Nghiên cứu phân lập các dẫn xuất phenyl glycosit từ cây trứng cua melochia umbellata

Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất đã phân lập được bằng các phương pháp phổ... Những chất này có thể lẫn với dung môi trong quá trình sản xuất hoặc trong khâu bảo quản như trong

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Hóa Hữu cơ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Hóa Hữu cơ

Người hướng dẫn khoa học

TS NGUYỄN XUÂN CƯỜNG

HÀ NỘI - 2016

LỜI CẢM ƠN

Khóa luận tốt nghiệp này được hoàn thành tại phòng Dược liệu biển - Viện Hóa sinh biển - Viện Hàn lâm Khoa học và Côngnghệ Việt Nam

Với lòng biết ơn chân thành, em xin cảm ơn sự giúp đỡ quý báu của

thầy TS Nguyễn Xuân Cường đã nhiệt tình, tận tâm hướng dẫn em trong

suốt quá trình thực hiện khóa luận này

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới tập thể các cán bộ phòng Dược liệu biển - Viện Hoá sinh biển, đã tạo điều kiện giúp đỡ em hoàn thành khoá luận tốt nghiệp

Em xin được bầy tỏ lòng biết ơn chân thành tới thầy giáo PGS.TS

Nguyễn Văn Bằng cùng toàn thể các thầy cô trong khoa Hóa Học, các thầy

cô giáo trong Trường Đại học sư phạm Hà Nội 2 đã truyền đạt những kiến thức quý báu cho em trong quá trình học tập tại trường

Trong quá trình thực hiện làm khóa luận tốt nghiệp này mặc dù đã hết sức cố gắng nhưng chắc chắn không thể tránh được những thiếu sót Vì vậy

em kính mong nhận được ý kiến đóng góp quý báu của các thầy cô và bạn bè

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 05 năm 2016

Sinh viên

Đỗ Thúy Hằng

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các kết quả nghiên cứu, số liệu được trình bày trong

khóa luận: “Nghiên cứu phân lập các dẫn xuất phenyl glycosit từ cây

Trứng cua - Melochia umbellata” dưới sự hướng dẫn của TS Nguyễn Xuân

Cường là hoàn toàn trung thực và không trùng với kết quả của tác giả khác

Sinh viên

Đỗ Thúy Hằng

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1.1 Giới thiệu về cây Trứng cua 3

1.1.2 Phân bố 4

1.1.3 Thành phần hóa học 4

1.2 Các phương pháp chiết mẫu thực vật 8

1.2.1 Chọn dung môi chiết 8

1.2.2 Quá trình chiết 10

1.3 Các phương pháp sắc kí trong phân lập các hợp chất hữu cơ 11

1.3.1 Đặc điểm chung của phương pháp sắc kí 12

1.3.2 Cơ sở của phương pháp sắc kí 12

1.3.3 Phân loại các phương pháp sắc kí 13

1.4 Một số phương pháp hóa lý xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ 17

1.4.1 Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy, IR) 17

1.4.2 Phổ khối lượng (Mass Spectroscopy, MS) 18

1.4.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR) 19

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁPNGHIÊN CỨU 22

2.1 Mẫu thực vật 22

2.2 Phương pháp phân lập các hợp chất 22

2.2.1 Sắc ký lớp mỏng (TLC) 22

2.2.2 Sắc ký lớp mỏng điều chế 22

2.2.3 Sắc ký cột (CC) 22

2.3.2 Phổ khối lượng (ESI-MS) 23

2.3.3 Phổ cộng hưởng từ nhân (NMR) 23

2.4 Dụng cụ và thiết bị 23

2.4.1 Dụng cụ và thiết bị tách chiết 23

2.4.2 Dụng cụ và thiết bị xác định cấu trúc 24

2.5 Hoá chất 24

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM 25

3.1 Thu mẫu thực vật và xử lý mẫu 25

3.2 Phân lập các hợp chất 25

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28

4.1 Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất MU4: Phenethyl alcohol β-D-glucopyranoside 28

