Ảnh hưởng của hàm lượng đường bổ sung vào môi trường MS, MS2 đến khả năng tạo cây hoàn chỉnh và khảo sát loại giá thể thích hợp cho cây lan giả hạc (dendrobium anosmum) cấy mô

TÓM TẮT Đề tài: “Ảnh hưởng của hàm lượng đường bổ sung vào môi trường MS, MS/2 đến khả năng tạo cây hoàn chỉnh và khảo sát loại giá thể thích hợp cho cây lan Giả hạc Dendrobium anosmum

TÓM TẮT

Đề tài: “Ảnh hưởng của hàm lượng đường bổ sung vào môi trường MS, MS/2 đến khả năng tạo cây hoàn chỉnh và khảo sát loại giá thể thích hợp cho cây lan Giả

hạc (Dendrobium anosmum) cấy mô” được thực hiện tại Trường Đại học An Giang nhằm

tìm ra hàm lượng đường và nồng độ khoáng thích hợp giúp lan Giả hạc ra rễ tốt, khỏe mạnh và đạt tỷ lệ sống cao trong giai đoạn thuần dưỡng Đồng thời, chọn được giá thể thích hợp để trồng lan Giả hạc cấy mô để tạo lượng lớn cây con khỏe, sinh trưởng tốt

Đề tài được thực hiện với 3 thí nghiệm:

- Khảo sát sự ảnh hưởng của hàm lượng đường trong môi trường MS, MS/2 đến

khả năng tạo cây hoàn chỉnh của chồi lan Giả hạc in vitro

- Khảo sát khả năng thích nghi của lan Giả hạc cấy mô ở giai đoạn thuần dưỡng

- Khảo sát khả năng tăng trưởng của cây lan Giả hạc cấy mô trên các loại giá thể khác nhau

Kết quả cho thấy những mẫu lan Giả hạc in vitro tạo cây hoàn chỉnh đạt hiệu quả

nhất trên ba môi trường: môi trường MS + 30 g/l đường, môi trường MS/2 + 20 g/l đường

và môi trường MS/2 + 30 g/l đường Sau đó, những cây đạt chuẩn trước khi được trồng ở môi trường bên ngoài sẽ trải qua quá trình thuần dưỡng ở vườn ươm và kết quả cho thấy lan Giả hạc cấy mô tạo được cây hoàn chỉnh đạt tỉ lệ sống cao (67,6%) ở môi trường MS/2 + 30 g/l đường Sau khi tiến hành khảo sát khả năng tăng trưởng của những cây lan Giả hạc cấy mô trên các loại giá thể khác nhau, ghi nhận những cây Giả hạc đạt tỉ lệ sống cao (66,67%) trên giá thể than + dớn nhuyễn sau 120 ngày và có khả năng sinh trưởng, phát triển tốt hơn so với các loại giá thể còn lại

Từ khóa: Lan Giả hạc, nuôi cấy mô thực vật, môi trường MS, giá thể

ABSTRACT Research topic: “The effect of added sucrose on MS, MS/2 medium to the

ability to create a complete plant and finding appropriate substrates for Dendrobium

anosmum was propagated by tissue culture method” was performed at An Giang

University to find the suitable content of sucrose and mineral to help D anosmum well

rooted, healthy and high survival rate in taming stage Also, choose the suitable substrates

for growing of D anosmum was propagated by tissue culture method to generate large

amounts of healthy seedlings, growing well

This project included three experiments:

- Survey of the effect of added sucrose on MS, MS/2 medium to the ability to

create a complete plant of D anosmum explants

- Survey of the adaptation of D anosmum was propagated by tissue culture method

in taming stage

- Survey of the growth possibility of D anosmum was propagated by tissue culture

method on several substrates

The result showed that the D anosmum explants created complete plants which

was the most effective on the three medium: MS medium + 30 g/l sucrose, MS/2 medium + 20 g/l sucrose and MS/2 medium + 30 g/l sucrose Then, the qualified plantlets before planted in the external environment would undergo the taming process in the nursery, the

result showed that the D anosmum explants created complete plants and achieved the high

survival rate (67.6%) on MS/2 medium + 30 g/l sucrose After surveying the growth

potential of D anosmum was propagated by tissue culture method on several substrates,

recorded seedlings achieved the high survival rate (66.67%) on wood charcoal + fern root after 120 days Besides, this seedlings was possible of growth and development better than the remaining substrates

Keywords: Dendrobium anosmum, plant tissue culture, MS medium, substrate

LỜI CAM KẾT

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu trong công trình nghiên cứu này có xuất xứ rõ ràng Những kết luận mới về khoa học của công trình nghiên cứu này chƣa đƣợc công bố trong bất kỳ công trình nào khác

………., ngày … tháng … năm……

Chủ nhiệm đề tài

Nguyễn Quốc Thanh

MỤC LỤC

CHẤP NHẬN CỦA HỘI ĐỒNG i

LỜI CẢM TẠ ii

TÓM TẮT iii

ABSTRACT iv

LỜI CAM KẾT v

MỤC LỤC vi

DANH SÁCH BẢNG ix

DANH SÁCH HÌNH x

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT xi

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1

1.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 2

1.3 MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI 2

CHƯƠNG 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

2.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ LAN RỪNG VIỆT NAM 3

2.2 GIỚI THIỆU VỀ LAN GIẢ HẠC 4

2.2.1 Nguồn gốc và phân loại lan Giả hạc 4

2.2.2 Đặc điểm hình thái của lan Giả hạc 5

2.2.2.1 Cơ quan sinh dưỡng 5

2.2.2.2 Cơ quan sinh sản 5

2.2.3 Điều kiện sinh lý đối với lan Giả hạc 5

2.2.3.1 Ánh sáng 5

2.2.3.2 Nhiệt độ 6

2.2.3.3 Ẩm độ 6

2.2.3.4 Phân bón 6

2.2.3.5 Độ thông gió 6

2.3 TẦM QUAN TRỌNG CỦA NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT 6

2.4 MÔI TRƯỜNG VÀ ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY 7

2.4.1 Môi trường nuôi cấy 7

2.4.2 Điều kiện nuôi cấy 9

2.5 CÁC VẤN ĐỀ GẶP PHẢI TRONG NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT 10

2.5.1 Nhiễm vi sinh vật 10

2.5.2 Sự hóa nâu 11

2.5.3 Sự thừa nước 11

2.5.4 Sự biến dị tế bào soma (somaclonal variation) 11

2.5.5 Cấu trúc bất thường 11

2.6 CẤU TRÚC HÌNH THÁI VÀ GIẢI PHẨU CỦA CÂY CON CẤY MÔ 12

2.6.1 Lớp cutin 12

2.6.2 Khí khẩu 12

2.6.3 Lá 12

2.6.4 Thân và rễ 12

2.7 ĐẶC ĐIỂM CÁC LOẠI GIÁ THỂ TRỒNG LAN 13

2.7.1 Xơ dừa 13

2.7.2 Than gỗ 13

2.7.3 Dớn 13

2.7.4 Trông trên vỏ cây 13

2.8 TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC 14

2.8.1 Ngoài nước 14

2.8.2 Trong nước 14

CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

3.1 ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN THỰC HIỆN 17

3.2 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 17

3.2.1 Thiết bị và dụng cụ 17

3.2.1.1 Thiết bị 17

3.2.1.2 Dụng cụ 17

3.2.2 Hóa chất 17

3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

3.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đường trong môi trường MS, MS/2 đến khả năng tạo cây hoàn chỉnh của chồi lan Giả hạc in vitro 17

