môi trường nuôi cấy phân lập và giám định vi khuẩn 1

Phân loại môi trườngtrường tổng hợp Căn cứ mục đích và phương pháp sử dụng của môitrường : môi trường cơ sở , môi trường dinhdưỡng... Nhu cầu các chất dinh dưỡng và khả năng đồng hóa của

CHUYÊN ĐỀ:

Các loại môi trường nuôi cấy phân

lập và giám định vi khuẩn

Phân loại môi trường

trường tổng hợp

Căn cứ mục đích

và phương pháp

sử dụng của môitrường : môi

trường cơ sở , môi trường dinhdưỡng

Nhu cầu các chất dinh dưỡng và khả năng đồng hóa của vsv

Cân bằng áp suất thẩm thấu giữa môi trường và tế bào vsv( tỷ lệ và các chất dinh dưỡng trong môi trường)

Đảm bảo các điều kiện lý hóa cho hoạt động trao đổi chất của vsv

NGUYÊN

TẮC

trường vào nồi, đun nóng cho tan.

1.Môi trường thạch thường

Khuẩn lạc mọc trên thạch thường

- Cho thạch sợi đã rửa sạch cắt nhỏ vào nồi Hấp 120⁰C/30phút

- Kiểm tra lại pH 7,4- 7,6

- Lọc qua giấy lọc hoặc bông vào bình cầu khi môi trường còn nóng

1.Công thức:

2 Tiến hành

-Đun nóng chảy 250 mL môi trường thạch thường đựng

trong bình cầu, để nguội 50⁰C

vào bình thạch trên ngọn lửa đèn cồn

nằm nghiêng cho thạch đông

3 Yêu cầu

đĩa thạch có độ dày vừa phải xấp xỉ 4 mm, ống thạch có

chân, lưỡi

2 Môi trường thạch máu

Môi trường thạch

máu

1 Công thức.

- Thịt bò, thịt lợn hoặc thịt trâu: 500g

2 Tiến hành.

thỉnh thoảng khuấy đều

2 Tiến hành

- Đun sôi hoà tan hoàn toàn các thành phần, điều chỉnh pH 7,4-7,6

- Hấp 121 o C/15 phút Để nguội 45-50 0 C, cho 50ml máu vào quay tròn bình cho máu hòa tan đều trong thạch

- Cho vào đun cách thủy 80 0 C/10 phút, chú ý luôn lắc tròn bình thạch.

- Để nguội 45-50 0 C đổ 20ml/đĩa.

3 Yêu cầu

- Chocolate agar suất hiện mờ đục và màu nâu.

4.Bảo quản

- Môi trường đổ đĩa được bảo quản ở 4 0 C

4.Môi trường chocolate agar

5 Môi trường canh thang thường

- Cân,đun sôi, lắc đều cho tan hết các thành phần.

- Điều chỉnh PH = 7,8 – 8 bằng dung dịch NaCl 20%

- Hấp 120 0 C/30p, để nguội cho lắng cặn.

- Chắt lấy nước trong, điều chỉnh PH= 7,4 - 7,6.

- Đun sôi, lọc qua giấy.

- Đóng ống nghiệm đã vô trùng mỗi ống 5ml sau đó hấp 110 0 C.

3 Yêu cầu.

Môi trường phải trong, màu vàng nhạt hoặc vàng sẫm, ống môi trường

không quá ít hoặc quá nhiều

- Nhỏ tiếp 0,6 mL đỏ trung tính 1%, khuấy đều

- Phân phối vào bình cầu, hấp 110°C 30 phút

- Để nguội 50°C, đổ đĩa petri.

7.Môi trường manit di động

- Cho dung dịch đỏ phenol

- Đóng vào ống 12 mm, mỗi ống khoảng 3 mL

8 Môi trường Nutrient Agar

- Thạch dinh dưỡng cũng thường được dùng làm môi

trường lưu giữ chủng.

- Thạch dinh dưỡng có chứa các chất dinh dưỡng

động vật và đặc biệt là hàm lượng protein thấp. Môi trường Nutrient Agar

9 Môi trường Muller-Hinton Agar

1 Công thức

+ 30% truyền thịt bò

+ 1.75% casein

2 Cách tiến hành

-Hòa tan 38g vào 1 lít nước cất, đun sôi hỗn hợp đến khi hòa tan hoàn

toàn rồi tiệt trùng bằng nồi hấp ở nhiệt độ 121°C trong 15 phút

3 Bảo quản

- Bảo quản Mueller Hinton Agar khô ở môi trường 10 – 30°C và pha chế

trước thời hạn sử dụng

- lưu trữ ở nhiệt độ 2 – 8°C

4.Ứng dụng của môi trường

- Mueller Hinton Agar với 5% máu đã tách fibrin làm môi trường cho

phương pháp thử nghiệm tính nhạy cảm đĩa tiêu chuẩn quốc tế.

