Đề tài nhân nhanh in vitro cây hoắc hương qua giai đoạn mô sẹo

TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 1. Tên đề tài Nhân nhanh in vitro cây hoắc hương qua giai đoạn mô sẹo 2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu Thí nghiệm được tiến hành trên cây hoắc hương (Pogostemon cablin (Blanco) Benth.) 3. Mục tiêu Nhằm tạo được nguồn giống cây trồng đồng đều, sạch bệnh, giữ được các đặc tính quý của nguyên liệu ban đầu. 4. Kết quả chính 1. Trong các môi trường sử dụng để nghiên cứu tạo mô sẹo từ thân và lá cây hoắc hương thì môi trường MS + 20 gl đường + 10 gl agar + 1,5 mgl 2,4D là môi trường tốt nhất cho tạo mô sẹo. 2. Môi trường MS + 20 gl đường + 10 gl agar + 1,5 mgl 2,4D + 0,5 gl THT là môi trường chứa than hoạt tính với nồng độ tốt nhất cho tạo mô sẹo. 3. Môi trường phù hợp nhất cho nhân nhanh mô sẹo là môi trường MS + 20 gl đường + 10 gl agar + 1,5 mgl 2,4D + 0,5 gl THT + 1,0 mgl BAP. 4. Môi trường thích hợp nhất cho tái sinh chồi từ mô sẹo là môi trường MS+ 20 gl đường + 10gl agar + 0,5 mgl THT + 1 mgl kinetin.

TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

1 Tên đề tài

Nhân nhanh in vitro cây hoắc hương qua giai đoạn mô sẹo

2 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Thí nghiệm được tiến hành trên cây hoắc hương (Pogostemon cablin

(Blanco) Benth.)

3 Mục tiêu

Nhằm tạo được nguồn giống cây trồng đồng đều, sạch bệnh, giữ được các đặc tính quý của nguyên liệu ban đầu

4 Kết quả chính

1 Trong các môi trường sử dụng để nghiên cứu tạo mô sẹo từ thân và lá cây hoắc hương thì môi trường MS + 20 g/l đường + 10 g/l agar + 1,5 mg/l 2,4-D là môi trường tốt nhất cho tạo mô sẹo

2 Môi trường MS + 20 g/l đường + 10 g/l agar + 1,5 mg/l 2,4-D + 0,5 g/l THT là môi trường chứa than hoạt tính với nồng độ tốt nhất cho tạo mô sẹo

3 Môi trường phù hợp nhất cho nhân nhanh mô sẹo là môi trường MS +

20 g/l đường + 10 g/l agar + 1,5 mg/l 2,4-D + 0,5 g/l THT + 1,0 mg/l BAP

4 Môi trường thích hợp nhất cho tái sinh chồi từ mô sẹo là môi trường MS+ 20 g/l đường + 10g/l agar + 0,5 mg/l THT + 1 mg/l kinetin

MỞ ĐẦU

Hiện nay, nhu cầu của con người về các nguồn dược liệu ngày càng tăng Nguồn dược liệu con người đang sử dụng có thể được tổng hợp từ nhiều con đường khác nhau như tổng hợp hóa học, tổng hợp từ vi sinh vật… song nguồn dược liệu từ thực vật đã được sử dụng từ lâu và giữ vị trí quan trọng Tuy nhiên, các loài dược liệu trong tự nhiên đang bị giảm về số lượng và chất lượng bởi sự khai thác quá mức của con người cũng như bởi các điều kiện của môi trường tự nhiên ngày càng bất lợi, nhiều loài dược liệu quý hiếm bị tuyệt chủng và đe dọa tuyệt chủng, ảnh hưởng đến nguồn cung cấp dược liệu bền vững cho con người [14]

Hoắc hương có tên khoa học là Pogostemon cablin (Blanco) Benth có

nguồn gốc từ Philippin Hiện nay chúng được trồng ở các vùng nhiệt đới như Châu Á và Châu Phi với qui mô lớn để lấy tinh dầu Tinh dầu hoắc hương là một trong những nguyên liệu tự nhiên quan trọng nhất được sử dụng làm nước hoa và nhiều sản phẩm khác [5] Ngoài tác dụng lấy tinh dầu, hoắc hương có mặt trong hàng trăm đơn thuốc với nhiều công dụng, đặc tính chữa bệnh khác nhau như: kháng khuẩn, kháng nấm, chống viêm, chống nôn, điều hòa tì vị, chữa đau bụng,

