luận văn thạc sĩ nghiên cứu đặc điểm đoạn cDNAEST từ cây chè bản địa thái nguyên

MỞ ĐẦU 1 1. Lí do chọn đề tài 1 2. Mục tiêu đề tài 2 3. Nội dung nghiên cứu 2 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1 Giới thiệu chung về cây chè 3 1.1.1 Phân loại 3 1.1.2 Nguồn gốc và phân bố 3 1.1.3 Đặc điểm thực vật của cây chè 3 1.1.4 Đặc điểm di truyền của cây chè 3 1.1.5 Thành phần hóa sinh trong cây chè 3 1.1.6 Giá trị của cây chè 3 1.2 Thư viện cDNAEST 3 1.2.1 Giới thiệu về cDNAEST 3 1.2.2 Phương pháp tạo ra thư viện cDNAEST 3 1.3 Tình hình nghiên cứu gen và genome ở chè 3 1.3.1 Genome chè 3 1.3.2 Các nhóm gen chức năng ở chè 3 1.3.3 Thư viện cDNAEST ở chè 3 CHƯƠNG II. VẬt LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 4 2.1 Vật liệu 4 2.1.1 Nguyên liệu 4 2.1.2 Hóa chất, thiết bị 4 2.2 Phương pháp nghiên cứu 4 CHƯƠNG III. DỰ KIẾN KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC 5 3.1 Dự kiến kết quả 5 3.2 Tiến độ thực hiện 5 TÀI LIỆU THAM KHẢO 6

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc

Tác giả

NGUYỄN THỊ HẠNH

1

0949.141.000LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Hoàng Thị Thu Yến - Giảng

viên, phó trưởng khoa - Khoa Khoa học Sự sống - Trường Đại học Khoa học - người

đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý báu để tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn tới các cán bộ công tác tại Viện Nghiên cứu hệ gen

- Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã nhiệt tình hướng dẫn và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình làm đề tài

Nhân dịp này tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Dương Trung Dũng – giảng viên trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên đã giúp đỡ tôi trong thời gian tôi thu thập vật liệu nghiên cứu làm đề tài

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới toàn thể gia đình, cảm ơn bạn bè, đồng nghiệp và nhóm nghiên cứu di truyền đã luôn cổ vũ, động viên tôi trong suốt thời gian qua

Tác giả

NGUYỄN THỊ HẠNH

2

DANH MỤC NHỮNG TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT

DEPC Diethylpyrocarbonate

DNA Deoxyribonucleic acid

dNTP Deoxynucleoside triphosphate

DTT

EDTA Ethyen Diamin Tetraacetic Acid

EtBr Ethidium Bromide

PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase)RNA Ribonucleic Acid

SSR Simple Sequence Repeat (đoạn lặp lại trình tự đơn giản)

4

Ngoài để uống người ta còn dùng nước chè xanh để rửa các vết thương những chỗ lở loét, nhiễm trùng trên cơ thể Vì thế chè không những có tên trong danh mục giải khát mà còn có tên trong từ điển y học, dược học Người Nhật Bản khẳng định chè cứu người khỏi bị nhiễm xạ và gọi đó là thứ nước uống của thời đại nguyên tử

Ở vùng Tây Nam Trung Quốc thời cổ đại đã dùng lá chè làm vật trao đổi ngang giá

và thứ thuốc tiên Ngoài ra, cây chè còn mang lại nhiều lợi ích kinh tế xã hội như: giải quyết công ăn việc làm, đem lại nguồn thu nhập ổn định cho người dân, thúc đẩy quá trình công nghiệp hóa và hiện đại hóa nông thôn (Đỗ Ngọc Quý, Đỗ Thị Ngọc Oanh, 2008)

Chè có giá trị sử dụng và là hàng hoá có giá trị kinh tế cao, và là một sản phẩm xuất khẩu có giá trị trên thị trường thế giới.Thị trường trong nước và thế giới đòi hỏi về chè ngày càng nhiều với yêu cầu chất lượng ngày càng cao Tuy vậy, những hiểu biết về các quá trình sinh học bên trong cây chè vẫn còn rất hạn chế

Kích thước genome chè là rất lớn (khoảng 4 Gb) (Shi et al., 20110) nên việc

giải mã toàn bộ genome đòi hỏi thời gian nhiều năm và chi phí ước tính hàng chục triệu đô la Ngày nay, để làm sáng tỏ các quá trình sinh học ở chè, các nhà khoa học

cũng bắt đầu tập trung nghiên cứu cây chè ở mức độ phân tử

5

Để làm sáng tỏ vai trò và ứng dụng của chè cần phải nghiên cứu về gen và genome nhằm cung cấp các thông tin di truyền về cấu trúc và chức năng của các gen

quan trọng quy định nên sản phẩm chè Phương pháp phân lập và phân tích các đoạn trình tự gene biểu hiện (Expressed Sequence Tag, EST/cDNA) là một trong các

phương pháp sinh học phân tử hiện đại nhằm tập trung nghiên cứu các gen chức năng

Để tạo tiền đề cho các nghiên cứu cơ bản tiếp theo về cấu trúc genome và nghiên cứu sự biểu hiện các gen chức năng ở chè, chúng tôi tiến hành thực hiện đề

tài nghiên cứu: “Nghiên cứu đặc điểm đoạn cDNA/EST từ cây chè bản địa Thái Nguyên”.