4.2 Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất MU6: Methyl salicylate β-D-glucopyranoside 32

4.3 Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất MU12: Benzyl O-β-D-glucoside 35 KẾT LUẬN 41

TÀI LIỆU THAM KHẢO 42

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

13C-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Cacbon 13

Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

1H-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton

Proton Magnetic Resonance Spectroscopy

1H-1H COSY 1H-1H Chemical Shift Correlation Spectroscopy

2D-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều

HMQC Heteronuclear Multiple Quantum Coherence

IR Phổ hồng ngoại Infrared Spectroscopy

Me Nhóm metyl

MS Phổ khối lượng Mass Spectroscopy

TLC Sắc ký lớp mỏng Thin Layer Chromatography

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ BẢNG BIỂU

Hình 1.1 Cây Trứng cua 3

Hình 3.1 Sơ đồ chiết các phân đoạn mẫu cây Trứng cua 24

Hình 3.2 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cây Trứng cua 25

Hình 4.1.a Cấu trúc hóa học của hợp chất MU4 27

Hình 4.1.b Phổ 1H-NMR của hợp chất MU4 27

Hình 4.1.c Phổ 13C-NMR của hợp chất MU4 28

Hình 4.1.d Phổ HSQC của hợp chất MU4 29

Hình 4.1.e Phổ HMBC của hợp chất MU4 31

Hình 4.1.f Các tương tác HMBC chính của hợp chất MU4 31

Hình 4.2.a Cấu trúc hóa học của hợp chất MU6 31

Hình 4.2.b Phổ 1H-NMR của hợp chất MU6 32

Hình 4.2.c Phổ 13C-NMR của hợp chất MU6 34

Hình 4.3.a Phổ 1H-NMR của hợp chất MU12 35

Hình 4.3.b Cấu trúc hóa học của hợp chất MU12 36

Hình 4.3.c Phổ 13C-NMR của hợp chất MU12 36

Hình 4.3.d Phổ HSQC của hợp chất MU12 38

Hình 4.3.e Phổ HMBC của hợp chất MU12 38

Hình 4.3.f Các tương tác HMBC chính của hợp chất MU12 39

Bảng 4.1: Số liệu phổ NMR của hợp chất MU4 và chất so sánh 30

Bảng 4.2: Số liệu phổ NMR của hợp chất MU6 và chất so sánh 33

Bảng 4.3 Số liệu Phổ NMR của hợp chất MU12 và chất so sánh 37

MỞ ĐẦU

Các sản phẩm thiên nhiên ngày càng được con người quan tâm và ứng dụng rộng rãi bởi đặc tính ít độc, dễ hấp thụ và không làm tổn hại đến môi sinh Theo các tài liệu công bố hiện nay, có khoảng 60% - 70% các loại thuốc chữa bệnh đang được lưu hành hoặc trong giai đoạn thử nghiệm lâm sàng có nguồn gốc tự nhiên

Bằng các phương pháp thử hoạt tính sinh học hiện đại, có kết quả cao, người ta đã tiến hành nghiên cứu các mẫu dịch chiết thực vật, nghiên cứu các chất đã tách được từ các dịch chiết Nhờ vậy mà phát hiện ra nhiều hợp chất

có hoạt tính sinh học quý báu, tạo điều kiện vô cùng thuận lợi cho việc phát triển ngành y, dược trong công cuộc chữa bệnh cứu người

Nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa, lượng mưa lớn, độ ẩm cao (khoảng trên 80%), Việt Nam hiện có một hệ thực vật rất phong phú với khoảng 12000 loài, trong đó có tới 4000 loài được nhân dân ta dùng làm thảo dược cùng các mục đích khác phục vụ cuộc sống con người

Cùng với bề dày phát triển 4000 năm lịch sử của dân tộc, ngành đông y

đã dành được nhiều thành công rực rỡ, nhiều phương thuốc cây cỏ động vật

đã được ứng dụng hiệu quả lưu truyền cho đến ngày nay Đó là cơ sở rất quan trọng cho việc phát triển ngành hóa học các hợp chất thiên nhiên