ợ khan, hôi miệng, thổ tả, ỉa chảy, khó tiêu, sôi bụng…[5]

Ở Việt Nam, hoắc hương phân bố khắp cả nước, song tập trung nhiều ở một số tỉnh miền bắc như: Hà Nội, Hưng Yên, Vĩnh Phúc… Nhìn chung, điều kiện nước ta phù hợp cho sự sinh trưởng, phát triển của hoắc hương và cho chất lượng tinh dầu cao hơn so với các nước đang sản xuất tinh dầu hoắc hương trên thế giới [10] Tuy nhiên, trong nhiều năm qua việc nghiên cứu, trồng và sử dụng hoắc hương còn rất hạn chế Vì vậy, vấn đề đặt ra là phải cung cấp đủ nguồn

nguyên liệu đáp ứng cả về số lượng và chất lượng cho việc sản xuất các sản phẩm từ hoắc hương.

Với những lợi thế nhất định việc nghiên cứu quy trình nhân nhanh in vitro

các giống cây luôn là một sự lựa chọn quan trọng và đã mang lại thành công cho việc nhân nhanh và bảo quản cũng như bảo tồn nhiều loài cây có giá trị Hơn thế

từ nguyên liệu là mô sẹo trong nuôi cấy có thể sử dụng để tái sinh cây phục vụ mục đích nhân nhanh cây giống hay có thể sử dụng làm nguyên liệu trực tiếp để sản xuất tinh dầu, nuôi cấy tế bào trần, chọn dòng tế bào…

Xuất phát từ những vấn đề thực tế trên và với hy vọng tiếp tục đóng góp một phần vào nghiên cứu cây hoắc hương ở Việt Nam, chúng tôi đã lựa chọn đề

tài: “Nhân nhanh in vitro cây hoắc hương qua giai đoạn mô sẹo” với mục

đích tạo ra mô sẹo phục vụ cho mục đích nhân giống in vitro và thu nhận tinh

dầu hoắc hương từ mô sẹo

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU1.1 Giới thiệu khái quát về cây hoắc hương

1.1.1 Đặc điểm phân loại

Hoắc hương (Pogostemon cablin (Blanco) Benth.) tên tiếng Anh là

Patchouli oil plant được Blanco mô tả vào năm 1837 và được Bentham xác định

- Lớp phụ: Asteridae (phân lớp hoa môi)

- Bộ: Lamiales (hoa môi)

- Họ: Lamiaceae (bạc hà)

- Chi: Pogostemon Desf

- Loài: Pogostemon cablin ( Blanco) Benth.

Trong y học, hoắc hương còn được biết đến với nhiều tên gọi khác nhau như: Hợp hương, Tô hợp hương, Hoắc khử bệnh, Linh lung hoắc khử bệnh (Hòa hán dược khảo), Đầu lâu bà hương (Lăng nghiêm kinh), Đa ma la bạt hương

(Pháp hoa kinh), Bát đát la hương (Kim quang minh kinh), Gia toán hương (Niết bàn kinh), Quảng hoắc hương, Quảng hoắc ngạnh, Tiên hoắc hương (Trung Quốc dược học đại từ điển), Thổ hoắc hương (Trấn nam bản thảo), Thanh kinh bạc hà (Quảng Tây bản thảo tuyển biên), Miêu vĩ ba hương, Miêu ba hổ (Liễu Ninh thảo dược), Lục hà hà (Phúc Kiến dược vật chí), Ngư hương, Kê tô, Thủy

ma diệp (Tứ Xuyên trung dược) Tuy nhiên, cần phải lưu ý để phân biệt giữa cây

hoắc hương với cây hoắc hương núi có tên khoa học là: Agastache rugosus (fisch

et meyer) O Katze, tên tiếng anh là: wrrinkle giant [26]

Hình 1.1 Cây và hoa hoắc hương (Pogostemon cablin (Blanco) Benth.)

trong tự nhiên

1.1.2 Đặc điểm hình thái

Hoắc hương là cây thảo sống lâu năm, cao 30-60 cm Thân non hình trụ vuông, phân nhiều cành, cành hơi cong, dài 30-60 cm, đường kính 2-7 mm Thân già hình trụ, đường kính 10-12 mm, lớp bần màu nâu xám

