Nghiên cứu chế phẩm xử lý nước thải nhà máy rượu Đồng Xuân, Tỉnh Phú Thọ (luận văn thạc sĩ)

Nghiên cứu chế phẩm xử lý nước thải nhà máy rượu Đồng Xuân, Tỉnh Phú Thọ (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu chế phẩm xử lý nước thải nhà máy rượu Đồng Xuân, Tỉnh Phú Thọ (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu chế phẩm xử lý nước thải nhà máy rượu Đồng Xuân, Tỉnh Phú Thọ (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu chế phẩm xử lý nước thải nhà máy rượu Đồng Xuân, Tỉnh Phú Thọ (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu chế phẩm xử lý nước thải nhà máy rượu Đồng Xuân, Tỉnh Phú Thọ (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu chế phẩm xử lý nước thải nhà máy rượu Đồng Xuân, Tỉnh Phú Thọ (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu chế phẩm xử lý nước thải nhà máy rượu Đồng Xuân, Tỉnh Phú Thọ (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu chế phẩm xử lý nước thải nhà máy rượu Đồng Xuân, Tỉnh Phú Thọ (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu chế phẩm xử lý nước thải nhà máy rượu Đồng Xuân, Tỉnh Phú Thọ (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu chế phẩm xử lý nước thải nhà máy rượu Đồng Xuân, Tỉnh Phú Thọ (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu chế phẩm xử lý nước thải nhà máy rượu Đồng Xuân, Tỉnh Phú Thọ (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu chế phẩm xử lý nước thải nhà máy rượu Đồng Xuân, Tỉnh Phú Thọ (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu chế phẩm xử lý nước thải nhà máy rượu Đồng Xuân, Tỉnh Phú Thọ (luận văn thạc sĩ)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

LÊ THỊ BÍCH HẰNG

NGHIÊN CỨU CHẾ PHẨM XỬ LÝ NƯỚC THẢI

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

Chương I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 8

1.1- KHÁI NIỆM VÀ PHÂN LOẠI NƯỚC THẢI 3

1.1.1- Khái niệm: 3

1.1.2 Phân loại nước thải: 8

1.1.3 Các hiện tượng ô nhiễm nước 9

1.1.3.3- Ô nhiễm về mặt sinh học 12

1.1.4 Các chỉ tiêu đánh giá độ nhiễm bẩn của nước thải 12

1.2 Đặc tính của nước thải nhà máy rượu Đồng Xuân - Phú Thọ 13

1.3 Các biện pháp xử lý nước thải 14

1.3.1 Phương pháp cơ học 14

1.3.2 Phương pháp hóa học 15

1.3.3 Phương pháp hóa lý 15

1.3.4 Phương pháp xử lý sinh học: 16

1.3.4.1 Phương pháp xử lý hiếu khí 17

1.3.4.2 Phương pháp thiếu khí (anoxic) 19

1.3.4.3 Quá trình khị khí (anaerobic) 20

1.4 CHẾ PHẨM SINH HỌC 25

1.4.1 Các vi sinh vật quan trọng trong xử lý nước thải 25

1.4.2 Các chất hữu cơ và các enzym vi sinh vật phân giải chúng 26

1.4.2.1 Tinh bột và enzym amylaza 27

1.4.2.2 Xenluloza và enzym xenlulaza 28

1.5 Tình hình nghiên cứu chế phẩm sinh học trong nước và ngoài nước 29

1.5.1.Trong nước 29

1.5.2 Ngoài nước: 31

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 32

2.1 NGUYÊN LIỆU 32

2.1.1 Vi sinh vật 32

2.1.2 Hoá chất 32

2.1.3 Thiết bị, dụng cụ 32

2.1.4 Môi trường (xem phụ lục) 32

2.2 PHƯƠNG PHÁP 32

2.2.1 Phương pháp phân lập và tuyển chọn vi sinh vật 32

2.2.1.1 Phân lập vi sinh vật 32

2.2.1.2 Tuyển chọn các chủng vi sinh vật 33

2.2.2 Phương pháp xác định hoạt tính enzym và hoạt tính kháng sinh 33

2.2.3 Xác định sinh khối bằng phương pháp đo mật độ quang học – OD (optical density) 34

2.2.4 Phương pháp đếm số lượng tế bào 34

2.2.5 Phương pháp xác định vi khuẩn G(+) hay G(-) 34

2.2.7 Phương pháp xác định ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy đến khả năng tổng hợp enzym và kháng sinh 35

2.2.8 Ảnh hưởng của một số yếu tố đến hoạt tính enzym 35

2.2.9 Xác định tính đối kháng 36

2.2.10 Phương pháp tạo chế phẩm 36

2.2.11 Phương pháp xác định một số đặc điểm sinh học của vi khuẩn 36

2.2.12 Phân loại theo sinh học phân tử 37

2.2.13 Xác định nhu cầu oxy hóa hóa học (COD) (ISO 8245:1987(E)) 40

ml mẫu 40

2.2.14.Xác định nhu cầu oxy hóa sinh hóa (BOD 5 ) [60] 41

2.2.15 Xác định oxy hóa hòa tan (DO) (ISO 8245: 1987) 41

2.2.16 Xác định chất rắn tổng số (TS) (ISO 8245:1987) 41

2.2.17 Xác định chất rắn huyền phù: 42

2.2.19 Xác định pH 42

2.2.20 Xác định các vi sinh vật sống trong nước thải 42

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 44

3.1 VI KHUẨN PHÂN GIẢI HỢP CHẤT HỮU CƠ 44

3.1.1 Tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng sinh enzym cao 44 3.1.2 Phân loại các chủng vi khuẩn được lựa chọn 45

3.1.2.1 Phân loại theo phương pháp truyền thống 45

3.1.3 Lựa chọn các điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sinh tổng hợp enzym 50

3.1.3.1 Lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp 50

3.1.3.2 Lựa chọn pH nuôi cấy thích hợp 53

3.1.3.3 Lựa chọn nhiệt độ nuôi cấy thích hợp 54

3.1.3.4 Lựa chọn thời gian nuôi cấy thích hợp 55

3.1.3.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của enzym 56

3.1.3.6 Ảnh hưởng của pH đến độ bền enzym 57

3.1.3.7 Ảnh hưởng của thời gian đến độ bền enzym 59

3.1.3.8 Khả năng sinh kháng sinh của ba chủng 60

3.2 BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM 61

3.2.1 Tính đối kháng của các chủng 61

3.2.2 Quy trình lên men dịch: 61

3.2.2.1 Tỷ lệ giống thích hợp đối với lên men dịch 61

3.2.2.2.Hệ thống xử lý nước thải tại nhà máy 62

3.2.2.3 Tỷ lệ chế phẩm 63

3.2.2.4 Thử nghiệm xử lý nước thải bằng phương pháp hiếu khí quy mô 100 lít 65

3.3 Quy trình lên men xốp: 67

3.3.1 Lựa chọn chất mang cho lên men xốp 68

3.3.2 Tỷ lệ thích hợp đối với lên men xốp 69

3.3.3 Thời gian ủ thích hợp đối với lên men xốp 70

3.3.4 Thử nghiệm xử lý nước thải với chế phẩm lên men xốp trong phòng thí nghiệm 70

KẾT LUẬN 72 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

mà ngày nay nguồn nước trên hành tinh chúng ta đang bị đe dọa Các hoạt động công nghiệp từng ngày từng giờ thải vào các dòng sông hàng ngàn tấn chất bẩn và độc hại Các hoạt động của con người cũng tạo nên sự ô nhiễm nghiêm trọng Con người dùng nguồn nước để sống nhưng cũng thải vào nguồn nước những sản phẩm độc hại đầu độc lại chính mình

Nước ta thực hiện sự nghiệp công nghiệp hóa, hiện đại hóa đất nước, theo đó nhiều khu công nghiệp, chế xuất với hàng nghìn nhà máy, doanh nghiệp ra đời, song do công tác xây dựng hạ tầng kỹ thuật thiếu đồng bộ, trong đó khá nhiều nơi ít quan tâm đến việc xử lý chất thải, cho nên hàng nghìn tấn chất thải rắn, lỏng… hàng năm cứ thể đổ vào các ao hồ sông suối gây ô nhiễm trầm trọng tới nguồn nước, đây là mầm mống gây ra các bênh

cạn kiệt và thiếu hụt nghiêm trọng Điều đó khiến cho việc cung cấp nước cho con người trở thành vấn đề hết sức khó khăn Chính vì vậy, xử lý nước thải để

có thể quay vòng cho nước trở lại đang là một vấn đề được chú trọng nghiên cứu mang lại cuộc sống tốt cho con người