2. Mục tiêu đề tài

Tạo dòng và xác định được đặc điểm trình tự đoạn cDNA/EST từ cây chè bản địa Thái Nguyên phục vụ cho các nghiên cứu sinh học phân tử tiếp theo

3. Nội dung nghiên cứu

Để đạt được mục tiêu đề tài chúng tôi tiến hành những nội dung nghiên cứu sau:

1. Nghiên cứu tạo dòng tái tổ hợp mang đoạn cDNA/EST ngẫu nhiên được tổng hợp từ mRNA của cây chè bản địa Thái Nguyên

2. Xác định và phân tích đặc điểm trình tự của đoạn cDNA/EST đã được tạo dòng từ cây chè bản địa Thái Nguyên

6

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu chung về cây chè

1.1.1 Phân loại

Cây chè có tên khoa học là Camellia sinnesis (L) O Kumtze và thuộc hệ thống

phân loại sau :

Chi chè (Camellia hoặc Thea)

Loài (Camellia sinensis)

Họ chè có 29 chi và khoảng 550 loài phân bố chủ yếu ở các nước nhiệt đới và cận nhiệt ở cả hai bán cầu, đặc biệt ở Đông và Đông Nam Á Ở Việt Nam có khoảng 11 chi với trên 200 loài

Dựa vào các đặc điểm thực vật học, đặc điểm sinh hóa, nguồn gốc phát sinh cây chè Cohen Stuart chia Camellia Sinensis ra làm bốn loại:

a) Chè Trung Quốc lá nhỏ (Camellia sinensis var Bohea)

Đặc điểm:

- Cây bụi thấp phân cành nhiều

- Lá nhỏ, dày nhiều gợn sóng, màu xanh đậm, lá dài 3,5 - 6,5 cm

- Có 6 - 7 đôi gân lá không rõ, răng cưa nhỏ, không đều

- Búp nhỏ, hoa nhiều, năng suất thấp, phẩm chất bình thường

7

- Khả năng chịu rét ở độ nhiệt -120C đến -150C.

Phân bố chủ yếu ở miền đông, đông nam Trung Quốc, Nhật Bản và một số vùng khác

b) Chè Trung Quốc lá to (Camellia sinensis var macrophylla)

Đặc điểm:

- Thân gỗ nhỡ cao tới 5m trong điều kiện sinh trưởng tự nhiên

- Lá to trung bình chiều dài 12 - 15 cm, chiều rộng 5 - 7 cm, màu xanh nhạt, bóng, răng cưa sâu không đều, đầu lá nhọn

- Có trung bình 8 - 9 đôi, gân lá rõ

- Năng suất cao, phẩm chất tốt

Nguyên sản ở Vân Nam, Tứ Xuyên (Trung Quốc)

c) Chè Shan (Camellia sinensis var Shan)

Đặc điểm:

- Thân gỗ, cao từ 6 đến 10 m

- Lá to và dài 15 - 18 cm màu xanh nhạt, đầu lá dài, răng cưa nhỏ và dày

- Tôm chè có nhiều lông tơ, trắng và mịn trông như tuyết, nên còn gọi là chètuyết - Có khoảng 10 đôi gân lá

- Có khả năng thích ứng trong điều kiện ấm ẩm, ở địa hình cao, năng suất

8

cao, phẩm chất thuộc loại tốt nhất.

Nguyên sản ở Vân Nam - Trung Quốc, miền Bắc của Miến Điện và Việt Nam

d) Chè Ấn Độ (Camellia sinensis var

assamica) Đặc điểm:

- Thân gỗ cao tới 17 m phân cành thưa

- Lá dài tới 20 - 30 cm, mỏng, mềm, thường có màu xanh đậm, dạng lá hình bầu dục, phiến lá gợn sóng, đầu lá dài

- Có trung bình 12 - 15 đôi gân lá

+ Cây chè có nguồn gốc ở Vân Nam Trung Quốc:

Nhiều công trình nghiên cứu, khảo sát trước đây cho rằng nguồn gốc của cây chè là ở Vân Nam – Trung Quốc, nơi có khí hậu ẩm ướt và ấm Theo các tài liệu Trung Quốc thì cách đây trên 4000 năm người Trung Quốc đã biết dùng chè làm dược liệu và sau đó là để uống Năm 1753, Carl Van Linnacus, nhà thực vật học lần đầu tiên trên thế giới đã xác định Trung Quốc là vùng nguyên sản của cây

chè và định tên khoa học của cây chè là Thea sinensis, phân thành 2 loại: Thea bohea và Thea viridis.

