm để

hỗ trợ quá trình thủy phân tinh bột bước đầu mang lại một số kết quả tích cực [1], [2] Những nghiên cứu này được thực hiện chủ yếu tại Trung Quốc và Thái Lan Đến nay, chưa có công bố khoa học về sử dụng sóng siêu âm trong quá trình thủy phân tinh bột tại Việt Nam

Hiện nay ở nước ta, tinh bột khoai mì (tinh bột sắn - Manihot esculenta crantz.) có

giá thành rẻ, phổ biến và được sử dụng rộng rãi trong quá trình thủy phân để sản xuất dextrin, maltodextrin, maltose và glucose [3] Quá trình thủy phân tinh bột có thể dài đến hàng chục giờ, lượng enzyme sử dụng nhiều và hiệu suất thủy phân chưa cao [4]

Xuất phát từ những vấn đề thực tế trên, chú ng tôi thực hiê ̣n đề tài “Ứng dụng

sóng siêu âm để nâng cao hiệu quả quá trình thủy phân tinh bột khoai mì (Manihot esculenta crantz.)”

Mu ̣c đích nghiên cứu là nâng cao hiệu quả của quá trình thủy phân tinh bột khoai

mì bằng giải pháp sử dụng sóng siêu âm để rú t ngắn thời gian thủy phân hoặc tiết kiệm lượng enzyme sử dụng

- 2 -

Quá trình thủy phân tinh bột

Về bản chất, quá trình thủy phân tinh bột là quá trình phân cắt mạch phân tử tinh bột có sự tham gia của nước Xúc tác được sử dụng phổ biến hiện nay là các enzyme amylase Quá trình thủy phân tinh bột thường được chia thành ba giai đoạn: hồ hóa, dịch hóa và đường hóa [5]

Các giai đoạn của quá trình thủy phân

1.1.1.1 Giai đoạn hồ hóa

Khi gia nhiệt huyền phù tinh bột trong nước, các phân tử nước sẽ khuếch tán vào bên trong hạt tinh bột khiến cho hạt trương nở Sự hình thành liên kết hydro giữa các phân tử tinh bột ở bên trong hạt với phân tử nước sẽ làm yếu đi liên kết giữa các phân

tử tinh bột với nhau Vùng cấu trúc tinh thể của hạt tinh bột chuyển dần thành vô định hình Sự biến đổi cấu trúc này là bất thuận nghịch Tiếp theo, các phân tử amylose và amylopectin mạch ngắn sẽ khuếch tán ra bên ngoài hạt tinh bột Một số hạt tinh bột bị

vỡ ra và không còn hình dạng nhất định Các phân tử nước sẽ bao quanh phân tử amylose

và amylopectin được giải phóng ra từ hạt tinh bột để tạo thành micell “nước – tinh bột” Các phân tử tinh bột này được gọi là tinh bột hòa tan (soluble starch) Giai đoạn này được gọi là hồ hóa (gelatinization) [6] Hồ hóa làm chín tinh bột, tăng khả năng tiêu hóa [7] Trong quá trình thủy phân tinh bột với xúc tác enzyme, giai đoạn hồ hóa sẽ giải phóng một số phân tử tinh bột ra khỏi hạt tinh bột ban đầu và làm tăng khả năng tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất [8]

Trong khoa học, có nhiều phương pháp để nghiên cứu giai đoạn hồ hóa như xác định mức độ hút nước - trương nở của hạt tinh bột bằng cách tính chênh lệch khối lượng của hạt tinh bột trước và sau giai đoạn hồ hóa [9], [10], [11]; xác định mức độ gia tăng lượng tinh bột hòa tan bằng các phương pháp so màu phức iod - tinh bột [11], [12]; xác định sự biến đổi độ nhớt của hỗn hợp theo thời gian hồ hóa bằng thiết bị đo nhanh độ nhớt (rapid visco analyzer – RVA) [6]; quan sát biến đổi cấu trúc hạt bằng kính hiển vi phân cực (polarization microscope) [13], [14] hay bằng kính hiển vi điện tử quét (scanning electron microscopy - SEM) [15]; xác định lượng nhiệt huyền phù tinh bột

- 3 -

hấp thu trong giai đoạn hồ hóa bằng thiết bị đo nhiệt lượng (differential scanning calorimetry – DSC [16]); xác định sự biến đổi vùng cấu trúc tinh thể thành vô định hình bằng cách phân tích hình ảnh nhiễu xạ khi chụp X quang, tán xạ ánh sáng, phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR [16], [17] Trong sản xuất công nghiệp, các biến đổi của giai đoạn hồ hóa thường được quan tâm là mức độ hút nước - trương nở của hạt, mức độ gia tăng hàm lượng tinh bột hòa tan, biến đổi về độ nhớt và năng lượng cần tiêu thụ [6], [16], [18], [19]

Dựa vào biến đổi độ nhớt, giai đoạn hồ hóa được xem là bắt đầu khi độ nhớt của huyền phù tăng vọt Nhiệt độ tại thời điểm đó được gọi là nhiệt độ bắt đầu hồ hóa (Pasting Temperature - Tpaste hay To) Nhiệt độ tại thời điểm độ nhớt đạt cực đại (ηpeak) gọi là nhiệt độ đạt đỉnh nhớt (Peak temperature - Tpeak) Nếu tiếp tục tăng nhiệt độ vượt quá giá trị nhiệt độ đạt đỉnh nhớt, độ nhớt của hỗn hợp sẽ giảm Khoảng nhiệt độ từ Tpaste đến Tpeak được gọi là khoảng nhiệt độ hồ hóa (Hình 1.1a) [6] Khoảng nhiệt độ hồ hóa của các loại tinh bột có nguồn gốc khác nhau sẽ khác nhau Đó là do sự khác nhau về cấu trúc hạt của loại tinh bột Dựa vào sự biến đổi độ nhớt, khoảng nhiệt độ hồ hóa của tinh bột khoai mì thường là 57 – 770C [20], [21], [22]

Hình 1.1 Đường cong mô tả giai đoạn hồ hóa tinh bột khoai mì của một số giống

khoai mì trồng tại Brazil

(a) Giản đồ thay đổi độ nhớt theo thời gian

(b) Đường cong hấp thu năng lượng nhiệt [23]

Dựa vào đường cong mô tả năng lượng nhiệt hấp thu, có ba điểm uốn ứng với ba giá trị nhiệt độ được quan tâm nhiều nhất là Tonset, Tpeak và Tend Nhiệt độ tương ứng với thời điểm độ hấp thu nhiệt của hỗn hợp bắt đầu tăng mạnh là nhiệt độ bắt đầu hồ hóa Tonset Giá trị nhiệt độ tại đó hỗn hợp hấp thu năng lượng nhiệt nhiều nhất thì được gọi

- 4 -

là Tpeak Giá trị nhiệt độ tương ứng với thời điểm đường hấp thu năng lượng nhiệt bắt đầu ổn định được gọi là Tend Khi đó, giai đoạn hồ hóa được xem là kết thúc Khoảng nhiệt độ từ Tonset đến Tend gọi là khoảng nhiệt độ hồ hóa (Hình 1.1b) [16], [24] Tonset của tinh bột khoai mì dao động trong khoảng 50,0 – 66,70C, Tpeak dao động trong khoảng

60 – 70,50C và Tend dao động trong khoảng 69,0 – 82,70C [21], [22], [25], [26], [27]

Để biểu diễn mức độ hồ hóa, hai thông số thường được sử dụng là độ trương nở (swelling power – SP) và độ hòa tan tinh bột (degree of solubilization – DSOL) của hạt tinh bột Hai thông số này được xác định bằng cách lấy một lượng thể tích mẫu huyền phù tinh bột trong giai đoạn hồ hóa để phối trộn với nước, sau đó ly tâm thu phần cặn Thông số SP được tính theo công thức (1.1) Thông số này càng cao chứng tỏ hạt càng hút được nhiều nước và trương nở càng lớn Thông số DSOL được xác định theo công thức (1.2) Thông số này càng lớn thì mức độ phân rã hạt tinh bột để giải phóng các phân

tử tinh bột ra ngoài hạt sẽ càng cao [9], [10], [11] Đối với tinh bột khoai mì, trong khoảng nhiệt độ hồ hóa 65 – 85oC, giá trị SP là 40 – 60 g/g [28] và DSOL là 0,13 – 0,24g/g [29]

𝑆𝑃 = 𝑚2

𝐷𝑆𝑂𝐿 = 𝑚3

Với m1 là lượng chất khô của tinh bột trong mẫu huyền phù ban đầu [g]

m2 là lượng tinh bột ướt thu được sau khi ly tâm (phần cặn) của VmL mẫu trong giai đoạn hồ hóa [g]

m3 là lượng tinh bột hòa tan trong giai đoạn hồ hóa huyền phù [g]