Trong một quy trình công nghệ xử lý nước thải bao gồm nhiều công trình và thiết bị nối tiếp theo đặc tính kỹ thuật có thể chia làm ba loại: Cơ học, hóa học và sinh học, trong đó xử lý sinh học là quy trình xử lý nước thải lợi dụng sự hoạt động, sống và sinh trưởng của vi sinh vật để đồng hóa các chất hữu cơ trong chất thải, biến các chất hữu cơ thành khí và vỏ tế bào của vi sinh vật để loại khỏi nước

Trên Thế giới, vấn đề nghiên cứu bảo vệ môi trường đã được chú ý từ lâu, nhiều nước đã đưa ra được công nghệ và thiết bị tiến tiến, đã hướng đến một nền sản suất nước sạch, nghiên cứu và đã tạo ra những chế phẩm sinh học làm sạch môi trường nước bị ô nhiễm như chế phẩm EM của Nhật hoặc GEM…

Nghiên cứu và phát triển chế phẩm sinh học tại Việt Nam chỉ thực sự phát triển từ năm 1995, các trung tâm nghiên cứu ngày càng chú trọng trong việc phát triển và phát minh các loại chế phẩm mới phục vụ cho hoạt động sản xuất kinh tế và bảo vệ môi trường…

Nhà máy Cồn, Rượu Sài Gòn- Đồng Xuân tại Thanh Ba- Phú Thọ được thành lập 15/9/1965, chuyên sản xuất cồn thực phẩm công xuất 1,5 triệu lít cồn, 3 triệu lít rượu phục vụ cho đời sống dân sinh và xuất khẩu Do đó hàng

rượu có nhiều chất hữu cơ và các yếu tố vi lượng, đồng thời không có những độc tố, rất thích hợp cho vi sinh vật sống và phát triển, đây chính là cơ sở cho việc xử lý nước thải công nghiệp sản suất rượu bằng phương pháp sinh học Mặc dù nhà máy đã xây dựng hệ thống xử lý nước thải nhưng chưa triệt để,

hệ thống xử lý nước thải của nhà máy cũng được xây dựng bao gồm quy trình

xử lý sinh học nhưng còn đơn giản, lượng nước thải ra sau khi xử lý vẫn chưa đạt được mức tiêu chuẩn cho phép

Để góp phần hỗ trợ vào việc xử lý nước thải cho nhà máy rượu, tạo ra nguồn nước thải sạch có thể tái sử dụng cho con người chúng tôi đã tiến hành

đề tài “ Nghiên cứu chế phẩm xử lý nước thải nhà máy rượu Đồng Xuân,

Tỉnh Phú Thọ ”

Chương I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1- KHÁI NIỆM VÀ PHÂN LOẠI NƯỚC THẢI

1.1.1- Khái niệm:

Nước thải là nước được tạo ra trong quá trình sử dụng hoặc được tạo ra trong quá trình công nghệ và không còn giá trị trực tiếp đối với quá trình công nghệ đó nữa [13]

1.1.2 Phân loại nước thải:

Có một số cách phân loại nước thải đó là:

học, ô nhiễm vi sinh vật, ô nhiễm nhiệt và ô nhiễm phóng xạ)

Tùy theo nguồn thải ra mà người ta phân loại nước thải sinh hoạt, nước thải công nghiệp hay nước thải nông nghiệp [20]

Nước thải sinh hoạt

Nước thải sinh hoạt là nước thải của một cộng đồng dân cư, được thải

ra từ các hộ gia đình, bệnh viện, khách sạn, trường học cơ quan, có chứa đựng các chất thải trong quá trình sống của con người [16]

Đặc điểm của nước thải sinh hoạt là chứa nhiều chất hữu cơ dễ phân hủy sinh học (hydratcacbon, protein, lipit), có nguồn gốc từ động thực vật, là nguồn cung cấp chất dinh dưỡng đối với vi sinh vật…Nước thải bao gồm 99,9% nước và 0,1% chất rắn trong đó khoảng 58% là chất hữu cơ, 42% là chất vô cơ và một lượng lớn các vi sinh vật Các chất vô cơ phân bố ở dạng tiềm tan nhiều hơn so với các chất hữu cơ Các chất hữu cơ phân bố ở dạng keo và không tan [36]

Nước thải công nghiệp

Nước thải công nghiệp được thải ra từ các cơ sở sản xuất công nghiệp, tiểu thủ công nghiệp, giao thông vận tải… Đặc điểm của nước thải công

nghiệp là có chứa các chất độc hại, các kim loại nặng, các chất hữu cơ khó phân hủy sinh học (phenol, chất hoạt động bề mặt…), các chất hữu cơ dễ phân hủy sinh học từ các cơ sở sản xuất công nghiệp thực phẩm… Mỗi loại nước thải từ các quy trình sản xuất công nghiệp khác nhau thì có tính chất khác nhau [40]

Tính chất đặc trưng của nước thải một số ngành công nghiệp như sau:

Bảng 1.1: Tính chất đặc trưng của một số ngành công nghiệp

hợp

Sản suất thịt hộp

1.1.3 Các hiện tượng ô nhiễm nước

Hiện tượng ô nhiễm nước thể hiện ở mặt vật lý hóa học và sinh học [36]

1.1.3.1- Ô nhiễm vật lý:

Hiện tượng ô nhiễm về mặt vật lý thể hiện ở màu sắc, độ đục của nước,

và hiện tượng nhiễm nhiệt

- Ô nhiễm màu thường do các chất hữu cơ màu gây nên, tuy nhiên cũng

có một số chất vô cơ có màu đậm, đặc biệt là những hợp chất chứa sắt và crom

- Độ đục nước: Các chất gây đục cho nước bao gồm cả chất vô cơ và hữu cơ Các chất hữu cơ trong nước được dùng làm thức ăn cho vi sinh vật

Sự phát triển của vi sinh vật lại gây thêm độ đục cho nước.Những chất dinh dưỡng vô cơ (như nitơ và phốtpho) có mặt trong nước thải từ vùng sản suất nông nghiệp sẽ làm thúc đẩy sự phát triển của tảo vì vậy làm cho độ đục của nước tăng lên

- Ô nhiễm nhiệt độ: nước thải ra từ các nhà máy nhiệt điện, nước làm sạch các máy móc, nước sản xuất thường có nhiệt độ cao làm cho nhiệt độ ở các thủy vực tăng lên (nước thải của các quá trình làm lạnh thường có nhiệt

độ làm giảm nồng độ oxy hòa tan trong nước gây ra tình trạnh kỵ khí Tình trạng kỵ khí do nhiệt độ tăng tạo điều kiện cho sản sinh các sản phẩm phân hủy độc hại và do vậy hiện tượng ô nhiễm ngày càng trở nên trầm trọng hơn

Bảng 1.2: Các đặc tính vật lý, hóa học, sinh học của nước thải và các nguồn thải Đặc tính Nguồn thải

Vật lý

Màu

Mùi

Chất rắn

Nước thải sinh hoạt, công nghiệp, do sự thối giữa

tự nhiên của các hợp chất hữu cơ

Do sự phân rã của các hợp chất hữu cơ trong nước thải

Từ nước thải sinh hoạt, công nghiệp hay do sự sói mòn đất

Nước thải công nghiệp

Từ nước thải sinh hoạt, công nghiệp, các khu thương mại

Do sự thối giữa tự nhiên của các chất hữu cơ

Từ nước thải sinh hoạt

Từ nước thải sinh hoạt Nước thải công nghiệp

Từ nước thải sinh hoạt, công nghiệp, các khu thương mại

Từ nước thải sinh hoạt, công nghiệp, các khu thương mại

Từ các sông suối tự nhiên và các nhà máy xử lý

Từ các sông suối tự nhiên và các nhà máy xử lý Nước thải sinh hoạt

Nước thải sinh hoạt

- Ô nhiễm do các hợp chất vô cơ ví dụ như kim loại nặng như As, Cd,

Cr, Cu, Pb, Mn, Hg, Zn…

- Ô nhiễm các hợp chất hữu cơ về khả năng phân hủy sinh học có thể chia làm hai loại như sau: chất hữu cơ dễ phân hủy sinh học(hydratcacbon, protein, chất béo…) và chất hữu cơ khó phân hủy sinh học (hydrocacbon vòng thơm, các chất đa vòng ngưng tụ…) Trong thành phần hữu cơ từ nước thải sinh hoạt có khoảng 40-60% protein, 25-50% hydrocacbon, 10% chất béo Trong số các chất thải hữu cơ thì đặc biệt nguy hiểm là các thuốc trừ sâu còn dư thừa và tích đọng trong đất nước gây tác hại nghiêm trọng đến sức khỏe của cộng đồng [32]