Theo Daraselia Gruzia (1989) thì các nhà khoa học Trung Quốc như: Schenpen, Jaiding, …đã giải thích cây chè mẹ ở Trung Quốc như sau: Tỉnh Vân Nam là nơi bắt đầu hàng loạt các con sông lớn đổ về các con sông ở Việt Nam, Lào, Campuchia, Mianma Đầu tiên cây chè mọc ở Vân Nam, sau đó hạt chè di chuyển theo dòng nước đến các nước nói trên và sau đó lan dần ra các nơi khác, dọc theo cao nguyên Tây Tạng.

+ Cây chè có nguồn gốc ở vùng Atxam (Ấn Độ):

Năm 1823, R.Bruce đã phát hiện được cây chè dại lá to ở vùng Atxam (Ấn Độ), từ đó các học giả người anh cho rằng: Nguyên sản của cây chè là ở vùng Atxam chứ không phải ở Vân Nam – Trung Quốc

+ Cây chè có nguồn gốc ở Việt Nam:

Những công trình nghiên cứu của Đjemukhatze (1961 – 1976) về phức catechin của lá chè từ các nguồn gốc khác nhau, so sánh về thành phần các chất catechin giữa các loại chè được trồng trọt và chè mọc hoang dại đã nêu lên luận điểm về sự tiến hóa sinh hóa của cây chè, trên cơ sở đó xác minh nguồn gốc của cây chè Đjemukhatze đã kết luận rằng những cây chè mọc hoang dại từ cổ xưa, tổng hợp chủ yếu là (-) – epicatechin galat, ở chúng có khả năng tổng hợp (-) - epigalocatechin và các galat của nó để tạo (+) galocatechin chậm hơn Nghiên cứu các cây chè dại ở Việt Nam cho thấy chủ yếu là tổng hợp (-) – epicatechin và (-) – epicatechin galat (chiếm 70% tổng các loại catechin) Khi di thực các cây chè dại này lên phía Bắc với các điều kiện khí hậu khắc nghiệt hơn, chúng sẽ thích hợp dần với các điều kiện sinh thái bằng cách có thành phần catechin phức tạp hơn, cùng với tạo thành (-) epigalocatechin và các galat của nó Điều đó có nghĩa là trao đổi chất ở đây hướng về phía tăng cường quá trình hidroxil hóa và galil hóa Từ những biến đổi hóa sinh này của các cây chè dại và cây chè được

trồng trọt, chăm sóc cho phép đi tới một kết luận mới là “ Nguồn gốc cây chè chính là ở Việt Nam” Từ đó có sơ đồ tiến hóa cây chè thế giới sau đây: Camellia

→ Chè Việt Nam → Chè Vân Nam lá to → Chè Trung Quốc → Chè Assam (Ấn Độ )

Tuy có sự khác nhau nhưng quan điểm nêu trên đều có sự thống nhất rằng:

cây chè có nguồn gốc từ Châu Á, nơi có điều kiện khí hậu nóng, ẩm.

Hiện nay cây chè phân bố khá rộng rãi trong những điều kiện tự nhiên rất khác nhau, từ 30 vĩ độ nam (Natan – Nam Phi) đến 45 vĩ độ bắc (Gruzia – Liên Xô), là những nơi có điều kiện tự nhiên rất khác xa vùng nguyên sản

b) Phân bố

Sự phân bố của cây chè phụ thuộc nhiều vào điều kiện khí hậu Các kết quả nghiên cứu đều đưa đến một kết luận chung là: Vùng khí hậu nhiệt đới, á nhiệt đới thích hợp cho cây chè Ngày nay, do trình độ khoa học kỹ thuật ngày càng phát triển đã lai tạo, chọn lọc ra nhiều giống chè khác nhau và được trồng rộng rãi

ở nhiều nước khác nhau trên thế giới Theo Đỗ Ngọc Quỹ[10], thì hiện nay chè được phân bố khá rộng từ 42º vĩ Bắc Pochi (Liên Xô cũ) đến 27º Nam Coriente (Achentina)