1.1.1.2 Giai đoạn dịch hóa

Sau giai đoạn hồ hóa, nếu bổ sung α – amylase vào huyền phù tinh bột, độ nhớt của hỗn hợp giảm nhanh, giai đoạn này được gọi là dịch hóa (liquefaction) Khi đó, các phân tử tinh bột hòa tan bị thủy phân, cắt ngắn mạch dưới tác dụng của α-amylase Enzyme α – amylase là endo-enzyme có khả năng thủy phân liên kết α- 1,4 glycoside tại vị trí giữa mạch phân tử amylose và amylopectin [30] Nếu bổ sung α – amylase chịu nhiệt vào huyền phù từ đầu quá trình thủy phân, giai đoạn hồ hóa và dịch hóa xảy ra

- 5 -

đồng thời và được gọi chung là dịch hóa Khi đó, quá trình thủy phân dưới xúc tác của

hệ enzyme amylase chỉ được chia thành hai giai đoạn dịch hóa và đường hóa [8] Trong công nghiệp, dịch hóa tinh bột được sử dụng để sản xuất dextrin, maltodextrin và là giai đoạn đầu của đường hóa để sản xuất maltose, glucose [8]

Để nghiên cứu giai đoạn dịch hóa tinh bột, các nhà khoa học có thể dựa vào mức

độ giảm hàm lượng tinh bột hòa tan, mức độ giảm chiều dài mạch phân tử tinh bột hay mức độ tăng hàm lượng “đường khử” trong dung dịch phản ứng Hàm lượng tinh bột

hòa tan được xác định bằng các phương pháp so màu phức iod - tinh bột [31], [32]

Chiều dài mạch phân tử tinh bột – chỉ số DP (Degree of Polymerization)được xác định bằng các phương pháp sắc ký, phổ biến nhất là sắc ký lỏng cao áp (HPLC) [33], [34] Hàm lượng “đường khử” trong hỗn hợp thủy phân tinh bột được xác định dựa vào phản ứng giữa nhóm khử-CHO của “đường khử” với các chất oxy hóa như Cu2+ [35], hay 3,5- dinitrosalisylic (DNS) [36]

Để biểu diễn mức độ dịch hóa, các nhà khoa học sử dụng một trong ba thông số:

độ dài trung bình của mạch dextrin 𝐷𝑃̅̅̅̅̅ (Number-average Degree of Polymerization) 𝑛[37], đương lượng dextrose DE (Dextrose Equivalent) [33] hay độ thủy phân tinh bột

DH (Degree of Hydrolysis) [38], [39] Hai chỉ số DE và DH có ý nghĩa khoa học và công thức tính tương tự nhau nhưng khác nhau về đơn vị đo Chỉ số DH có đơn vị là %, chỉ số DE không có thứ nguyên

Độ dài trung bình của mạch maltodextrin là đại lượng cho biết chiều dài trung bình của các maltodextrin trong hỗn hợp thủy phân Khi mức độ thủy phân càng nhiều thì giá trị 𝐷𝑃̅̅̅̅̅ càng nhỏ 𝐷𝑃𝑛 ̅̅̅̅̅ được tính theo phương trình (1.3), trong đó ci và Mi được xác 𝑛

∑ 𝑐𝑖

∑(𝑐𝑖/𝑀𝑖)

(1.3)

Với 𝐷𝑃̅̅̅̅𝑛 là độ dài trung bình của mạch dextrin

M n là phân tử lượng trung bình của dextrin [đvc]

- 6 -

mi là hàm lượng phân tử dextrin được tạo thành từ i phân tử glucose [g]

M i là phân tử lượng của phân tử dextrin được tạo thành từ i phân tử glucose [đvc]

Đương lượng dextrose hay còn gọi là chỉ số DE là đại lượng chỉ khả năng khử của các sản phẩm thủy phân trong hỗn hợp so với mẫu chuẩn là đường glucose (dextrose) Giá trị DE thay đổi từ 0 (tương ứng với mẫu chứa tinh bột không hòa tan) đến 100 (tương ứng với dung dịch glucose nguyên chất) Chỉ số DE được tính bằng số gram sản phẩm thủy phân có gốc khử được quy đổi thành D-glucose trong 100g chất khô của sản phẩm (phương trình 1.4) [41]

𝐷𝐸 = 𝑚4

Với m4 là lượng nhóm khử quy đổi thành đường glucose [g]

m1 là lượng tinh bột tính theo chất khô trong huyền phù ban đầu [g]

Độ thủy phân tinh bột DH được định nghĩa là lượng đường khử tạo thành (quy đổi

ra đường glucose) so với lượng nguyên liệu khô ban đầu (Phương trình 1.5) DH thay đổi từ 0% đến 100% Quá trình thủy phân càng nhiều thì giá trị DH càng cao, [42]

1.1.1.3 Giai đoạn đường hóa

Giai đoạn đường hóa là giai đoạn cuối của quá trình thủy phân tinh bột Ngoài amylase, giai đoạn đường hóa còn sử dụng các exo-enzyme và các enzyme cắt nhánh như β-amylase (thủy phân liên kết α, 1 – 4 glycoside từ đầu không khử và tạo sản phẩm

α-là đường maltose), -amylase (thủy phân liên kết α, 1 – 4 và α, 1 – 6 glycoside từ đầu không khử và tạo sản phẩm là đường glucose), pullulanase (thủy phân liên kết α, 1 – 6 glycoside làm giảm độ phân nhánh của amylopectin) Sản phẩm của giai đoạn này là

- 7 -

hỗn hợp các loại đường tan, chủ yếu là maltose và glucose Các sản phẩm thông dụng trên thị trường gồm: maltose có DE = 40-45, “high maltose” có DE = 50-55, “high conversion syrup” có DE = 55-70 và “high content of glucose” có DE = 95-97, [43]

Động học quá trình thủy phân tinh bột

1.1.2.1 Động học giai đoạn hồ hóa tinh bột

Phương trình động học mô tả tốc độ hồ hóa theo thời gian có thể dựa vào sự gia tăng độ nhớt của hỗn hợp (Phương trình 1.6), [44], [45], sự gia tăng nồng độ tinh bột hòa tan (phương trình 1.7) [44], [46], [47], [48], sự gia tăng enthalpy (Phương trình 1.8) [27], [49] hay sự biến đổi của các tính chất lưu biến của hỗn hợp hồ tinh bột như độ chắc (Phương trình 1.9) [26], modul đàn hồi (Phương trình 1.10), [50]

m5 là khối lượng tinh bột hòa tan tại tại thời điểm đang khảo sát [g]

m1 là khối lượng tinh bột trong huyền phù ban đầu [g]

dα

Với α = ∆Ht

∆H ∞ là độ hồ hóa tinh bột tại thời điểm đang khảo sát [không thứ nguyên]

Ht và H là enthalpy hỗn hợp đã hấp thu cho đến thời điểm đang khảo sát và tại thời điểm hồ hóa hoàn toàn [J]

n là bậc phản ứng giai đoạn hồ hóa [không thứ nguyên]

ln (Ft

Với Et, E0, E∞ là modul đàn hồi tại thời điểm đang khảo sát, thời điểm bắt đầu hồ hóa

và thời điểm quá trình hồ hóa đạt cân bằng [g.cm]

Giá trị hằng số tốc độ hồ hóa tinh bột (khh) phụ thuộc vào nhiệt độ phản ứng theo phương trình động học Arrhenius (1.11)

Với T là nhiệt độ phản ứng [oK]

Ea là năng lượng hoạt hóa của giai đoạn hồ hóa [kJ/mol]

R là hằng số khí lý tưởng, R = 8,314J/mol.K

ko là hệ số phản ứng (reaction frequency factor)

Trong thực tế, một số loại tinh bột khi hồ hóa sẽ tăng độ nhớt rất cao, tạo ra hỗn hợp đặc quánh nên kết quả đo độ nhớt sẽ không chính xác Để xác định nhiệt năng tiêu thụ và các tính chất lưu biến của hỗn hợp hồ tinh bột thì cần phải có thiết bị đo chuyên dụng Vì vậy, động học của quá trình hồ hóa thường được mô tả theo độ tăng của hàm lượng tinh bột hòa tan (phương trình 1.7) [46]

1.1.2.2 Động học giai đoạn dịch hóa và đường hóa tinh bột

Có hai cách để mô tả động học quá trình thủy phân tinh bột khi có mặt enzyme xúc tác: mô tả biến đổi vận tốc phản ứng theo nồng độ cơ chất ban đầu và mô tả biến đổi nồng độ cơ chất hay sản phẩm theo thời gian phản ứng

Michaelis và Menten (1913) đã đề nghị mô hình động học mô tả sự tương quan giữa vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác với nồng độ cơ chất ban đầu Giai đoạn dịch hóa và đường hóa tinh bột đều có xúc tác của enzyme nên có thể được mô tả theo phương trình Michaelis-Menten (1.12) [51]

𝑣 = 𝑣𝑚𝑎𝑥[𝑆]

Với: v và vmax là vận tốc phản ứng và vận tốc phản ứng cực đại [mol/phút]

[S] là nồng độ cơ chất [mol/L]

Km là hằng số phân ly biểu kiến của phức enzyme – cơ chất hay còn gọi là hằng

số Michaelis – Menten [mol/L]