Hiện tượng ô nhiễm hóa học còn thể hiện ở các đặc tính về mùi và vị của nước Nước thải công nghiệp chứa nhiều chất hữu cơ hóa học như muối sắt, mangan, clo tự do, hydrosunfua, các phenol và những hydrocacbon không

no …làm cho nước có vị không tốt Mùi của nước thường được gây ra do những chất có mùi mạnh như amoniac, các phenol, các sunfua, xyanua…Ngoài ra sự có mặt của nhiều loại rong tảo và những động, thực vật khác đang bị thối giữa làm cho nước có mùi hôi thối rất khó chịu [33]

1.1.3.3- Ô nhiễm về mặt sinh học

Tác nhân gây ô nhiễm sinh học thường là các vi khuẩn gây bệnh, một

số loại nấm, tảo,virut, động vật nguyên sinh, các loại giun ký sinh và bất cứ loại động vật nào do một nguyên nhân nhất định mà sinh sôi trong nước hoặc

có tính chất gây hại [16]

1.1.4 Các chỉ tiêu đánh giá độ nhiễm bẩn của nước thải

Các chỉ tiêu cơ bản đánh giá độ nhiễm bẩn của nước thải là nồng độ hợp chất chứa trong nước được đặc trưng bởi: Nhu cầu oxy sinh hóa (Biochemical Oxygen Demand – BOD), nhu cầu oxy hóa hóa học (Chemical Oxygen Demand – COD) Chất rắn tổng số (Total Solids – TS) và chất huyền phù (Suspendend Solids–SS)… [18,19,24,33]

- Nhu cầu oxy hóa (BOD – Biochemical Oxygen Demand)

Nhu cầu oxy sinh hóa là lượng oxy sử dụng để oxy hóa sinh hóa hiếu khí các hợp chất hữu cơ trong thời gian nhất định để đảm bảo cho quá trình oxy hóa diễn ra Để oxy hóa hòa tan hoàn toàn 21-28 ngày Nói chung người ta xác

Oxy hóa sinh học thể hiện qua phản ứng sau đây:

BOD được dùng để đánh dấu độ nhiễm bẩn của nước thải, BOD càng lớn thì

độ nhiễm bẩn càng lớn Đơn vị tính BOD thường sử dụng là mg/l Trong hệ

chất rắn ở dạng hòa tan và lơ lửng có trong nước thải TS được tính bằng khối

C -

lượng chất rắn lơ lửng có trong nước thải được giữa trên giấy lọc và được sấy

1.2 Đặc tính của nước thải nhà máy rượu Đồng Xuân - Phú Thọ

Nước thải công nghiệp sản xuất rượu gồm:

lớn nhưng ít ô nhiễm

VSV

- Nước rửa thiết bị dịch hóa, đường hóa tinh bột, thiết bị nấu rượu, nước làm lạnh, nước rửa thiết bị lọc, rửa bã chứa nhiều tinh bột

nhiều xác nấm men

chính nhà máy dùng để nấu rượu là sắn có thành phần chủ yếu là tinh bột và xenluloza nên bã malt cũng gồm chủ yếu là tinh bột và xenluloza còn lại sau khi nấu rượu

Nói chung nước thải nhà máy rượu không chứa các độc tố và dễ bị phân hủy bởi vi sinh vật

- Nhà máy đã xây dựng hệ thống xử lý nước thải theo phương pháp sinh học, hệ thống xử lý cũng bao gồm có bể khị khí và bể hiếu khí, tuy nhiên nước thải ra sau quá trình xử lý vẫn chưa đạt chỉ tiêu cho phép, nước có mùi rất hôi, và màu nâu đậm Vì đây là nước mà nhà máy cho là đã xử lý nên sau

đó được thải ra các cống rãnh xung quanh, đặc biệt ở gần khu vực đó có rất nhiều nhân cư sinh sống gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến đời sống của người dân

chất không tan hay tạp chất cơ học trong nước thải Các tạp chất này có thể là

vô cơ hay hữu cơ [5]

Các phương pháp thường dùng là: Lọc qua lưới, lắng, xyclon thủy lực, lọc cát, ly tâm

1.3.2 Phương pháp hóa học

Cơ sở của phản ứng hóa học là các phản ứng hóa học của các chất bẩn

có trong nước thải và hóa chất cho thêm vào Những phản ứng diễn ra thường

là phản ứng oxy hóa, trung hòa, keo tụ và nhiều hiện tượng vật lý khác [5] Các phương pháp ozon hóa có khả năng đạt được hiệu suất cao do ozon là chất oxy hóa mạnh, dễ dàng nhường đi oxy nguyên tử

Thực chất của phương pháp hóa học là nhờ các phản ứng oxy hóa khử

mà các chất bẩn chất độc hại trong nước được chuyển thành các chất không độc hại, một phần ở dạng cặn, một phần ở dạng khí Vì vậy để khử các chất độc hại trong nước thải thường dùng nhiều phương pháp nối tiếp: oxy hóa khử - lắng cặn- hấp phụ

1.3.3 Phương pháp hóa lý

Cơ sở của phương pháp này trong xử lý nước thải là dựa trên quá trình keo tụ, hấp phụ, trích ly, tuyển nổi, trao đổi ion, tinh thể hóa, màng bán thấm… [6]

chất keo tụ để liên kết chất bẩn dạng lơ lửng và kết chúng thành các bông có khích thước lớn hơn, các bông này khi lắng xuống sẽ khéo theo các chất không tan trong nước xuống theo

cách tập trung các chất đó trên bền mặt chất mang

- Trích ly: Là tách các chất bẩn hòa tan khỏi nước thải bằng dung môi, dung môi này không tan trong nước và độ hòa tan của chất bẩn trong dung môi phải cao hơn trong nước

trong đó phải bay hơi theo hơi nước

- Tuyển nổi: Dùng các tác nhân tuyển nổi để thu hút và kéo các chất bẩn lên mặt nước, sau đó loại tác nhân tuyển nổi và chất bẩn khỏi nước Khi tuyển nổi thường dùng các hạt khí nhỏ, phân tán và bão hòa trong nước thải Các hạt chất bẩn có bám bọt khí nhẹ dần sẽ nổi lên

Các vi sinh vật quan trọng trong xử lý nước thải sinh học bao gồm nhiều loại vi sinh vật khác nhau như vi khuẩn, nấm men, nấm mốc, nguyên sinh động vật protozoa, các thể kí sinh và cộng sinh tảo…Trong đó vai trò chủ yếu là vi khuẩn [26] Theo Wright và Hobbie (1966), các vi khuẩn nước có thể sử dụng axetat và glucoza ở nồng độ 1-10μg/l Do đó chúng vượt hẳn các loài khác khi xử lý nước thải [26] Tùy thuộc vào độ nhiễm bẩn của nước mà các loài vi khuẩn có mặt trong nước thải có mặt số lượng nhiều ít khác nhau Bên cạnh đó, trong nước thải còn có nhiều loại nấm Nấm là cơ thể dị dưỡng cacbon hoàn toàn và do vật phụ thuộc vào sự có mặt chât hữu cơ Chúng có khả năng phân giải protein, đường, tinh bột, mỡ và còn có thể phân giải cả peptin, hemixenluloza, lignin và kitin [31]