Sự phân bố của cây chè theo điều kiện khí hậu đất đai và địa hình cũng có sự khác nhau Đất trồng chè tốt phải nhiều mùn, thoát nước tốt và có độ dốc thoải Ảnh hưởng của độ cao đã hình thành nên các vùng chè với nhiều giống chè, chất lượng khác nhau Các nhà khoa học cho rằng: Chè trồng ở những vùng có độ cao lớn hơn so với mặt nước biển thường có chất lượng tốt hơn so với chè trồng ở vùng thấp

Về điều kiện khí hậu, chè sinh trưởng tốt ở điều kiện nhiệt độ từ 15ºC đến 20ºC, tổng nhiệt độ hàng năm vào khoảng 8.000ºC; lượng mưa trung bình hàng năm 1500 – 2000 mm; độ ẩm đất 70 - 80% Tuy nhiên với khả năng thích nghi rộng cùng với sự tiến bộ của khoa học hiện nay chè được trồng ở những vùng khắc nghiệt hơn

1.1.3 Đặc điểm thực vật của cây chè

Cây chè có bộ nhiễm sắc thể lưỡng bội 2n = 30, thuộc loại thân gỗ hoặc thân bụi và được trồng để thu lá làm nguyên liệu cho công nghiệp chế biến và mang một số đặc điểm sinh học sau đây:

Đặc điểm hình thái

Thân: Thẳng và tròn, phân nhánh liên tục thành một hệ thống cành và chồi

Trên thân có mấu chia thành nhiều lóng.

Cành: Do mầm dinh dưỡng biến đổi thành Trên cành chia ra làm nhiều đốt,

chiều dài đốt cành biến đổi từ 1 – 10 cm tùy theo giống và điều kiện sinh trưởng Tùy theo lứa tuổi mà màu sắc cành chè biến đổi từ màu xanh thẫm, xanh nhạt, màu đỏ, màu nâu và khi cành già có màu xám

Chồi: Mọc ra từ nách lá, chia theo sự biệt hóa của chồi có chồi dinh dưỡng

mọc ra lá và chồi sinh thực mọc ra nụ, hoa, quả Chia theo vị trí trên cành có: chồi ngọn (đỉnh), chồi nách, chồi ngủ (trong cành)

Lá: Lá chè là loại lá hình đơn nguyên, có hệ gân lá rất rõ, rìa lá có răng cưa,

chiều dài từ 4 – 15 cm, rộng từ 2 – 5 cm Mặt phiến lá có thể nhẵn, lồi lõm, láng bóng Hệ gân lá hình mạng lông chim Lá chè có thể có hình thuôn, mũi mác, ô van, trứng gà, gần tròn Gốc lá nhọn, tròn đến tù; chóp lá nhọn tù Lá chè thường thay đổi về hình dạng, màu sắc và kích thước tùy theo giống, điều kiện tự nhiên

và điều kiện canh tác Các độ tuổi khác nhau của lá chè tạo ra các các sản phẩm chè có chất lượng khác nhau do thành phần hóa học trong các lá này khác nhau

Hoa: Hoa chè là loại hoa lưỡng tính, trong hoa có 5 - 8 cánh màu trắng, có khi

lại hơi phớt hồng Tràng có 5 - 9 cánh màu trắng hay phớt hồng, bộ nhị đực trung bình có 200 - 300 cái; bao phấn có hai nửa bao, chia 4 túi phấn, hạt phấn hình tam giác màu vàng nhạt (khi chín màu hoàng kim) Bầu nhị cái có 3 - 4 ô, chứa 3 - 4 noãn, ngoài phủ lớp lông tơ, núm nhị cái chẻ ba Ở gốc bầu nhụy có tuyến mật làm thành một vòng tròn gọi là đĩa

Quả: Quả chè là một loại quả nang có từ 1 - 4 hạt Quả chè có dạng hình tròn,

tam giác, vuông tùy theo số hạt Khi còn non quả chè có màu xanh, khi chín chuyển xang màu xanh thẫm hoặc nâu Khi quả chín vỏ nứt ra giải phóng các hạt chè Kích thước của hạt phụ thuộc vào giống, kỹ thuật canh tác Hạt chè có khối lượng từ 0,6 – 2g thường từ 1- 1,6g

Hạt: Hình cầu, bán cầu, tam giác tùy giống chè; vỏ sành thường màu nâu,

cứng, bên trong là lớp vỏ mỏng

Hệ rễ: Gồm rễ cọc (trụ), rễ dẫn (hay rễ nhánh, rễ bên) màu nâu hay nâu đỏ và

rễ hút hay rễ hấp thụ màu vàng ngà

Đặc tính sinh lý, sinh thái của cây chè

Nhiệt độ không khí thuận lợi cho sự sinh trưởng và phát triển của chè là 22 -

28oC, độ ẩm không khí tương đối thích hợp là 80 - 85 % Hàm lượng nước cần thiết cho cây chè biến động tùy từng giống chè Loại đất thích hợp cho trồng chè dày 60 – 100 cm; mực nước ngầm dưới 100 cm; độ chua pH: 4,5 - 5,5; tỷ lệ mùn