Tuy nhiên, đối với một đất nước còn hạn chế về nguồn vốn và cơ sở vật chất như Việt Nam thì vấn đề đặt ra là làm thế nào để khai thác và sử dụng nguồn tài nguyên một cách hiệu quả nhất cho xã hội

Cây Trứng cua - Melochia umbellata thuộc họ Trôm Sterculiaceae là

loại cây phổ biến ở khu vực Bảo Lộc, Lâm Đồng Tuy nhiên, hiện chưa có

Vì vậy, tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu phân lập các dẫn

xuất phenyl glycosit từ cây Trứng cua – Melochia umbellata”

Khóa luận này tập trung nghiên cứu các thành phần phenyl glicosit của cây Trứng cua tạo cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực tìm kiếm thuốc mới, các giải pháp điều trị bệnh

Nội dung của khóa luận bao gồm:

1 Phân lập các hợp chất phenyl glycosit từ lá cây Trứng cua bằng các phương pháp sắc ký

2 Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất đã phân lập được bằng các phương pháp phổ

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về cây Trứng cua

1.1.1 Giới thiệu về cây Trứng cua

Tên khoa học: Melochia umbellata (Wight.) Stapf thuộc họ Trôm

Sterculiaceae

Tên Việt Nam : Trứng cua

Hình 1.1 Cây Trứng cua Mô tả cây:

Cây gỗ nhỏ; cành non có lông dày trắng Lá xoan to, dài đến 20 cm, có

hường; đài dính thành ống cao 2,5 mm, có lông mịn; cánh hoa cao 8 mm; tiểu nhụy 5, chỉnh dính thành ống ngắn; noãn sào có lông dày Nang cao 1 cm, có

Các nghiên cứu đã được công bố trên thế giới về các loài thuộc chi

Melochia cho thấy sự có mặt của các lớp chất alkaloid [1-7], tritecpen [8] và

Cấu trúc hóa học các hợp chất Tritecpen phân lập được từ các loài Melochia

Apigenin Kaempferol Quercetin

Cấu trúc hóa học các hợp chất flavonoit phân lập được từ các loài Melochia

Tuy nhiên, hiện chưa có nhiều công trình khoa học công bố về thành

phần hóa học của cây Trứng cua - M umbellata Tính đến thời điểm hiện tại,

mới chỉ có 03 công trình khoa học được công bố về loài này Năm 1980, nhóm tác giả Gunasegaran và cs công bố sự phân lập và xác định cấu trúc của

một hợp chất flavonoit là kaempferol-3-O-galactoside từ loài này [10]

Kaempferol-3-O-galactoside

Đến năm 2012, hợp chất stigmasterol glycoside là

stigmast-5,22-dien-3-O-β-D-glucopyranoside tiếp tục được công bố từ loài Melochia umbellata (Houtt) Stapf var degrabrata K [11]

Stigmast-5,22-dien-3-O-β-D-glucopyranoside

Waltherione C Cleomiscosin A

Gần đây nhất, một hợp chất quinolinone alkaloid là waltherione C và một hợp chất coumarinolignan là cleomiscosin A cũng được phân lập từ loài này Con đường sinh tổng hợp của các hợp chất waltherione A-D và các hợp chất 4-quinolinone phân lập được từ các loài thuộc họ Malvaceae cũng được các tác giả đề xuất [12]

1.2 Các phương pháp chiết mẫu thực vật [13, 14]

Sau khi tiến hành thu hái và làm khô mẫu, tuỳ thuộc vào đối tượng chất

có trong mẫu khác nhau (chất phân cực, chất không phân cực, chất có độ phân cực trung bình…) mà ta chọn dung môi và hệ dung môi khác nhau

1.2.1 Chọn dung môi chiết

Thường thì các chất chuyển hoá thứ cấp trong cây có độ phân cực khác nhau Tuy nhiên những thành phần tan trong nước ít khi được quan tâm Dung môi dùng trong quá trình chiết cần phải được lựa chọn rất cẩn thận