Phần lớn quá trình sinh học bao gồm của phức hợp những quần thể sinh học tương tác với nhau Khi thiết kế hoặc phân tích một quá trình xử lý sinh học, cần quan tâm đến cả một hệ sinh thái vi sinh vật phát triển trong nước thải [26]

Quá trình xử lý sinh học trong nước thải là quá trình gồm 3 giai đoạn [ 13,19,15]

- Giai đoạn 1: Khuếch tán nhằm di chuyển và tiếp xúc chất hữu cơ

lên bề mặt vi sinh vật Hiệu quả của công đoạn này phụ thuộc vào các quy luật khuếch tán và trạng thái thủy động của môi trường

- Giai đoạn 2: Di chuyển các chất hữu cơ qua màng bàn thấm của tế

bào bằng khuếch tán do sự chênh lệch nồng độ bên trong và bên ngoài tế bào

- Giai đoạn 3: Chuyển hóa các chất trong tế bào tạo ra năng lượng

cho quá trình sinh sản và phát triển của tế bào.Giai đoạn này đóng vai trò quan trọng nhất quyết định mức độ và hiệu quả xử lý nước thải

Nói chung thành phần và hàm lượng chất hữu cơ có ảnh hưởng rất mạnh đến quần thể vi sinh vật và hệ enzym được nó tổng hợp nên [31]

Có 3 nhóm phương pháp xử lý nước thải sinh học:

1.3.4.1 Phương pháp xử lý hiếu khí

Phương pháp hiếu khí dùng để loại bỏ các hợp chất hữu cơ dễ bị vi sinh vật phân hủy ra khỏi nguồn nước Các chất này được các vi sinh vật hiếu khí oxy hóa bằng oxy hòa tan trong nước [2]

khử vi sinh vật tự dưỡng (quá trình nitơrat hóa)

VSV

Theo phương pháp này các hợp chất trong nước thải được oxy hóa và phân hủy theo 3 giai đoạn [8]:

các phản ứng trên đều xảy ra dưới tác dụng của emzim nội bào hay enzim ngoại bào do vi sinh vật trong bùn hoạt tính tạo nên.Trong quá trình oxy hóa khử các hợp chất hữu cơ bị phân hủy theo thứ tự là: đường, protein, tinh bột, chất béo, các chất cao phân tử (xenluloza, lignin )

Sơ đồ hệ thống xử lý nước thải bằng phương pháp hiếu khí

Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất của quá trình xử lý hiếu khí bằng phương pháp hiếu khí:

- Tỷ lệ các chất trong nước thải xử lý bằng phương pháp hiếu khí phải đạt được tỷ lệ các chất cấu thành C: N: K: P = 100:10: 4:1 nếu tỷ lệ này không tương xứng thì vi sinh vật không phát triển bình thường nếu thiếu N thì hiệu suất xử lý giảm đi rõ rệt, hiệu suất của quá trình xử lý đạt tối đa là 95% Trong trường hợp thiếu P thì khả năng kết lắng của bùn hoạt tính rất khó, người ta phải bổ sung các chất trợ lắng là 20% so với tổng thể tích trong vòng

30 phút là tốt nhất, các chất trợ lắng là phèn nhôm, nên sử dụng các chất trợ lắng vào bể sơ bộ và bể lắng lần 2 là an toàn nhất

- Mức độ ô nhiễm: Ảnh hưởng rất lớn đến hiệu suất quá trình xử lý hệ

lượng oxy cũng sẽ không đủ cho vi sinh vật hoạt động, lượng oxy cũng tốt nhất cho hệ thống là 2÷8 mg/l (DO = 22÷8 mg/l ) nhưng trong thực tế thì OD

= 5÷8 mg/l

- pH: Là yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu suất quá trình xử lý, pH trong quá trình xử lý phải đạt 7÷7,2 nếu pH dưới vi sinh vật hiếu

khí sẽ gặp khó khăn, pH trung hòa thì vi sinh vật phát triển sẽ cao Còn pH ở bể

của môi trường tăng lên, pH ở trong đang sục thì là “giả tạo’’ khi đưa sang bể

lắng 2 thì pH sẽ đạt là 7,5

Trong các hệ thống xử lý người ta thường dùng bơm định lượng pH đa

số nước thải đều bị axit hoá do vậy bổ sung pH tức là bổ sung kiềm NaOH, nước vôi Rất ít khi bổ sung thêm axit chỉ có nhà máy giấy mới bổ sung pH để đưa pH vể trung tính

Oxy hoà tan (OD): Ảnh hưởng trực tiếp đến hoạt động sống của vi sinh vật vì hệ thống hiếu khí là sử dụng các vi sinh vật hiếu khí mà trong đó chủ yếu là các vi khuẩn, lượng DO dao động từ 2÷8(mg/l), trường hợp thiếu oxy làm cho bùn hoạt tính khó lắng hiệu xuất xử lý không cao Cung cấp oxy cho

hệ thống có nhiều cách: Dùng máy thổi khí hoặc khuấy nhưng thường sử dụng máy có thổi khí có ưu điểm là tốn ít điện năng ít ồn hơn so với khuấy

Các ion kim loại nặng: Ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật ở mức độ cao có khả năng gây chết do đó ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu quả xử lý của hệ thống trong quá trình xử lý bằng phương pháp sinh học thì phải lại bỏ hết các ion kim loại ra khỏi nước thải trước khi nước thải vào

1.3.4.2 Phương pháp thiếu khí (anoxic)

Trong điều kiện thiếu oxy hòa tan việc khử nitrat hóa sẽ sảy ra Oxy được giải phóng từ nitrat sẽ oxy hóa chất hữu cơ và nitơ sẽ tạo thành [17]

O2 N2 + CO2 + H2O

VSV Chất hữu cơ

1.3.4.3 Quá trình khị khí (anaerobic)

Phương pháp xử lý khị khí là một trong các quá trình cổ xưa nhất được ứng dụng để xử lý nước thải có độ nhiễm bẩn cao, có khả năng thu hồi năng lượng, tạo ra ít bùn, khả năng phân huỷ chất hữu cơ tới 75% và tạo ra khí thải Các nghiên cứu cho thấy trong quá trình xử lý kị khí có tới 90% chất hữu cơ trong nước thải biến thành khí sinh học với hàm lượng 60 ÷ 70% có thể sử dụng như một năng lượng tái sinh có giá trị [13].Quá trình phân huỷ hiếm khí

Themophilus (tốc độ phân huỷ trong điều kiện này cao hơn 2-3 lần so với tốc

hữu cơ trong qúa trình phân huỷ khị khí diễn ra theo 3 bước:

Bước 1: sự chuyển hoá phức chất có trọng lượng phân tử lớn thành

những phân tử nhỏ hơn phù hợp cho vi sinh vật sử dụng như một nguồn năng lượng và cacbon cho tế bào Đây là giai đoạn thuỷ phân.Trong giai đoạn này một số loài vi sinh vật có khả năng tấn công sang các polime ngay cả khi các chất này nằm trong cơ thể rắn Các loài vi sinh vật này có chứa các enzim ngoại bào có khả năng phân huỷ các nguyên liệu có trọng lượng các phân tử thấp, thậm chí các monosaccharit, lipit thành các aixt béo, axit nucleic thành các purin và pyrimidin Các phân tử nhỏ hoà tan sau đó sẽ được các vi khuẩn cùng loại hấp thụ và sử dụng cho trao đổi chất của mình

Bước 2(axit hoá): Bao gồm vi khuẩn chuyển hoá các sản phẩm của

bước 1 thành phức chất trung gian có phân tử lượng thấp hơn nữa Do kết quả hoạt động trao đổi chất của nhóm vi khuẩn này, trong hỗn dịch sẽ xuất hiện các sản phẩm cuối cùng ở dạng khử, đó là các axit béo bay hơi chứa 2-5 nguyên tử cacbon hoặc hơn, etanol và các rượu hoặc etannol khác hoặc các axit hữu cơ như axit lactic Do nhiều axit hữu cơ được sinh ra trong quá trình lên men Bước này của quá trình phân huỷ kị khí được gọi là bước sinh axit

Bước 3: (Bước metan hoá): [ 27,28,32]

Bao gồm vi khuẩn chuyển hoá những phức chất trung gian thành những

Sự tạo thành metan có thể xảy ra theo hai cách sau:

Những nhóm vi sinh vật gồm những vi khuẩn không sinh metan được

phân lập từ bể khị khí có Clostridium sp, Peptococus anacrobus,

Bifisobacterium sp, Desulphovibrio sp, Corynebacteirum sp, Lactobacillus, Actinomomyces, Staphylococus Những nhóm có sinh lý khác gồm những

nhóm có emzim phân giải protein, phân giải ure, hoặc phân giải xenluloza [25, 27]

Một nhóm vi sinh vật thứ ba chuyển hoá hydro và axit axetic thành khí metan và dioxit cacbon Nhóm này kị khí hoàn toàn được gọi là nhóm sinh metan Các nhóm sinh metan là nhóm sử dụng hydro và axit axetic Tốc độ phát triển của chúng rất chậm Vì vậy sự trao đổi chất của chúng thường xuyên làm hạn chế tốc độ trong khị khí nước thải hữu cơ [1] Khí metan và

hoàn thành Khí metan không hoà tan do đó nó tách ra từ nước thải bay lên

Quá trình lên men kị khí là một khả năng công nghệ sinh học nhiều tác dụng (linh hoạt) biến hầu hết tất cả các vật liệu hợp chất các phân tử thành khí

là do có sự phân tích sinh hoá liên tiếp các hợp chất cao phân tử thành khí

Quá trình lên men kị khí metan là do một loạt tác động qua lại việc biến đổi chất trong các nhóm khác nhau của vi sinh vật Sự miêu tả các vi sinh vật tham gia vào quá trình lên men metan dựa trên cơ sở phân tích vi khuẩn được tách ra từ dạ cỏ của một số động vật được tóm tắt bằng hình vẽ sau:

Giai đoạn I

Thủy phân và lên men

Giai đoạn II

Giai đoạn III

Hình 1.1 Quá trình lên men kị khí metan

Trong giai đoạn của quá trình lên men Các khí metan: Hợp chất cao phân tử như lipit, protein và cacbonhydrat bị phân hủy bằng emzim ngoại bào được tiết ra bởi vi khuẩn ở giai đoạn 1 Các emzim phân hủy các chất cao phân tử có thể trở thành các phân tử nhỏ hơn, các đơn phân sau đó chúng bị các vi khuẩn tiêu hủy

Trong quá trình lên men khí metan nước thải có chứa các hợp chất cao phân tử, hoạt động thủy phân liên quan đến mỡ hợp chất cao phân tử có thể trở thành một bước giới hạn tỷ lệ đối với sản xuất các vi khuẩn đơn giản hơn được dùng trong các bước thoái hóa tiếp theo

Bryant cho rằng còn có sự tồn tại của một bước trung gia\n trong quá trình tạo thành khí metan, có những mối liên quan còn thiếu giữa một phía là các axit béo bay hơi chứa ba nguyên tử cacbon hoặc hơn với một phía khác là

Ở bước trung gian, một vài nhóm vi khuẩn được dùng làm cầu nối giữa nước lên men axit và bước tạo thành metan Một số trong chúng còn cạnh

chuỗi dài,các axit béo chuỗi dài được tạo thành ra bị thoái hóa bởi quá trình β- oxi hóa khử để tạo ra axetyl CoA Nhìn chung protein được phân hủy thành hợp chất hữu cơ có chứa amin (aminoaxit) bởi các tác nhân phân hủy protein

được tiết ra bởi các vi khuẩn Bacteriodes, Butyrivibrio, Clostridium

Các polisacsarit như xenluloza, tinh bột và peptin bị phân hủy bởi xenluloza, amylaza và peptinaza Phần lớn các xenluloza do vi sinh vật tạo ra gồm:

- Endo- β-1,4 glucanaza

- Enxo- β-1,4 glucanaza

- Xenlobiaza hoặc β-glucanaza

Ba loại chất xúc tác này hoạt động một cách hợp lực trên xenluloza thủy phân cấu trúc tinh thể của nó có hiệu quả để tạo glucoza thủy phân cấu trúc tinh thể Khi các amino sunphat có thể trở nên quan trọng Một số trong chúng có thể cạnh tranh với các vi khuẩn axetat tạo thành hydro bắt buộc về axit béo bay hơi dùng làm cơ chất Nhóm vi khuẩn có khả năng sử dụng etanol và lactat có thể bao gồm chủ yếu các vi khuẩn khử sunphat

Các vi khuẩn này có thể là vi khuẩn khử sunfat tuỳ tiện Khi các ion

hydro có thể xảy ra và kết quả phụ thuộc vào điều kiện môi trường, việc các

vi khuẩn khử sunfat có thể bị lôi kéo vào quá trình tạo thành metan dẫn đến 2 kết luận quan trọng:

- Chúng có thể hỗ trợ hoặc cạnh tranh với các vi khuẩn metan

Ngoài các vi khuẩn khử sunfat, một nhóm vi khuẩn dinh dưỡng hydro cũng giữa vai trò quan trọng trong quần thể vi sinh vật metan tổng thể [1] Các vi khuẩn này thuộc nhóm vi khuẩn axetat đồng hình chúng thuộc nhóm

để tạo thành axetat Một số các vi khuẩn này là vi khuẩn tự dưỡng và có khả

vi khuẩn lên men vì chúng có khả năng tạo axetat từ glucoza Trường hợp này, thường là vi khuẩn hóa dưỡng hữu-vô cơ hỗn hợp và vi khuẩn hỗn dưỡng Các vi khuẩn axetat đồng hình không cạnh tranh với các vi khuẩn metan về cơ chất (vi chúng sinh axetat) mà về năng lượng vì chúng sử dụng

Các axit béo không thể được chuyển hóa thành các sản phẩm cuối cùng

khuẩn sinh axetat sản phẩm sinh hydro bắt buộc chúng sống cộng dưỡng bắt buộc với vi khuẩn dinh dưỡng hydro để duy trì áp lực riêng phần của hydro

Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất của quá trình xử lý bằng phương pháp khị khí:

- Thời gian lưu: Nếu lượng nước thải vào chậm, tốc độ dòng thấp hiệu suất sử lý của hệ thống giảm Nếu tốc độ dòng vào lớn, thời gian lưu ngắn thì hiệu suất xử lý giảm Thời gian lưu tốt nhất là 8-12giờ hay 0,6 m/h

- Mức độ ô nhiễm: Nếu quá cao thì thời gian lưu dài dẫn đến hiệu suất giảm Mức độ ô nhiễm tốt nhất ở COD = 500-2000mg/l

- pH: Là một trong những yếu tố cực kì quan trọng cả hiếu khí và khị khí hoạt động trong pH =5,5 – 7,5 tối ưu là 6-6,5

pH axit thì vi sinh vật sinh metan chết gần hết nên phải điều chỉnh pH

- Các chất độc: Là một trong những yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất sử

sẽ gây chết các vi sinh vật

- Thiết kế bể: Làm như thế nào toàn bộ khối phải đồng nhất, đường kính bể không được quá cao

hữu cơ là cacbon Khi xét cả photpho thì công thức chung của tế bào vi khuẩn

và hợp chất này vi khuẩn đều phải lấy từ môi trường nên vi khuẩn có vai trò quan trọng trong chuyển hóa các chất có trong nước thải Các nhà máy xử lý nước thải thông thường dựa trên sự thủy phân hủy sinh học của các chất hữu

cơ không độc nhờ vi khuẩn Sự phân hủy sinh học này trong điều kiện có oxi

có thể được biểu diễn theo phương trình [22, 19]

(C, O, N, S)

Về nguyên tắc thì trong hệ thống xử lý nước thải, các yếu tố môi trường cấn được hiệu chỉnh sao cho các vi sinh vật hóa dị dưỡng chiếm ưu thế vì vi sinh vật dị dưỡng sử dụng các hợp chất hữu cơ làm nguồn cacbon và nguồn năng lượng để thực hiện các phản ứng sinh tổng hợp