3 - 4 %

Sinh trưởng và phát triển của cây chè

Sự phát triển của cây chè chia làm hai chu kỳ: Chu kì phát triển lớn gồm suốt đời sống cây chè từ khi hạt nảy mầm đến khi cây chết và chu kì phát triển nhỏ bao gồm các giai đoạn sinh trưởng, phát triển lặp lại nhiều lần trong một năm

1.1.4 Đặc điểm di truyền của cây chè

Chè là loại cây trồng quan trọng ở nhiều nơi trên thế giới nhưng cho đến nay, vẫn chưa có nhiều thông tin về hệ gen của cây chè Những nghiên cứu trước đây

đã cho ra những kết quả rất khác nhau Năm 2001, nghiên cứu của Hanson cho

thấy kích thước bộ gen của cây chè Camellia sinensis vào khoảng 15.298 Mbp

Tuy nhiên gần đây, nghiên cứu của Tanaka và Taniguchi (năm 2007) trên các giống chè Nhật Bản lại cho thấy kích thước bộ gen của cây chè được ước tính khoảng 4 Gbase Nghiên cứu tế bào học các giống chè của Kondo (1979) đã xác định cây chè là loài thực vật lưỡng bội (2n = 30, số nhiễm sắc thể cơ sở là 15)

và kiểu nhân (karotype) biến đổi khác nhau giữa các giống chè

Nói chung, các nhiễm sắc thể của chè có kích thước nhỏ và có xu hướng kết

lại với nhau thành khối Giá trị r (tỷ lệ chiều dài giữa cánh dài và cánh ngắn

của nhiễm sắc thể) của 15 cặp nhiễm sắc thể trong khoảng 1,00 đến 1,9 Sự đồng nhất của các nhiễm sắc thể lưỡng bội cho thấy đặc điểm cùng nguồn

(monophyletic) tất cả các loài thuộc chi Camellia.

1.1.5 Thành phần hóa sinh trong cây chè

Phẩm chất của chè thành phẩm được quyết định do những thành phần hóa học của nguyên liệu và kỹ thuật chế biến Thành phần sinh hóa của chè biến động rất phức tạp nó phụ thuộc vào giống, tuổi chè, điều kiện đất đai, địa hình,

kỹ thuật canh tác, mùa thu hoạch Trên cơ sở nắm được những đặc điểm chủ yếu về mặt sinh hóa của nguyên liệu sẽ đặt cơ sở cho một số biện pháp kỹ thuật

để nâng cao sản lượng đồng thời giữ vững và nâng cao chất lượng của chè Những thành phần sinh hóa chủ yếu trong búp chè gồm có:

Nước: Nước là thành phần chủ yếu trong búp chè: nước có quan hệ đến quá

trình biến đổi sinh hóa trong búp chè và đến sự hoạt động của các men, là chất quan trọng không thể thiếu được để duy trì sự sống của cây Hàm lượng nước trong búp chè thay đổi tùy theo giống, tuổi cây, đất đai, kỹ thuật canh tác, thời gian hái và tiêu chuẩn hái v.v Trong búp chè (tôm + 3 lá) hàm lượng nước

thường có từ 75 - 82% Để tránh khỏi sự hao hụt những vật chất trong búp chè qua quá trình bảo quản và vận chuyển, phải cố gắng tránh sự giảm bớt nước trong búp chè sau khi hái

Tanin: Tanin là một trong những thành phần chủ yếu quyết định đến phẩm

chất chè Tanin còn gọi chung là hợp chất fenol, trong đó 90% là các dạng

catechin Tỷ lệ các chất trong thành phần hỗn hợp của tanin chè không giống nhau và tùy theo từng giống chè mà thay đổi Những hợp chất này dựa vào tính chất của chúng có thể phân thành:

- Dạng tan được trong este: phân tử lượng 320 - 360

- Dạng tan trong nước hoặc xeton: phân tử lượng 420 - 450

- Dạng kết hợp với protein (chỉ sau khi dùng dung dịch NaOH 0,5% để xử lý, mới có thể hòa tan trong dung dịch)

Các dạng catechin như epicatechin galat, epigalocatechin galat tham gia vào quá trình sinh trưởng của cây

Về mặt phẩm chất chè, tanin giữ vai trò chủ yếu trong việc tạo thành màu sắc, hương vị của chè (nhất là đối với việc chế biến chè đen), vì vậy trong quá trình trồng trọt cần chú ý nâng cao hàm lượng tanin trong nguyên liệu.

