Dựa vào mức độ tương đồng về trình tự nucleotide, người ta xếp các HCV vào các kiểu gene genotype khác nhau 66-69% tương đồng.. 1 Hiện nay, cĩ 6 genotype HCV được phân biệt và sự phân bố
Trang 1Ứ NG D Ụ NG K Ĩ THU Ậ T REALTIME PCR VÀ REALTIME RT-PCR TRONG XÁC ðị NH KI Ể U GENE C Ủ A
VIRUS GÂY VIÊM GAN SIÊU VI B VÀ C
H ồ Th ị Thanh Th ủ y 1 , Nguy ễ n B ả o Tồn 2 , Cao Minh Nga 3 , V ũ Th ị T ườ ng Vân 4
1
Cơng ty c ổ ph ầ n TM – SX & DV Vi ệ t Á , 2 Trung tâm ch ẩ n đ ốn Y khoa Medic, TP HCM, 34 Khoa Y, ðạ i h ọ c Y d ượ c
TP HCM, 4 Khoa Vi sinh, B ệ nh vi ệ n B ạ ch Mai
M Ở ðẦ U
Viêm gan siêu vi B (HBV) và C (HCV) luơn là những bệnh nhiễm rấ đáng lo ngại bởi số ượng người bị nhiễm
b nh, cũng như các kiểu biến chứng gây nguy hiểm đến sức khỏe con người như xơ gan, ung thư gan Dựa vào mức độ tương đồng về trình tự nucleotide, người ta xếp các HCV vào các kiểu gene (genotype) khác nhau (66-69% tương đồng). 1 Hiện nay, cĩ 6 genotype HCV được phân biệt và sự phân bố các genotype này được ghi nhận phụ thuộc vào địa dư.1,2 Các nghiên cứu về mối tương quan giữa genotype của HCV với sựđáp ứng thuốc trong điều trịđã được cơng bố.3ðối với HBV, 8 kiểu gene đã được xác định (kí hiệu từ A đến H) dựa vào
sự khác nhau trên 8% của tồn bộ bộ gene HBV,4,5 và sự phân bố của các kiểu gene này cũng phụ thuộc vào
địa dư.5,6 Mối tương quan giữa genotype và đáp ứng với các kiểu thuốc điều trị cũng đã được cơng bố trong
những năm gần đây.7,8,9,10
Mặc dù trên thị trường hiện nay đã cĩ rất nhiều bộ kít được sản xuất trong và ngồi nước dựa trên kĩ thuật sinh
h c phân tử phục vụ cho việc xác định kiểu gene của HBV và HCV Mỗi kít cĩ những ưu và nhược điểm riêng,
nhưng nhìn chung chi phí bệnh nhân phải trả cho việc xác định đồng bộ các kiểu gene là rất cao
Nghiên cứu này được đặt ra nhằm xây dựng hai quy trình kĩ thuật realtime PCR và realtime RT-PCR để xác
định đồng thời ba kiểu gene phổ biến (A, B và C) của HBV và bốn kiểu gene phổ biến (1, 2, 3 và 6) của virus HCV hiện lưu hành ở người Việt nam,với mục đích cuối cùng là cĩ thểđưa đến những quy trình xác định kiểu gene virus HBV và virus HCV đơn giản, hiệu quả và chi phí thấp Chúng tơi chọn trình tự mục tiêu cho phản
ứng realtime PCR và realtime RT-PCR lần lượt là vùng gene S trên bộ gene HBV và vùng 5’NC trên bộ gene HCV ðối với cả hai quy trình, điểm chung là cặp mồi sử dụng cho phép nhân bản mọi kiểu gene đã xác định
của virus (mồi consensus) và TaqMan probe đặc hiệu cho từng kiểu gene (A, B và C đối với HBV và 1, 2, 3 và 6
đối với HCV) được thiết kế bên trong đ ạn trình tự nằm giữa hai mồi Các loại chấ đánh dấu huỳnh quang khác nhau được sử dụng nhằm phân biệt dễ dàng các kiểu gene
