Hiện nay Khoa thú y – Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã phân lập được một số chủng virus PRRS từ các lợn có triệu chứng, bệnh tích khá điển hình của lợn mắc PRRS,với tỷ lệ ốm và tỷ lệ chế
Trang 1HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SỸ NÔNG NGHIỆP
TÊN ĐỀ TÀI:
“So sánh một số đặc tính sinh học, sinh học phân tử và tính kháng nguyên chủ yếu của 02 chủng virus KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02”
Chuyên ngành: Thú y
Mã số:
Người hướng dẫn khoa học:
Người thực hiện: NGÔ THỊ HẠNH
Mã số học viên: 24150610 Lớp: CH25TYB
Hà Nội – 2016
Trang 2I. MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (Porcine reproductive and respiratory syndrome – PRRS) hay còn gọi là “Bệnh tai xanh ở lợn” đã gây ra thiệt hại vô cùng to lớn cho ngành chăn nuôi lợn trên toàn thế giới Lợn ở tất cả các lứa tuổi đều cảm nhiễm, nhưng lợn con và lợn nái mang thai thường mẫn cảm với các biểu hiện như sốt cao, da mẩn đỏ, tỷ lệ ốm và tỷ lệ chết cao (Gao và cs, 2004; Chen
và cs, 2006) Loài lợn rừng cũng mắc bệnh, đây có thể coi là nguồn dịch thiên nhiên
Từ năm 2007 đến nay, tại Việt Nam, dịch PRRS xảy ra liên miên, có những diễn biến phức tạp và có nguy cơ bùng phát ở tất cả các địa phương trong cả nước
Theo báo cáo kết quả Hội thảo khoa học phòng chống hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn của Cục Thú y năm 2008 thì hiện tại ở Việt Nam đang tồn tại
cả hai chủng virus PRRS thuộc dòng Bắc Mỹ: Chủng cổ điển độc lực thấp và chủng biến thể độc lực cao Trong đó, chủng virus độc lực cao gây bệnh tại Việt Nam thuộc dòng Bắc Mỹ
Hiện nay Khoa thú y – Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã phân lập được một số chủng virus PRRS từ các lợn có triệu chứng, bệnh tích khá điển hình của lợn mắc PRRS,với tỷ lệ ốm và tỷ lệ chết cao tại một số tỉnh ở Việt Nam, trong đó có 02 chủng virus KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02 Để phục vụ mục đích lựa chọn chủng chế tạo vacxin, đánh giá hiệu quả của vacxin hoặc sản xuất chế phẩm sinh học phòng trị bệnh cho vật nuôi thì việc nghiên cứu các đặc tính sinh học, sinh học phân
tử và tính kháng nguyên của các chủng virus phân lập đượclà điều vô cùng quan
trọng Chính vì vậy chúng tôi tiến hành đề xuất nghiên cứu đề tài: “So sánh một số đặc tính sinh học, sinh học phân tử và tính kháng nguyên chủ yếu của 02 chủng
Trang 31.2. Mục tiêu nghiên cứu