Tanin được dùng trong y học để làm thuốc cầm máu, nó có khả năng tăng cường sức đề kháng của thành huyết quản trong cơ thể động vật, tăng cường sự tích lũy và đồng hóa sinh tố C

Ancaloit: Trong chè có nhiều loại ancaloit nhưng nhiều nhất là cafein Hàm

lượng cafein ở trong chè có từ 3 - 5% thường nhiều hơn cafein ở trong lá cà phê

từ 2 - 3 lần Nó không có khả năng phân ly ion H+ tức là không có tính axít mà chỉ là một kiềm yếu Cafein chỉ hòa tan trong nước với tỷ lệ 1/46, rất dễ hòa tan trong dung môi clorofoc Cafein có tác dụng kích thích hệ thần kinh trung ương, kích thích cơ năng hoạt động của tim, có tác dụng lợi tiểu Cafein rất bền vững trong chế biến Nó có khả năng kết hợp cới tanin để tạo thành hợp chất tanat cafein có hương vị dễ chịu Theo tài liệu của Roberto, hợp chất tanat cafein được tạo thành chủ yếu từ cafein, teaflavin, tearubigin, teaflavingalat Ngoài ra còn có

sự tham gia của ECG và EGCG

Protein và axít amin: Protein là hợp chất hữu cơ phức tạp chứa N, phân bố

không đều ở các phần của búp chè và thay đổi tùy theo giống, thời vụ, điều kiện canh tác và các yếu tố khác Protein có thể trực tiếp kết hợp với tanin, polifenol tạo ra những hợp chất không tan làm ảnh hưởng xấu đến phẩm chất chè đen Do

đặc điểm của việc chế biến chè xanh là diệt men ngay từ đầu, nên hàm lượng

tanin trong chè ít bị thay đổi và còn quá cao làm cho chè có vị đắng Protein kết hợp với một phần tanin làm cho vị chát và đắng giảm đi Vì thế trong một chừng mực nào đó, protein có lợi cho phẩm chất chè xanh

Ngày nay người ta đã tìm thấy trong chè có 17 axít amin, các axít amin này kết hợp với đường và tanin tạo thành andehit có mùi thơm của chè đen và làm cho chè xanh khác

Gluxít và pectin: Trong lá chè chứa rất ít gluxít hòa tan, trong khi đó các

gluxít không hòa tan lại chiếm tỷ lệ lớn Xenlulo và hemixenlulo cũng tăng lên

theo tuổi của lá, vì vậy nguyên liệu càng già chất lượng càng kém Hàm lượng đường hòa tan ở trong chè tuy ít nhưng rất quan trọng đối với hương vị chè Đường tác dụng với protein hoặc axít amin tạo nên các chất thơm

Pectin thuộc về nhóm gluxít và nó là hỗn hợp của các polixacarit khác nhau

và những chất tương tự chúng ở trong chè, pectin thường ở dạng hòa tan trong nước, tan trong axít oxalic, tan trong amon oxalat Pectin tham gia vào việc tạo thành hương vị chè, làm cho chè có mùi táo chín trong quá trình làm héo ở mức

độ vừa phải, pectin làm cho chè dễ xoăn lại khi chế biến nhưng nó có ảnh hưởng xấu đến quá trình bảo quản chè thành phẩm vì pectin dễ hút ẩm

Diệp lục và các sắc tố khác gần nó: Trong lá chè có chứa diệp lục tố, carotin

và xantofin Các sắc tố này biến động theo giống, theo mùa và các biện pháp kỹ thuật canh tác

Trong chè thành phẩm diệp lục tố có ảnh hưởng xấu tới phẩm chất của chè bởi vì làm cho sản phẩm có màu xanh, mùi hăng, vị ngái

Dầu thơm: Dầu thơm ở trong chè rất ít, hàm lượng của chúng trong lá chè

tươi: 0,007% - 0,009% và trong chè bán thành phẩm: 0,024 - 0,025% Hàm lượng dầu thơm trong lá chè, được tăng dần ở những địa hình cao, tuổi lá quá non chứa ít hương thơm Dầu thơm ảnh hưởng trực tiếp đến hương vị của chè do hương thơm tự nhiên và do quá trình chế biến tạo thành như sự lên men, ôxi hóa, tác dụng của độ nhiệt cao

Dầu thơm có tác dụng điều tiết sinh lý của cây để thích hợp với điều kiện bên ngoài (khi độ nhiệt quá cao hay quá thấp) và ngăn cản những bức xạ có bước sóng ngắn, tác hại đến cây chè Đối với cơ thể con người dầu thơm có tác dụng kích thích hệ thần kinh trung ương làm cho tinh thần minh mẫn, thoải mái dễ chịu nâng cao hiệu suất làm việc của các cơ năng trong cơ thể