Điều kiện của dung môi là phải hoà tan được những chất chuyển hoá thứ cấp đang nghiên cứu, dễ dàng được loại bỏ, có tính trơ (không phản ứng với chất nghiên cứu), không dễ bốc cháy, không độc

Nếu dung môi có lẫn các tạp chất thì có thể ảnh hưởng đến hiệu quả và chất lượng của quá trình chiết Vì vậy những dung môi này nên được chưng cất để thu được dạng sạch trước khi sử dụng Thường có một số chất dẻo lẫn trong dung môi như các diankyl phtalat, tri-n-butyl-axetylcitrar và tributylphosphat Những chất này có thể lẫn với dung môi trong quá trình sản xuất hoặc trong khâu bảo quản như trong các thùng chứa hoặc các nút đậy bằng nhựa

Methanol và chlorofrom thường chứa dioctylphtalat phtalat hoặc bis-2-etylhexyl-phtalat] Chất này sẽ làm sai lệch kết quả phân lập trong các quá trình nghiên cứu hoá thực vật, thể hiện hoạt tính trong thử nghiệm sinh học và có thể làm bẩn dịch chiết của cây Chlrofrom, metylen

[di-(2-etylhexyl)-clorit và methanol là những dung môi thường được lựa chọn trong quá trình chiết sơ bộ một phần của cây như: lá, thân, rễ, củ, quả, hoa…

Những tạp chất của chlorofrom như CH2Cl2, CH2ClBr có thể phản ứng với một vài hợp chất như các ancaloit tạo muối bậc 4 và những sản phẩm khác Tương tự như vậy, sự có mặt của lượng nhỏ axit clohiđric (HCl) cũng

có thể gây ra sự phân huỷ, sự khử nước hay sự đồng phân hoá với các hợp chất khác Chlorofrom có thể gây tổn thương cho gan và thận nên khi làm việc với chất này cần được thao tác khéo léo, cẩn thận ở nơi thoáng mát và phải đeo mặt nạ phòng độc Metylen clorit ít độc hơn và dễ bay hơi hơn chlorofrom

Methanol và ethanol 80% là những dung môi phân cực hơn các hiđrocacbon thế clo Người ta cho rằng các dung môi thuộc nhóm rượu sẽ thấm tốt hơn lên màng tế bào nên quá trình chiết với các dung môi này sẽ thu được lượng lớn các thành phần trong tế bào Trái lại, khả năng phân cực của chlorofrom thấp hơn, nó có thể rửa giải các chất nằm ngoài tế bào Các ancol hoà tan phần lớn các chất chuyển hoá phân cực cùng với các hợp chất phân cực trung bình và thấp Vì vậy, khi chiết bằng ancol thì các chất này cũng bị hoà tan đồng thời Thông thường dung môi cồn trong nước có những đặc tính tốt nhất cho quá trình chiết sơ bộ

Tuy nhiên cũng có một vài sản phẩm mới được tạo thành khi dùng methanol trong suốt quá trình chiết Thí dụ trechlonolide A thu được từ trechlonaetes aciniata được chuyển thành trechlonolide B bằng quá trình phân huỷ 1-hydroxytropacocain cũng xảy ra khi erythroxylum novogranatense được chiết trong methanol nóng

Dietyl ete hiếm khi được dùng cho các quá trình chiết thực vật vì nó rất

dễ bay hơi, bốc cháy và rất độc, đồng thời nó có xu hướng tạo thành peroxit

dễ nổ Peroxit của dietyl ete dễ gây phản ứng oxi hoá với các hợp chất không

có khả năng tạo cholesterol như các carotenoid Tiếp đến là axeton cũng có thể tạo thành axetonit nếu 1,2-cis-diol có mặt trong môi trường axit Quá trình chiết dưới điều kiện axit hoặc bazơ thường được dùng với quá trình phân tách đặc trưng, cũng có khi xử lí các dịch chiết bằng axit-bazơ có thể tạo thành những sản phẩm mong muốn

