CÁC KỸ THUẬT ỨNG DỤNG TRONG CHUYỂN GEN TV

Giới thiệu chung về cây chuyển gen (GMPs) Các khái niệm chung Các mốc lịch sử của GMPs Sự phát triển của GMPs trên thế giới Lợi ích và hạn chế Tiềm năng của GMPs Hướng phát triển trong tương lai Tạo cây chuyển gen Vật liệu chuyển gen Phương pháp chuyển gen Đối tượng và vật liệu chuyển gen Một số thành tựu công trình đang nghiên cứu tại Viện CNSH Tạo cây kháng virus bằng công nghệ RNAi Vaccine ăn được và một số chất dược liệu Nâng cao chất lượng cây trồng Cải tạo nâng cao khả năng chống chịu của cây trồng.

CÁC KỸ THUÂÂT ỨNG DỤNG TRONG CHUYỂN GEN TV

I Giới thiệu chung về cây chuyển gen (GMPs)

- Sự phát triển của GMPs trên thế giới

- Lợi ích và hạn chế

- Hướng phát triển trong tương lai

II Tạo cây chuyển gen

- Vâât liêâu chuyển gen

- Đối tượng và vật liệu chuyển gen

II Một số thành tựu công trình đang nghiên cứu tại Viện CNSH

- Vaccine ăn được và một số chất dược liệu

- Cải tạo nâng cao khả năng chống chịu của cây trồng

Chuyển gen (transgenesis):

- Đưa một đoạn DNA ngoại lai vào hệ gen (genome) của một cơ thể

đa bào

- Đoạn DNA ngoại lai sẽ có mặt ở hầu hết các tế bào và được truyền

lại cho thế hệ sau- các tính trạng sẽ được truyền cho các thế hệ kế tiếp thông qua sinh sản

Ở nấm men, vi khuẩn và tế bào nuôi cấy mang một đoạn DNA

ngoại lai được gọi là các tế bào tái tổ hợp (recombinant cell) hoặc

tế bào biến nạp (transformed cell)

Sinh vật biến đổi gen (GMO-Genetically Modified Organism) là

thuật ngữ chỉ các sinh vật tiếp nhận những gen mới từ các sinh vật khác thông qua phương pháp chuyển gen trong phòng thí nghiệm

Thực phẩm chuyển gen (GMF) là những thực phẩm được sinh ra

hay chế biến từ các GMO GMF xuất hiện từ thập kỷ 90 của thế kỷ trước với các cây thực phẩm như lúa mỳ, đậu tương, ngô, cà chua

MỘT SỐ KHÁI NIỆM

- Quá trình biến nạp (transformation): quá trình đưa một DNA

ngoại lai vào genome của một sinh vật Cây được biến nạp được gọi là cây biến đổi gen (genetically modified plants -GMP).

- Gen chuyển (transgene): gen ngoại lai được chuyển từ một cơ thể

sang một cơ thể mới bằng kỹ thuật di truyền

Các gen chuyển được sử dụng để tạo động vật, thực vật chuyển gen

có nguồn gốc từ các loài sinh vật khác nhau

- Kỹ thuật di truyền (genetic engineering) là các kỹ thuật sinh học

phân tử có liên quan đến việc gây các biến đổi trên vật liệu di truyền

- ….

MỘT SỐ KHÁI NIỆM

VAI TRÒ CỦA GMPs

- Dân số thế giới tăng

- Biến đổi khí hââu gây nên

hạn hán, mất mùa, giảm sản

lượng lương thực

- 1980, lần đầu tiên DNA ngoại lai

(transposon Tn7) được chuyển vào thực vật nhờ

A tumefaciens

- 1983, đã biến đổi T-DNA và đưa DNA ngoại lai

vào, tạo ra tính kháng một số chất kháng sinh

(electroporation) biến nạp bằng tế bào trần

(protoplast) ở ngô

-Năm 1985-1986: cây biến đổi gen được mô tả

có tính kháng thuốc diệt cỏ và kháng virus GMP

được phép đưa ra đồng ruộng.

-1987: phương pháp biến nạp bằng súng bắn

gen: thành công ở các cây một lá mầm quan

trọng như lúa (1988), ngô (1990) và lúa mỳ

(1992), cà chua (1987)…

-1989, thành công trong việc chuyển các gen

mã hóa các kháng thể vào thực vật, mở ra khả

LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU

- 1991-1992: thành phần

carbohydrate, các acid béo, thành

phần alkaloid của thực vật được biến

đổi, có ý nghĩa lớn đối với việc thu

nhận dược liệu Hy vọng sẽ có những

thực vật có đặc tính mới, được sử

dụng như là các bioreactor thực vật để

sản xuất “nguyên liệu tái sinh”

- 1998: trên thế giới đã có 48 giống

cây trồng biến đổi gen và sản phẩm

được thị trường hóa Năm 1999, cây

lúa biến đổi gen được đưa ra với 7

gen được biến nạp

- 2000: Cây lúa biến đổi gen có khả

năng tổng hợp bea-carotene (tiền chất

của vitamin A)

LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU

Worldwide Cultivation areas with genetically modified plants,

1996 - 2009, in millions of hectares

Năm 2009: Trồng ~134 mil

hectares ở 25 quốc gia trên

thế giới

LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU

16 mil.ha

~21%

MỘT SỐ CÂY TRỒNG CHUYỂN GEN

TT Nước Diêện

ti c h

GM plants TT Nước Diêện

tic h

GM plants

1 USA 64 S,M,C,R, SB,squash,

papaya 11 Philippines 0.5 M

2 Brazil 21.4 S,M,C 12 Australia 0.2 C,R, carnation

3 Argentina 21.3 S,M,C 13 Burkina Faso 0.1 C

Đơn vị diêện tich: mil.ha

S = Soybeans, M= Maize, R = Rapeseed, C = Cotton, SB=sugarbeet

QUỐC GIA TRỒNG GMPs

Cây chuyển gen “thế hệ thứ nhất” đã giúp giảm chi phí sản xuất

Cây chuyển gen “thế hệ thứ hai” nhằm tăng các giá trị dinh dưỡng hoặc có

những đặc điểm thích hợp cho công nghiệp chế biến:

- Lúa gạo giàu vitamin A và sắt

- Khoai tây tăng hàm lượng tinh bột.

- Vaccine thực phẩm (edible vaccine) ở ngô và khoai tây.

- Những giống ngô có thể trồng được trong điều kiện nghèo dinh dưỡng.

- Dầu ăn có lợi cho sức khoẻ hơn từ đậu nành và cải dầu.

 Cung cấp nguồn lương thực cần thiết cho tương lai

 Tăng cường chất lượng thực phẩm

 Tăng khả năng chăm sóc sức khỏe

 Tạo nên sự đa dạng trong sinh học.

ƯU ĐIỂM CỦA GMPs

- Đối với con người: gây dị ứng, độc tố,kháng kháng sinh

- Đối với việc bảo vệ đa dạng sinh học: phát tán gen sang họ hàng hoang dại của chúng, sang sâu bệnh

có nguy cơ làm tăng tính kháng của chúng đối với đặc tính chống chịu sâu bệnh của cây trồng chuyển gen hoặc làm tăng khả năng gây độc của cây trồng chuyển gen đối với các loài sinh vật có ích

Trồng đại trà CTCG: xâm hại giống bản địa, mất an toàn đa dạng sinh học mất các nguồn gen quý và đa dạng sinh học (đăặc biêặt các loài cây thụ phấn chéo: ngô)

- Đối với môi trường: ảnh hưởng tới hệ sinh thái của

vi sinh vật đất.

NHƯỢC ĐIỂM CỦA GMPs

a.Trong nông nghiệp:

- Tạo giống cây trồng nông nghiệp biến

đổi gen như: lúa, ngô, khoai tây, cà

chua, bông cải dầu,…

- Tính trạng kháng virus, kháng sâu

bệnh, chịu hạn, chịu mặn, v.v…

b Trong công nghiêệp: Sản xuất nhiều

loại hóa chất, trong đó chủ yếu là các

loại dầu chiết từ hạt lanh, cải dầu và

biệt như sợi sinh học tổng hợp

- Chế tạo nhiên liệu sinh học

ỨNG DỤNG GMPs

c Trong lâm nghiêệp: tăng tốc

độ sinh trưởng của cây trồng, biến đổi cấu trúc gỗ, thay đổi chu kỳ tái sinh, tăng tính kháng đối với một số chất diệt cỏ nhất định

d Trong y học: Sản xuất ra các

vaccine, dược phẩm có thể chống được các căn bệnh đặc biệt ở những bệnh nhân nhất định.

Ví dụ: sản xuất insulin dành cho những bệnh nhân tiểu đường, lợi dụng cây thuốc lá biến đổi gen

để chế tạo thuốc chống bệnh HIV…

ỨNG DỤNG GMPs

- Nâng cao sản lượng cây trồng đảm bảo an ninh lương thực

- Ít tiêu tốn đất có khả năng đem lại sản lượng cao hơn

- Đáp ứng yêu cầu phát triển bền vững nông nghiệp và môi trường

- Tăng khả năng ổn định sản xuất, làm giảm những thiệt hại phải gánh chịu trong các điều kiện khó khăn

- Cải thiện các lợi ích kinh tế và xã hội và loại bỏ tình trạng đói nghèo ở các nước đang phát triển

TIỀM NĂNG

Altered composition Virus resistance

Elimination of pollutants Disease resistance

Stress resistance Pest resistance

Pharming Herbicide resistance

ĐỊNH HƯỚNG PHÁT TRIỂN GMPs

CHIẾN LƯỢC PHÁT TRIỂN GMP Ở VN

Quyết định số 11/2006/QĐ-TTg của

Chính phủ ngày 11-1-2006 về kế hoạch

phát triển cây trồng chuyển gene ở Việt

Nam với 3 giai đoạn:

- 2006 – 2010: thử nghiệm một số giống

cây trồng chuyển gene trên đồng ruộng;

- 2011- 2015 đưa một số giống cây trồng

chuyển gene vào sản xuất;

-2016 - 2020 tăng diện tích một số cây

trồng chuyển gene như ngô, bông, đậu

tương sẽ có diện tích từ 30-50% trên

toàn quốc

Các viêân nghiên cứu:

Viêân CNSH, Di truyền NN, Nhiêât đới,…

TẠO CÂY CHUYỂN GEN (GMPs)

QUY TRÌNH TẠO GMPs

1 Phân lập gen:

- Xác định gen liên quan đến tính trạng cần quan tâm

- Phân lập gen

2 Thiết kế vector:

- Gắn gen vào vector biểu hiện (expression vector) để biến nạp.