Vitamin: Các loại vitamin có trong chè rất nhiều Chính vì vậy giá trị dược

liệu cũng như giá trị dinh dưỡng của chè rất cao Theo các tài liệu của Trung

Quốc, hàm lượng một số vitamin trong chè tính theo mg/1.000g chất khô như

sau: Vitamin A: 54,6; B1: 0,70; B2: 12,20; PP: 47,0; C: 27,0 v.v

Đáng chú ý nhất là hàm lượng vitamin C ở trong chè, nhiều hơn trong cam chanh từ 3 đến 4 lần Quá trình chế biến chè đen làm cho vitamin C giảm đi

nhiều vì nó bị ôxi hóa, còn trong chè xanh thì nó giảm đi không đáng kể

Men: Men là nhân tố quan trọng của sự sống Men quyết định chiều

hướng phát triển của mọi phản ứng hóa học xảy ra trong cơ thể sinh vật và

chúng là chất kích động tất cả các biến đổi hóa học

Trong búp chè non có hầu hết các loại men, nhưng chủ yếu gồm hai nhóm chính:

- Nhóm thủy phân: men amilaza, glucoxidaza, proteaza và một số men khác

- Nhóm ôxi hóa khử: Chủ yếu là hai loại men: peroxidaza và polifenoloxidaza

Chất tro: Các nguyên tố tro giữ vai trò quan trọng trong hoạt động của cơ

thể sống, chúng là những nhân tố của sự thay đổi trạng thái các chất keo và ảnh hưởng trực tiếp đến sự trao đổi chất của tế bào Hàm lượng tro trong chè tươi từ 4-5% và trong chè khô từ 5-6% Trong chè, tro chia thành hai nhóm: hòa tan

trong nước và không hòa tan trong nước Chè thành phẩm loại tốt, hàm lượng tro

ít hơn so với loại chè xấu nhưng tỷ lệ chất tro hòa tan lại nhiều hơn

1.1.6 Giá trị của cây chè

Cây chè là loại cây công nghiệp lâu năm, mau cho sản phẩm, cho hiệu quả kinh tế cao, có đời sống kinh tế lâu dài Chè trồng một lần, có thể thu hoạch 30 -

40 năm hoặc lâu hơn nữa Chè được dùng làm nước uống từ thời xa xưa, đến nay đã trở thành một thức uống lý tưởng được nhân trên thế giới ưa dùng Có giá trị về nhiều mặt như: thực phẩm, dược liệu, kinh tế xã hội, văn hóa…

Giá trị về mặt thực phẩm: Trong chè có các thành phần hóa học giàu chất dinh

dưỡng, có tác dụng tốt đối với cơ thể con người như hỗn hợp tanin chè có khả

năng giải khát, chữa một số bệnh đường ruột (tả, lỵ, thương hàn), các loại protein, vitamin, muối khoáng… Cafein và một số alcoloit khác là chất có thể kích thích hệ thần kinh trung ương, vỏ cầu đại não, giúp tăng cường sự hoạt động của cơ thể, giảm mệt nhọc

Giá trị y học: Nước chè tươi còn giảm được các quá trình viêm như viêm

khớp, viêm gan mãn tính, tăng cường tính đàn hồi của thành mạch máu Uống chè giảm nguy cơ tim mạch, chống lão hóa, chống nhiễm độc Mới đây nhất, các nhà khoa học còn phát hiện ra chè còn có tác dụng chống khả năng gây ung thư của các chất phóng xạ Người ta đã trích ly các chất trong chè để điều chế các thuốc trợ tim, cầm máu, lợi tiểu… Những giá trị tiềm ẩn của cây chè vẫn còn đang được quan tâm nghiên cứu

Giá trị về mặt kinh tế xã hội: Cây chè giữ vai trò quan trọng trong cơ cấu cây

trồng nông nghiệp, sản phẩm chè là mặt hàng xuất khẩu quan trọng của ngành nông nghiệp Việt Nam Sản xuất chè đã góp phần tạo công ăn việc làm, xóa đói giảm nghèo, tạo nguồn thu nhập ổn định cho người dân và thúc đẩy quá trình công nghiệp hóa, hiện đại hóa nông thôn, nhất là vùng Trung du và miền núi

Ngoài ra, trồng chè còn giúp phủ xanh đất trống đồi trọc, chống sói mòn đất, bảo vệ môi trường…