NGUYÊN LI Ệ U VÀ PH ƯƠ NG PHÁP
M ẫ u b ệ nh ph ẩ m
100 mẫu bệnh phẩm huyết thanh, trong đĩ 50 mẫu nhiễm HBV và 50 mẫu nhiễm HCV do bệnh viện ðại học Y
dược TP HCM, Trung tâm chẩn đốn Y khoa Medic và phịng xét nghiệm Y khoa Âu Lạc cung cấp
M ồ i, m ẫ u dị
Hai hệ mồi, mẫu dị (được tĩm tắt trong bảng 1 và 2) sử dụng trong nghiên cứu này được thiết kế, dựa vào trình
tự các gene S trên bộ gene HBV và vùng 5’NC trên bộ gene HCV được cơng bố trên ngân hàng gene và được
tổng hợp bởi cơng ty IDT (USA)
Bảng 1 Mồi và mẫu dị trên gene S của HBV
Tên Chức
Chiều dài (bp)
Kích thước sản phẩm PCR (bp)
PrimerHBV-F Mồ
xuơi 5’-CTGGTGGC TC AGT TCA GGA AC-3’ 22 91 PrimerHBV-R Mồ
ngược
5’-GGCGCAGGGTCCCCAAT- 3’
17
ProbeA Mẫu dị 5’-FAM ACATCTCGTCAATCTCCGCGAG– BHQ1-3’ 22
ProbeB Mẫu dị 5’-HEX TCCATATCGTCAATCTTATCGAAGA– BHQ1-3’ 25
ProbeC Mẫu dị 5’-Cy5 CCCATATCGTCAATCTTCTCGAG– BHQ2-3’ 23
Trang 2Bảng 2 Mồi và mẫu dò trên vùng 5’NC của HCV
Tên Chức
Chiều dài (bp)
Kích thước sản phẩm PCR
(bp) PrimerF Mồi xuôi 5’-AGCCATAGTGGTCTGCGGAAC-3’ 22 99
PrimerR Mồi
ngược 5’-ACGCCCAAATBTCCRGGCATTGA-3’ 17
Probe1 Mẫu dò 5’-FAM –TGCCAGGACGACCGGGTCCTTTCTTG-BHQ1-3’ 22
Probe2 Mẫu dò 5’-Cy5-AAG GAC CCA GTC TTC CCG GCA ATT C-BHQ2-3’ 25
Probe3 Mẫu dò 5’-ROX-ACC CGG TCA CCC CAG CGA TTC C- BHQ2-3’ 23
Probe 6 Mẫu dò 5’-HEX-TGCCAGGACGACCGGGTCCTTTCCAT-BHQ1-3’ 26
Tách chi ế t acid nucleic
RNA và DNA từ mẫu huyết thanh bệnh nhân ñược ly trích bằng phương pháp sử dụng phenol/chloroform,
phỏng theo phương pháp của Chomczynski & Sacchi (1987): 200 µl huyết thanh ñược thêm vào 900 µl Trizol,
pH4 (ñối với tách RNA) và pH8 (ñối với tách DNA) Acid nucleic sau ñó ñược tủa bằng Isopropanol với chất trợ
tủa GlycoBlue Acid nucleic thu ñược sau tủa ñược giữ trong dung dịch TE 1X (Tris-EDTA) (ñối với DNA) và
H2O cấ ñã qua xử lý bằng DEPC (ñối với RNA) và bảo quản ở -20oC cho ñến khi sử dụng
Realtime PCR và Realtime-RT-PCR
Phản ứng ñược thực hiện trên máy Mxpro-Mx3005P (Stratagene) với chương trình nhiệt bao gồm 950C- 5’ (1
chu kỳ) và 40 chu kỳ l p lại với 950C- 15’’, 600C- 1’ cho Realtime PCR và 250C- 5’ (1 chu kỳ), 420C- 30’ (1 chu
k ), 850C- 5’ (1 chu kỳ) và 950C- 5’ (1 chu kỳ) và 40 chu kỳ ặp lại với 950C- 15’’, 600C- 1’ cho Realtime RT-PCR
Thể tích hỗn hợp phản ứng PCR realtime là 50 µl bao gồm: 1× dung dịch ñệm PCR, 100 nmol/L mồi và mẫu
dò, 400 µmol/L mỗi loại dATP, dGTP, dCTP và dTTP, 1.5 units hot-start Taq DNA polymerase, 3 mmol/L MgCl2
Thể tích hỗn hợp phản ứng RT là 20µl bao gồm: 1× dung dịch ñệm RT, 20 units Rnase Inhibitor, 0,2 µg Random
hexamer, 200 units M-MuLV Reverse Transcriptase và 100 ng - 5 µg total RNA 3 kiểu gien của HBV ñược xác