- Xác định được một số đặc tính sinh học, sinh học phân tử và tính kháng nguyên của 02 chủng virus KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02 đã được phân lập, nhằm phục vụ cho việc chọn chủng chế tạo vacxin, đánh giá hiệu quả của vacxin và sản xuất chế phẩm sinh học phòng trị bệnh cho lợn
Trang 4II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Giới thiệu chung về hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản (PRRS) 2.2 Lịch sử và tình hình dịch bệnh PRRS ở lợn
2.2.1 Lịch sử xuất hiện bệnh
2.2.2 Dịch bệnh trên thế giới
2.2.3 Tình hình bệnh tai xanh tại Việt Nam
2.3 Căn bệnh
2.3.1 Hình thái và cấu tạo của virus PRRS
2.3.2 Phân loại virus PRRS
2.3.3 Tính chất nuôi cấy của virus PRRS
2.3.4 Sức đề kháng của virus
2.3.5 Khả năng gây bệnh và độc lực của virus PRRS
2.4 Cơ chế sinh bệnh và phương thức truyền lây
2.5 Triệu chứng và bệnh tích
2.5.1 Triệu chứng
2.5.2 Bệnh tích
2.6 Chẩn đoán
2.6.1 Chẩn đoán lâm sàng
2.6.2 Chẩn đoán bằng phương pháp giải phẫu bệnh
2.6.3 Phát hiện virus
2.6.4 Chẩn đoán huyết thanh học
2.6.5 Chẩn đoán phân biệt
2.7 Các biện pháp phòng và trị hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn
2.7.1 Phòng bệnh
Trang 52.7.2 Trị bệnh
III. ĐỐI TƯỢNG - NỘI DUNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Vật liệu, địa điểm nghiên cứu
Vật liệu nghiên cứu:
- Virus: 02 chủng virus KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02 đã phân lập được từ
các đàn lợn mắc PRRS tự nhiên tại miền Bắc Việt Nam
- Địa điểm: Phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ sinh học Thú y, phòng thí
nghiệm bộ môn Bệnh lý thú y, trại nuôi động vật thí nghiệm – Khoa Thú y – Học viện Nông nghiệp Việt Nam
3.2. Nội dung nghiên cứu
3.2.1. Nghiên cứu, so sánh một số đặc tính sinh học của 02 chủng virus
KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02
- Xác định hiệu giá của 02 chủng virus PRRS nghiên cứu
- Xác định khả năng gây bệnh tích tế bào 02 chủng virus PRRS nghiên cứu
- Xác định sự ổn định về một số đặc tính sinh học 02 chủng virus PRRS nghiên cứu qua các đời cấy chuyển
- Xác định đường biểu diễn sự nhân lên của 02 chủng virus nghiên cứu
3.2.2 Nghiên cứu, so sánh đặc tính sinh học phân tử của 02 chủng virus KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02
- Giải trình tự gen 02 chủng virus PRRS nghiên cứu
- So sánh trình tự gen giữa 02 chủng virus PRRS nghiên cứu với nhau và với các chủng virus tham chiếu trên ngân hàng gen