Lá đơn mọc đối, hình trứng hoặc hình elip, dài 5 - 12 cm, rộng 2,5 - 8 cm,

cả hai mặt lá màu trắng xám, có lông mượt như nhung, chóp lá hơi nhọn hoặc tròn, gốc lá vát nhọn hoặc tròn, mép lá có răng cưa ngắn, mùi thơm đặc biệt, vị hơi đắng [2], [26]

Cụm hoa hình chùm, gồm các bông mọc đối nhau ở đầu cành hoặc kẽ lá, dài 4 - 6 cm, hoa nhỏ không có cuống màu hồng hoặc tím nhạt Lá bắc nhỏ, hình mác, có lông dày Đài hoa hình ống dài 7 - 9 mm, mặt ngoài phủ nhiều lông, mặt trong ít lông hơn Tràng hoa chia thành hai môi, môi trên kéo dài, nhị bốn thò ra khỏi tràng, chỉ nhị rời, phần giữa có lông [1], [2], [27]

Quả gần hình cầu, hơi dẹt, có hạt cứng Cây hiếm thấy ra hoa và quả Hạt

có rất ít nội nhũ

1.1.3 Điều kiện sinh thái

Nhiệt độ: hoắc hương là cây nhiệt đới, nhiệt độ thích hợp cho cây sinh trưởng và phát triển là từ 22-28oC Nhiệt độ quá cao hoặc quá thấp kéo dài đều

có thể làm cây bị chết nhanh chóng Do đó, việc lựa chọn thời gian trồng cây hoắc hương có ảnh hưởng lớn đến năng suất và chất lượng tinh dầu Nếu trồng cây vào cuối đông thì thời gian sinh trưởng kéo dài Nếu cây trồng vào mùa hè (tháng 3 hoặc tháng 4) cây sinh trưởng nhanh, sớm cho thu hoạch nhưng năng suất thấp do sự rút ngắn thời gian về tổng hợp và tích lũy chất thứ cấp Vì vậy, thời vụ tốt nhất để trồng hoắc hương ở nước ta là vào mùa xuân hay đầu hè [1]

Độ ẩm: hoắc hương là cây ưa ẩm, lượng mưa trung bình từ 1500-3000

mm, độ ẩm tương đối 75% là thích hợp cho sinh trưởng của hoắc hương [9] Thiếu độ ẩm cây thường dẫn đến khô cằn, lá nhỏ và quăn, ở điều kiện mùa hè (tháng 6 , tháng 7) khi nhiệt độ cao, nếu tưới tiêu không tốt cây sẽ bị chết Ngược lại thời tiết mưa nhiều hay ngập úng cây thường ngả sang màu vàng và chết nhanh chóng [10]

Ánh sáng: ánh sáng không có tác dụng trực tiếp lên quá trình tổng hợp tinh dầu song nó có tác dụng lên quá trình tích lũy tinh dầu trong cây Màu sắc lá, độ dày cũng như kích thước lá có thể thay đổi khi trồng ở các vùng ánh sáng khác nhau Vùng có cường độ chiếu sáng mạnh lá thường có màu xanh tím, lá nhỏ và dày Còn ở những nơi có cường độ chiếu sáng yếu lá thường có màu xanh tươi,

lá to và mỏng hơn [10] Điều đó một phần thể hiện sự thích nghi của cây, mặt khác sẽ ảnh hưởng đến sự tích lũy cũng như chất lượng tinh dầu hoắc hương [10] Nhìn chung hoắc hương là cây ưa bóng, với điều kiện ở nước ta nếu che khoảng 50% ánh sáng tự nhiên thì cây sẽ sinh trưởng nhanh và cho chất lượng tinh dầu ổn định Do đó nhân dân ở các địa phương thường trồng xen hoắc hương với chuối, chanh hay các cây ăn quả khác [5], [10]

Ngoài các yếu tố trên thì đất là một yếu tố rất quan trọng Đất phù hợp cho cây hoắc hương là đất mùn, giàu chất hữu cơ, độ pH = 5,5 - 6,2 Các loại đất có khả năng giữ nước kém như đất cát không phù hợp cho sinh trưởng của cây hoắc hương [26]

1.1.4 Phân bố, thu hái và chế biến

a) Phân bố

Hoắc hương là loài cây trồng tương đối phổ biến ở vùng nhiệt đới châu Phi và châu Á Ở Ấn Độ, Malaixia, Philippin, Mangat và Indonexia, người ta trồng hoắc hương để chưng cất tinh dầu và làm hương liệu [27]