- 9 -

Khi nồng độ cơ chất ban đầu quá cao thì enzyme bị ức chế Ví dụ như khi nghiên cứu quá trình thủy phân tinh bột, Yankov và cộng sự (1986) nhận thấy phương trình Michaelis - Menten chỉ đúng trong khi hàm lượng tinh bột trong huyền phù ban đầu nhỏ hơn hay bằng 250g/L Khi hàm lượng cơ chất cao hơn 250g/L, vận tốc phản ứng không còn tuân theo mô hình phương trình Michaelis – Menten, vì vậy cần có các mô hình khác để mô tả động học phản ứng [52]

Theo Ofoli (1990), sự thay đổi lượng sản phẩm thủy phân theo thời gian được biểu diễn dưới dạng phương trình (1.13)

bt

at P

t là thời gian từ lúc bắt đầu bổ sung enzyme đến thời điểm đang khảo sát [phút]

a là hằng số biểu thị vận tốc ban đầu của quá trình thủy phân tinh bột [g/L.phút]

b là hằng số thực nghiệm [1/phút]

Khi thời gian tiến tới vô cùng hay tại thời điểm phản ứng đạt cân bằng thì nồng độ sản phẩm tiến tới giá trị a/b Đây là lượng sản phẩm tối đa có thể thu được sau phản ứng [53]

Theo Marangoni (2002), sự thay đổi lượng của cơ chất và sản phẩm thủy phân theo thời gian có thể được biểu diễn theo phương trình (1.14) và phương trình (1.15)

Với ∆St và ∆S là lượng cơ chất giảm đi so với ban đầu tại thời điểm khảo sát và tại

thời điểm vô cùng (Lượng cơ chất tại thời điểm vô cùng được hiểu là lượng cơ chất còn lại khi phản ứng đạt cân bằng) [g/L]

∆Pt và ∆P là lượng sản phẩm tăng thêm tại thời điểm khảo sát và tại thời điểm

vô cùng (Lượng sản phẩm tại thời điểm vô cùng được hiểu là lượng sản phẩm tạo

- 10 -

𝑘𝑑ℎ = 𝑘𝑜𝑒(−𝐸𝑎 /𝑅𝑇)

(1.16) Với T là nhiệt độ phản ứng [oK]

Ea là năng lượng hoạt hóa của giai đoạn dịch hóa hay đường hóa [kJ/mol]

ko là hệ số phản ứng (reaction frequency factor)

Khi thời gian tiến tới vô cùng hay tại thời điểm phản ứng đạt cân bằng thì St tiến tới S và Pt tiến tới P, từ đó suy ra được lượng sản phẩm tối đa có thể thu được sau phản ứng [54]

Khi nghiên cứu về giai đoạn dịch hóa và đường hóa tinh bột, do sản phẩm là đường khử nên có thể thay P bằng lượng đường khử tăng thêm RS [1], [55], [56], [57], [58], [59], [60], [61], ΔDH hay ΔDE [62], [63]

Bảng 1.1 giới thiệu kết quả nghiên cứu động học quá trình thủy phân tinh bột khoai mì có sử dụng xúc tác enzyme đã được công bố trong thời gian gần đây

Bảng 1.1 Kết quả nghiên cứu động học quá trình thủy phân tinh bột khoai mì bằng

𝑑𝛼

𝑑𝑡 = 𝑘ℎℎ(1 − 𝛼)

𝑛 Với ln(k hh ) = 73,8 ± 5,43 và

n = 0,985 ± 0,002

Zhang và cộng sự (2013) [27]

2

Chế phẩm STARGEN

TM 001

Hàm lượng tinh bột 250g/L

pH 7,0; T = 100 o C

∆𝑃 𝑡 = ∆𝑃 ∞ (1 − 𝑒 −𝑘𝑑ℎ𝑡 ) Với ∆𝑃 ∞ = 12,2 (g/100g mẫu)

k hh = 0,296 (1/giờ)

Nitayavardhana và cộng sự (2008) [1]

T = 65 o C,

Mô hình Michaelis-Menten với K m = 0,046mg/mL và

v max = 769U/mg

Pervez và cộng sự (2014) [64]

Amylase

Amylase là một hệ enzyme rất phổ biến trong thế giới sinh vật Các enzyme này thuộc nhóm thủy phân, xúc tác phân giải liên kết O – glucoside của các polysaccharide với sự tham gia của nước (Phương trình 1.17)

(1.17)

- 11 -

Amylase thủy phân tinh bột, glycogen và dextrin thành glucose, maltose và dextrin mạch ngắn Các enzyme amylase có trong nước bọt của một số động vật, trong dịch tiêu hóa của người và động vật, trong hạt nảy mầm, nấm sợi, nấm men, xạ khuẩn và vi khuẩn Amylase là một trong những loại enzyme được ứng dụng rộng rãi nhất trong công nghiệp, đặc biệt là trong ngành công nghiệp thực phẩm Hai nhóm amylase được sử dụng nhiều nhất là glucoamylase (GA) chiếm 26% và  - amylase chịu nhiệt chiếm 24% [65]

Việc phân loại các enzyme khác nhau trong hệ amylase có thể dựa vào nguồn gốc, khả năng chịu nhiệt, vị trí tác động của enzyme trên cơ chất hay cơ chế tác dụng lên tinh bột Thông thường các nhà khoa học dựa vào cả cơ chế và vị trí xúc tác để phân loại các

enzyme amylase theo như Hình 1.2 [66], [67]

Hình 1.2 Phân loại enzyme amylase dựa vào vị trí và cơ chế xúc tác

Enzyme  - amylase

Enzyme  - amylase là enzyme ngoại bào thủy phân liên kết α – 1,4 – glucoside một cách ngẫu nhiên nhưng vị trí liên kết bị thủy phân chủ yếu tập trung ở giữa mạch amylose và amylopectin nên được gọi là endo – enzyme Nếu α-amylase thủy phân tinh bột tạo thành sản phẩm là các đường tự do thì enzyme được xếp vào nhóm “đường hóa” Nếu α – amylase thủy phân tinh bột chỉ tạo thành các dextrin thì enzyme được xếp vào nhóm “dịch hóa” Sản phẩm thủy phân chung của các α – amylase bao gồm dextrin, maltose và glucose [68] Chế phẩm enzyme α – amylase công nghiệp chủ yếu được thu

nhận từ canh trường nấm mốc Aspergillus hay vi khuẩn Bacillus

- 12 -

Enzyme α-amylase là protein có cấu trúc bậc ba, phân tử lượng thấp, thường nằm trong khoảng 50.000 đến 60.000 Da Cấu tạo cơ bản của α - amylase gồm ba domain: domain A là domain lõi có cấu trúc đặc trưng kết vòng gồm 8 đoạn xoắn α và gấp nếp

β xen kẽ liên tiếp nhau (Helix (α/)8-barrel), được nối với domain C có cấu trúc 8 đoạn

β – sheet song song Domain B gồm 2 đoạn β – sheet được lồng vào giữa đoạn  - sheet thứ 3 và α - Helix thứ 3 của domain A Domain B quyết định hoạt tính enzyme và liên kết enzyme – cơ chất [69], [70] Có một ion Ca2+ nối giữa domain A và domain B Mô hình chung của α-amylase được trình bày trong Hình 1.3a Cấu trúc cụ thể của α-amylase

từ Bacillus licheniformis được trình bày trong Hình 1.3b

Hình 1.3 Cấu trúc của α-amylase

(a) Mô hình cấu trúc α-amylase vi khuẩn (Vị trí của 4 vùng trong cấu trúc không gian được biểu diễn

bằng nét gạch đứt) [71]

(b) Mô hình cấu trúc của α – amylase từ vi khuẩn Bacillus licheniformis Domain A có màu xanh lá cây, domain B có màu hồng tím và domain C có màu xanh dương Ion Calcium và Kali tương ứng được biểu diễn bởi quả cầu đỏ và cam Trung tâm hoạt động với Asp231, Glu261 và Asp328 có màu đỏ Vùng nối

từ L7 đến K7 có màu vàng [71], [72]

Cơ chế xúc tác của α-amylase từ vi khuẩn Bacillus do Nielsen (1999, 2000, 2003)

đưa ra [73], [74], [75],[76] và đượctrình bày trong Hình 1.4 [73]

- 13 -

Hình 1.4 Cơ chế phản ứng thủy phân nhóm glycosyl của α-amylase từ vi khuẩn

Bacillus

(I) Proton hóa nguyên tử O của nhóm glycoside và tấn công vào C1 của gốc glucose bởi D231

(III) Tái hình thành phân tử cho proton ban đầu

Một số tính chất của α– amylase từ vi khuẩn Bacillus đã được Gupta và công sự báo cáo tổng hợp vào năm 2003 Các kết quả này được trình bày trong Bảng 1.2 [77]

Bảng 1.2 Một số tính chất của các α-amylase từ chủng vi khuẩn Bacillus

β-du ̣ng chủ yếu của enzyme này là trong sản xuất glucose syrup có hàm lượng glucose cao 96-98% [79]