- Xây dựng cây sinh học phân tử cho thấy mối quan hệ di truyền của 02 chủng
virus PRRS nghiên cứu với các chủng virus khác trong ngân hàng gen
3.2.3 Nghiên cứu, so sánh tính kháng nguyên của 02 chủng virus
KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02
- Gây bệnh cho lợn thực nghiệm bằng 02 chủng virus nghiên cứu
- Theo dõi triệu chứng lâm sàng của lợn thực nghiệm
Trang 6- Nghiên cứu chỉ tiêu virus huyết ở lợn thực nghiệm
- Nghiên cứu biến đổi bệnh lý của lợn thí nghiệm
- Nghiên cứu sự phân bố của virus PRRS trên lợn thực nghiệm
3.3 Phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Phương pháp nuôi cấy tế bào
- Khôi phục tế bào
- Cấy chuyển tế bào
- Thu tế bào
3.3.2 Phương pháp phân lập virus PRRS trên tế bào tổ chức
3.3.3 Phương pháp xác định TCID 50
3.3.4 Phương pháp xác định đường biểu biễn sự nhân lên của virus
3.3.5 Phương pháp tách chiết RNA
3.3.6 Phương pháp tiến hành phản ứng RT – PCR
- Tiến hành phản ứng RT- PCR
- Điện di kiểm tra sản phẩm PCR
3.3.7 Phương pháp giải trình tự gen
3.3.8 Phương pháp xử lý số liệu
3.3.9 Phương pháp gây bệnh thực nghiệm
3.3.10 Phương pháp ELISA
3.3.11 Phương pháp mổ khám kiểm tra bệnh tích đại thể.
3.3.12 Phương pháp làm tiêu bản bệnh lý kiểm tra bệnh tích vi thể
IV KẾT QUẢ DỰ KIẾN ĐẠT ĐƯỢC
4.1 Kết quả nghiên cứu, so sánh một số đặc tính sinh học của 02 chủng virus KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02
4.1.1 Kết quả xác định hiệu giá của 02 chủng virus PRRS nghiên cứu
Bảng 4.1 Thông tin sơ bộ về nguồn gốc 02 chủng virus KTY-PRRS-01 và
KTY-PRRS-02
Trang 7STT Tên chủng
virus Nguồn gốc mẫu phân lập Triệu chứng chủ yếu
Bảng 4.2 Kết quả xác định hiệu giá của 03 chủng virus PRRS Hua 01, PRRS
Hua 02 và chủng virus PRRS vắc-xin
TCID50/25µl
3 Chủng virus PRRS vắc-xin
4.1.2 Kết quả xác định khả năng gây bệnh tích tế bào 02 chủng virus PRRS nghiên cứu
Bảng 4.3 Khả năng gây bệnh tích tế bào của 02 chủng virus KTY-PRRS-01 và
KTY-PRRS-02
(tính theo% diện tích tế bào bị phá hủy so với tổng số diện tích đáy bình nuôi cấy)
vắc-xin
CPE theo thời
gian sau khi
gây nhiễm
virus
24h 36h 48h 60h 72h
Trang 884h 96h 108h
4.1.3 Kết quả xác định sự ổn định về đặc tính sinh học 02 chủng virus PRRS nghiên cứu qua các đời cấy chuyển
Bảng 4.4 Khả năng gây bệnh tích tế bào của 02 chủng virus KTY-PRRS-01 và
KTY-PRRS-02 qua các đời cấy chuyển
CPE (%)
Virus PRRS
vắc-xin
24h 36h 48h 60h 72h 84h 96h
KTY-PRRS-01
24h 36h 48h 60h 72h 84h 96h
KTY-PRRS-02
24h 36h 48h 60h 72h 84h 96h
Trang 94.1.4 Kết quả xác định đường biểu diễn sự nhân lên của 02 chủng virus PRRS nghiên cứu
Bảng 4.6 Hiệu giá của chủng virus KTY-PRRS-01 (lgTCID50)
Thời gian
lg TCID50 24hpi 36hpi 48hpi 60hpi 72hpi 84hpi 96hpi
Virus trong tế bào
KTY-PRRS-01
Virus giải phóng
ngoài tế bào
KTY-PRRS-01
Virus ở trong tế
bào chủng vắc-xin
Virus ở dịch ngoài
tế bào chủng
vắc-xin
Bảng 4.6 Hiệu giá của chủng virus KTY-PRRS-02 (lgTCID50)
Thời gian
lg TCID50 24hpi 36hpi 48hpi 60hpi 72hpi 84hpi 96hpi
Virus trong tế bào
KTY-PRRS-02
Virus giải phóng
ngoài tế bào
KTY-PRRS-02
Virus ở trong tế
bào chủng vắc-xin
Virus ở dịch ngoài
Trang 10tế bào chủng