3.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát khả năng thích nghi của lan Giả hạc cấy mô ở giai đoạn thuần dưỡng 19

3.3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát khả năng tăng trưởng của cây lan Giả hạc cấy mô trên các loại giá thể khác nhau 20

3.3.4 Phương pháp xử lý số liệu 21

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22

4.1 THÍ NGHIỆM 1: KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA HÀM LƯỢNG ĐƯỜNG TRONG MÔI TRƯỜNG MS, MS/2 ĐẾN KHẢ NĂNG TẠO CÂY HOÀN CHỈNH CỦA CHỒI LAN GIẢ HẠC IN VITRO 22

4.2 THÍ NGHIỆM 2: KHẢO SÁT KHẢ NĂNG THÍCH NGHI CỦA LAN GIẢ HẠC CẤY MÔ Ở GIAI ĐOẠN THUẦN DƯỠNG 26

4.3 THÍ NGHIỆM 3: KHẢO SÁT KHẢ NĂNG TĂNG TRƯỞNG CỦA CÂY LAN GIẢ

HẠC CẤY MÔ TRÊN CÁC LOẠI GIÁ THỂ KHÁC NHAU 27

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 32

5.1 KẾT LUẬN 32

5.2 KIẾN NGHỊ 32

TÀI LIỆU THAM KHẢO 33

PHỤ CHƯƠNG 35

PHỤ CHƯƠNG A: THÀNH PHẦN VÀ HÀM LƯỢNG CỦA MÔI TRƯỜNG KHOÁNG MS VÀ PHÂN BÓN LÁ ĐẦU TRÂU B1, 501 35

PHỤ CHƯƠNG B: KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ANOVA 37

DANH SÁCH BẢNG

2.1 Các loài lan rừng thuộc chi Hoàng thảo (Dendrobium) phổ biến hiện nay 3 2.2 Thành phần cơ bản và thành phần tự chọn của môi trường nuôi cấy 7 2.3 Các loài vi khuẩn thường gặp trong cấy mô (Leifert và Waites, 1990) 10

4.1 Kết quả tạo cây hoàn chỉnh của chồi lan Giả hạc in vitro 30 NSKC 22 4.2 Kết quả tạo cây hoàn chỉnh của chồi lan Giả hạc in vitro 60 NSKC 23 4.3 Kết quả tạo cây hoàn chỉnh của chồi lan Giả hạc in vitro 90 NSKC 24 4.4 Kết quả tỉ lệ sống (%) của lan Giả hạc cấy mô ở giai đoạn thuần dưỡng 27 4.5 Kết quả tỉ lệ sống (%) của lan Giả hạc cấy mô sau khi trồng trên các loại

DANH SÁCH HÌNH

3.3 Giá thể thí nghiệm than (A), xơ dừa (B) và dớn nhuyễn (C) 20

4.3 Các cây lan Giả hạc cấy mô đƣợc trồng trên giá thể than (A), xơ dừa (B),

dớn nhuyễn (C) và than + dớn nhuyễn (D) ở thời điểm 120 NSKT

31

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

EDTA Ethylenediamine tetraacetate

IAA Indolacetic acide

MS Murashige & Skoog

NAA Alpha-Naphthaleneacetic acid

NSKC Ngày sau khi cấy

NSKT Ngày sau khi trồng

NSKTD Ngày sau khi thuần dƣỡng

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Lan rừng Việt Nam có hơn 2.000 loài với rất nhiều loài hoa đẹp và có triển vọng kinh doanh trong lĩnh vực thương mại Theo Phan Thúc Huân (2005), đã có 300 loài lan rừng Việt Nam được nhiều nhà nghiên cứu, sưu tầm lan chọn lọc để sản xuất, nhân giống, cung cấp cho thị trường thế giới Trong đó, Dendrobium là một trong 6 giống phong lan rừng phổ biến được

mọi người ưa chuộng, mà đại diện là Denbrobium anosmum (lan Giả hạc) Theo Trần Văn

Bảo (1999), lan Giả hạc là loài lan rừng quý hiếm ở Việt Nam có nhiều trên dãy núi Trường Sơn từ Nam ra Bắc, đặc điểm của loài này là siêng hoa, hoa to, đẹp và có hương thơm nồng nàn nên rất được ưa chuộng cả trong và ngoài nước

Tuy nhiên, lan Giả hạc rừng tự nhiên hiện nay rất khan hiếm do bị khai thác quá mức, nhưng tại các phòng nuôi cấy mô trong nước ít có đề tài nghiên cứu về nhân giống lan Giả

hạc Đồng thời, vấn đề tạo cây in vitro hoàn chỉnh và thuần dưỡng cây con sau giai đoạn vườn

ươm đang còn gặp nhiều khó khăn nên tỉ lệ cây con chết khi chuyển ra vườn ươm còn khá cao

Dó đó, nguồn cây giống lan Giả hạc in vitro trong nước chưa cung cấp đủ nhu cầu thị trường

nên giá thành cây lan giống còn khá cao Hiện nay, thị trường trong nước một cây lan Giả hạc với một đơn vị nhỏ cũng phải giá hàng trăm ngàn, nếu là đơn vị lớn thì vài trăm đến triệu đồng

Bên cạnh đó, do ít có nghiên cứu được công bố về việc chuyển cây cấy mô ra ngoài trồng nên chưa có cơ sở khoa học để người dân có thể tự thuần dưỡng cây con từ các chai mô Vì thế, khi người dân ra cây trồng thì gặp nhiều khó khăn như tỉ lệ cây sống thấp, cây giống không đạt chất lượng, hay kỹ thuật trồng chưa đạt dẫn đến cây chậm lớn, tỉ lệ chết cao, nhiều bệnh hại tấn công… nên họ rất e ngại khi mua cây con từ các chai mô về trồng, nhưng nếu những cây lan này đã được thuần dưỡng vài tháng thì giá tăng gấp 2, gấp 3 lần so với trước lúc thuần dưỡng

Xuất phát từ những cơ sở trên, đề tài: “Ảnh hưởng của hàm lượng đường bổ sung vào môi trường MS, MS/2 đến khả năng tạo cây hoàn chỉnh và khảo sát loại giá thể thích hợp cho cây

lan Giả hạc (Dendrobium anosmum) cấy mô” được thực hiện nhằm cung ứng nhu cầu thị

trường và tạo nguồn cây giống lan Giả hạc cho nhà lưới để phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo về lan Giả hạc