Ở Việt Nam, hoắc hương có thể được coi là một cây thuốc có từ lâu đời có mặt trong các bộ sách “ Nam dược thần liệu” của Tuệ Tĩnh và “ Dược phẩm vạng yếu” của Hải Thượng Lãn Ông Hoắc hương được nhân dân trồng trong vườn nhà làm thuốc khá phổ biến suốt từ Bắc vào Nam Một số vùng đã sử dụng cây hoắc hương là một trong những cây thuốc chính dùng cho việc sản xuất nguyên liệu thương phẩm như: Hưng Yên, Hải Dương, Hà Nội, Vĩnh Phúc…[10].

b) Thu hái và chế biến

Thu hái: phần cây hoắc hương dùng làm thuốc là phần lá khô hoặc các phần nằm trên mặt đất, có mùi thơm nồng là tốt Hoắc hương có thể thu hái quanh năm trước khi ra hoa, nhưng người ta thường thu vào tháng 5 - 6, phơi trong râm cho khô, hoặc sấy nhẹ cho tới khi khô [26]

Chế biến: lá khô đem thái nhỏ dùng trong thuốc thang hoặc tán bột nhỏ để làm hoàn tán (Trung Quốc dược học đại từ điển) hoặc có thể phun nước cho ngấm đều, thái phiến, phơi khô để dùng (Đông dược học yếu) [9]

1.1.5 Thành phần hóa học

Thành phần hóa học của hoắc hương gồm nhiều hợp chất khác nhau như:methylchavicol, anethole, anisaldehyde, limonene, β-methoxinnamaldehyde, pinene, 3-octanone, 1-octen-3-ol, linalool, 1-caryphyllene, β-emelene, γ-humulene, β-farnenene, α-ylangene, γ-cardinene, calamenene, β-hexenal , acacetin, tilianin, linarin, agastachoside, isoagastachoside, agastachin maslinic acid, crategolic acid, oleanolic acid, 3-o-acetyloleanolic aldehyde, daucostool, γ-sitosterol, dehydroagastol, methylchavicol, anethole, anisaldehyde, d-limonene, β-methoxycinamaldehyde, α-pinene, 3-octanone, 3-octanol, β-cymene, 1-octen-3-ol, β-humulene, α-ylangene, β-farnesene…[10]

Trong các thành phần hóa học của hoắc hương thì tinh dầu hoắc hương là thành phần quan trọng và được chú ý nhiều nhất Tinh dầu hoắc hương là chất lỏng màu vàng, mùi mạnh bền vững Thành phần hóa học tinh dầu hoắc hương Việt Nam gồm có: patchouli alcohol (37,80%), β-caryophyllene( 2,77%), β-patchoulene (3,2%), β-elemene (0,69%), α-guaiene (13,47%), β-guaiene (3,47%), α-patchoulene (8,03%), α-bulnesene (14,67%), seychellene (7,74%), pogostol (2,47%), ledene (1,6%), viriflorol (0,30%), salilene cyclo (1,4%), δ-cadinene (1,16%), oxydcaryophullene (1,10%) [27]

Tinh dầu hoắc hương tích lũy chủ yếu ở lá (85%), trong đó lá non là nhiều nhất, hàm lượng tinh dầu giảm dần cùng với sự tăng tuổi của lá Thành phần, hàm lượng tinh dầu hoắc hương luôn có sự thay đổi tùy thuộc vào từng bộ phận của cây, tuổi cây, các yếu tố môi trường, thời điểm thu hoạch, cách thức bảo quản và tách chiết So với các nước đã và đang sản xuất tinh dầu hoắc hương trên thế giới thì tinh dầu hoắc hương Việt Nam thuộc loại sản phẩm có chất lượng cao [10]

Ngoài ra tinh dầu hoắc hương còn có tác dụng trị côn trùng, kích thích sự mọc tóc, tăng tiết dịch vị dạ dày, giúp tiêu hóa, làm giảm bớt căng thẳng, trấn tĩnh tinh thần, giúp tinh thần thoải mái và làm việc hiệu quả [9], [19].