Sự hiểu biết về những đặc tính của những chất chuyển hoá thứ cấp trong cây được chiết sẽ rất quan trọng để từ đó lựa chọn dung môi thích hợp cho quá trình chiết, tránh được sự phân huỷ chất bởi dung môi và quá trình tạo thành chất mong muốn

Sau khi chiết, dung môi được cất ra bằng máy cất quay ở nhiệt độ không quá 30-400C, với một vài hoá chất chịu nhiệt có thể thực hiện ở nhiệt

độ cao hơn

1.2.2 Quá trình chiết

Hầu hết quá trình chiết đơn giản được phân loại như sau:

- Chiết ngâm

- Chiết sử dụng một loại thiết bị là bình chiết Xoclet

- Chiết sắc với dung môi nước

- Chiết lôi cuốn theo hơi nước

Chiết ngâm là một trong những phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất trong quá trình chiết thực vật bởi nó không đòi hỏi nhiều công sức và thời gian Thiết bị sử dụng là một bình thuỷ tinh với một cái khoá ở dưới đáy

để điều chỉnh tốc độ chảy thích hợp cho quá trình tách rửa dung môi Dung môi có thể nóng hoặc lạnh nhưng nóng sẽ đạt hiệu quả chiết cao hơn Trước đây, máy chiết ngâm đòi hỏi phải làm bằng kim loại nhưng hiện nay có thể

Thông thường quá trình chiết ngâm không được sử dụng như phương pháp chiết liên tục bởi mẫu được ngâm với dung môi trong máy chiết khoảng

24 giờ rồi chất chiết được lấy ra Thông thường quá trình chiết một mẫu chỉ thực hiện qua 3 lần dung môi vì khi đó cặn chiết sẽ không còn chứa những chất giá trị nữa Sự kết thúc quá trình chiết được xác định bằng một vài cách khác nhau

Ví dụ:

- Khi chiết các ancaloid, ta có thể kiểm tra sự xuất hiện của hợp chất này bằng sự tạo thành kết tủa với những tác nhân đặc trưng như tác nhân Đragendroff và tác nhân Maye

- Các flavonoid thường là những hợp chất màu Vì vậy, khi dịch chiết chảy ra mà không có màu sẽ đánh dấu sự rửa hết những chất này trong cặn chiết

- Khi chiết các chất béo thì nồng độ trong các phần của dịch chiết ra

và sự xuất hiện của cặn chiết tiếp theo sau đó sẽ biểu thị sự kết thúc quá trình chiết

- Các lacton của sesquitecpen và các glicozid trợ tim, phản ứng Kedde

có thể dùng để biểu thị sự xuất hiện của chúng hoặc khi cho phản ứng với aniline axetat sẽ cho biết sự xuất hiện của các hydrat cacbon và từ đó có thể biết được khi nào quá trình chiết kết thúc

Như vậy, tuỳ thuộc vào mục đích cần thiết lấy chất gì để lựa chọn dung môi cho thích hợp và thực hiện quy trình chiết hợp lí nhằm đạt hiệu quả cao Ngoài ra, có thể dựa vào mối quan hệ của dung môi và chất tan của các lớp chất mà ta có thể tách thô một số lớp chất ngay trong quá trình chiết

1.3 Các phương pháp sắc kí trong phân lập các hợp chất hữu cơ

1.3.1 Đặc điểm chung của phương pháp sắc kí

Sắc kí là phương pháp tách, phân tích, phân li các chất dựa vào sự khác nhau về bản chất hấp phụ và sự phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha: pha động và pha tĩnh

Sắc kí gồm có pha động và pha tĩnh Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu

tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh tương ứng với tính chất của chúng (tính bị hấp phụ, tính tan…)

Phương pháp sắc kí dựa trên sự khác biệt về tốc độ di chuyển của các chất trong pha động khi tiếp xúc mật thiết với một pha tĩnh Nguyên nhân của sự khác nhau đó là do khả năng bị hấp phụ và phản hấp phụ khác nhau hoặc do khả năng trao đổi khác nhau của các chất ở pha động với các chất ở pha tĩnh