1.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Khảo sát sự ảnh hưởng của hàm lượng đường trong môi trường MS, MS/2 đến khả năng tạo

cây hoàn chỉnh của chồi lan Giả hạc in vitro

Khảo sát khả năng thích nghi của lan Giả hạc cấy mô ở giai đoạn thuần dưỡng

Khảo sát khả năng tăng trưởng của những cây lan Giả hạc cấy mô trên các loại giá thể khác nhau khi chuyển ra nhà lưới

1.3 MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI

Xác định hàm lượng đường và nồng độ khoáng tối ưu giúp lan Giả hạc ra rễ tốt, khỏe mạnh và đạt tỷ lệ sống cao trong giai đoạn thuần dưỡng

Chọn được giá thể thích hợp để trồng lan Giả hạc được nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô nhằm tạo lượng lớn cây con khỏe, sinh trưởng tốt

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ LAN RỪNG VIỆT NAM

Theo cuốn sách “Flore General de l‟Indochine” do H Lecomte chủ biên (1932-1934), Đông Dương đã xác định và mô tả được 101 giống gồm 750 loài lan rừng Ngày nay, theo một số tài liệu cho rằng lan rừng Việt Nam có hơn 2.000 loài Trong đó, có nhiều loài quí vì giá trị về nguồn gen, quí về hoa đẹp và bền, đặc biệt nhiều loài có hương thơm nồng nàn (Phan Thúc Huân, 2005)

Theo Nguyễn Công Nghiệp (2004), lan rừng Việt Nam có nhiều giống nở trên hai tháng như

Mỹ dung dạ hương (Vanda denisoniana), Huyết nhung (Renanthera imschootiana), Hồng lan (Cymbidium insigne), Hoàng lan (Cymbidium iridioides)… Có loại nở trung bình 1 – 2 tuần như Long tu (Dendrobium primulinum), Kim điệp (Dendrobium capillies), Đuôi cáo (Aerides multiflora), Ngọc điểm (Rhynchostylis gigantea)… Thậm chí có loài chỉ nở một ngày như loài

Thạch hộc So với các loài lan lai, lan rừng Việt Nam có kích thước bé hơn nhưng nhờ đa số

có mùi thơm nên vẫn hấp dẫn các người ái mộ như Mỹ dung dạ hương, Giả hạc, Hạc đỉnh

(Phaius tankervilliae), Đuôi cáo, Ngọc điểm…

Bảng 2.1: Các loài lan rừng thuộc chi Hoàng thảo (Dendrobium) phổ biến hiện nay

5 Hoàng thảo đơn cam Dendrobium unicum

7 Hoàng thảo u lồi Dendrobium pendulum

9 Hoàng thảo duyên dáng Dendrobium amabile

10 Hoàng thảo thủy tiên Dendrobium palpebrae

11 Thất điểm hồng Dendrobium draconis

12 Bạch hỏa hoàng Dendrobium bellatulum

13 Hoàng thảo xương rồng Dendrobium cariniferum

14 Hoàng thảo tam giác Dendrobium trigonopus

(Nguồn: Minh Trí và Xuân Giao, 2010)

2.2 GIỚI THIỆU VỀ LAN GIẢ HẠC

2.2.1 Nguồn gốc và phân loại lan Giả hạc

Theo Dương Công Kiên (2006), họ Orchidaceae có khoảng 750 chi, 25.000 loài, chiếm vị trí thứ hai sau họ Cúc trong ngành thực vật hạt kín và là họ lớn nhất trong lớp một lá mầm Các loài trong hệ thống này phân bố rất rộng, do đó hình thái và cấu tạo cũng hết sức đa dạng và phức tạp

Theo Huỳnh Văn Thới (2005), tên Dendrobium có nguồn gốc từ chữ Grec Dendron nghĩa là cây gỗ và bios là tôi sống Dendrobium là giống phụ sinh, sống trên cây gỗ Có người gọi là Hoàng lan, có người gọi là Đăng lan Dendrobium có trên 1.600 loài và chia thành hai dạng chính:

 Dạng đứng: thường mọc ở xứ nóng chịu ẩm và rất siêng hoa như Nhất điểm hồng, Nhất điểm hoàng, Báo hỉ, Ý thảo, Thủy tiên,…

 Dạng thòng: chịu khí hậu mát mẽ như Giả hạc, Hạc vĩ, Long tu, Phi điệp vàng,… Theo Phan Thúc Huân (2005), lan Giả hạc được phân loại như sau:

Dendrobium anosmum được mô tả lần đầu tiên bởi Lindley vào năm 1845 trong quyển “ The Botanical Register” Sau đó, H.G Reichenbach mô tả chúng với tên là Dendrobium superbum,

loài này phân bố nhiều ở Philippines, Indonesia, New Guinea, Sri Lanka, Malaysia và Thái Lan (Helmut Bechtel, 1981) Ở Việt Nam, lan Giả hạc còn được gọi là Phi điệp, loài lan này sống được ở nhiều nơi cả miền Bắc và Tây Nguyên, trên núi đất có độ cao thấp hay trung bình (Minh Trí và Xuân Giao, 2010)

Ở vùng Trung nguyên (độ cao trung bình 700 – 1.000 m), lan Giả hạc sinh trưởng nhiều nhất trên cây cà chí, đôi khi trên các cây giẻ sồi và một số ít mọc trên đá, nhiều nhất là ở vùng Tam

Bố (Lâm Dồng) trải dài theo hướng Tây qua biên giới tỉnh Đắc Lắc, rải rác loài này cũng mọc dọc đèo Ngọan Mục, Đơn Dương, nhưng loại ở đây trổ hoa chậm thường sau tết 15 ngày (Nguyễn Công Nghiệp, 2004)

Phân họ (subramilia) EpidendroideaeTông (tribus) Epidendreae

Loài (species) Dendrobium anosmum

2.2.2 Đặc điểm hình thái của lan Giả hạc

2.2.2.1 Cơ quan sinh dưỡng

Lan Giả hạc thuộc nhóm lan đa thân, có giả hành hình trụ, thân có nhiều đốt và rủ xuống, thân dài từ 60 – 120 cm, rộng khoảng 0.8 cm Thân được bao bọc bởi các bẹ lá xếp thành hai hàng dọc chiều dài thân Lá mỏng, thuôn dài hình elip từ 10 – 18 cm, rộng 2 – 3 cm, bẹ mau rách và

lá rụng theo mùa (Helmut Bechtel, 1981 và Phan Thúc Huân, 2005)

Theo Phan Thúc Huân (2005), giả hành có chứa diệp lục và dự trữ nhiều chất dinh dưỡng cần thiết cho cây trong quá trình sinh trưởng, phát triển và cả khi cây lan ra hoa vào thời kỳ nghỉ Giả hành còn có chức năng giữ nước duy trì sự sống của cây lan trong điều kiện khô hạn