ñịnh trong cùng một phản ứng chứa ñầy ñủ các mồi và mẫu dò ñặc hiệu cho mỗi kiểu gien A, B và C và tương
tự 4 kiểu gien của HCV cũng ñược xác ñịnh trong cùng phản ứng chứa ñầy ñủ các mồi và mẫu dò ñặc hiệu cho
mỗi kiểu gien 1, 2, 3 và 6
Gi ả i trình t ự
Sản phẩm PCR và RT-PCR ñặc trưng cho các genotype của HBV và HCV sau ñó gửi ñến công ty Macrogen,
Hàn quốc ñể tinh sạch và giải trình tự
K Ế T QU Ả & TH Ả O LU Ậ N
ðộ ñặ c hi ệ u c ủ a m ồ i và m ẫ u dò
ðố i v ớ i h ệ m ồ i và m ẫ u dò trên gene S c ủ a HBV: chúng tôi thiết kế thí nghiệm sử dụng DNA chứng dương là
HBV genotype A ñược ñưa vào các hỗn hợp cho phản ứng realtime PCR chứa các probe ñặc trưng cho HBV
genotype A, B và C Việc bố trí thí nghiệm cũng ñược tiến hành tương tự cho các genotype còn lại Kết quả chỉ
có hỗn hợp chứa mẫu dò ProbeA ñặc trương cho HBV genotype A mới cho tín hiệu dương tính Kết quả tương
tự cho các genotype còn lại (hình 1a)
HBV genotype C HBV genotype A
Ch ứ ng âm HBV genotype B
Hình 1a K ế t qu ả kh ả o sát kh ả n ă ng khu ế ch
ñạ i c ủ a m ồ i và m ẫ u dò trên gene S c ủ a HBV
Trang 3ðố i v ớ i h ệ m ồ i và m ẫ u dò trên vùng 5’NC c ủ a HCV: chúng tôi thiết kế thí nghiệm sử dụng RNA chứng dương là HCV genotype 1 ñược ñưa vào các hỗn hợp cho phản ứng realtime RT-PCR chứa các probe ñặc trưng cho HCV genotype 1, 2, 3 và 6 Việc bố trí thí nghiệm cũng ñược tiến hành tương tự cho các genotype còn lại Kế
quả chỉ có hỗn hợp chứa mẫu dò Probe1 ñặc trưng cho HCV genotype 1 mới cho tín hiệu dương tính Kết quả
tương tự cho các genotype còn lại (hình 1b)
Hình 1b K ế t qu ả kh ả o sát kh ả n ă ng khu ế ch ñạ i c ủ a m ồ i và m ẫ u dò trên vùng 5’NC của HCV
Các hình 1 a và b ñều cho thấy trong các phản ứng nếu có các kiểu genotype tương ứng với các mẫu dò ñặc
trưng thì các tín hiệu huỳnh quang vượt trên tín hiệu nền, các mẫu chứng âm (ñược thiết kế với các thành phần
tương tự cho phản ứng realtime-PCR và realtime RT-PCR, chỉ thay acid nucleic bằng nước) có tín hiệu huỳnh quang thấp hơn tín hiệu nền Như vậy các hệ mồi và mẫu dò của chúng tôi ñều hoạ ñộng hiệu quả và ñặc hiệu cho các genotype HBV và HCV
ðộ nh ạ y c ủ a ph ả n ứ ng
Các hình 2a, b và c cho thấy, các dạng ñồ thị biểu thị cho các kiểu genotype tương ứng với các mồi và mẫu dò
ñặc trưng, thì các tín hiệu huỳnh quang vượt trên tín hiệu nền, từ mẫu có nồng ñộ amplicon 107 copy/ml với chu
k ngưỡng (Ct) giảm dần ñến mẫu có nồng ñộ 102 copy/ml Các mẫu chứng âm (ñược thiết kế với các thành
phần tương tự cho phản ứng realtime-PCR và realtime RT-PCR, chỉ thay acid nucleic bằng nước) có tín hiệu
huỳnh quang thấp hơn tín hiệu nền
Hình 2a K ế t qu ả kh ả o sát ñộ nh ạ y c ủ a m ồ i và m ẫ u dò trên gene S c ủ a HBV