Các chất khác nhau sẽ có ái lực khác nhau với pha động và pha tĩnh Trong quá trình pha động chuyển động dọc theo hệ sắc kí hết lớp pha tĩnh này đến lớp pha tĩnh khác, sẽ lặp đi lặp lại quá trình hấp phụ và phản hấp phụ Kết quả là các chất có ái lực lớn với pha tĩnh sẽ chuyển động chậm hơn qua hệ thống sắc kí so với các chất tương tác yếu hơn với pha này Nhờ đặc điểm này

mà người ta có thể tách các chất qua quá trình sắc kí

1.3.2 Cơ sở của phương pháp sắc kí

Phương pháp sắc kí dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữa pha động và pha tĩnh Ở điều kiện nhiệt độ không đổi, định luật mô tả sự phụ thuộc của lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh với nồng độ của dung dịch (hoặc với chất khí là áp suất riêng phần) gọi là định luật hấp phụ đơn phân tử đẳng nhiệt Langmuir:

n = Error!

n : Lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh lúc đạt cân bằng

n : Lượng cực đại của chất có thể bị hấp phụ lên một chất hấp

phụ nào đó

b : Hằng số

C : Nồng độ của chất bị hấp phụ

1.3.3 Phân loại các phương pháp sắc kí

Trong phương pháp sắc kí: Pha động là các chất ở trạng thái khí hay lỏng, còn pha tĩnh có thể là các chất ở trạng thái lỏng hoặc rắn

 Theo bản chất của hai pha sử dụng

- Pha tĩnh: Có thể là chất rắn hoặc chất lỏng

+ Pha tĩnh là chất rắn: Thường là alumin hoặc silica gel đã được xử

lý, nó có thể nạp nén vào trong một cột + Pha tĩnh là chất lỏng: Có thể là một chất lỏng được tẩm lên bề mặt một chất mang

- Pha động: Có thể là chất lỏng hoặc chất khí

+ Pha động là chất khí: Thí dụ trong kỹ thuật sắc ký khí Trong truờng hợp này chất khí được gọi là khí mang hay khí vectơ + Pha động là chất lỏng: Thí dụ trong kỹ thuật sắc ký giấy, sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột

 Phân loại sắc ký theo bản chất của hiện tượng xảy ra trong quá trình phân tách chất

- Sắc ký phân chia (partition chromatography)

+ Pha động là chất lỏng hoặc chất khí (trong sắc ký khí)

+ Pha tĩnh là chất lỏng, lớp chất lỏng với chiều dày rất mỏng, chất lỏng này được nối hóa học lên bề mặt của những hạt rắn, nhuyễn

và mịn

- Sắc ký hấp thụ (Adsorption chromatography)

+ Pha động là chất lỏng hoặc chất khí

- Sắc ký trao đổi ion (Ion exchange chromatography)

+ Pha động chỉ có thể là chất lỏng

+ Pha tĩnh là chất rắn, là những hạt hình cầu rất nhỏ, có cấu tạo hóa học là polymer nên gọi là hạt nhựa Bề mặt của hạt mang các nhóm chức hóa học ở dạng ion Có hai loại hạt nhựa: nhựa trao đổi anion và nhựa trao đổi cation

- Sắc ký lọc gel (size exclusion chromatography, gel filtration chromatography)

+ Pha động chỉ có thể là chất lỏng

+ Pha tĩnh là chất rắn, đó là những hạt hình cầu bằng polymer, trên

bề mặt có nhiều lỗ rỗng

- Sắc ký ái lực (arrinicy chromatography)

+ Sắc ký ái lực dựa vào tính bám dính của một protein, các hạt trong cột có nhóm hóa học kết dính bằng liên kết cộng hóa trị Một protein có ái lực với nhóm hóa học này sẽ gắn vào các hạt và

 Phân loại sắc ký theo cấu hình (chromatography configuration)