2.2.2.2 Cơ quan sinh sản

Giả hạc ra hoa khi các giả hành đã rụng hết lá, mỗi đốt ra một hoặc hai hoa màu hồng tím với cánh môi có hai vết màu tím đậm, cánh hoa có dạng hình chữ nhật, dài từ 4.5 – 6 cm, rộng khoảng 2 cm Lá đài hình mũi mác, nhọn, dài từ 4 – 6 cm, rộng khoảng 1 cm (Helmut Bechtel, 1981) Hoa sau khi thụ tinh sẽ tạo quả (thuộc dạng quả nang) chứa vô số hạt, hạt nhỏ, nhiều phôi chưa phân hóa Hạt lan được phát tán nhờ gió nhưng phần lớn hạt bị chết vì hạt muốn nảy mầm phải có nấm cộng sinh Theo Knudson (1922), nguyên nhân hạt lan không nảy mầm được là do hạt lan không có khả năng tạo ra hydratcacbon từ CO2 Do đó, vai trò của nấm đối với sự nảy mầm của hạt lan là cung cấp đường (Phan Thúc Huân, 2005)

Cây lan Giả hạc cho hoa cỡ lớn đường kính từ 7 – 10 cm, hương rất thơm (Haruyuki Kamemoto và ctv, 1999) Hoa thường nở vào tháng 4 – 5, kéo dài trong một tuần (Minh Trí và Xuân Giao, 2010) Sau khi hoa tàn, những đốt gần trên ngọn hoặc ở gần dưới gốc thường sinh

ra cây con (keiki) Vài tháng sau, khi các cây con mọc rễ dài từ 3 – 4 cm có thể tách ra trồng riêng, dùng cho nhân giống

2.2.3 Điều kiện sinh lý đối với lan Giả hạc

2.2.3.1 Ánh sáng

Ánh sáng là một nguồn năng lượng rất cần thiết cho sự sống của phong lan Ánh sáng tham gia vào quá trình chuyển hóa cacbon cũng như góp phần tạo nên các tế bào thực vật và việc có ánh sáng hay không giữ vai trò quan trọng tác động đến việc ra hoa sớm, muộn hay mất hẳn Ngoài ra, ánh sáng không thích hợp là một yếu tố ảnh hưởng đáng kể khi thì làm cây chậm lớn khi thì làm cây còi cọc không thể phát triển được (Trần Văn Bảo, 1999)

Theo Minh Trí và Xuân Giao (2010), giống lan Dendrobium được xếp vào nhóm ưa sáng trung bình nhu cầu ánh sáng khoảng 50 – 80%, riêng đối với lan Giả hạc ánh sáng thích hợp là

40 – 60%

2.2.3.3 Ẩm độ

Đối với cây lan, độ ẩm không khí nơi cây sống tự nhiên trong rừng hay độ ẩm không khí của vườn, của giá thể nuôi cây phải thích hợp thì cây lan mới sinh trưởng và phát triển tốt (Phan Thúc Huân, 2005) Đây là yếu tố quan trọng đối với Giả hạc giúp cây phát triển tốt, tránh bị khô héo do mất nước hay ánh sáng quá mạnh, ẩm độ phù hợp nhất trong khoảng 60% – 70% Vào mùa khô nên chú ý tưới nước hằng ngày cho cây, thời điểm tưới tốt nhất vào buổi sáng 8 giờ và chiều 4 giờ để tránh ẩm độ lắng đọng vào ban đêm, giúp cây tránh được bệnh thối rữa

2.2.3.4 Phân bón

Lan Giả hạc ưa phân hữu cơ như bánh dầu, phân xác súc vật…(Trần Văn Bảo, 1999) Tuy nhiên, các loại Dendrobium thân thòng ăn phân yếu nên phải dùng nồng độ thật loãng (Nguyễn Công Nghiệp, 2004)

2.2.3.5 Độ thông gió

Theo Nguyễn Công Nghiệp (2004), sự thông gió thích hợp với hầu hết các loài lan là gió cấp 2

và cấp 3, có nghĩa là khoảng 10 – 15 km/giờ Tuy gió làm giảm nhiệt độ nhưng sự thông gió quá độ cũng làm giảm ẩm độ cần thiết cho cây gây ra thủy xuất và hô hấp quá cao, chính các điều này làm cho lan kém tăng trưởng

2.3 TẦM QUAN TRỌNG CỦA NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT

Trong giai đoạn hiện nay, nuôi cấy mô thực vật được ứng dụng mạnh mẽ vào thực tiễn chọn giống, nhân giống, vào việc sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinhh học và trong nghiên cứu lý luận di truyền thực vật bậc cao

Theo Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên (2002), phương pháp nuôi cấy mô được sử dụng để phục tráng và nhân nhanh các giống cây trồng quí, có giá trị kinh tế cao Hiện nay, phương pháp nhân giống vô tính thực vật trong ống nghiệm đã trở thành kỹ thuật nông nghiệp phổ biến Ý nghĩa thực tiễn quan trọng nhất của nuôi cấy mô tế bào là áp dụng kỹ thuật sản xuất đại trà có kiểm soát trong tạo giống và nhân giống cây trồng, những lợi ích trong việc áp dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật được tóm tắt như sau:

 Kiểm soát được dịch bệnh cây trồng Bằng phương pháp nuôi cấy mô và tế bào, ta hoàn toàn có thể loại được những cá thể nhiễm bệnh hay mang mầm bệnh

 Kiểm soát được chất lượng giống thông qua kiểm soát kiểu gen của giống đem vào sản xuất

 Kiểm soát được toàn bộ kỹ thuật từ khâu nhân giống đến khâu thu hoạch

 Tạo ra sự đồng loạt về giống, từ đó tạo ra sự đồng loạt của sản phẩm cuối Sự đồng loạt này giúp cơ giới hóa được khâu trồng trọt và khâu thu hoạch Do đó, năng suất lao động sẽ tăng lên Chất lượng sản phẩm đồng nhất, tạo điều kiện thuận lợi cho khâu tiêu thụ và chế biến

Ngày nay, phương pháp gieo hạt chỉ được áp dụng để lai giống Các loại lan hiện tại đều có tính dị hợp tử cao vì thế chúng sẽ không bao giờ đồng nhất Do đó, chỉ có nuôi cấy mô là phương pháp duy nhất và có hiệu quả để nhân giống lan trên quy mô công nghiệp So với phương pháp tách chiết thông thường tốc độ phát triển trung bình 1 cây/ năm thì phương pháp cấy mô sẽ sản xuất một số lượng cây con gần như không tưởng khoảng 4 triệu cây/năm (Nguyễn Công Nghiệp, 2004)

2.4 MÔI TRƯỜNG VÀ ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY

2.4.1 Môi trường nuôi cấy

Thành phần của môi trường nuôi cấy bao gồm rất nhiều chất Thông thường, các chất được phân thành hai nhóm: thành phần cơ bản (luôn luôn có trong môi trường) và thành phần tự chọn (có thể thêm hoặc không thêm vào môi trường)