b) Tác dụng khử mùi

Đây là một công dụng tốt của hoắc hương mà hiện nay đang được khai thác rất mạnh Nhờ có tính kháng khuẩn rộng và mùi hương dễ chịu nên hoắc hương có tác dụng khử mùi hôi, mùi ẩm mốc, chống thối rất tốt Do vậy rất nhiều sản phẩm chứa tinh dầu hoắc hương đã được sản xuất như: nước khử hôi miệng, sữa tắm khử mùi hôi cơ thể, nước rửa tay, lau chùi các vật dụng dễ bị ẩm mốc…[10]

c) Tác dụng là chất định liệu

Hoắc hương có mùi hương khá nặng, bền, rất đặc trưng và hấp dẫn Do đó hoắc hương được sử dụng nhiều trong công nghiệp sản xuất nước hoa, hóa mĩ phẩm (phấn, sữa tắm, dầu masage…), trong công nghiệp sản xuất bánh kẹo…

1.2 Tình hình sử dụng hoắc hương trên thế giới và Việt Nam

1.2.1 Trên thế giới

Theo ước tính, mức tiêu thụ tinh dầu hoắc hương trên thế giới khoảng

2000 tấn mỗi năm [26] Trong đó, hoắc hương được sản xuất và sử dụng nhiều ở các nước Đông Nam Á (Indonexia, Malaixia, Philippin), Ấn Độ, Trung Quốc, Brazil, Hoa Kỳ, Châu Âu… Ở các nước này, hoắc hương được sản xuất trên quy

mô công nghiệp tạo ra nguyên liệu thô và hàng trăm sản phẩm liên quan đến tinh dầu hoắc hương

Indonexia được coi là nước có sản lượng hoắc hương và tinh dầu hoắc hương lớn nhất thế giới, chiếm khoảng 90% lượng tinh dầu của thế giới Việc trồng và xuất khẩu hoắc hương đã đem lại cho Indonexia rất nhiều lợi nhuận về kinh tế [10], [25].

Ấn Độ, mặc dù được coi là một trong những nước sản xuất tinh dầu hoắc hương lớn nhất thế giới với lượng tiêu thụ khoảng 300 tấn mỗi năm nhưng nguồn nguyên liệu trong nước chỉ đáp ứng được khoảng 18% nhu cầu Do đó phần lớn nguyên liệu Ấn Độ phải nhập khẩu từ Indonexia và Malaixia [25]

1.2.2 Ở Việt Nam

Ở Việt Nam, từ xa xưa hoắc hương đã được coi là một trong những dược liệu có giá trị, thông dụng, có mặt trong nhiều phương thuốc cổ truyền: Tuệ Tĩnh

đã dùng hoắc hương phối hợp với trần bì, gừng sống đem sắc uống chữa đau bụng, nôn mửa, ợ hơi, tiêu hóa kém Hải Thượng Lãn Ông đã dùng bài thuốc “ hoắc hương bách giải hoàn” để phòng và điều trị bệnh sốt rét, đau bụng, thổ tả, cảm nóng Đến nay ngoài việc sử dụng hoắc hương trong các bài thuốc cổ truyền, hoắc hương đã được các gia đình nước ta trồng để làm nguyên liệu cho các ngành công nghiệp tách chiết tinh dầu hoắc hương với giá bán khá cao khoảng 38000 đồng/kg (thời điểm tháng 4 năm 2003) Mặc dù là một trong những nước có điều kiện tốt cho việc sản xuất và phát triển vùng nguyên liệu này nhưng việc trồng hoắc hương ở nước ta mới chỉ được thực hiện rải rác ở một số địa phương như: Hải Dương (Mỹ Văn), Hưng Yên (Văn Lâm), Thái Bình (Hưng

Hà, Tiền Hải, Kiến Xương), Hà Nội (Thanh Trì, Từ Liêm, Gia Lâm), Vĩnh Phúc (Tam Đảo), Thanh Hóa, Tiền Giang, Đồng Nai…