- Sắc ký giấy và sắc ký lớp mỏng (paper thin – layer chromatography) Trong sắc ký giấy:

+ Pha tĩnh: một tờ giấy bằng cellulos

+ Pha động: là chất lỏng

Trong sắc ký lớp mỏng:

+ Chất hấp phụ thông dụng trong sắc ký lớp mỏng là silica gel, là loại pha tĩnh với tính chất rất phân cực

+ Pha động: luôn luôn là chất lỏng

- Sắc ký cột hở cổ điển (classical open column chromatography)

+ Sắc ký cột hở cổ điển là tên gọi để chỉ loại sắc ký sử dụng một ống hình trụ, được đặt dựng đứng, với đầu trên hở và đầu dưới có gắn một khóa

+ Pha tĩnh rắn được nhồi vào ống hình trụ Mẫu cần tách được đặt lên trên bề mặt của pha tĩnh

+ Pha động là dung môi được liên tục rót vào đầu cột

Dựa vào trạng thái tập hợp của pha động, người ta chia sắc kí thành hai nhóm lớn: sắc kí lỏng và sắc kí khí

Dựa vào cách tiến hành sắc kí, người ta chia sắc kí thành các nhóm nhỏ: sắc kí cột và sắc kí lớp mỏng

1.3.3.1 Sắc kí cột (C.C)

Đây là phương pháp sắc kí phổ biến nhất, đơn giản nhất, chất hấp phụ

là pha tĩnh gồm các loại silica gel (có kích thước hạt khác nhau) pha thường

và pha đảo YMC, ODS, Dianion Chất hấp phụ được nhồi vào cột (cột có thể bằng thuỷ tinh hoặc kim loại, phổ biến nhất là cột thuỷ tinh) Độ mịn của chất hấp phụ rất quan trọng, nó phản ánh số đĩa lí thuyết hay khả năng tách của

kích thước hạt càng nhỏ thì tốc độ chảy càng giảm, có thể gây ra hiện tượng tắc cột (dung môi không chảy được) Khi đó người ta phải sử dụng áp suất,

với áp suất trung bình (MPC) hoặc áp suất cao (HPLC)

Trong sắc kí cột, tỉ lệ đường kính (D) so với chiều cao cột (L) rất quan trọng, nó thể hiện khả năng tách của cột Tỉ lệ L/D phụ thuộc vào yêu cầu tách, tức là phụ thuộc vào hỗn hợp chất cụ thể

Trong sắc kí, tỉ lệ giữa quãng đường đi của chất cần tách so với quãng đường đi của dung môi gọi là Rf , với mỗi một chất sẽ có một Rf khác nhau Nhờ vào sự khác nhau về Rf này mà ta có thể tách từng chất ra khỏi hỗn hợp

Tỉ lệ chất so với tỉ lệ chất hấp phụ cũng rất quan trọng Tuỳ theo yêu cầu tách mà ta có tỉ lệ khác nhau: Tách thô thì tỉ lệ này thấp (1/5 – 1/10), tách tinh thì tỉ lệ này cao hơn và tuỳ vào hệ số tách (tức phụ thuộc vào sự khác nhau Rf của các chất), mà hệ số này trong khoảng 1/20 – 1/30

Trong sắc kí cột, việc đưa chất lên cột hết sức quan trọng Tuỳ thuộc vào lượng chất và dạng chất mà người ta có thể đưa chất lên cột bằng các phương pháp khác nhau Nếu lượng chất nhiều và chạy thô thì phổ biến là tẩm chất vào silica gel rồi làm khô, tơi hoàn toàn, đưa lên cột Nếu tách tinh thì đưa trực tiếp chất lên cột bằng cách hoà tan chất bằng dung môi chạy cột với

lượng tối thiểu

Có hai cách đưa chất hấp phụ lên cột:

Khi chuẩn bị cột phải lưu ý không được để bọt khí bên trong (nếu có bọt khí gây nên hiện tượng chạy rối trong cột, giảm hiệu quả tách) và cột không được nứt, gãy, dò