Bảng 2.2: Thành phần cơ bản và thành phần tự chọn của môi trường nuôi cấy

Các thành phần cơ bản Các thành phần tự chọn

Các nguyên tố khoáng Chất thẩm thấu

Chất điều hòa sinh trưởng

(Nguồn: Nguyễn Bảo Toàn, 2004)

 Nước

Phẩm chất nước là điều kiện quan trọng trong nuôi cấy Nước sử dụng trong nuôi cấy mô là nước cất một lần Trong một số trường hợp, người ta cũng có thể sử dụng nước cất hai lần hoặc nước khử khoáng

 Các nguyên tố khoáng

Theo Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Mỹ Tiên (2002), có nhiều nguyên tố khoáng được sử dụng trong môi trường nuôi cấy, mỗi nguyên tố có một vai trò riêng Các nguyên tố khoáng được chia thành hai nhóm:

Khoáng đa lượng: nhu cầu khoáng của mô, tế bào thực vật tách rời không khác nhiều so với cây trồng trong điều kiện tự nhiên Các nguyên tố đa lượng cần phải cung cấp là nitrogen, phosphorus, potassium, calcium, magnesium, sắt

Khoáng vi lượng: nhu cầu khoáng vi lượng trong nuôi cấy mô thực vật là lĩnh vực còn ít được nghiên cứu, rất ít các nguyên tố vi lượng được chứng minh là không thể thiếu đối với sự phát triển của mô và tế bào Vì vậy, có những trường hợp, một số khoáng vi lượng có thể là không cần thiết Các nguyên tố vi lượng có thể có ảnh hưởng đến sự phân hóa tế bào khi kết hợp với các chất điều hào sinh trưởng thực vật

 Nguồn carbohydrate

Trong nuôi cấy in vitro, nguồn carbon giúp mô, tế bào thực vật tổng hợp nên các chất hữu cơ

giúp tế bào phân chia và tăng sinh khối không phải là do quá trình quang hợp cung cấp mà chính là nguồn carbon bổ sung vào môi trường dưới dạng đường Trong đó, sucrose là loại đường được sử dụng phổ biến hiện nay, tùy theo mục đích nuôi cấy nồng độ sucrose biến đổi

từ 1 – 6% (w/v) và thông thường nhất là 2% (w/v) tương ứng với 58,4 mM (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002)

Khi sử dụng đường sucrose trong môi trường nuôi cấy, nó được thủy phân hoàn toàn hoặc một phần thành monosaccharide: glucose và fructose (Nguyễn Bảo Toàn, 2004) Tuy nhiên, việc

sử dụng fructose bị hấp tiệt trùng có thể làm tổn hại đến sự tăng trưởng của tế bào (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002)

 Vitamine

Thông thường, thực vật tổng hợp các vitamin cần thiết cho sự tăng trưởng và phát triển của chúng, thực vật cần vitamin để xúc tác các quá trình biến dưỡng khác nhau (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002)

Trong nuôi cấy mô, vitamin thường được sử dụng nhất là nicotinic acid (PP), pyridoxine (B6), thiamine (B1), myo inositol, vitamin C thường được sử dụng như là chất chống oxy hóa Thiamine được sử dụng như là coenzyme trong biến dưỡng carbohydrate Nicotinic được sử dụng như là coenzyme trong biến dưỡng các chất nicotinamide adenin dinucleotid (NAD) hay nicotinamid phosphate (NADP) Pyridoxin là coenzyme trong phản ứng dị hóa amino acid

Myo inositol là thành phần của phosphatidyl inositol và phytic acid hỗ trợ cho sự sinh trưởng của tế bào (Nguyễn Bảo Toàn, 2004)

 Chất tạo gel

Agar là thành phần quyết định độ cứng của môi trường, không gây độc hay tác dụng với các thành phần có trong môi trường vì agar có nguồn gốc từ thực vật (rong biển) Lượng agar thường sử dụng ở 6 – 10 g/l Khi nồng độ agar quá cao, môi trường trở nên quá cứng sẽ ảnh hưởng đến sự khuếch tán dinh dưỡng gây khó khăn cho sự hấp thụ nước và dinh dưỡng của

mô cấy Agar tan ở nhiệt độ 80oC và đông lại ở nhiệt độ phòng (25 – 30oC) (Vũ Văn Vụ và ctv, 2007)

 Chất điều hòa sinh trưởng thực vật auxin

Auxin là nhóm chất điều hòa sinh trưởng thực vật được sử dụng rất thường xuyên trong nuôi cấy mô – tế bào thực vật, đặc tính của auxin là kích thích sự tăng trưởng và kéo dài tế bào Theo Friedman và ctv (1985), khi nồng độ auxin cao hơn cytokinin hoặc khi chỉ xử lý với auxin thì rễ sẽ được hình thành và trong sự tạo rễ lượng cytokinin ngoại sinh sẽ là chất cản Người ta cho rằng auxin cảm ứng sự tạo rễ là do nó cảm ứng sự tổng hợp polyamine (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002)

Theo Nguyễn Bảo Toàn (2004), auxin tự nhiên được tìm thấy ở thực vật là indole-3-acetic acid (IAA) Trong lĩnh vực nuôi cấy mô, hiệu quả chính của nó là trên sự phân chia tế bào và quá trình giảm phân Bên cạnh đó, còn có các auxin tổng hợp như indole-3-butyric acid (IBA), alpha-naphthaleneacetic acid (NAA) và 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), những auxin này ổn định với nhiệt và ánh sáng hơn so với IAA Do đó, chúng có thể được hấp khử trùng

2.4.2 Điều kiện nuôi cấy

 Nhiệt độ

Theo Nguyễn Bảo Toàn (2004), có thể tối ưu hóa nhiệt độ cho mỗi loài thực vật và mỗi giai đoạn sinh trưởng, nhiệt độ chung cho tất cả các phòng thường được điều chỉnh 24  2o

C Tuy nhiên, nhiệt độ trong các keo lọ nuôi cấy thường cao hơn nhiệt độ phòng vài độ do hiệu ứng nhà kính

 Ánh sáng

Quang phổ ảnh hưởng đến hình thái cây mô nên cần lưu ý các tỉ lệ của phổ ánh sáng xanh dương/đỏ hoặc đỏ/cuối đỏ và quang kỳ thường được sử dụng là chế độ ngày dài (16 giờ chiếu sáng) Cường độ ánh sáng trong giai đoạn tạp dưỡng là khoảng 30 µmol/m2

/giây, còn đối với

mô tự dưỡng cường độ ánh sáng lên đến 250 µmol/m2/giây (Nguyễn Bảo Toàn, 2004)

2.5 CÁC VẤN ĐỀ GẶP PHẢI TRONG NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT

2.5.1 Nhiễm vi sinh vật

 Vi khuẩn

Theo Nguyễn Bảo Toàn (2004), nhiễm do vi khuẩn thường gặp trong nuôi cấy in vitro Một số

vi khuẩn gây nhiễm có thể là vi khuẩn gây bệnh cho cây chủ, nhưng một số khác không phải

là vi khuẩn gây bệnh Nó có thể gây chết cây hoặc làm chậm sự sinh trưởng của mẫu vật nuôi cấy Triệu chứng nhiễm khuẩn thường tạo trên môi trường nuôi cấy một lớp nhầy Lớp này có thể có nhiều màu sắc khác nhau như vàng, đỏ, trắng hoặc đen ở ngay vị trí mẫu vật nuôi cấy hay trên bề mặt môi trường nuôi cấy