- 14 -

Glucoamylase chủ yếu được thu nhận từ canh trường nấm mốc Aspergillus,

Trichoderma như A niger [80], A awamori [81], Trichoderma reesei [82] Enzyme

glucoamylase là protein có cấu trúc bậc ba, phân tử lương nằm trong khoảng từ 25 – 112 kDa Các loa ̣i nấm mốc sinh ra hai loa ̣i glucosamylase là GAI và GAII GAI chứa 616 amino acid và có ba domain: domain xúc tác (từ acid amin 1 - 470), domain nối (từ 471 – 514), và domain liên kết với tinh bô ̣t (từ acid amin 515 – 616) GAII chỉ có 514 acid amin, và chỉ có GAI có khả năng thủy phân ha ̣t tinh bô ̣t thô (Hình 1.5) [83] Phân tử lượng của glucoamylase trong khoảng 25 – 112kDa [84]

Hình 1.5Mô phỏng cấu trúc của glucoamylase từ Aspergillus niger

Mô hình được sử du ̣ng rô ̣ng rãi để giải thích cho hoa ̣t đô ̣ng của glucoamylase là sự hình thành ion oxocarbenium, gồm sự vâ ̣n chuyển proton đến O trong liên kết O-glycosylate từ mô ̣t chất xúc tác acid, và mô ̣t sự tấn công ái nhân của nước bởi mô ̣t xúc tác kiềm (Hình 1.6) [82]

Hình 1.6 Cơ chế thủy phân liên kết glycoside của glucoamylase

Các hiện tượng xảy ra khi sóng siêu âm tác động vào môi trường lỏng

Sóng siêu âm là tên gọi của sóng có tần số cao hơn tần số sóng âm mà con người nghe được (Tần số lớn hơn 20 kHz) Giới hạn trên của tần số sóng siêu âm không được phân định rõ ràng nhưng thường được quy ước là 5MHz trong môi trường không khí và 500MHz trong môi trường chất lỏng [85], [86]

Sóng siêu âm khi truyền qua chất lỏng sẽ làm xuất hiện hiện tượng “xâm thực” (cavitation), các “vi dòng” (micro-streaming), “vi tia” (microjet), làm gia tăng nhiệt độ

và tạo ra các vùng có áp lực cao [86]

Dưới tác động của sóng siêu âm, các phân tử trong chất lỏng sẽ nhận năng lượng

và truyền chuyển động theo những chu kỳ nén và giãn (Hình 1.7a) Tại thời điểm các phân tử bị nén, áp lực do sóng siêu âm tạo ra sẽ tăng cao; trong khi đó ở thời điểm giãn, giá trị áp lực sẽ thấp hơn so với khi không có tác động của sóng siêu âm Áp lực tại một điểm trong lòng chất lỏng sẽ biến đổi theo chu kỳ và được miêu tả bằng phương trình (1.18) và Hình 1.7b [87]

P t = P h + P a = P h + P A sin 2π ft (1.18)

Với: Pt là áp suất tổng tại điểm đang xét [Pa]

P h là áp suất thủy tĩnh tại điểm đang xét [Pa]

P a là áp suất do sóng siêu âm tạo ra tại thời điểm t [Pa]

P A là biên độ áp suất do sóng siêu âm tạo ra tại điểm đang xét [Pa]

f là tần số của sóng siêu âm [Hz]

t là khoảng thời gian kể từ khi sóng siêu âm tác động vào môi trường đến thời điểm đang xét [phút]

- 16 -

Trong hỗn hợp chất lỏng, tồn tại trạng thái cân bằng giữa chuyển động nhiệt hỗn loạn và các lực tĩnh điện của các phân tử dung môi lỏng và chất phân tán (bao gồm cả chất khí, chất lỏng và chất rắn hòa tan) Tại một vị trí x xác định, trong nửa chu kỳ nén, giá trị áp lực tăng và khoảng cách trung bình giữa các phân tử bị giảm Ngược la ̣i, trong nửa chu kỳ giãn, giá trị áp lực giảm và khoảng cách trung bình giữa các phân tử sẽ tăng lên Lực liên kết giữa các phân tử sẽ giảm đi khi khoảng cách giữa chúng càng xa Các phân tử khí và lỏng chuyển động nhiệt hỗn loạn hơn làm hình thành các bong bóng rất

nhỏ được gọi là các vi bong bóng trong lòng chất lỏng [29], [88]

Hình 1.7 Sự hình thành, phát triển của bong bóng trong lòng chất lỏng dưới tác dụng

của sóng siêu âm

(a) Đồ thị mô tả dao động của hàm vị trí

(b) Đồ thị mô tả “dao động” của hàm áp suất do sóng siêu âm tạo thành trong lòng chất lỏng

(c) Sự hình thành, phát triển và triệt tiêu của bong bóng

(d) Sự hình thành, phát triển và nổ tung của bong bóng

Vi bong bóng thường không bền Áp suất tăng sẽ đẩy các phần tử lại gần nhau để tái tạo các liên kết phân tử, các phân tử khí hay hơi bị đẩy trở về pha lỏng; hệ quả là vi bong bóng có thể bị triệt tiêu (Hình 1.7c) Tuy nhiên nếu trong chu kỳ nén, áp suất tổng

Pt không đủ lớn để triệt tiêu vi bong bóng thì tại các nửa chu kỳ giãn tiếp theo, vi bong bóng sẽ dần dần to lên Một số bong bóng lớn cũng có thể được hình thành do sự kết

độ nhớt, áp suất hơi (,, Pv) Theo Mason và cộng sự (2002), áp suất cân bằng là áp suất hơi và khí bên trong bong bóng [87] tuân theo phương trình (1.19)

Với: Pcb là áp suất khí và hơi trong bong bóng tại thời điểm cân bằng [Pa]

Pv-cb là áp suất hơi trong bong bóng tại thời điểm cân bằng [Pa]

Pg-cb là áp suất khí trong bong bóng tại thời điểm cân bằng [Pa]

 là Sức căng bề mặt giữa 2 pha lỏng – “khí” [N/m]

R0 là bán kính của bong bóng ở trạng thái cân bằng [m]

Khi các bong bóng nổ tung theo mọi hướng sẽ tạo ra các vi bong bóng mới; các phân tử sẽ chuyển động rất nhanh và hỗn loạn tạo nên các “vi dòng” Các “vi dòng” xuất hiện trong chất lỏng sẽ tạo nên sự “khuấy đảo do sóng âm” (acoustic streaming) Trong

hệ huyền phù, các “vi dòng” xuất hiện ở gần bề mặt phân chia pha lỏng - rắn và hướng

về pha rắn sẽ được gọi là các “vi tia” Các “vi dòng” và “vi tia” trong hệ huyền phù được gọi chung là các “dòng chảy rối” “Dòng chảy rối” có năng lượng rất lớn sẽ tạo nên lực cắt (shear forces) mạnh, có khả năng phá vỡ các hạt rắn trong huyền phù đồng thời bẻ gãy liên kết phân tử và có thể tạo ra các gốc tự do [11], [91], [92], [93] Hiê ̣n tượng này được go ̣i là “xâm thực” [94] Tại vị trí bong bóng vỡ, áp lực và nhiệt độ rất cao và có thể lên đến 20000 kPa và 5000oC Tuy nhiên, giá trị áp lực và nhiệt độ này chỉ tồn tại trong vài nano giây [88] Kích thước bong bóng trước thời điểm nổ tung trong lòng chất lỏng được gọi là kích thước tới hạn Khả năng phát triển cũng như kích thước tới hạn của bong bóng phụ thuộc bản chất sóng siêu âm và bản chất môi trường lỏng [95], [96] Tùy thuộc vào giá trị của áp suất tổng Pt mà sóng siêu âm có thể sinh ra “xâm thực” khí hay hơi Trong “xâm thực” khí, bong bóng chứa chủ yếu là các khí đã hòa tan vào chất lỏng trước đó Trong “xâm thực” hơi, bong bóng chứa chủ yếu là hơi dung môi Hai quá trình “xâm thực” hơi và “xâm thực” khí thường xảy ra song song Tùy vào loại sóng âm và điều kiện thí nghiệm mà chúng xảy ra với tỷ lệ khác nhau [88], [97], [98]

- 18 -

Tóm lại, các yếu tố ảnh hưởng đến hiện tượng “xâm thực” bao gồm:

- Bản chất và các thông số hóa lý của khí và hơi: độ tan của khí trong hỗn hợp, áp suất hơi bão hòa

- Bản chất và các thông số vật lý, hóa lý của hỗn hợp lỏng như độ nhớt, sức căng bề mặt, nhiệt độ, áp suất

- Tần số, công suất của sóng siêu âm

Ứng dụng sóng siêu âm vào quá trình thủy phân tinh bột

Cơ sở khoa học

Có hai nguyên nhân chính làm thay đổi hiệu suất thủy phân khi sóng siêu âm tác động vào huyền phù tinh bột:

 Tác động của các “dòng chảy rối” làm tăng va chạm hữu hiệu giữa các phân tử, từ

đó thúc đẩy phản ứng xảy ra nhanh hơn

 Tác động của “xâm thực” hỗ trợ sự giải phóng phân tử tinh bột ra khỏi hạt tinh bột

và làm thay đổi cấu trúc enzyme Đối với enzyme, nếu như tác động “xâm thực” ở mức độ thích hợp thì sẽ làm biến đổi cấu trúc enzyme theo hướng dễ tạo phức với

cơ chất hơn và thúc đẩy sự khuếch tán sản phẩm ra khỏi phức enzyme – cơ chất, giải phóng enzyme tự do, từ đó làm tăng hiệu quả phản ứng Ngược lại, nếu cấu trúc enzyme bị biến đổi theo hướng làm biến dạng tâm hoạt động, giảm khả năng tạo phức giữa enzyme và cơ chất thì hiệu quả của phản ứng thủy phân sẽ giảm đi hay enzyme bị vô hoạt [96]

1.4.1.1 Tác động của sóng siêu âm lên dung môi nước

Sóng siêu âm có khả năng phân giải phân tử nước trong huyền phù tinh bột để tạo thành các gốc tự do Năng lượng từ “dòng chảy rối” có thể bẻ gãy liên kết giữa hydro

và oxy trong phân tử nước, tạo thành các gốc tự do hydrogen và hydroxyl (H và OH) Trong trường hợp thủy phân tinh bột có enzyme xúc tác, sự hình thành gốc tự do là nguyên nhân làm giảm hoạt độ enzyme, từ đó có thể làm giảm hiệu suất phản ứng thủy phân [99], [100], [101], [102], [103], [104], [105]

- 19 -

1.4.1.2 Tác động của sóng siêu âm lên hoạt độ enzyme amylase

Các “dòng chảy rối” xuất hiện trong huyền phù tinh bột khi được xử lý siêu âm tạo nên sự khuấy trộn mãnh liệt và làm xuất hiện “lực cắt” Sự khuấy trộn tốt trong dung dịch phản ứng sẽ làm tăng hiệu quả truyền khối, tăng khả năng tạo phức “cơ chất – enzyme” và khả năng tách rời phức “sản phẩm – enzyme” Kết quả là làm tăng hiệu suất của phản ứng thủy phân Các “lực cắt” có thể làm biến đổi cấu trúc phân tử nên có thể làm tăng hay giảm hoạt độ của enzyme [106], [107], [108] Các gốc tự do sinh ra do sóng siêu âm tác động vào phân tử nước có thể làm biến đổi các acid amin trong phân

tử enzyme nên hoạt độ enzyme có thể bị giảm đi [109], [110]

1.4.1.3 Tác động của sóng siêu âm đến hạt tinh bột

Khi xảy ra “xâm thực”, lực tác động của các “vi tia” trên bề mặt hạt tinh bột tạo ra các vết nứt [111] Qua các vết nứt này, nước khuếch tán vào bên trong hạt dễ dàng hơn

và tốc độ quá trình phân rã hạt sẽ nhanh hơn [112], [113], [114] Sóng siêu âm làm giảm kích thước hạt và tăng hàm lượng tinh bột hòa tan [1], [57], [115], [116] “Lực cắt” tạo

ra từ các “dòng chảy rối” có thể cắt đứt các liên kết glycoside trong phân tử tinh bột hòa tan, làm giảm độ nhớt hồ tinh bột [9], nồng độ tinh bột hòa tan và đường khử sinh ra

nhiều hơn [117], [118]

Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất thủy phân tinh bột dưới tác động đồng

thời của enzyme và sóng siêu âm

1.4.2.1 Tính chất sóng siêu âm

a Ảnh hưởng của tần số sóng

Quá trình “xâm thực” xảy ra qua 3 giai đoạn: hình thành, lớn lên và nổ tung các bong bóng Cả 3 giai đoạn này đều cần có một khoảng thời gian nhất định Nếu sóng siêu âm có tần số càng cao thì thời gian diễn ra các chu kỳ giãn và nén sẽ càng ngắn, thời gian không đủ để hình thành bong bóng khí, tăng kích thước và gây nổ tung, vì vậy hiện tượng “xâm thực” xảy ra rất yếu hay không xảy ra “Xâm thực” xảy ra mạnh khi tần số sóng siêu âm thấp Khoảng tần số thường dùng để hiện tượng “xâm thực” xảy ra mạnh mẽ là 20 – 50 kHz [87]

b Ảnh hưởng của nhiệt độ siêu âm

- 20 -

Khi nhiệt độ tăng, độ nhớt hỗn hợp giảm, sức căng bề mặt cũng giảm, các bong bóng khí và hơi được hình thành dễ bị nổ tung Ngoài ra, tăng nhiệt độ còn làm cho sự khuếch tán của các phân tử trong hỗn hợp phản ứng diễn ra mạnh hơn, từ đó làm tăng khả năng phá vỡ hạt tinh bột trong giai đoạn hồ hóa Tuy nhiên, khi nhiệt độ lên đến giá trị đạt đỉnh nhớt của hồ tinh bột, độ nhớt tăng cao làm cho hiện tượng xâm thực yếu đi, hiệu quả phá vỡ hạt do sự “xâm thực” sẽ giảm [119], [120]

Bên cạnh đó, nhiệt độ tăng sẽ làm giảm độ hòa tan của khí bên trong chất lỏng và làm tăng áp suất hơi cân bằng của nước nên các bong bóng được tạo thành nhanh và nhiều hơn, lượng hơi nước trong bong bóng cao hơn Vì hơi nước có hệ số truyền nhiệt nhỏ hơn khí nên lượng hơi nước nhiều sẽ làm giảm nhiệt độ cũng như áp suất cục bộ khi bong bóng nổ tung Ngoài ra, nhiệt độ cao làm giảm sức căng bề mặt giữa hai pha lỏng – “khí” nên Pcb giảm (Phương trình 1.19), do đó giá trị áp suất cục bộ sẽ không cao khi bong bóng nổ tung Dựa trên những lập luận này thì nhiệt độ cao làm giảm hiệu quả của quá trình xâm thực Ở nhiệt độ sôi, hiện tượng xâm thực sẽ biến mất, sự vô hoạt enzyme xảy ra là do tác động chủ yếu của nhiệt [87]

Như vậy, tùy theo các tính chất hóa lý của huyền phù tinh bột mà sẽ tồn tại giá trị nhiệt độ siêu âm thích hợp để hiệu quả thủy phân là cao nhất Trong quá trình siêu âm, hầu hết năng lượng sinh ra từ hiện tượng xâm thực sẽ được phân tán dưới dạng nhiệt lượng, vì vậy nhiệt độ của hỗn hợp sẽ tăng Khi nhiệt độ tăng đến giá trị làm biến tính protein thì enzyme sẽ bị vô hoạt bởi nhiệt Nếu trong quá trình siêu âm có hệ thống giải nhiệt, nhiệt độ không vượt quá giá trị gây biến tính enzyme thì tác động khuấy trộn của sóng siêu âm sẽ làm tăng sự tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất, từ đó hiệu suất phản ứng

sẽ tăng lên [108]

c Ảnh hưởng của năng lượng sóng siêu âm

Sóng siêu âm năng lượng thấp sẽ hạn chế phản ứng tạo ra những gốc tự do Đối với sóng siêu âm năng lượng cao, khả năng tạo bong bóng sẽ gia tăng, từ đó làm tăng hàm lượng tinh bột hòa tan nhưng lại tạo ra nhiều gốc tự do hơn Vì vậy, với mỗi một hỗn hợp huyền phù tinh bột cụ thể sẽ có một năng lượng siêu âm thích hợp để làm tăng hiệu suất thủy phân [1], [118], [121], [122], [123], [124]

- 21 -

d Ảnh hưởng của thời gian siêu âm

Khi tăng thời gian siêu âm, thời gian tác động của các “vi dòng” và “vi tia” kéo

dài, hạt tinh bột bị phá vỡ nhiều hơn và khả năng tiếp xúc giữa enzyme với cơ chất sẽ

tốt hơn, do đó hiệu suất phản ứng tăng Nghiên cứu của Huang và cộng sự (2007) [115],

Shewale và cộng sự (2009) [122], Montalbo-Lomboy và cộng sự (2010) [118], Zheng

và cộng sự (2013) [125] đều đưa ra kết luận là khi tăng thời gian siêu âm, hiệu suất phản

ứng sẽ tăng lên Tuy nhiên, khi các tác động của “vi dòng”, “vi tia” và lực cắt quá lớn,

đồng thời sự tích tụ của gốc tự do tăng dần theo thời gian siêu âm thì hoa ̣t tính enzyme

bị giảm đi Các nghiên cứu của Junqing và cộng sự (2011) [123], Nikolíc và cộng sự

(2011) [117], Miao và cộng sự (2014) [124] lại đưa ra kết quả là khi tăng thời gian siêu