Vi nấm:Vi nấm có tầm quan trọng trong kỹ thuật môi trường, đó là các

nấm dị dưỡng, hầu hết các vi nấm là vi hiếu khí bắt buộc.Chúng có khả năng sinh trưởng ở điều kiện nhiệt độ thấp và có thể chịu được điều kiện pH tương đối thấp, pH tối ưu cho các nấm là 5-6 mặc dù giới hạn pH là 2-9 Nấm có nhu cầu nitơ thấp, chỉ bằng nửa nhu cầu của vi khuẩn Khả năng sống ở pH thấp và điều kiện hạn chế về nguồn nitơ và đi cùng với khả năng phân giảxenluloza của chúng Đặc điểm này khiến chúng trở nên quan trọng trong xử lý chất thải công ghiệp, chẳng hạn từ các nhà máy sản xuất gỗ, giấy… [32, 36]

vi khuẩn

Động vật nguyên sinh:

Động vật nguyên sinh là các cá thể đơn bào có khả năng di động Đa số động vật nguyên sinh là dị dưỡng hiếu khí, một số là kỵ khí Protozoa thường lớn hơn vi khuẩn và có khả năng thực khuẩn, dùng chúng làm nguồn năng lượng Trong các quá trình xử lý chất thải bằng phương pháp sinh học, protoza thường lớn hơn vi khuẩn và có khả nằn thực khuẩn, dùng chúng làm nguồn năng lượng.Trong các quá trình xử lý nước thải bằng phương pháp sinh học, Protozoa hoạt động như một yếu tố làm sạch dòng chảy do tiêu thụ vi khuẩn và các chất hữu cơ [12,17]

Rotifer là động vật nguyên sinh đa bào dị dưỡng hiếu khí Chúng được đặt tên dựa vào hình thái do có hai roi luôn xoáy tròn ở đầu với chức năng di chuyển và bắt mồi Rotifer có chức năng xử lý các vi khuẩn rải rác hay keo tụ

và các mẫu hữu cơ trong nước thải Sự có mặt của chúng trong nước đã xử lý chứng tỏ hiệu quả cao của quá trình xử lý sinh học [17,38]

Tảo, vi khuẩn lam:

Tảo và vi khuẩn lam là sinh vật đơn bào, tự dưỡng Chúng có vai trì quan trọng đối với xử lý sinh học bởi hai lý do:

- Trong ao hồ chúng quang hợp tạo ra oxi cần thiếtcho hệ sinh thái nước

- Ở các bể oxi hóa hiếu khí hay hiếu khí không bắt buộc thì tảo cũng cần cung cấp oxi cho các vi khuẩn hiếu khí dị dưỡng [38]

1.4.2 Các chất hữu cơ và các enzym vi sinh vật phân giải chúng

Quá trình phân hủy các hợp chất hữu cơ trong tự nhiên là là quá trình hóa sinh phức tạp Nhờ hoạt động sống của vi sinh vật, một lượng lớn hợp chất hữu cơ bị phân giải Trong quá trình phân hủy các vi sinh vật tiết ra các enzym ngoại bào và các hợp chất hữu cơ như xenluloza, tinh bột, protein…được phân giải thành những phần nhỏ như các axit hữu cơ, peptit, các đường đơn, các axit amin…đồng thời sinh khối vi sinh vật được tạo thành

Các hợp chất hữu cơ trong tự nhiên chủ yếu là xenluloza, hemi- xenluloza,

tinh bột, protein …Trong khuân khổ của đề tài này chúng tôi chỉ đề cập đến các vi sinh vật phân giải chất hữu cơ chính là vi sinh vật phân giải tinh bột và xenluloza

1.4.2.1 Tinh bột và enzym amylaza

Tinh bột là polysaccarit dự trữ của thực vật, chủ yếu có trong hạt, phổ

biến ở các loại lúa mỳ, khoai tây, sắn, gạo… Phân tử tinh bột có công thức

không phân nhánh, dài khoảng 300-1000 gốc glucoza, xoắn theo kiểu lò xo, cấu trúc xoắn được giữ vững nhờ liên kết hydro được tạo thành giữa các nhóm -OH tự do Amyloza tạo thành màu xanh khi kết hợp với iốt

Cấu trúc phân tử của nó bao gồm một nhánh trung tâm (chứa liên kiết glucozit), từ nhánh này phát ra các nhánh phụ có chiều dài khoảng vài chục gốc glucoza Amylopectin được phân bố ở mặt ngoài hạt tinh bột Khi đun nóng cấu trúc amylopectin bị thay đổi dẫn tới trạng thái hồ hoá tinh bột

1,4-Khi bị thủy phân, tinh bột sẽ chuyển hoá thành các sản phẩm trung gian gọi

là dextrin Các dextrin có thể tiếp tục bị thuỷ phân hoàn toàn tạo thành các gốc

glucoza Còn khi bị nhuộm màu với Lugol, tinh bột sẽ bắt màu xanh sẫm [9]

Enzym amylaza Trong tự nhiên có rất nhiều loại vi sinh vật có khả

năng tổng hợp amylaza xúc tác cho quá trình thuỷ phân tinh bột, glycogen… thành các phân tử có khối lượng nhỏ hơn như: oligosaccarit, glucoza, maltoza… Amylaza có ba loại:

- -amylaza (amylo-1,4-dextrinaza) có khả năng phân giải các liên kết

giảm khối lượng phân tử mạnh, đồng thời gây giảm tính nhớt, mất khả năng tạo màu với iốt

- -amylaza (amylo-1,4glucozidaza) có khả năng phân giải liên kết 

phẩm cuối cùng là maltoza và glucoza

- -amylaza (amylo-1,6-dextrinaza) có khả năng phân giải các liên kết

Hầu hết các vi khuẩn đều có khả năng sinh amylaza như: Aspergillus

oryzae, Bacillus subtilis, Bacillus diastaticus, Aerobacillus macerans Trong

đó Bacillus là một trong những nhóm được xét là có khả năng sinh amylaza

mạnh Hầu hết các chế phẩm xử lý ô nhiễm đều có thành các loài thuộc chi

Bacillus

1.4.2.2 Xenluloza và enzym xenlulaza

Xenluloza là thành phần chính có trong lớp vỏ của tế bào thực vật

glucoza này với vị trí C4 của phân tử glucoza kế tiếp Vì vậy xenluloza không

có cấu tạo mạch nhánh Cấu trúc mixen của xenluloza gồm 2 vùng chính: Vùng kết tinh có cấu trúc trật tự rất cao và chặt chẽ Vùng này rất khó bị tác dụng ngay cả với enzym xenlulaza Vùng vô định hình có cấu trúc lỏng lẻo, kém bền vững hơn vùng kết tinh nên dễ bị tác động hơn Vùng này có thể hấp thụ nước và trương lên tạo điều kiện thuận lợi giúp cho enzym xenlulaza tấn công dễ dàng.[11]

CMC (Cacboxymethyl cellulose) được tạo thành khi cho

alcalixenluloza tác dụng với axit cloaxetic hoặc muối natri cloaxetat cho nên CMC có thể tồn tại ở hai dạng H hoặc Na Dạng H - CMC không tan trong nước, rượu, axeton nhưng tan trong dung dịch kiềm cũng như trong các hệ dung môi dùng để hoà tan xenluloza Còn CMC dưới dạng muối kim loại kiềm hoặc amoni có khả năng hoà tan khác nhau phụ thuộc vào mức độ thế

Xenlulaza: Hàng loạt vi khuẩn và nấm có khả năng phân giải xenluloza

một cách tự nhiên nhờ hoạt động phối hợp của một tập hợp các enzym

xenlulaza Ở một số vi khuẩn hoạt tính xenlulaza thường gặp trong một số phức hệ nhiều enzym gọi là xenlulozasom nằm ở mặt ngoài tế bào gồm các loại enzym sau [30]

- Endoglucanaza(CMC-aza) có khả năng cắt đứt các liên kết bên trong

phân tử xenluloza làm giảm nhanh chiều dài chuỗi và làm tăng các nhóm khử

xenlodextrin, xenlobioza và glucoza Giúp phân giải mạnh các xenluloza hoà tan nhất là dạng xenluloza vô định hình và hoạt động chủ yếu ở vùng kết tinh