Bảng 2.3: Các loài vi khuẩn thường gặp trong cấy mô (Leifert và Waites, 1990)

Tên vi khuẩn Tỉ lệ nhiễm (%)

diện của nấm trong môi trường nuôi cấy có thể làm chết mẫu cấy, cây con, đôi khi cả callus (Nguyễn Bảo Toàn, 2004)

 Nhện nhỏ và bọ trĩ (mite và thrips)

Hầu hết phòng thí nghiệm nuôi cấy mô lâu năm rất dễ nhiễm các loại nhện nhỏ và bọ trĩ Các con nhện và bọ trĩ vô hại, nhưng gây ra vấn đề du nhập bào tử nấm và vi khuẩn vào môi trường Biện pháp phòng ngừa là phủ lớp nông dược có keo trên bề mặt kệ nơi để bình nuôi cấy (Nguyễn Bảo Toàn, 2004)

2.5.2 Sự hóa nâu

Mẫu cấy và môi trường thường trở nên nâu hoặc hoá đen sau khi cấy, có thể do hoạt động của enzyme oxidase chứa đồng (ví dụ: polyphenoloxidase và tyrosinase) được phóng thích hoặc tổng hợp và hiện diện trong điều kiện oxy hóa khi mô bị thương Hậu quả là sự sinh trưởng của mẫu cấy bị ngăn cản và mô thường chết (Nguyễn Bảo Toàn, 2004)

2.5.3 Sự thừa nước

Theo Nguyễn Bảo Toàn (2004), đây là sự mất cân đối về sinh lý xảy ra trong nuôi cấy mô thực vật Có nhiều nguyên nhân gây ra sự thừa nước nhưng triệu chứng chung của các mẫu cấy là: khoảng trống gian bào lớn, sự phát triển hệ mạch giảm, lớp biểu bì hư, lớp sáp thay đổi, hoạt động khí khẩu kém

2.5.4 Sự biến dị tế bào soma (somaclonal variation)

Theo Nguyễn Bảo Toàn (2004), đây là hiện tượng biến động cao ở các cây cấy mô hoặc các chồi bất định Sự thay đổi di truyền tiêu biểu là sự thay đổi số nhiễm sắc thể, cấu trúc chromosome, sự chuyển dịch (translocation), sự mất đoạn (deletions), nhân đôi (duplications)

và chuỗi DNA (đột biến base) Điều bất lợi lớn nhất của biến dị tế bào soma là làm mất đi sự đồng nhất dòng của các mẫu cấy

2.5.5 Cấu trúc bất thường

Trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật, hầu hết các cơ quan hình thành từ mẫu cấy hoặc từ các callus đều có các cấu trúc dễ nhận biết, ví dụ như chồi, rễ Tuy nhiên, trong quá trình biến đổi thành các cơ quan này có một số quá trình được điều tiết bên trong cơ thể không được hoàn tất hoặc ngừng hẳn Điều này có thể dẫn đến kết quả hình thành nên các cơ quan mới có cấu trúc bất thường như rễ bất thường, cơ quan giống như hoa, giả mầm, giả hành….(Nguyễn bảo Toàn, 2004)

2.6 CẤU TRÚC HÌNH THÁI VÀ GIẢI PHẨU CỦA CÂY CON CẤY MÔ

Một vấn đề thường gặp của các cây con cấy mô chuyển từ nơi nuôi dưỡng ra môi trường tự nhiên là sự mất nước quá nhiều Nguyên nhân của hiện tượng này liên quan nhiều đến cấu trúc hình thái và giải phẩu của lá và rễ:

2.6.1 Lớp cutin

Trên bề mặt biểu bì lá có chứa một lớp sáp và cutin Trong tự nhiên, lớp này giúp lá cây giảm bớt sự mất nước và phản chiếu bớt ánh sáng chiếu đến bề mặt lá Cấu trúc lớp cutin trên bề mặt lá của cây cấy mô được quan sát dưới kính hiển vi điện tử quét (scanning electron microscope) cho thấy lớp cutin có dạng hạt và que nhám Trong khi cây trồng trong nhà lưới thì lớp này nhẵn (Preece và Sutter, 1991) Vì vậy lá cây mô rất dễ mất nước Theo Sutter và Langhans (1982), nguyên nhân sự thiếu lớp cutin dày ở cây cấy mô là do ẩm độ trong bình nuôi cấy quá cao, sự mất nước từ lá hầu như không có, cho nên chức năng của lá tạo nên lớp sáp không cần thiết Sự thiếu lớp sáp dày trên bề mặt lá là một trong những nguyên nhân làm cho cây cấy mô dễ mất nước và chết khi trồng trong điều kiện tự nhiên (Nguyễn Bảo Toàn, 2004)

2.6.2 Khí khẩu

Khí khẩu trong cây có vai trò trong sự thoát hơi nước, hấp thu và thải khí CO2 và O2 Ở cây cấy mô khí khẩu có dạng hình tròn, so với cây bình thường trồng trong nhà lưới có cấu trúc hình elip Độ mở khí khẩu của cây cấy mô lớn hơn độ mở khí khẩu của cây trồng trong nhà lưới Kết quả nghiên cứu của nhiều tác giả cũng cho thấy, cây cấy mô có số khí khẩu trên đơn

vị diện tích lá nhiều hơn cây trồng trong nhà lưới và khí khẩu của cây cấy mô chưa có chức năng đóng mở khi chuyển bình nuôi cấy ra môi trường bên ngoài (Nguyễn Bảo Toàn, 2004)

2.6.3 Lá

Cấu trúc giải phẩu lá của các cây cấy mô cho thấy rằng, lá của các cây cấy mô mỏng hơn các cây trồng trong nhà lưới Các tế bào mô giậu phát triển nghèo nàn và ít các khoảng trống bên trong Ở một số loài, lá của cây cấy mô chỉ phát triển một lớp mô giậu, trong khi lá của các cây trồng trong nhà lưới phát triển 2 đến 3 lớp mô giậu (Nguyễn Bảo Toàn, 2004)

2.7 ĐẶC ĐIỂM CÁC LOẠI GIÁ THỂ TRỒNG LAN

Giá thể là loại môi trường sống của lan, tùy thuộc vào từng loại lan, điều kiện trồng trọt để chọn giá thể phù hợp