Tốc độ chảy của dung môi cũng ảnh hưởng đến hiệu quả tách Nếu tốc

độ dòng chảy quá lớn sẽ làm giảm hiệu quả tách Còn nếu tốc độ dòng chảy quá thấp thì sẽ kéo dài thời gian tách và ảnh hưởng đến tiến độ công việc

1.3.3.2 Sắc kí lớp mỏng

Sắc kí lớp mỏng (SKLM) thường được sử dụng để kiểm tra và định hướng cho sắc kí cột SKLM được tiến hành trên bản mỏng tráng sẵn silica gel trên đế nhôm hay đế thuỷ tinh Ngoài ra, SKLM còn dùng để điều chế thu chất trực tiếp Bằng việc sử dụng bản SKLM điều chế (bản được tráng sẵn silica gel dày hơn), có thể đưa lượng chất nhiều hơn lên bản và sau khi chạy sắc kí, người ta có thể cạo riêng phần silica gel có chứa chất cần tách rồi giải hấp phụ bằng dung môi thích hợp để thu được từng chất riêng biệt Có thể phát hiện chất trên bản mỏng bằng đèn tử ngoại, bằng chất hiện màu đặc trưng cho từng lớp chất hoặc sử dụng dung dịch H2SO4 10%

1.4 Một số phương pháp hóa lý xác định cấu trúc của các hợp chất hữu

1.4.1 Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy, IR)

kiểu liên kết được đặc trưng bởi một vùng bước sóng khác nhau Do đó dựa vào phổ hồng ngoại, có thể xác định được các nhóm chức đặc trưng trong hợp chất, ví dụ như dao động hoá trị của nhóm OH tự do trong các nhóm hydroxyl

là 3300 - 3450 cm-1, của nhóm cacbonyl C = O trong khoảng 1700 - 1750 cm-1, của nhóm C = C trong vùng 1630 – 1650 cm-1, của nhóm ete C – O – C trong vùng 1020 – 1100 cm-1, Đặc biệt vùng dưới 700 cm-1 được gọi là vùng vân tay, được sử dụng để nhận dạng các hợp chất hữu cơ theo phương pháp so sánh trực tiếp

Hiện nay, thông tin chung thu được từ phổ hồng ngoại không nhiều, mà lượng chất cần để thực hiện phép đo này lại cần đến 2 – 3 mg chất và khó thu hồi lại Vì vậy, thường đối với các hợp chất thiên nhiên (lượng chất thu được ít) thì phổ hồng ngoại được đo sau khi đã hoàn chỉnh các phép đo khác

1.4.2 Phổ khối lượng (Mass Spectroscopy, MS)

Nguyên tắc của phương pháp phổ này là dựa vào sự phân mảnh ion của phân tử chất dưới sự bắn phá của chùm ion bên ngoài Phổ MS còn cho các pic ion mảnh khác mà dựa vào đó người ta có thể xác định được cơ chế phân mảnh và dựng lại được cấu trúc hoá học của các hợp chất Hiện nay có rất nhiều loại phổ khối lượng, như những phương pháp chủ yếu sau:

- Phổ EI-MS (Electron Impact Ionization Mass Spectroscopy) dựa vào

sự phân mảnh ion dưới tác dụng của chùm ion bắn phá năng lượng khác nhau, phổ biến là 70eV

- Phổ ESI-MS (Electron Sprayt Ionization Mass Spectroscopy) gọi là

phổ phun mù điện tử Phổ này được thực hiện với năng lượng bắn phá thấp hơn nhiều so với phổ EI-MS, do đó phổ thu được chủ yếu là pic ion phân tử

và các pic đặc trưng cho sự phá vỡ các liên kết có mức năng lượng thấp, dễ bị phá vỡ

- Phổ FAB-MS (Fast Atom Bombing Mass Spectroscopy) là phổ bắn

phá nguyên tử nhanh với sự bắn phá nguyên tử nhanh ở năng lượng thấp, do

đó phổ thu được cũng dễ thu được pic ion phân tử