âm, hiệu suất phản ứng tăng dần đến giá trị cực đại rồi giảm dần

1.4.2.2 Tính chất của huyền phù tinh bột

a Loại tinh bột

Mỗi loại tinh bột sẽ có tỷ lệ amylose/amylopectin và cấu trúc của hạt tinh bột khác

nhau Cấu trúc hạt tinh bột giàu amylose có tỷ lệ vùng vô định hình nhiều hơn nên sóng

siêu âm dễ tác động làm phá vỡ hạt hơn [126]

b Hàm lượng tinh bột

Hàm lượng tinh bột cao trong huyền phù sẽ làm tăng độ nhớt, từ đó gây cản trở sự

lan truyền của sóng siêu âm đồng thời làm giảm khả năng “xâm thực”, do đó tác động

của sóng siêu âm lên hiệu suất quá trình thủy phân tinh bột sẽ giảm [9]

Những kết quả nghiên cứu đã thu được

Sóng siêu âm thường được ứng dụng trong giai đoạn tiền xử lý các hạt bột hay tinh

bột từ hạt và củ Quá trình siêu âm làm giải phóng phân tử tinh bột ra khỏi hạt bột và

tinh bột, tăng khả năng tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất và nâng cao hiệu suất thủy phân

- 22 -

Bảng 1.4 giới thiệu các công bố về sử dụng sóng siêu âm để giải phóng phân tử tinh bột ra khỏi hạt bột hay tinh bột trước khi bổ sung chế phẩm enzyme, từ đó giúp cho giai đoạn tiếp theo của quá trình thủy phân diễn ra tốt hơn và làm tăng hiệu suất thủy phân

- 23 -

Bảng 1.4 Ứng dụng sóng siêu âm trong giai đoạn hồ hóa tinh bột

40 giây, không điều nhiệt

Lượng đường khử sau dịch hóa tăng 32 % so với đối

chứng

Khanal và cộng sự (2007) [121]

2 Bột ngô trong nước,

hàm lượng 30% w/v

Thanh siêu âm, 500W, siêu

âm theo chu kỳ hoạt động 15 giây, nghỉ 5 giây, thời gian

15 phút, không điều nhiệt

Độ thủy phân DH tăng 18,4% so với đối chứng

Huang và cộng sự (2007) [115]

40 giây, không điều nhiệt

Lượng đường khử sau giai đoạn dịch hóa tăng 177% so với đối chứng

Nitayavardhana và cộng sự (2008) [127]

Montalbo-Lomboy

và cộng sự (2010) [118]

6 Bột ngô trong nước,

7 Bột ngô trong nước,

hàm lượng 33% w/v Bể siêu âm 400W, 15 phút, 55 o C

Hiệu suất phản ứng thủy phân tăng thêm 7,9% so với

đối chứng

Junqing và cộng sự (2011) [123]

Pejin và cộng sự (2012) [120]

Lượng tinh bột hòa tan tăng 2,69% so với đối chứng Zheng và cộng sự (2013) [125]

10 Bã rắn từ quá trình sản

xuất tinh bột khoai tây

Thanh siêu âm, 20 kHz, 40W, 240 giây, 60 o C

Lượng đường khử tăng thêm 1% so với đối chứng

Hernoux-Villière

và cộng sự (2013) [128]

Miao và cộng sự (2014) [124]

Thiết lập được phương trình

mô tả ảnh hưởng của nhiệt

độ, công suất, thời gian siêu

âm và nồng độ cơ chất đến DSOL, SP, DP của tinh bột

Amini và công sự (2015) [130]

14 Bột ngô trong nước,

hàm lượng 10%w/w

Bể siêu âm có 2 tần số 25kHz

và 20kHz, 400W, siêu âm liên tục trong suốt quá trình gia nhiệt từ 30 o C lên 92 o C, giữ nhiệt 5 phút và giảm nhiệt xuống 50 o C, tốc độ 7,5 o C/phút

Giảm độ nhớt của hỗn hợp lần lượt 18.87% và 17.66%

ở tần số 25 kHz và 20 kHz

Hu và cộng sự (2015) [131]

Kang và cộng sự (2016) [132]

- 24 -

Đến nay, có rất ít công bố sử dụng sóng siêu âm trong giai đoạn dịch hóa (xử lý siêu âm huyền phù tinh bột có chứa chế phẩm enzyme α – amylase ngay từ ban đầu) để làm tăng hiệu quả thủy phân tinh bột Có thể kể đến nghiên cứu của Leaes và cộng sự (2013) sử dụng bể siêu âm (tần số 40kHz, công suất 132 W, tổng diện tích bề mặt truyền sóng 282,2cm2, nhiệt độ ổn định ở 40oC trong thời gian 8 giờ) để xử bã rắn từ quy trình sản xuất tinh bột khoai mì có bổ sung hỗn hợp enzyme α-amylase và amyloglucosidase Kết quả cho thấy hàm lượng các đường lên men thu được từ mẫu siêu âm cao hơn mẫu đối chứng là 1,4 lần [133]

Xác định hướng nghiên cứu của đề tài

Sau khi thực hiện xong phần tổng quan tài liệu, chúng tôi nhâ ̣n đi ̣nh rằng sử dụng sóng siêu âm để nâng cao hiệu quả quá trình thủy phân tinh bột là một giải pháp có thể mang lại lợi ích về mặt công nghệ Đã có một số nghiên cứu chuyên sâu về vấn đề này

và đưa ra kết luận là sử dụng sóng siêu âm xử lý hạt tinh bột trong giai đoạn hồ hóa có thể rút ngắn được thời gian quá trình thủy phân và làm tăng hàm lượng đường khử thu được Tuy nhiên vì đây là một hướng mới nên còn nhiều vấn đề chưa được nghiên cứu thấu đáo, cụ thể là:

 Tác động của sóng siêu âm đến hoạt độ chế phẩm enzyme amylase công nghiệp khi không có sự hiện diện của tinh bột

 Tác động của sóng siêu âm lên quá trình thủy phân tinh bột khi sử dụng huyền phù với hàm lượng tinh bột cao Hiện nay, quá trình thủy phân tinh bột trong công nghiệp được được thực hiện trên các huyền phù với hàm lượng tinh bột 30 – 35%

Ở Việt nam, quá trình thủy phân tinh bột trong sản xuất công nghiệp được thực hiện chủ yếu với tinh bột khoai mì có hàm lượng tinh bột trong khoảng 20 – 25% [134], [135] Do đó, tìm hiểu về ảnh hưởng của sóng siêu âm đến hoạt độ chế phẩm enzyme amylase công nghiệp khi không có sự hiện diện của tinh bột và ảnh hưởng của sóng siêu

âm đến giai đoạn dịch hóa tinh bột khoai mì với hàm lượng cao (trên 30%) là những hướng nghiên cứu mới mà luận án có thể đi sâu vào khai thác

phường 09, quận Phú Nhuận thành phố Hồ Chí Minh

Chế phẩm enzyme α – amylase có tên thương mại là Termamyl 120L Đây là chế

phẩm chứa α – amylase bền nhiệt có xuất xứ từ canh trường vi khuẩn Bacillus

licheniformis Điều kiện hoạt động thích hợp của chế phẩm là 85oC – 95oC, pH 6,0 – 7,0 Chế phẩm có hoạt độ 120 KNU/g (Kilo Novo Unit) Một KNU được hãng Novozymes định nghĩa là lượng enzyme cần thiết để xúc tác thủy phân 5,26 g tinh bột hòa tan trong một giờ trong điều kiện pH 5,6 và nhiệt độ 37oC theo phương pháp chuẩn của Novozyme (Termamyl® 120 L, Type L Product Data Sheet, Novo Nordisk, 2005) Chế phẩm enzyme glucoamylase có tên thương mại là Dextrozyme GA Đây là

chế phẩm chứa glucoamylase có xuất xứ từ canh trường nấm mốc Aspergillus nige Điều

kiện hoạt động thích hợp của chế phẩm là 60oC – 65oC, pH 4,0 – 5,0 Chế phẩm có hoạt

độ 270 AGU/g (AmyloGlucosidase Unit) Một AGU được định nghĩa là lượng enzyme cần thiết để xúc tác thủy phân ra 1 μmol đường glucose trong 1 phút ở điều kiện nồng

độ cơ chất 10 mg/mL; nhiệt độ 37oC; pH 5,0; thời gian phản ứng 30 phút (Dextrozyme®

GA Product Data Sheet, Novo Nordisk, 2005)

Tinh bột khoai mì

Tinh bột khoai mì được cung cấp bởi Công ty trách nhiệm hữu hạn khoai mì Tây Ninh Tinh bột có độ ẩm 13 ± 0,5% Hàm lượng tinh bột 86 ± 0,5% Kích thước trung bình của hạt tinh bột khoai mì là 41μm Nhiệt độ bắt đầu hồ hóa và nhiệt độ đạt đỉnh nhớt của dung dịch tinh bột 5% tương ứng là 65oC và 75oC