-Exoglucanaza (exo-1,4--D glucan-exolobiohydrolaza) có khả năng tấn công chuỗi xenluloza từ đầu không khử và giải phóng chủ yếu ra xenlobioza, đôi khi là glucoza Enzym này không phân giải xenluloza kết tinh cũng như xenluloza hoà tan khác, chúng tác dụng yếu lên CMC nhưng hoạt động mạnh lên xenluloza vô định hình hoặc xenluloza đã phân giải một phần như xenlodextrin Sự có mặt của exoglucanaza làm quá trình phân giải tăng mạnh

- -1,4-glucozidaza (xenlobiaza) có khả năng thuỷ phân mạnh

xenlobioza hay các xenlodextrin hoà tan trong nước giải phóng glucoza Hoạt tính giảm của chúng giảm dần theo chiều dài của chính sự tích luỹ các chất cảm ứng của enzym xenlulaza

Các loại vi khuẩn sinh xenlulaza chủ yếu thuộc hiếu khí như:

Achromobacter, Pseudomonas, Cellulomonas, Vibrio, Cellvibrio, Bacillus, Cytophaga, Angiococcus, Polyangium, Sporocytophaga, Sorangium, Archangium, Promyxo bacterium Nấm sợi sinh xenlulaza nhiều hơn vi

khuẩn Chúng tiết vào môi trường hệ enzym đầy đủ hơn nên thủy phân hoàn

toàn cơ chất xenluloza Ví dụ một số chủng đã được nghiên cứu như: Trichoderma

reesei, T viride, Fusariumsolani, Penicillium pinophinum, Phanerochate chrysosporium, Sporotrichum pulverulentum và Sclerolium rolfsii

1.5 Tình hình nghiên cứu chế phẩm sinh học trong nước và ngoài nước 1.5.1.Trong nước

Nghiên cứu và phát triển chế phẩm sinh học tại Việt Nam chỉ thực sự phát triển từ năm 1995 Trong thời gian qua đã có nhiều công trình nghiên

cứu đề cập đến vấn đề xử lý chất thải, nước thải của các làng nghề, các nhà máy, các cơ sở sản xuất hoặc nước thải sinh hoạt… Một trong các sản phẩm của công trình này được ứng dụng rộng rãi trong thực tế, trong đó phải kể đến các sản phẩm xử lý chất thải nông nghiệp, công nghiệp góp phần làm sạch môi trường Ví dụ như chế phẩm Biochie dạng bột và lỏng trên cơ sở vi khuẩn

Bacillus và Lactobacillus Chế phẩm Bio-DW có khả năng ứng dụng để giảm

thiểu ô nhiễm môi trường nước ao nuôi tôm, cá, làm sạch nền đáy hồ sau mỗi

vụ mùa và tăng năng suất nuôi tôm [7]

Đối với chế phẩm xử lý nước thải sinh hoạt và nước thải công nghiệp phải kể đến chế phẩm EM của Nhật hoặc GEM, VEM – là chế phẩm EM đã được nội địa hóa Các chế phẩm này với các tên thương hiệu GEM-P,GEM-K CTA-T do Nguyễn Văn Thu trung tâm Tư vấn Công nghệ Nông sản thực phẩm & Môi Trường CTA nghiên cứu sản suất bao gồm các nhóm vi sinh vật hữu ích, có tác dụng phân hủy các chất hữu cơ gây ô nhiễm môi trường, tiêu

đã được chứng minh làm tăng hiệu quả xử lý BOD và COD (40-80%) trong

hệ thống xử lý nước thải và giảm hàm lượng bùn trong hệ thống xử lý nước thải [41]

Cùng với loại chế phẩm nói trên phải kể đến EM – Bokashi 1% Đây là chế phẩm EM cải tiến của Đại Học Nông nghiệp I- Hà Nội có tác dụng rất tốt trong việc xử lý môi trường [42]

Năm 2005 Bà Võ Thị thứ Viện Công nghệ Sinh học và cộng sự đã hoàn thành dự án nghiên cứu “ Hoàn thiện và triển khai công nghệ sản xuất chế phẩm sinh học phục vụ xử lý môi trường nuôi trồng thủy sản’’ Nghiên cứu này đã đưa được ra các quy trình trong quá trình sản xuất chế phẩm sinh học ứng dụng cho môi trường nuôi trồng thủy sản và nâng cao năng suất nuôi trồng Hoàn thiện công nghệ sản suất giống ổn định, công nghệ lên men sản xuất chế phẩm, công nghệ thu hồi, tạo chế phẩm và bảo quản chế phẩm

Nước ta, ngày càng có nhiều chế phẩm sinh học xử lý môi trường được nghiên cứu và ứng dụng, chúng góp phần không nhỏ trong việc bảo vệ môi trường, mang lại nguồn nước sạch cho con người

1.5.2 Ngoài nước:

Trên Thế giới, việc áp dụng các quy trình công nghệ hiện để xử lý chất thải hữu cơ để bảo vệ môi trường đã được thực hiện ở rất nhiều quốc gia Nổi bật trong các công trình nghiên cứu chế phẩm sinh học xử lý môi trường, cần nói đến công trình nghiên cứu của Giáo sư tiến sĩ Teruo Higa –Trường Đại Học tổng hợp Ryukyus, Okinawoa, Nhật Bản Ông đã nghiên cứu và sáng tạo

ra một loại chế phẩm mang tên EM (Effective Microoganisms) – Có nghĩa là

vi sinh vật hữu hiệu Chế phẩm này có khoảng 80 vi sinh vật kỵ khí và hiếu khí thuộc các nhóm: vi khuẩn quang hợp, vi khuẩn lactic,nấm men, nấm mốc,

xạ khuẩn, 80 loài sinh vật này được lựa chọn từ hơn 2000 loài được sử dụng phổ biến trong công nghiệp thực phẩm và công nghệ lên men Công nghệ EM

đã thành công đến nỗi chính tác giả - giáo sư Teruo Higa cũng không nghĩ rằng nó lại có tác dụng rộng lớn đến thế Chế phẩm EM không những giúp mang lại những kết quả khả quan trong chăn nuôi, trồng trọt mà còn là một chế phẩm sinh học rất hiệu quả trong xử lý môi trường Đến nay khoản 90 quốc gia tham gia chương trình nghiên cứu ứng dụng EM và hơn hai mươi quốc gia có thể sản xuất được EM

Việc sử dụng các vi sinh vật có khả năng phân hủy cơ chất xenluloza đã được nhiều tác giả quan tâm nghiên cứu như N Ollivier và J.L Garcia đã

công bố khả năng phân hủy xenluloza bởi Clostridium, Thermocellum,

Methanobacterium sp và Methanosarcina MP [35] Các chất thải từ ngành

công nghiệp thực phẩm là protein, tinh bột, hemixenluloza, xenluloza, kitin,…cũng đã được nhiều tác giả nghiên cứu tìm phương pháp xử lý Virendra S Biasaria và Taurn K Ghose sử dụng enzym từ vi sinh vật ưa nhiệt

để xử lý chất thải hữu cơ loại này [39]

Với sự nhanh chóng và tính năng hiệu quả của chế phẩm sinh học, hiện nay tại hầu hết các nước trên thế giới đều sử dụng chế phẩm như là giải pháp

hỗ trợ xử lý rác thải và chất thải để bảo vể môi trường sống

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 NGUYÊN LIỆU

2.1.1 Vi sinh vật

- Các chủng vi khuẩn phân lập từ đất bùn, nước ở một số ao hồ thuộc một số tỉnh khu vực phía Bắc

- Bộ vi khuẩn kiểm định: Proteus mirabilis, Pseudomonas sp.,

Escherichia coli, Vibrio parahaemolyticus, Aeromonas hydrophyla do Bảo

tàng Giống chuẩn Vi sinh vật- Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học- Đại học Quốc gia Hà Nội cung cấp

môi trường Thạch ủ ở 300C Sau 48 giờ, cấy vi khuẩn đã mọc vào môi trường thạch NA để giữ giống

Các chủng này tiếp đó được nuôi cấy trên môi trường dịch thể ở nhiệt

độ thích hợp Sau 48-72 giờ, ly tâm 8000 vòng/phút trong 15 phút, thu dịch enzym thô, xác định hoạt tính enzym

2.2.2 Phương pháp xác định hoạt tính enzym và hoạt tính kháng sinh

*Phương pháp đặt thỏi thạch

Môi trường cơ chất: - Thạch 16 (g); Cơ chất (CMC, tinh bột tan …)