- Biến nạp vector vào Agrobacterium

- Phân tích khả năng biểu hiện gen trong cây mô hình (thuốc lá,…)

3 Biến nạp gen:

- Tối ưu khả năng tái sinh của đối tượng quan tâm nghiên cứu

- Biến nạp vào mô hoặc tế bào của đối tượng quan tâm nghiên cứu

- Chọn lọc các thể biến nạp trên môi trường chọn lọc.

- Tái sinh cây biến nạp.

4 Phân tích cây biến nạp

- Phân tích để xác nhận gen chuyển

- Đánh giá mức độ biểu hiện của gen.

QUY TRÌNH TẠO GMPs

1 Xác định gen liên quan đến

- PCR từ thư viện genomic DNA

3 Phân tích gen phân lập:

- Đọc trình tự (sequencing)

- Đổi mã amino acid, xử lý đột

biến,

PHÂN LẬP GEN

Thiết kế và tổng hợp mồi (primer):

PCR từ genomic DNA bằng cặp mồi

đặc hiệu

- Gen ít intron

- Không quá dài

- Sử dung polymerase đăặc hiêặu, đôặ

chính xác cao

PHÂN LẬP GEN

Vector là một phân tử DNA có khả năng mang một đoạn DNA ngoại lai và khi xâm nhập vào loại tế bào chủ thích hợp thì có khả năng tự tái bản không phụ thuộc vào sự sao chép của hệ gen

tế bào chủ

Vector phải đủ lớn để mang DNA

ngoại lai nhưng không quá lớn

Vector phải chứa các trình tự

kiểm soát (control sequences)

như khởi điểm tái bản (origin of

replication)

Vector phải mang một hoặc

nhiều vị trí nhận biết của enzym

THIẾT KẾ VECTOR

Promoter hay vùng (gene)

khởi động là trình tự DNA

cần thiết cho một gen tiến

hành phiên mã tổng hợp

mRNA.

- Promoter biểu hiện đặc trưng

(specific promoter): mô, cơ

quan hay một giai đoạn

phát triển.

- Promoter cơ bản

(constitutive promoter):

biểu hiện ở tất cả các mô,

các giai đoạn phát triển

THIẾT KẾ VECTOR

- Kháng kháng sinh: Neomycin phosphotransferase II- NPTII (Kan); hygromycin phosphotransferase –hpt (Hygromycin B); khác (streptomycin, bleomycin,

streptothricin, and

Chloramphenicol)

-Kháng chất diêât cỏ: bar gen (Phosphinothricin (PPT); phosphinothricin

acetyltransferase-PAT (bialaphos) –sử dụng cho loài không hiêâu quả với Kan (monocot)

- Chọn lọc bằng các chất không gây đôâc: phosphomannose isomerase (manA)

- Chọn lọc khác: isopentenyl transferase –IPT (làm tăng khả năng tái sinh chồi, nhưng hạn chế ra rễ)

Barnase (codes for a ribonuclease): cây bất dục đực; ps: túi phấn, t: bao túi phấn

Gen chọn lọc cây chuyển gen:

ĐỐI TƯỢNG

Callus – “tính toàn năng”:

Tỷ lệ tạo GMPs cao

Quá trình biến nạp lâu.

Khó khăn trên nhiều đối tượng.

ĐỐI TƯỢNG

Mô phân sinh:

- Mô phân sinh đỉnh (apical

Sàng lọc cá thể chuyển gen:

Phân tích gen biến nạp:

PCR

- Mồi đăặc hiêặu, gDNA

Đăặc điểm: dương tính giả, nhiễm cao

Southern blot (lai DNA-DNA):

- Tách DNA tổng số

- Cắt RE

- Điêặn di và chuyển màng

- Lai probe

- Hiêặn phim và phân tích

Đăặc điểm: biết được sự có măặt và số

copy của gen, phức tạp,

PHÂN TÍCH GMPs

Phân tích mức độ biểu hiện

Phân tích mức độ biểu hiện

Phân tích mức độ biểu hiện gen:

Phân tích mức độ biểu hiện gen:

- Nghiên cứu biểu hiêặn promoter

- Khả năng biểu hiêặn protein đích

PHÂN TÍCH GMPs

Đánh giá tính trạng mới:

Ở các thế hệ T0, T1, T2,…

Tính trạng mới của gen biến nạp

Ảnh hưởng tính trạng mới

Ổn định các tính trạng

Khả năng phát triển GMPs (thí nghiêặm,

thị trường)

PHÂN TÍCH GMPs