- 26 -

Các hóa chất phân tích

Các hóa chất phân tích gồm tinh bột hòa tan, maltodextrin DE 20, thuốc thử DNA 3,5 – dinitrosalicylic acid, thuốc thử Coomassie Brilliant Blue, hệ đệm natri phosphate

và hệ đệm citrate phosphate do hãng Merck (Đức) sản xuất

Nội dung nghiên cư ́ u

Khi sóng siêu âm tác động vào hỗn hợp nước, tinh bột và enzyme, hiện tượng xâm thực có thể tác động đến cấu trúc của hạt tinh bột và hoạt độ của enzyme Để có thể hiểu

rõ ảnh hưởng của sóng siêu âm đến từng nhóm cấu tử của hỗn hợp, luận án được chia thành 4 phần: Xử lý siêu âm huyền phù tinh bột khoai mì; Xử lý siêu âm chế phẩm enzyme amylase; Xử lý siêu âm hỗn hợp huyền phù tinh bột khoai mì có chứa enzyme

và so sánh hiệu quả của các giải pháp làm tăng hiệu quả thủy phân

Phần 1: Xử lý siêu âm huyền phù tinh bột khoai mì – Ảnh hưởng của sóng siêu âm đến giai đoạn hồ hóa: Mục đích của phần này nhằm tìm hiểu quy luật ảnh hưởng của sóng siêu âm đến quá trình giải phóng amylose và amylopectin ra khỏi hạt tinh bột, làm tăng

độ hòa tan tinh bột khi không có enzyme xúc tác

Phần 2: Xử lý siêu âm chế phẩm enzyme amylase nhằm tìm hiểu quy luật ảnh hưởng của sóng siêu âm đến hoạt độ và tính chất của hai chế phẩm Termamyl 120L và Dextrozyme GA khi không có mặt tinh bột

Phần 2.1 Ảnh hưởng của sóng siêu âm đến chế phẩm Termamyl 120L

 Ảnh hưởng của sóng siêu âm đến hoạt độ α- amylase của chế phẩm Termamyl 120L: Xác đi ̣nh quy luật ảnh hưởng của nhiệt độ, công suất và thời gian siêu âm đến hoạt tính xúc tác bằng phương pháp cổ điển và quy hoa ̣ch thực nghiê ̣m

 Ảnh hưởng của sóng siêu âm đến tính chất của chế phẩm Termamyl 120L: Xác định

và so sánh tính chất của mẫu siêu âm và mẫu đối chứng; trong đó, chế phẩm Termamyl 120L có hoạt độ gia tăng nhờ xử lý siêu âm được gọi tắt là mẫu siêu âm,

và chế phẩm Termamyl 120L ban đầu được gọi tắt là mẫu đối chứng Nội dung khảo sát bao gồm: biến đổi hoạt độ α – amylase theo pH và nhiệt độ; các thông số động học và nhiệt động học của phản ứng thủy phân tinh bột hòa tan có enzyme xúc tác

và các thông số nhiệt động của quá trình vô hoạt enzyme

- 27 -

Phần 2.2: Ảnh hưởng của sóng siêu âm đến chế phẩm enzyme Dextrozyme GA

 Ảnh hưởng của sóng siêu âm đến hoạt độ glucoamylase của chế phẩm Dextrozyme GA: Xác đi ̣nh quy luật ảnh hưởng của nhiệt độ, công suất và thời gian siêu âm đến hoạt tính xúc tác bằng phương pháp cổ điển và quy hoa ̣ch thực nghiê ̣m

 Ảnh hưởng của sóng siêu âm đến tính chất của chế phẩm Dextrozyme GA: Xác định

và so sánh tính chất của mẫu siêu âm và mẫu đối chứng; trong đó, chế phẩm Dextrozyme GA có hoạt độ gia tăng nhờ xử lý siêu âm được gọi tắt là mẫu siêu âm,

và chế phẩm Dextrozyme GA ban đầu được gọi tắt là mẫu đối chứng Nội dung khảo sát bao gồm: biến đổi hoạt độ glucoamylase theo pH và nhiệt độ

Phần 3: Xử lý siêu âm hỗn hợp huyền phù tinh bột khoai mì có chứa enzyme – Ảnh hưởng của sóng siêu âm đến giai đoạn dịch hóa: Mục đích của phần này nhằm xác đi ̣nh quy luật ảnh hưởng của sóng siêu âm đến quá trình giải phóng và thủy phân tinh bột, làm tăng hàm lượng tinh bột hòa tan trong hỗn hợp tinh bột và enzyme

Phần 4: So sánh các giải pháp sử dụng sóng siêu âm để nâng cao hiệu quả thủy phân tinh bột khoai mì: sử dụng enzyme có hoạt độ gia tăng nhờ xử lý siêu âm để xúc tác cho quá trình thủy phân và sử dụng sóng siêu âm để xử lý hỗn hợp huyền phù tinh bột khoai mì và enzyme trong giai đoạn dịch hóa Thông số so sánh là hiệu suất thủy phân tinh bột sau hai giai đoạn dịch hóa và đường hóa; lượng enzyme sử dụng và năng lượng siêu âm cần sử dụng để tăng thêm 1g đường khử so với mẫu đối chứng

Phương pháp nghiên cứu thực nghiê ̣m

Phương pháp cổ điển

Chúng tôi thay đổi giá tri ̣ một thông số cần khảo sát, cố đi ̣nh giá tri ̣ các thông số còn la ̣i, từ đó xác định quy luật biến đổi của hàm mu ̣c tiêu theo thông số khảo sát

Phương pháp quy hoạch thực nghiê ̣m

Chúng tôi thay đổi đồng thời các thông số cần khảo sát theo ma trâ ̣n quy hoa ̣ch thực nghiê ̣m phương án quay bậc hai có tâm của Box – Hunter nhằm đánh giá ảnh hưởng đồng thời của các yếu tố đến hàm mu ̣c tiêu và xác đi ̣nh giá tri ̣ của các yếu tố để hàm

mu ̣c tiêu đa ̣t giá tri ̣ cực đa ̣i

- 28 -

Bố trí thí nghiệm

Phần 1: Xử lý siêu âm huyền phù tinh bột khoai mì – Ảnh hưởng của sóng

siêu âm đến giai đoạn hồ hóa

 Mu ̣c đích: xác đi ̣nh quy luật ảnh hưởng của hàm lượng tinh bột trong huyền phù ban đầu và các thông số nhiệt độ, công suất, thời gian siêu âm đến độ hòa tan tinh bột trong giai đoạn hồ hóa

 Cách thực hiện: 100 gram tinh bột khoai mì được hòa với nước cất ở các hàm lượng khác nhau Hỗn hợp huyền phù được gia nhiệt trong thiết bị phản ứng đến một giá trị nhiệt độ xác định Các “mẫu siêu âm” được xử lý với thời gian và công suất siêu

âm được cài đặt sẵn Quá trình siêu âm được thực hiện trong thiết bị phản ứng có hệ thống điều nhiệt sao cho nhiệt độ các mẫu xử lý không vượt quá giá trị nhiệt độ cần khảo sát Các “mẫu đối chứng” được ủ trong thiết bị phản ứng ở nhiệt độ tương đương với các “mẫu siêu âm” Sau đó, cả mẫu siêu âm và đối chứng đều được gia nhiệt lên đến 90oC và giữ ở nhiệt độ này trong một khoảng thời gian sao cho tổng thời gian xử lý nhiệt và siêu âm là 60 phút Mẫu phân tích được lấy ở thời điểm bắt đầu siêu âm, kết thúc siêu âm và sau mỗi 10 phút trong suốt quá trình thí nghiệm để xác định hàm lượng tinh bột hòa tan, từ đó xác định phương trình động học mô tả độ hòa tan tinh bột theo thời gian hồ hóa Bên cạnh đó, để giải thích ảnh hưởng của nhiệt độ bắt đầu siêu âm đến độ hòa tan tinh bột trong các thí nghiệm 1.2 (Bảng 2.1), tiến hành xác định sự biến thiên độ nhớt của huyền phù tinh bột khoai mì theo sự gia tăng nhiệt độ trong giai đoạn hồ hóa