1 (g); Nước 1000 (ml)

dụng cụ khoan lỗ thạch Đặt các thỏi thạch vào đĩa Petri sạch, sau đó:

- Đổ môi trường cơ chất khoảng 2/3 chiều cao thỏi thạch Cho vào tủ

- Đổ môi trường thạch NA có chứa vi sinh vật kiểm định khoảng 2/3

C Sau 24 giờ xác định hoạt tính kháng sinh thông qua kích thước vòng vô khuẩn

Hoạt tính enzym/kháng sinh (HTE/HTKS) xác định theo công thức:

HTE/HTKS = D – d (mm)

D: Đường kính vòng phân giải/vòng vô khuẩn + đường kính thỏi thạch d: Đường kính thỏi thạch

* Phương pháp nhỏ dịch Vi khuẩn được nuôi cấy lắc 220 vòng/phút

C trong môi trường dịch thể Sau 48-72 giờ ly tâm dịch nuôi cấy với tốc độ 8000 vòng/phút trong 15 phút Dịch sau ly tâm được nhỏ vào lỗ thạch đã khoan trong đĩa Petri chứa:

- Môi trường cơ chất, để vào tủ ấm 300C Sau 24 giờ xác định vòng phân giải

- Môi trường chứa vi sinh vật kiểm định để trong tủ lạnh từ 6-8 giờ cho chất kháng sinh khuyếch tán vào thạch sau đó cho vào tủ ấm Sau 24 giờ xác định hoạt tính kháng sinh thông qua kích thước vòng vô khuẩn

Hoạt tính enzym/hoạt tính kháng sinh (HTE/HTKS) xác định theo công thức: HTE/HTKS = D – d (mm)

D: Đường kính vòng phân giải/vòng vô khuẩn + đường kính lỗ khoan d: Đường kính lỗ khoan

2.2.3 Xác định sinh khối bằng phương pháp đo mật độ quang học – OD (optical density)

Số lượng tế bào vi sinh vật trong dịch nuôi có thể xác định gián tiếp bằng cách đo mật độ quang học Dịch nuôi được pha loãng 5 lần, đo OD ở bước sóng 620 nm

2.2.4 Phương pháp đếm số lượng tế bào

Dịch nuôi cấy vi khuẩn ở các điều kiện thích hợp được pha loãng với mỗi nồng độ kế tiếp giảm 10 lần Sau đó cấy gạt 0,05 ml dịch pha loãng trên

lạc mọc trên đĩa Petri

Công thức tính số lượng tế bào: Số lượng tế bào = a x 1/K x 1/V

a: số khuẩn lạc trung bình mọc trên đĩa thạch

K: độ pha loãng

V: thể tích dịch pha loãng được cấy gạt trên đĩa thạch

2.2.5 Phương pháp xác định vi khuẩn G(+) hay G(-)

Cố định tiêu bản vi khuẩn bằng ngọn lửa rồi nhuộm bằng dung dịch tím kết tinh trong khoảng một phút, rửa bằng nước, nhuộm tiếp bằng dung dịch Iốt (dung dịch Lugol) trong một phút, rửa bằng nước, phủ lên vết bôi dung dịch etanol 95%: axeton (1:1) trong một phút và lại rửa bằng nước, sau đó nhuộm tiếp bằng thuốc nhuộm màu đỏ Safranin trong 30-60 giây, rửa qua nước, để khô rồi soi kính Nhóm G(+) sẽ không bị dung môi hữu cơ (etanol,

axeton) tẩy phức chất màu giữa tím kết tinh và iốt nên sẽ bắt màu tím Nhóm G(-)

bị dung môi tẩy màu thuốc nhuộm màu đầu nên sẽ bắt màu đỏ (Safranin) [15]

2.2.7 Phương pháp xác định ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy đến khả năng tổng hợp enzym và kháng sinh

- Lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp

khối tế bào Sau 72 giờ nuôi cấy, xác định hoạt tính kháng sinh, pH và sinh khối tế bào

- Ảnh hưởng của thời gian

sinh và đồng thời xác định sinh khối Nuôi cấy trong vòng 72 giờ, sau mỗi 12 giờ xác định hoạt tính enzym, sau mỗi 24 giờ xác định hoạt tính kháng sinh và xác định sinh khối bằng phương pháp đo mật độ quang

- Ảnh hưởng của pH nuôi cấy

enzym (sau 48 giờ)

- Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy

C Sau 48 giờ xác định pH sau nuôi cấy, sinh khối, hoạt tính enzym Sau 72 giờ xác định pH sau nuôi cấy, sinh khối

2.2.8 Ảnh hưởng của một số yếu tố đến hoạt tính enzym

Các chủng vi khuẩn có khả năng sinh enzym được nuôi cấy lắc 220 vòng/phút ở điều kiện tối ưu Sau 48 giờ, ly tâm 8000 vòng/phút trong 15 phút để thu dịch enzym thô

i Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzym

Tiến hành theo phương pháp nhỏ dịch Sau đó đặt các đĩa Petri vào

ii Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzym

Tiến hành theo phương pháp nhỏ dịch, nhưng trên cơ chất được pha trong dung dịch đệm tạo ra giá trị pH 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 Sau 24 giờ đo vòng phân giải cơ chất

iii Ảnh hưởng của thời gian bảo quản đến hoạt tính enzym

thử hoạt tính theo phương pháp nhỏ dịch sau mỗi tuần

2.2.9 Xác định tính đối kháng

Các chủng vi sinh vật được tiến hành thử tính đối kháng theo phương pháp nhỏ dịch tương tự như xác định hoạt tính kháng sinh

2.2.10 Phương pháp tạo chế phẩm

Tỷ lệ giống cấy thích hợp: Giống cấp hai được bổ sung vào môi trường

chứa chất mang thích hợp đối với từng loại vi khuẩn theo tỷ lệ khác nhau: 0,5-1-5-10-13-15-20 % Bổ sung nước đến độ ẩm thích hợp và ủ 2 ngày, sau

0,1-đó đếm số lượng tế bào của từng loại vi khuẩn để xác định khả năng sinh trưởng của các chủng

2.2.11 Phương pháp xác định một số đặc điểm sinh học của vi khuẩn

Xác định khả năng sinh bào tử

Cấy vi khuẩn trên môi trường thạch thường Sau 3 ngày tiến hành xử lý

năng sinh bào tử Nếu không thì kết luận ngược lại

Xác định khả năng hóa lỏng gelatin

Cấy vi khuẩn theo phương thẳng đứng, sâu vào ống nghiệm môi trường

Kiểm tra kết quả nếu thấy môi trường vẫn lỏng thì kết luận có khả năng hóa lỏng gelatin Ngược lại là không có khả năng

Xác định khả năng sinh khí CO 2

Cấy vi khuẩn vào ống nghiệm chứa 5 ml môi trường thạch thường dịch

nổi lên, kết luận có khả năng sinh khí Ngược lại kết luận không có khả năng

Xác định hoạt tính catalaza

Cấy vi khuẩn vào ống nghiệm chứa 5 ml môi trường thạch thường dịch

kết luận có hoạt tính catalaza Ngược lại không có hoạt tính

2.2.12 Phân loại theo sinh học phân tử

 Phương pháp tách ADN vi kuẩn

C trong 30 phút

trong đá lạnh, sau đó ly tâm với vận tốc 15.000 vòng/phút Sau ly tâm, lấy dịch trên

(Bước này được lặp lại 2 lần)

- Dùng etanol lạnh với thể tích gấp 2 lần thể tích mẫu để tủa ADN

- Rửa tủa bằng etanol 70%

- Làm khô ADN bằng máy làm khô chân không

Điện di trên gel agaroza

Đây là kỹ thuật quan trọng vì đó là cách chủ yếu làm cho các đoạn axit nucleic hiển thị trực tiếp Phương pháp này dựa trên một đặc tính của axit nucleic là ở pH trung tính mang điện tích âm nhờ các nhóm photphat nằm trên khung photphodieste của các sợi axit nucleic Điều đó có nghĩa là các phân tử

sẽ chạy về cực dương khi đặt trong điện trường Kỹ thuật này được tiến hành trên một đệm gel có tác dụng phân tách các axit nucleic theo kích thước