+ 0.15% tinh bột + 1.7% agar

Môi trường Hinton Agar

Muller-10 Môi trường Esculin Agar

- Cho 56.6g bột cho vào 1 lít nước cát và đun sôi

- Hấp ở 121°C trong 15 phút Để ở 50-60 °C và dổ vào tấm có độ dày

3-5mm

- Lưu trữ ở 2-8°C khoảng 2 tuần

3 Bảo quản

-Cấy vi khuẩn là phần riêng nghiêng của môi trường Ủ ở 35°C trong

điều kiện hiếu khí và quan sát sự phát triển, môi trường có màu đen cho

thấy có sự thủy phân esculin.

4 Ứng dụng

- Phân biệt khả năng thủy phân esculin của vi khuẩn

-Ferric citrate: 0.5g -Agar: 15g

-Nước cất; 1 lit

Môi trường Esculin

Agar

11.Môi trường Simmons Citrate

1 Công thức

- Ammoinium dihydrogen phosphate: 1g

- Dipotassium hydrogen phosphate: 1g

- Nacl: 5g

2 Tiến hành

-Lấy 23g trong 1 lít nước cất

- Đun sôi để hòa tan hoàn toàn

- Tiệt trùng bằng nôi hấp ở 121 °C trong thời gian 15 phút

3 Ứng dụng

Phân biệt các loại vi khuẩn dựa vào khả năng sử dụng citrate

( nguồn CO2 duy nhất của chủng phân lập)

4.Yêu cầu

-Có màu xanh nước biển

-Sodium citrate: 2g -MgSo4: 0.2 g

-Bromothymol blue : 0.08g -Agar: 13g

Môi trường Simmons

Citrate

12.Môi trường Kligler Iron Agar (KIA)

Môi trường Tủ ấm Sinh vật kiểm tra Kết quả mong đợi

Thạch máu

(Blood Agar) 24h,CO2

S aureus Phát triển và tan máu hoàn toàn

S.pneumoniae Phát triển và tan máu không hoàn toàn Thạch Chocolate 24h,CO2 H.influenzae Phát triển

Thạch MacConkey với crystal

violet 24h

E.coli Khuẩn lạc có màu đỏ

P.mirabilis Khuẩn lạc không màu

E.faecalis Không phát triển Methyl red/Voges-Proskauer 48h

E.coli (+)/(-)

K.pneumoniae (-)/(+) Mueller-Hinton

Agar 24h

E.coli ATCC 25922 Độ lớn của vòng vô khuẩn

P.aeruginosa ATCC 27853 Độ lớn của vòng vô khuẩn Peptone water (indole) 24h E.coli (+)

K.pneumoniae (-) Thạch Simmons citrate 48h

E.coli Không phát triển

K.pneumoniae Phát triển và sinh sắc tố sanh nước biển Thạch Thiosulfate citrate bile salt

(TCBS) 24h Vibrio spp.( Không dính) Khuẩn lạc màu vàng

Thayer Martin Agar 24h, CO2

N.meningitidis Phát triển

N.gonorrhoeae Phát triển

Staphylococci Không phát triển

E.coli Không phát triển

1.Môi trường Istrati

- Để thạch nguội 45- 500C, đổ đĩa petri, bảo quản ở tủ lạnh

3 Yêu cầu:

Môi trường có màu xanh cỏ úa, mịn, độ dày vừa phải

2.Môi trườngSalmonella- Shigella agar

- Xanh brilan (dung dịch 0,1% trong nước): 0,3 mL.

- Đỏ trung tính (dung dịch 1% trong nước): 2,5 mL.

- Thạch: 20 g.

- Nước cất: 1000 mL.

Khuẩn lạc mọc trên môi trường SS

2.Môi trườngSalmonella- Shigella agar

(SS)

2.Pha chế:

- Chuẩn bị đủ dụng cụ: ống đong, bình cầu, cân, pipet, đĩa petri, đèn cồn

- Chuẩn bị đủ hoá chất dùng cho môi trường.

- Cân, đong đủ các thành phần môi trường vào bình cầu.

- Đun sôi nhỏ lửa, lắc đều cho tan hết các chất.

3.Môi trường Macconkey

3.Môi trường Macconkey

2.Pha chế:

- Chuẩn bị đủ dụng cụ: ống đong, bình cầu, cân, pipet, nồi nhôm, đĩa petri, đèn cồn.

- Chuẩn bị đủ hoá chất để pha chế môi trường.