2.7.1 Xơ dừa

Xơ dừa là nguyên liệu rẻ tiền nên đây là chất trồng rất cần nếu sản xuất lan đại trà trên quy mô lớn Mặt khác, xơ dừa có khuyết điểm là dễ mọc rêu, không thoáng, dễ mục Nếu dùng xơ dừa trồng chậu phải hạn chế tưới nước, tốt nhất là tạo điều kiện ẩm độ bên ngoài hơn là trong chậu Đối với chất trồng này phải phun thuốc ngừa sâu bệnh thường xuyên Tuy nhiên, xơ dừa lại là

môi trường rất tốt cho đa số các loại lan thuộc giống Dendrobium (Nguyễn Công Nghiệp,

2004)

2.7.2 Than gỗ

Than được dùng với mục đích giữ ẩm, đây là một chất trồng tốt nhất vì không có mầm bệnh, không bị mục và có khả năng giữ nước (Nguyễn Công Nghiệp, 2004) Theo Minh Trí và Xuân Giao (2010), một số loại côn trùng và sên không vỏ (Slug) không ưa sống trong than nên đã hạn chế sự phá hại rễ của một số loại côn trùng Tuy nhiên, nhược điểm của than là giữ chất muối và phân bón nên thỉnh thoảng (1 – 2 tháng) phải xả thật nhiều nước cho giá thể không bị mặn

 Dớn sợi: là loại dớn già, hóa mộc

 Dớn vụn (dớn nhuyễn): là những phần non của thân cây dớn Loại này có độ hút ẩm cao nhưng thiếu thoáng khí nên giá thể sử dụng toàn dớn vụn sẽ dễ làm thối rễ lan

2.7.4 Trồng trên vỏ cây

Đây là cách trồng ngay trên một khúc thân cây, một tấm gỗ hay một mảnh vỏ (có lót một lớp giá thể là chất rêu để giữ độ ẩm cho lan) dưới hình thức treo rất phù hợp với các loài lan ký sinh có nguồn gốc từ các miền nhiệt đới Cách trồng này không bao giờ làm hỏng cây do ngập nước và thối rễ, đặc biệt rất có lợi về mặt nghệ thuật khi giới thiệu trưng bày và trang trí, nhưng điều bất lợi là phải tưới nước nhiều lần hơn so với trồng chậu (Trần Văn Bảo, 1999)

2.8 TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC

2.8.1 Ngoài nước

Năm 1883, Wilhelm Roux lần đầu tiên lý giải về phân bào giảm nhiễm ở cơ quan sinh dục Từ

một tế bào thực vật nuôi cấy in vitro có thể tái sinh thành một cơ thể sống hoàn chỉnh, khả

năng này của tế bào thực vật được gọi là tính toàn năng Năm 1960, Georges Morel đã thực hiện bước ngoặt cách mạng trong sử dụng kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng trong nhân

nhanh các loại địa lan Cymbidium, mở đầu công nghiệp vi nhân giống thực vật

Môi trường MS (Murashige & Skoog, 1962) sửa đổi có chứa một lượng kali nitrat và amoni

nitrat ít hơn so với môi trường MS ban đầu là tối ưu để thân rễ Cymbidium kanran tạo cây con

mà không cần bổ sung auxin và cytokinin (Kazuhiko Shimasaki và Shunpei Uemoto, 1990) Theo A Mitra và ctv (1998), việc làm giàu CO2 không ảnh hưởng đáng kể đến sự tạo rễ in vitro của một giống lan Dendrobium khi được nuôi cấy quang tự dưỡng

Năm 2001, R Prażak đã khảo sát ảnh hưởng của aluminium từ AlCl3 đến sự biệt hóa và tăng

trưởng của Dendrobium kingianum Bidwill trong điều kiện in vitro Aluminium (AlCl3) đã

được thêm vào ở nồng độ: 0 (đối chứng); 0,5; 1,0; 2,0 và 5,0 mg/dm3

Kết quả cho thấy sự kết hợp 0,5 mg/dm3 NAA và 1,0 mg/dm3 Kinetin là hiệu quả nhất cho rễ phát triển và việc tăng nồng độ aluminium đến 5,0 mg/dm3 trong môi trường này dẫn đến hình thành số lượng rễ và chồi cao nhất Ngoài ra, các mẫu cấy thu được trên môi trường chứa aluminium cho trọng lượng tươi cao hơn, các chồi và rễ dài hơn so với môi trường đối chứng

Yih-Juh Shiau và ctv (2005) đã nhân giống in vitro lan Dendrobium candidum Wall Ex Lindl., từ các đốt thân của cây in vitro 9 tháng tuổi Sau 75 ngày, 73,2% các mẫu cấy tạo chồi

trên môi trường chứa 2 mg/l BA và 0,1 mg/l NAA, các chồi đã kéo dài được tạo rễ trên môi trường có chứa 0,2 mg/l NAA và các cây con đã được thuần dưỡng thành công

Năm 2004-2005, Huỳnh Thanh Tùng tiến hành ngiên cứu các vật liệu làm giá thể trồng lan

Dendrobium tại Thủ Đức, thành phố Hồ Chí Minh Kết quả cho thấy hàm lượng dinh dưỡng

trong các giá thể được trộn từ phân trùn với các vật liệu khác nhau cao hơn giá thể đối chứng

là than và phù hợp cho sự sinh trưởng, phát triển của cây lan Dendrobium Trong các vật liệu

phối trộn thì 70% phân trùn + 30% sơ dừa, 70% phân trùn + 30% rễ lục bình và 70% phân

trùn + 30% dớn với chất kết dính Gelatin là phù hợp nhất cho cây lan Dendrobium sinh

trưởng

Năm 2009, Nguyễn Thị Mỹ Duyên tiến hành nhân giống Dendrobium anosmum và Dendrobium mini bằng phương pháp nuôi cấy mô Kết quả cho thấy chồi lan D anosmum tạo

rễ tốt nhất trên môi trường MS + 1mg/l NAA Sau 3,5 tháng tạo được cây hoàn chỉnh, đạt tiêu

chuẩn để đưa ra ngoài vườn Bên cạnh đó, D mini cũng cho kết quả tạo rễ tốt trên hai môi trường MS/2 + 0,2 mg/l NAA và MS/2 + 0,7 mg/l NAA Ngoài ra, khi thử nghiệm ra cây D mini trên nhiều loại giá thể khác nhau cho thấy từ lúc cây mới ra khỏi chai mô đến khi cây

được 7,5 tháng tuổi thì giá thể trồng thích hợp nhất cho cây là dớn và dừa miếng

Năm 2010, Đặng Xuyến Như và ctv thực hiện nghiên cứu nhân nhanh lan hài Tam Đảo

(Paphiopedilum gratrixianum) bằng phương pháp gieo hạt in vitro Sau 3 tháng gieo hạt, P gratrixianum có tỉ lệ nảy mầm tốt nhất trên môi trường RE (50%) và bổ sung NAA 0,8 ppm

có tác dụng tích cực đến một số chỉ tiêu sinh lý của cây con ở giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh

Giá thể thích hợp để trồng cây con P gratrixianum là rêu + bọt đá núi lửa (tỉ lệ 70:30) và rêu