Giá trị về mặt văn hóa: Lá chè được sử dụng không chỉ để chế biến thức uống

phục vụ nhu cầu của con người, mà từ lâu chè thành phẩm đã trở thành nét văn

hóa đặc trưng của nhiều quốc gia Uống chè là nét văn hóa lâu đời của người Việt

Nam, mang một giá trị thiêng liêng, cao quý trong đời sống tinh thần của con người Thưởng thức chè là một thú vui tao nhã, tạo được cảm hứng trong văn thơ, hội họa… Ở Việt Nam chè không thể thiếu trong lễ nghi giao tiếp, giáo dục, cưới xin, ma chay, hội hè…

1.2 Thư viện cDNA/EST

1.2.1 Giới thiệu về cDNA/EST

a) Định nghĩa

EST là một phần nhỏ của trình tự DNA (thường dài từ 200 - 500 nucleotide) được tạo ra từ một hoặc cả hai đầu của một gen biểu hiện (từ đầu 5’ hay 3’ của cDNA) Gồm có 5’EST và 3’EST

b) Nguyên nhân hình thành và ứng dụng của EST

Các nhà nghiên cứu đang lao động một cách cần mẫn để giải trình tự và thu thập

bộ gen của rất nhiều loại sinh vật, bao gồm chuột và người, với một số lượng lớn vì những lí do quan trọng

Mặc dù những mục tiêu quan trọng của bất kì dự án giải trình tự nào đều có thể

có được trình tự gen và xác định được một tập hợp hoàn chỉnh của gen, nhưng mục tiêu cuối cùng là đạt đến tầm hiểu biết về việc khi nào, vị trí nào và bằng cách nào mà một gen được hoạt hóa, một tiến trình mà thường được xem là sự biểu hiện gen

Một khi chúng ta bắt đầu tìm hiểu vị trí nào và bằng cách nào một gen được biểu hiện dưới những điều kiện thông thường, sau đó chúng ta có thể nghiên cứu điều

gì xảy ra trong một trạng thái đã thay đổi, ví dụ như trường hợp bị nhiễm bệnh Tuy nhiên, để thực hiện được mục tiêu sau cùng, các nhà nghiên cứu phải xác định và nghiên cứu về protein, hay những protein mà nó được mã hóa bởi một gen nào đó

Việc tìm thấy một gen mã hóa cho một protein hoặc nhiều protein là điều không dễ dàng Như trước đây các nhà nghiên cứu sẽ bắt đầu cuộc tìm kiếm bằng cách định rõ một vấn đề sinh học và phát triển thành một chiến lược cho việc nghiên

cứu vấn đề đó Thông thường, việc tìm tài liệu khoa học thường cung cấp nhiều dẫn chứng cho việc tiến hành như thế nào Ví dụ, các phòng thí nghiệm khác có thể công

bố dữ liệu mà đã thiết lập sự liên kết giữa một protein và một căn bệnh được quan tâm Các nhà nghiên cứu sau đó sẽ làm việc để phân lập protein, xác định chức năng của nó, và định vị gen mã hóa cho protein

Một cách khác, các nhà khoa học sẽ tiến hành những nghiên cứu di truyền để xác định vị trí nhiễm sắc thể của một gen đặc biệt Một khi vị trí nhiễm sắc thể đã được xác định, các nhà khoa học sẽ sử dụng những phương pháp hóa sinh để phân lập gen và protein tương ứng Dù bằng cách nào thì những phương pháp này đều tốn nhiều thời gian, có trường hợp nhiều năm, và kết quả là chỉ có vị trí và sự miêu tả của một số lượng phần trăm nhỏ của gen đƣợc tìm thấy

Tuy nhiên, thời gian đòi hỏi cho việc định vị và mô tả hoàn toàn một gen

đã giảm xuống đáng kể nhờ sự phát triển và hướng tiếp cận của một kĩ thuật được dùng để tạo ra Expressed Sequence Tag hay EST EST cung cấp cho nhà nghiên cứu một phương pháp nhanh chóng và không tốn kém cho việc khám phá các gen mới, tìm được dữ liệu về sự biểu hiện và điều hòa gen, và cho việc thành lập bản đồ gen

Ý tưởng là giải trình tự những mảnh DNA mà chúng đại diện cho những gen biểu hiện trong tế bào, mô hay cơ quan nào đó từ những sinh vật khác nhau

và sử dụng những sự đánh dấu này để tìm ra được gen bằng sự bắt cặp giữa các nucleotide Thách thức kết hợp việc xác định gen từ trình tự bộ gen biến đổi giữa các sinh vật và độc lập với kích thước bộ gen cũng như sự hiện diện hay vắng mặt của intron, nó là những trình tự DNA xen vào làm gián đoạn trình tự

mã hóa protein của một gen

c) Sự hình thành EST

cDNA đại diện cho 1 gen biểu hiện đã được phân lập, các nhà khoa học sau

đó có thể giải trình tự vài trăm nucleotide từ đầu này hay đầu kia của phân tử để tạo ra hai loại EST khác nhau