Hình 2b K ế t qu ả kh ả o sát ñộ nh ạ y c ủ a m ồ i và m ẫ u dò trên vùng 5’NC của HCV, genotype 1 và 6
HCV genotype 1 HCV genotype 3 HCV genotype 2 HCV genotype 6
Ch ứ ng âm
106 copy/ml
105 copy/ml
104 copy/ml
103 copyml
101 copy/ml
102 copy/ml
107 copy/ml
GHI CHÚ:
: HBV genotype A : HBV genotype B : HBV genotype C
Ch ứ ng âm
GHI CHÚ:
: HCV genotype 1
: HCV genotype 6
10 6 copy/ml
105 copy/ml
10 4 copy/ml
10 3 copy/ml
10 1 copy/ml
102 copy/ml
107 copy/ml
Ch ứ ng âm
Trang 4Hình 2c K ế t qu ả kh ả o sát ñộ nh ạ y c ủ a m ồ i và m ẫ u dò trên vùng 5’NC của HCV, genotype 2 và 3
K ế t qu ả Realtime PCR và Realtime RT-PCR trên b ệ nh ph ẩ m
Quy trình ñược thử nghiệm trên 50 mẫu bệnh phẩm nhiễm HBV và HCV Kết quả cho thấy có 39 mẫu (78%)
ñược xác ñịnh nhiễm HBV genotype B, và 11 mẫu (22%) ñược xác ñịnh nhiễm HBV genotype C ðối với trường
hợp nhiễm HCV, kết quả realtime RT-PCR ghi nhận 28 trường hợp (56%) nhiễm HCV genotype 1, 7 trường hợp (14%) nhiễm HCV genotype 2, 15 trường hợp (30%) nhiễm HCV genotype 6 Bước ñầu, các kết quả này ñã
ñược kiểm chứng lại bằng giải trình tự sản phẩm PCR và kết quả của cả hai phương pháp cho thấy hoàn toàn trùng khớp trong genotyping
Tóm lại, phương pháp mà chúng tôi vừa xây dựng hoàn toàn phù hợp trong việc xác ñịnh các kiểu gene virus HBV và HCV nhiễm phổ biến ở Việt nam
TÀI LI Ệ U THAM KH Ả O
1 Simmonds P, Holmes EC, Cha TA, Chan SW, McOmish F, Irvine B, et al Classification of hepatitis C virus into six major genotypes and a series of subtypes by phylogenetic analysis of the NS-5 region J Gen Virol 1993a;74:2391–9
2 Simmonds P, McOmish F, Yap PL, Chan SW, Lin CK, Dusheiko G, et al Sequence variability in the 5_ non-coding region
of hepatitis C virus: identification of a new virus type and restrictions on sequence
diversity J Gen Virol 1993b;74:661–8
3 Manns MP, McHutchison JG, Gordon SC, Rustgi VK, Shiffman M, Reindollar R, et al Peginterferon alfa-2b plus ribavirin compared with interferon alfa-2b plus ribavirin for initial treatment of chronic hepatitis C: a randomised trial Lancet
2001;358:958–65
4 Norder H, Courouce AM, Magnius LO Complete genome, phylogenetic relatedness and structural proteins of six strains of
the hepatitis B virus, four of which represent two new genotypes Virology 1994;198:489-503
5 Okamoto H, Tsuda F, Sakagawa H, Sastrosoewignjo RI, Imai M, Miyakawa Y, et al Typing hepatitis B virus by homology
in nucleotide sequence comparison of surface antigen subtypes J Gen Virol 1988;69:2575-83
6 Norder H, Hammas B, Lee SD, Bele C, Courouce AM, Mushawar IK, et al Genetic relatedness of hepatitis B viral strains