Bảng 2.1 Bố trí thí nghiê ̣m khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố trong quá trình xử lý

siêu âm đến hàm lượng tinh bột hòa tan trong giai đoạn hồ hóa

1.1 Hàm lượng huyền phù tinh bột (%)

5 – 10 – 15 – 20 – 25 – 30 – 35%

- Nhiệt độ bắt đầu siêu âm: 65 o C

- Công suất siêu âm: 3W/g tinh bột

- Thời gian siêu âm: 10 phút

1.2 Nhiệt độ bắt đầu siêu âm ( o C)

50 – 60 – 64 – 65 – 70 – 75 – 77

- Nồng độ huyền phù tinh bột: được chọn từ kết quả TN1.1

- Công suất siêu âm: 3W/g tinh bột

- Thời gian siêu âm: 10 phút

1.3 Công suất siêu âm (W/g tinh bột)

0 – 1,5 – 2,25 – 3,0 – 3,75 – 4,5

- Nồng độ huyền phù tinh bột: được chọn từ kết quả TN1.1

- Nhiệt độ bắt đầu siêu âm: được chọn từ kết quả TN1.2

- Thời gian siêu âm: 10 phút

1.4 Thời gian siêu âm (phút)

0 – 5 – 10 – 15 – 20 – 25

- Nồng độ huyền phù tinh bột: được chọn từ kết quả TN1.1

- Nhiệt độ bắt đầu siêu âm: được chọn từ kết quả TN1.2

- Công suất siêu âm được: chọn từ kết quả TN1.3

- 29 -

 Bố trí thí nghiệm: Các thí nghiệm sẽ được bố trí theo phương pháp cổ điển Các yếu

tố cố định và thay đổi được trình bày trong Bảng 2.1

 Kết quả dự kiến: xác đi ̣nh được quy luâ ̣t ảnh hưởng của các yếu tố nhiệt độ, công suất

và thời gian siêu âm đến độ hòa tan tinh bột sau 60 phút hồ hóa và tại thời điểm cân bằng

Phần 2: Xử lý siêu âm chế phẩm enzyme amylase

2.4.2.1 Phần 2.1 Ảnh hưởng của sóng siêu âm đến chế phẩm Termamyl 120L

a Ảnh hưởng của sóng siêu âm đến hoạt độ α- amylase của chế phẩm Termamyl 120L

 Mu ̣c đích: xác đi ̣nh quy luật biến đổi hoạt độ α - amylase của chế phẩm Termamyl 120L khi thay đổi các thông số nhiệt độ, công suất và thời gian siêu âm

 Cách thực hiện: 15 mL chế phẩm enzyme được cho vào cốc thủy tinh để xử lý siêu

âm với thời gian và công suất được cài đặt sẵn Trong quá trình siêu âm, cốc đựng mẫu được đặt trong bể nước lạnh để điều nhiệt sao cho nhiệt độ mẫu không vượt quá giá trị nhiệt độ cần khảo sát Sau quá trình siêu âm, các mẫu enzyme được đem xác định hoạt độ amylase và so sánh hoạt độ với mẫu đối chứng không xử lý siêu âm Để giải thích nguyên nhân sóng siêu âm làm thay đổi hoạt tính amylase trong mẫu siêu

âm, mẫu enzyme siêu âm có hoạt độ α – amylase tăng cao nhất và mẫu enzyme đối chứng được đem đi xác định hàm lượng protein hòa tan, thành phần protein theo phân

tử lượng, phổ UV, phổ hồng ngoại và phổ cộng hưởng từ hạt nhân

 Bố trí thí nghiệm: Các thí nghiệm được bố trí theo phương pháp cổ điển và quy hoạch thực nghiệm quay bậc hai có tâm của Box – Hunter Các thông yếu tố cố định và

thay đổi được trình bày trong Bảng 2.2

Bảng 2.2 Bố trí thí nghiê ̣m theo phương pháp cổ điển về ảnh hưởng của các yếu tố xử

lý siêu âm đến hoạt độ amylase của chế phẩm enzyme thương mại

20 – 30 – 40 – 50 – 60

- Công suất siêu âm: 20W/mL chế phẩm

- Thời gian siêu âm: 60 giây

0 – 10 – 15 – 20 – 25 – 30 – 35

- Nhiệt độ siêu âm: được chọn từ kết quả TN2.1.1

- Thời gian siêu âm: 60 giây

2.1.3

Thời gian siêu âm (giây)

0 – 30 – 45 – 60 – 75 – 90 – 105 – 120 –

135 – 150

- Nhiệt độ siêu âm: được chọn từ kết quả TN2.1.1

- Công suất siêu âm: được chọn từ kết quả TN2.1.2

- 30 -

 Kết quả dự kiến: xác đi ̣nh được quy luâ ̣t ảnh hưởng của các yếu tố xử lý siêu âm đến hoạt độ amylase của chế phẩm Termamyl 120L; chọn được các yếu tố xử lý siêu âm

để hoạt độ amylase của chế phẩm Termamyl 120L đạt giá trị cao nhất

b Ảnh hưởng của sóng siêu âm đến tính chất của chế phẩm Termamyl 120L

Sử dụng các yếu tố xử lý siêu âm đã tìm được ở mục 2.4.2.1.a để làm tăng hoạt tính xúc tác của chế phẩm Termamyl 120L Chế phẩm này được gọi tắt là enzyme siêu

âm Trong các thí nghiệm tiếp theo, tính chất của chế phẩm enzyme siêu âm sẽ được so sánh với chế phẩm “enzyme đối chứng” (không qua siêu âm)

i pH tối ưu và các thông số động học enzyme

 Mu ̣c đích: xác đi ̣nh và so sánh ảnh hưởng của pH đến hoạt độ amylase của hai chế phẩm enzyme siêu âm và đối chứng

 Cách thực hiện: Mỗi mẫu thí nghiệm được đem đi xác định hoạt độ amylase và các thông số động học (vmax, Km, kcat, kcat/Km) khi thay đổi giá trị pH từ 5,0 đến 9,0, nhiệt

độ được ổn định ở 85oC Giá trị hoạt độ enzyme thu được ở các điều kiện pH khác nhau sẽ được tính theo tỷ lệ phần trăm so với điều kiện pH cho hoạt độ cao nhất

 Kết quả dự kiến: xác đi ̣nh được quy luật ảnh hưởng của pH đến hoạt độ amylase của chế phẩm enzyme siêu âm và đối chứng và giá trị pH tối thích của chế phẩm enzyme siêu âm và enzyme đối chứng

ii Nhiệt độ tối ưu, các thông số động học enzyme và nhiệt động học phản ứng

 Mu ̣c đích: xác đi ̣nh và so sánh ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng đến hoạt độ amylase của hai chế phẩm enzyme siêu âm và đối chứng

 Cách thực hiện: Mẫu enzyme siêu âm và enzyme đối chứng được đem đi xác định hoạt độ amylase và các thông số động học (vmax, Km, kcat, kcat/Km) khi nhiệt độ thay đổi từ 50oC đến 95oC, giá trị pH tối ưu được chọn từ thí nghiệm trước Giá trị hoạt

độ enzyme thu được ở các điều kiện nhiệt độ phản ứng khác nhau sẽ được tính theo

tỷ lệ phần trăm so với điều kiện nhiệt độ cho hoạt độ cao nhất

Các thông số nhiệt động của phản ứng thủy phân tinh bột hòa tan do enzyme xúc tác sẽ được tính toán dựa vào các giá trị động học theo nhiệt độ phản ứng Các thông

số nhiệt động gồm có năng lượng hoạt hóa (Ea), enthalpy (ΔH), entropy (ΔS), năng lượng tự do của phản ứng thủy phân tinh bột (ΔG), năng lượng tự do của giai đoạn hình thành phức chất giữa enzyme với cơ chất (ΔGE-S) và năng lượng tự do của giai

iii Độ bền hoạt tính của chế phẩm Termamyl 120L

 Mu ̣c đích: xác đi ̣nh và so sánh ảnh hưởng của thời gian (phản ứng hay bảo quản) đến hoạt độ α – amylase trong hai chế phẩm enzyme siêu âm và đối chứng ở các nhiệt

độ khác nhau

 Cách thực hiện:

- Nhiệt độ phản ứng: Chế phẩm enzyme (không có mặt cơ chất) được ủ trong một giờ ở các giá trị nhiệt độ lần lượt là 70oC, 75oC, 80oC, 85oC, 90oC Trong thời gian

ủ, tiến hành lấy mẫu sau mỗi 10 phút để xác định hoạt độ α – amylase

- Nhiệt độ bảo quản: Thí nghiệm được thực hiện tương tự như trên với hai giá trị nhiệt độ khảo sát là 30oC và 5oC Thời gian khảo sát là 63 ngày, tiến hành lấy mẫu sau mỗi 7 ngày để xác định hoạt độ α – amylase

- Từ các kết quả thu được, các thông số động học (kin và t1/2) và các thông số nhiệt động học (bao gồm năng lượng hoạt hóa (Ea-in), enthalpy (ΔHin), entropy (ΔSin), năng lượng tự do (ΔGin)) của quá trình vô hoạt enzyme được xác định theo phương pháp của Eyring và Stearn (1939) [136]

 Kết quả dự kiến: xác đi ̣nh được hằng số tốc độ vô hoạt enzyme, thời gian “bán hủy”

và các thông số nhiệt động học quá trình vô hoạt amylase của mẫu enzyme siêu âm

và enzyme đối chứng ở các nhiệt độ khác nhau

2.4.2.2 Phần 2.2: Ảnh hưởng của sóng siêu âm đến chế phẩm Dextrozyme GA

a Ảnh hưởng của sóng siêu âm đến hoạt độ glucoamylase của chế phẩm Dextrozyme GA

Thí nghiệm được thực hiện tương tự phần 2.4.2 (mục 2.4.2.1) với thông số cần xác định là hoạt độ glucoamylase Chế phẩm Dextrozyme GA là một tổ hợp của nhiều