Ngoài quy mô trồng nhỏ lẻ tự phát của nhân dân thì những nghiên cứu phát triển tổng thể theo hướng sản xuất hàng hóa về nguyên liệu và tinh dầu hoắc hương vẫn còn hạn chế Giá trị sản xuất cũng như xuất khẩu nguyên liệu, tinh dầu hoắc hương của nước ta so với nhiều nước trong khu vực còn rất nhỏ, trong

khi đó nhu cầu về hoắc hương và tinh dầu hoắc hương ở trong nước không ngừng tăng Phần lớn tinh dầu hoắc hương sử dụng trong nước vẫn phải nhập khẩu từ nước ngoài với giá thành khá cao Do đó để phát triển và mở rộng quy

mô trồng, sản xuất các sản phẩm từ hoắc hương đáp ứng nhu cầu trong nước và xuất khẩu đòi hỏi ngành nông nghiệp nước ta phải có những chính sách, biện pháp để việc trồng và chế biến hoắc hương ở nước ta ngày càng được mở rộng

mà vấn đề đầu tiên là việc cung cấp giống cho người nông dân

1.3 Nhân giống thực vật in vitro

Nhân giống in vitro là một trong bốn lĩnh vực ứng dụng chính của công nghệ tế

bào thực vật và đã mang lại hiệu quả kinh tế lớn nhất [3] Kỹ thuật nhân nhanh

in vitro nhằm phục vụ những mục đích sau:

- Duy trì và nhân nhanh các kiểu gen quý hiếm và làm vật liệu cho công tác tạo giống

- Nhân nhanh và duy trì các cá thể đầu dòng tốt để cung cấp hạt giống các loại cây trồng khác nhau như cấy lương thực có củ, các loại cây rau, cây hoa, cây cảnh, cây dược liệu thuộc nhóm cây thân thảo

- Nhân nhanh và kinh tế các kiểu gen quý của giống cây lâm nghiệp

- Nhân nhanh ở điều kiện vô trùng, cách li tái nhiễm kết hợp với làm sạch virut

- Bảo quản các tập đoàn giống nhân giống vô tính và các loại cây giao phấn trong ngân hàng gen [3]

1.3.1 Cơ sở lí luận của nuôi cấy in vitro

Dựa trên cơ sở về tính toàn năng của tế bào: Haberlandt(1902) – nhà thực vật học người Đức – là người đầu tiên đề xuất phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã chứng minh học thuyết về tính toàn năng của tế bào Theo ông mỗi tế bào của bất kể sinh vật nào đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền

cần thiết và đủ của cả sinh vật đó, vì vậy khi gặp điều kiện thích hợp mỗi tế bào đều có thể phát triển thành cơ thể hoàn chỉnh [11].

Dựa trên khả năng biệt hóa và phản biệt hóa của tế bào: quá trình phát sinh

hình thái trong nuôi cấy thực vật in vitro là kết quả của các quá trình biệt hóa tế

bào và phản biệt hóa tế bào, mà bản chất là sự hoạt hóa gen

Trong trường hợp này, mẫu nuôi cấy được đưa vào môi trường dinh dưỡng nhân tạo phù hợp, trong điều kiện vô trùng các tế bào sẽ thực hiện quá trình giải biệt hóa để hình thành mô sẹo chứa các tế bào phôi hóa và từ mô sẹo sẽ tái sinh thành chồi và cây con khi cấy chuyển chúng sang môi trường dinh dưỡng

có bổ sung các chất ĐHST với nồng độ phù hợp Mẫu nuôi cấy ở đây là tất cả các phần sống của cây (đỉnh sinh trưởng, lá, thân, hoa…) đều có thể được sử dụng

Trong nuôi cấy để tạo mô sẹo hoặc phôi, số lượng chồi tái sinh thu được

sẽ lớn gấp nhiều lần so với phương pháp tạo cơ quan trực tiếp, nhưng thường kéo theo những biến dị soma Do đó cần phải kiểm tra kỹ trước khi đem nhân giống đại trà [15]

1.3.2 Các phương pháp nhân giống vô tính in vitro

Quá trình thực hiện nhân giống in vitro tạo ra các dòng vô tính Theo Shull

(1912) dòng vô tính là một nhóm cá thể có kiểu gen tương tự nhau, chúng được nhân bằng sinh sản vô tính, các dòng vô tính này sẽ được tạo ra theo các phương thức sau:

- Tái sinh cây trực tiếp từ đỉnh sinh trưởng, phôi, ngọn chồi, chồi nách

- Tái sinh cây gián tiếp thông qua giai đoạn hình thành mô seọ

a) Tái sinh cây trực tiếp: Từ mẫu nuôi cấy là quá trình mẫu sống (cơ quan,

mô…) được nuôi trong môi trường dinh dưỡng nhân tạo thích hợp, trong điều kiện vô trùng để trực tiếp tạo chồi và cây hoàn chỉnh không qua giai đoạn mô

sẹo Theo phương thức này, các mẫu được chọn cho nuôi cấy là đỉnh sinh trưởng, phôi, chồi đỉnh, chồi nách Cây con được tạo ra bằng cách nuôi cấy đỉnh sinh trưởng thông qua tái sinh trực tiếp là sạch virus, đồng nhất về mặt di truyền

và duy trì được tính trạng của cây mẹ

b) Tái sinh gián tiếp: Trong trường hợp này, mẫu nuôi cấy được đưa vào môi

trường dinh dưỡng nhân tạo phù hợp, trong điều kiện vô trùng, các tế bào sẽ thực hiện quá trình giải biệt hóa để hình thành mô sẹo chứa các tế bào phôi hóa và từ

mô sẹo sẽ tái sinh thành chồi và cây con khi cấy chuyển chúng sang môi trường dinh dưỡng có bổ xung chất điều hòa sinh trưởng với nồng độ phù hợp Mẫu nuôi cấy ở đây là tất cả những phần sống của cây (đỉnh sinh trưởng, lá thân, hoa…) đều có thể sử dụng được

Trong nuôi cấy để tạo mô sẹo hoặc phôi, số lượng chồi tái sinh thu được

sẽ lớn gấp nhiều lần so với phương pháp tạo cơ quan trực tiếp, nhưng thường kéo theo những biến dị soma Do đó cần phải kiểm tra kỹ trước khi đem nhân giống [15]

1.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quy trình nhân nhanh in vitro

a) Điều kiện vô trùng

Điều kiện tiên quyết đối với tất cả thí nghiệm nuôi cấy in vitro là phải đảm

bảo nguyên tắc vô trùng cho môi trường nuôi cấy và các trang thiết bị có liên quan như: dụng cụ đựng môi trường nuôi cấy, dụng cụ thực hiện các thao tác nuôi cấy, buồng cấy…

Các nhóm phương pháp thường được dùng trong khử trùng môi trường và các trang thiết bị nuôi cấy gồm có:

- Phương pháp hóa học: sử dụng các loại hóa chất có tính sát trùng mạnh như:

H2O2, cồn 70 độ…

- Phương pháp vật lý: sử dụng tia cực tím, các liều chiếu phóng xạ, nhiệt độ, áp suất, lọc…

- Kết hợp cả phương pháp vật lý và hoá học

Tùy thuộc vào đối tượng cần được vô trùng để chọn và sử dụng phương pháp vô trùng hợp lý Tuy nhiên, dù khử trùng bằng phương pháp nào thì kết quả khử trùng cũng cần phải đảm bảo các yếu tố sau:

- Phải đảm bảo sự tiệt trùng

- Hạn chế sự gây nên những biến tính cho các chất cũng như đảm bảo sự ổn định của môi trường nuôi cấy

- Mang lại hiệu quả kinh tế cao

Trên thực tế, môi trường nuôi cấy và các dụng cụ nuôi cấy thường được khử trùng bằng hơi nước ở áp suất cao (121oC, 103 kPa) trong khoảng 14 đến 40 phút Thời gian khử trùng cụ thể phụ thuộc vào thể tích môi trường Trong môi trường có một số thành phần không chịu được nhiệt độ cao thì vô trùng bằng cách dùng màng lọc vi khuẩn

Ngoài ra để đảm bảo tốt điều kiện vô trùng trong suốt quá trình nuôi cấy tất cả các thao tác nuôi cấy, cấy chuyển… cũng đều phải được thực hiện trong điều kiện vô trùng

b) Ảnh hưởng của mẫu nuôi cấy

Khi nghiên cứu ảnh hưởng của mẫu nuôi cấy người ta thường quan tâm đến những vấn đề sau:

- Loài thực vật và cá thể thực vật:

Loài thực vật thường được chọn là những loài cây quý hiếm, có giá trị sử dụng cũng như kinh tế cao, cần phải được bảo tồn nguồn gen và khai thác những giá trị mà nó mang lại Khả năng tái sinh của mẫu cấy cũng thay đổi tùy theo loại

thực vật Thông thường, thực vật hai lá mầm có khả năng tái sinh hơn thực vật

một lá mầm trong nuôi cấy in vitro (Kaosarard and Apavatjrut, 1998) Nhóm cây

thân thảo dễ tái sinh hơn nhiều so với cây bụi và cây thân gỗ Trong cùng một nhóm cây, các cá thể của cùng một loài đôi khi cũng có khả năng tái sinh khác nhau (Nguyễn Đức Lượng, 2006)