of diverse geographical origin and natural variation in the primary structure of the surface gene J Gen Virol 1993; 74:1341-8
7 Thakur V, Guptan RC, Kazim SN, Malhotra V, Sarin SK Profile, spectrum and significance of HBV genotype in chronic
liver disease patients in the Indian subcontinent J Gastroenterol Hepatol 2002;17:165-70
8 Erhardt A, Reineke V, Blondin D, Gerlich WH, Adam O, Heintges T, et al Mutation of the core promoter and response to interferon in chronic replicative hepatitis B Hepatology 2000;31:716-25
9 Kao JH, WuNH, Chen PJ, Lai MY, Chen DS Hepatitis B genotype and the response to interferon therapy J Hepatol
2000;33:998-1002
10 Thakur V, Sarin SK, Rehman S, Guptan RC, Kazim SN, Kumar S Role of HBV genotype in predicting response to
lamivudine therapy in patients with chronic hepatitis B Indian J Gastroenterol 2005;24:12-1
Tác giả chịu trách nhiệm chính: Hồ Thị Thanh Thủ : Công ty cổ phần TM – SX & DV Việt Á, email: htthuy80@yahoo.com, mobile: 0903217541
GHI CHÚ:
: HCV genotype 2
: HCV genotype 3
106 copy/ml
105 copy/ml
104 copy/ml
10 3 copy/ml
101 copy/ml
102 copy/ml
10 7 copy/ml
Ch ứ ng âm
Trang 5APPLICATION OF REALTIME PCR AND REALTIME RT-PCR IN GENOTYPING OF
HBV AND HCV
Ho Thi Thanh Thuy 1 , Nguyen Bao Toan 2 , Cao Minh Nga 3 , Vu Thi Tuong Van 4
1
Viet A Trading – Production & Service Corp, 2 Medic medical center of HoChiMinh city, 3 Faculty of Medicine, Medicinal University of HoChiMinh city, 4 Faculty of Microbiology, Bach Mai Hospital
Background: There is the need for rapid and inexpensive methods for genotyping hepatitis B (HBV) and C
viruses (HCV) to support clinical practice
Objectives: To develop two realtime-PCR and realtime RT-PCR for HBV and HCV genotyping in a single tube Study design: Three type-specific probes, genotypes A–C and four type-specific probes, genotypes 1, 2, 3 and
6, were designed around genotype-specific motifs in the S gene of HBV and 5’non-coding (NC) region of HCV, respectively The PCR based assays were compared with sequencing and were applied on a further 100 clinical samples
Results: The performances of these assays were assessed by analyzing serial dilutions of acid nucleic of known
concentrations and the lower limit of detection were found to be 102 acid nucleic copies/ml Then, 50 samples infected HBV were analysed by realtime PCR: 39 cases (78%) were genotype B, 11 cases (22%) genotype C For 50 samples infected HCV, 28 samples (56%) were HCV genotype 1, 7 samples (14%) genotype 2, 15 samples (30%) genotype 6 Concordant results were obtained with the sequencing for all cases tested
Conclusions: The PCR-based assays were sensitive, specific, fast, accurate and convenient methods for routine
HBV and HCV genotyping