+ xơ dừa (tỉ lệ 70:30), cây con cần được bón phân Grow-More (NPK 30:10:10) nồng độ 0,5 g/l, bón 1 lần/tuần và điều chỉnh che sáng 60-70% trong nhà lưới vào mùa hè

Lan Dendrobium nobile Lindl trồng trên hệ thống khí canh cho khả năng thích ứng cao nhất,

đạt tỷ lệ sống 100% sau 1 tháng trồng ở các vụ xuân, xuân - hè và vụ hè Cây sinh trưởng tốt trên hệ thống khí canh với các thông số pH = 6,0 - 6,5; EC dung dịch = 400 - 500 μs/cm; dung dịch dinh dưỡng là dung dịch III (cải tiến từ dung dịch Knoop); thời gian phun dung dịch là 2 phút và thời gian nghỉ là 4 giờ (Trần Thế Mai và ctv, 2012)

Phạm Vĩnh Sơn (2012) đã ghi nhận lan Giả hạc in vitro nhân chồi tốt nhất trên môi trường MS

+ 0,5 mg/l NAA + 3 mg/l BA, khi cắt chồi thành từng đoạn sẽ đạt hệ số nhân chồi tối ưu (12,50 chồi) so với để nguyên chồi (8,76 chồi)

Nhân giống in vitro cải tiến loài lan bản địa Dendrobium nobile Lindl bằng nuôi cấy đặc

thoáng khí giúp giảm 25% lượng saccharose bổ sung vào môi trường và tăng hệ số nhân protocorm lên gấp 1,4 lần so với nuôi cấy kinh điển Môi trường tối ưu tạo cây hoàn chỉnh là

RE (Robert Ernst, 1979) + 10g saccharozase + 0,5g than hoạt tính, cường độ ánh sáng 2300 lux (Vũ Ngọc Lan và Nguyễn Thị Lý Anh,2013)

Bên cạnh đó, còn có một vài nghiên cứu liên quan đến giống lan Dendrobium như nghiên cứu

của Nguyễn Thị Quỳnh và ctv (2006) về ảnh hưởng của nồng độ đường và điều kiện ánh sáng

lên sự tăng trưởng của lan Dendrobium Burana fancy nuôi cấy in vitro Năm 2010, Nguyễn

Thị Mỹ Duyên và ctv nghiên cứu quan hệ giữu các giống, loài hoa lan (orchidaceae) dựa trên đặc tính hình thái, cung cấp cho chúng ta nhiều thông tin có giá trị để chọn lựa bố mẹ làm vật liệu lai tạo ra cá thể lai có đặc điểm mong muốn, hoặc nghiên cứu của Nguyễn Thị Pha và ctv (2012) về đánh giá sự đa dạng di truyền của 12 mẫu hoa lan thuộc 9 loài lan rừng và 02 loài

lan lai có nguồn gốc từ Thái Lan của chi Dendrobium bằng kỹ thuật RAPD làm cơ sở di

truyền cho công tác lai tạo, khai thác và nhân giống các loài lan rừng ở Việt Nam

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN THỰC HIỆN

 Địa điểm thực hiện:

Thí nghiệm 1 được bố trí trong phòng nuôi cấy mô, Bộ môn Công nghệ sinh học, Khu thí nghiệm thuộc Trường Đại học An Giang

Thí nghiệm 2 và 3 được bố trí trong vườn lan, Trường Đại học An Giang (khu cũ)

 Thời gian thực hiện:

Dụng cụ đổ môi trường: ống đong (1 lít, 100 ml, 50 ml), micropipet, cốc 50 ml, đũa thủy tinh,

ca nhựa 1 lít, keo cấy mô…

Dụng cụ cấy: kẹp, dao cấy, bông gòn…

Dụng cụ thuần dưỡng và trồng lan cấy mô: kẹp gấp, chậu đất trồng lan (tròn), dây treo, rổ, thau nhựa…

3.2.2 Hóa chất

Môi trường khoáng MS (bảng 1, phụ chương A), Fe EDTA, agar, đường sucrose, chất điều hòa sinh trưởng NAA và các loại vitamin (nicotinic acid, pyridoxine, thiamine, myo inositol, glycine)

Cồn 70o, dung dịch NaOH 0.5 M, HCl 0.5 M

3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đường trong môi trường MS,

MS/2 đến khả năng tạo cây hoàn chỉnh của chồi lan Giả hạc in vitro

Mục đích: chọn ra được môi trường thích hợp cho lan Giả hạc cấy mô tạo cây hoàn chỉnh, thích nghi tốt ở giai đoạn thuần dưỡng

Vật liệu: Chồi lan Giả hạc in vitro cao khoảng 1 cm tại phòng nuôi cấy mô, Bộ môn Công

nghệ sinh học, Trường Đại học An Giang

Môi trường nuôi cấy: môi trường cơ bản MS, MS/2 (giảm một nửa thể tích dung dịch khoáng

đa lượng so với môi trường MS) có bổ sung hàm lượng đường sucrose từ 0 đến 30 g/l, nồng

Hình 3.1: Cấy mẫu lan Giả hạc vào môi trường thí nghiệm

Chỉ tiêu theo dõi:

 Số lượng rễ trên chồi

 Chiều dài rễ trung bình (cm): đo từ gốc rễ đến chóp rễ của 3 rễ dài nhất

 Số lá trên chồi chính

 Chiều cao chồi chính (cm): đo từ mặt thạch đến đỉnh chồi

 Đánh giá cảm quan hình thái chồi và rễ

Thời gian lấy chỉ tiêu: 30, 60, 90 ngày sau khi cấy

3.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát khả năng thích nghi của lan Giả hạc cấy mô ở giai đoạn thuần dƣỡng

Mục đích: xác định tỉ lệ sống và khả năng thích nghi của lan Giả hạc cấy mô ở thí nghiệm 1 trong giai đoạn thuần dưỡng

Vật liệu: những cây lan con hoàn chỉnh thu được từ thí nghiệm 1

Hình 3.2: Cây lan con hoàn chỉnh đƣợc thu nhận từ thí nghiệm 1

Thuần dưỡng cây cấy mô: keo mô có chứa các cây lan hoàn chỉnh được chuyển từ phòng lạnh sang phòng nhiệt độ thường trong một tuần, nhằm giúp cây quen dần với điều kiện bình thường Sau đó, dùng kẹp gấp cây lan ra khỏi chai mô và rửa sạch agar bám quanh rễ, đặt cây lan ở nơi thoáng mát, khi cây ráo nước thì trồng lên giá thể dớn nhuyễn Trong thời gian thuần dưỡng, cây con không cần sử dụng phân bón nhưng mỗi tuần tưới thuốc ngừa nấm bệnh một lần Giữ cây trong điều kiện ánh sáng nhẹ (sử dụng lưới che để giảm sáng), tránh mưa

Bố trí thí nghiệm: bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên, gồm 6 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại là 2 chậu, mỗi chậu trồng 10 cây

Bảng 3.2: Kí hiệu nghiệm thức thí nghiệm 2

Nghiệm thức Môi trường nuôi cấy Hàm lượng đường