vắc-xin
4.2 Kết quả nghiên cứu, so sánh đặc tính sinh học phân tử của 02 chủng virus KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02
4.2.1 Kết quả giải trình tự gen các chủng virus PRRS nghiên cứu
4.2.2 Kết quả so sánh trình tự gen giữa các chủng virus PRRS nghiên cứu với nhau và với các chủng virus tham chiếu trên ngân hàng gen
Bảng 4.7 Các vị trí sai khác nucleotide đoạn gen ORF7 giữa các chủng virus
nghiên cứu với chủng virus tham chiếu
TT Vị Trí Nucleotide
sai khác
TT Vị Trí Nucleotide
sai khác
TT Vị Trí Nucleotide
sai khác 1
2
3
Bảng 4.8 Các vị trí sai khác nucleotide đoạn gen ORF5 giữa các chủng virus
nghiên cứu với chủng virus tham chiếu
TT Vị Trí Nucleotide
sai khác
TT Vị Trí Nucleotide
sai khác
TT Vị Trí Nucleotide
sai khác 1
2
3
4.2.3 Kết quả xây dựng cây sinh học phân tử cho thấy mối quan hệ di truyền của các chủng virus PRRS phân lập được với các chủng virus khác trong ngân hàng gen
4.3 Kết quả nghiên cứu, so sánh tính kháng nguyên của 02 chủng virus KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02
Trang 114.3.2 Kết quả theo dõi triệu chứng lâm sàng của lợn thực nghiệm
Bảng 4.9 Kết quả kiểm tra hàm lượng kháng thể của lợn thí nghiệm
bằng phương pháp ELISA
Lô thí nghiệm 1 Lô thí nghiệm 2 Lô đối chứng TN1.1 TN1.2 TN1.3 TN2.1 TN2.2 TN2.3 ĐC1 ĐC2 S/P
Kết quả
4.3.3 Kết quả nghiên cứu chỉ tiêu virus huyết ở lợn thực nghiệm
Bảng 4.10 Kết quả xét nghiệm PRRSV bằng phương pháp RT-PCR
Ngày gây
nhiễm
Lô TN1 gây nhiễm chủng KTY-PRRS-01
Lô TN2 gây nhiễm chủng KTY-PRRS-02 Lô đối chứng
0
3
5
7
9
11
13
15
17
19
21
Trang 134.3.4 Kết quả theo dõi hàm lượng kháng thể PRRS ở lợn thực nghiệm
Bảng 4.11 Hàm lượng kháng thể kháng PRRSV của một số ngày sau gây nhiễm tính theo S/P
Lô Ngày
Lợn
S/P KQ S/P KQ S/P KQ S/P KQ S/P KQ S/P KQ S/P KQ S/P KQ S/P KQ S/P KQ S/P KQ
Lô
1
TN1.1
TN1.2
TN1.3
Lô
2
TN2.1
TN2.2
TN2.3
Lô
Đ
C
ĐC1
ĐC2
Trang 144.3.5 Kết quả nghiên cứu biến đổi bệnh lý của lợn thí nghiệm
Bảng 4.12 Bệnh tích đại thể của lợn thí nghiệm gây nhiễm 2 chủng
KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02
STT Cơ quan
Lợn
Bệnh tích các cơ quan
Gây nhiễm KTY-PRRS- 01 Gây nhiễm KTY-PRRS- 02 Đối chứng
TN1.1 TN1.2 TN1.3 TN2.1 TN2.2 TN2.3 ĐC 1 ĐC 2
1 Hạch
lâm ba
2 Phổi
4 Lách
5 Ruột
6 Thận
7 Dạ dày
Bảng 4.13 Bệnh tích vi thể của lợn thí nghiệm gây nhiễm 2 chủng
KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02
STT Cơ quan
Lợn
Bệnh tích các cơ quan
Gây nhiễm KTY-PRRS- 01 Gây nhiễm KTY-PRRS- 02 Đối chứng
TN1.1 TN1.2 TN1.3 TN2.1 TN2.2 TN2.3 ĐC 1 ĐC 2
1 Hạch lâm ba
2 Phổi
4 Lách
5 Ruột
6 Thận
7 Dạ dày
Trang 16V. KẾ HOẠCH THỰC HIỆN
1 Kết quả nghiên cứu, so sánh một số đặc tính sinh học của 02 chủng virus KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02
2 Nghiên cứu, so sánh đặc tính sinh học phân tử của 02 chủng virus KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02
3 Nghiên cứu, so sánh tính kháng nguyên của 02 chủng virus KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02
5 Phân tích số liệu và viết luận văn
Giáo viên hướng dẫn
(Ký và ghi rõ họ tên)
Học viên thực hiện đề tài
(Ký và ghi rõ họ tên)