- Cân, đong đủ các thành phần của môi trường cho vào nồi.

- Đun nhỏ lửa, khuấy đều cho tan các chất.

- Điều chỉnh pH 7,2- 7,4.

- Nhỏ tiếp 0,6 mL đỏ trung tính 1%, khuấy đều

- Phân phối vào bình cầu, hấp 110°C 30 phút

- Để nguội 50°C, đổ đĩa petri.

3 Yêu cầu :

Môi trường có màu hồng sẫm, các đĩa thạch không có nước, đủ độ dày.

4.Môi trường Brilliant Green

1 Công thức

+Chiết xuất nấm men

+Enzyme tiêu hóa của casein

+Enzyme tiêu hóa của mô

+Agar

Môi trường brilliant

green

5.Môi trườngTryptic Soya Agar

Đun nóng chảy các thành phần nêu trên, sau đó

Chuyển môi trường vào các ống nghiệm hoặc

6.Môi trường Triple Sugar Iron ( TSI )

Môi trường TSI

6.Môi trường Triple Sugar Iron ( TSI )

2 Dụng cụ

-Đĩa petri, ống nghiệm

-Ống đong, bình cầu, cân, giấy lọc, đèn cồn, nồi nhôm và các loại hoá chất.

3.Cách tiến hành

- Hòa tan các thành phần trên hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước, đun nóng nếu cần.

- Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng là 7,4 ± 0,2 ở 25°C Chuyển các thể tích 10 ml hỗn dịch này vào các ống nghiệm hoặc các đĩa Hấp trong 15 phút ở nhiệt độ 121°C

4.Yêu cầu

Đặt nghiêng để thạch có bề dày trên đáy từ 2,5 cm đến 5 cm.

+ Lấy 55g cho vào 1000ml nước cất

+ Đun cho đến khi sôi để nguội ở 50°C

8.Môi trường Endo

- Đóng bình cầu, mỗi bình khoảng 300 mL, hấp 110°C/ 20 phút.

- Để môi trường nguội 50°C, đổ đĩa.

Phương pháp giám định

Giám định vi khuẩn là để xác dịnh chủng vi khuẩn

+ Cấy khuẩn lạc trên môi trường điển hình để giám định + làm tiêu bản, nhuộm và quan sát trên kính hiển vi

+ Làm các phản ứng sinh hóa

Phương pháp giám định

1.Thử nghiệm Citrate

-Mục đích : Xác định khả năng vi sinh vật sử dụng nguồn

citrate như nguồn cacbon duy nhất

-Cơ sở sinh hóa : VSV sử dụng citrate sinh ra CO2 làm

kiềm hóa môi trường, sử dụng muối ammonium là nguồn

đạm duy nhất tạo ra NH3 làm kiềm hóa môi trường

-Trên môi trường Simmon citrate agar khi cấy vi khuẩn vào

môi trường ở nhiệt độ 35-37 trong 24h

Chú ý : cấy lượng sinh khối vừa đủ ,có đối chứng đi kèm

Kết quả

2 thử nghiệm catalase

-Mục đích: phát hiện các vi sinh vật có hệ enzyme catalase

-Cơ sở sinh hóa: Catalase hiện diện ở các VSV hiếu khí và kỵ khí tùy tiện

-Tiến hành : lấy ít vi khuẩn cho vào đĩa nhỏ oxy già

+ phản ứng dương tính có bọt khí

+ phản ứng âm tính không có bọt khí

Phương pháp giám định

2 thử nghiệm catalase

Phương pháp giám định

1.thử nghiệm khả năng sinh Idol

-Mục đích: phát hiện VSV có khả năng sinh idol từ các VSV có hệ enzyme tryptophanse

Phương pháp giám định

Là phản ứng phân biệt

+ E coli (+) với Klebsiella (-)

+ Proteus mirabilis (-) với Proteus khác (+)

+ Bacillus alvei (+) với Bacillus khác (-)

Đối chứng (+) Proteus rettgeri

(-) Seratia marcescens

Phương pháp giám định

1.thử nghiệm khả năng sinh Idol

Quy trình Vi sinh vật Phản ứng mong đợi

Coagulase S aureus + Tạo thành vón cục sau 4 gìơ

Oxidase P.aeruginosa + Màu tím trong vòng 20 giây

Đĩa Oxidase P.aeruginosa + Màu tím trong vòng 30 giây

Tài liệu tham khảo

 http://www.vetbact.org/vetbact/?showgrowthmedia=1



http://www.visinhyhoc.net/cac-moi-truong-nuoi-cay-phan-lap-vi-khuan-gay-benh/

 http://xetnghiemdakhoa.com/diendan/printthread.php?tid=522