- Tuổi và giai đoạn phát triển của cây

Khả năng sinh trưởng và phát sinh hình thái cũng khác nhau ở những cây

mẹ có tuổi cũng như giai đoạn phát triển khác nhau Trong hầu hết các trường hợp, các mô lấy từ cây non có khả năng tái sinh cao hơn các mô lấy từ cây trưởng thành (Hoàng Minh Tấn, 1993; Nguyễn Đức Lượng, 2006)

- Vị trí thu mẫu trên cây

Các mô và cơ quan thường được sử dụng cho nuôi cấy là các đỉnh sinh trưởng (chồi đỉnh, chồi nách, chóp rễ) lá non, phôi, hạt phấn… Đối với mỗi loại

mô và cơ quan khác nhau trên cùng một cây thường có đặc điểm về sinh lý khác nhau, khả năng tái sinh khác nhau Theo Nguyễn Quang Thạch (2001), chồi đỉnh

có khả năng sinh trưởng tốt hơn các mô cơ nguồn gốc từ chồi nách

- Kích thước của mảnh mô nuôi cấy

Kích thước của mảnh mô nuôi cấy cũng ảnh hưởng đến khả năng tái sinh, thường các mảnh mô có kích thước lớn dễ tái sinh hơn những mảnh mô có kích thước nhỏ

c) Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng

- Nguồn cacbon

Các mô và tế bào thực vật nuôi cấy in vitro sống theo phương thức dị

dưỡng, mặc dù ở nhiều trường hợp chúng có thể sống bán dị dưỡng nhờ khả năng quang hợp trong điều kiện ánh sáng nhân tạo Do đó, việc đưa vào môi trường nuôi cấy nguồn cacbon hữu cơ là điều kiện bắt buộc Nguồn cacbon chủ

yếu là đường sacarose, ngoài ra trong một số trường hợp còn sử dụng đường khác như: glucose, maltose, galactose Đường được sử dụng làm nguồn cacbon cung cấp năng lượng cho nuôi cấy, đồng thời đóng vai trò duy trì áp suất thẩm thấu của môi trường [3], [15] Hàm lượng đường có thể phụ thưộc vào từng đối tượng nuôi cấy thường là từ 2% đến 8% Nếu sử dụng ở nồng độ cao hơn sẽ gây

ức chế sinh trưởng của mô nuôi cấy [14], [15]

- Thành phần khoáng

Các nguyên tố khoáng rất cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của thực vật, chúng tham gia vào hầu hết các thành phần cấu trúc và hoạt động chức năng của tế bào, mô, cơ quan và toàn bộ cơ thể Xét theo nhu cầu, hàm lượng cần thiết, các nguyên tố khoáng được chia thành 2 nhóm: nhóm đa lượng và nhóm vi lượng Các nguyên tố đa lượng như: N, P, S, K, Mg, Ca… là các nguyên tố cần với hàm lượng lớn và thường tồn tại dưới dạng muối NO3-, NH4+, NaH3PO4, KNO3, KCl, Ca(NO3).4H2O, MgSO4.7H2O… Các nguyên tố vi lượng như: Mn,

Bo, Zn, Cu, Ni… được cung cấp với lượng nhỏ nhưng rất quan trọng đối với sự phát triển ở thực vật và thường tham gia vào hoạt động của enzim [1]

- Nước

Nước là thành phần quan trọng trong môi trường nuôi cấy, nó chiếm khoảng 95% trong môi trường dinh dưỡng Nước được sử dụng là nước chưng cất 2 lần

- Agar

Agar là một loại polysaccarit tách chiết từ tảo biển, được sử dụng phổ biến trong môi trường nuôi cấy nhằm làm chất kết đông và giá thể rắn cho môi trường Hàm lượng agar thường sử dụng cho nuôi cấy dao động từ 0,6-1,0% theo khối lượng Nếu sử dụng agar ở nồng độ cao, môi trường trở nên cứng, sự

khuyếch tán các chất dinh dưỡng cũng như hấp thụ của mô gặp khó khăn Ngoài agar người ta có thể sử dụng gelatin, gellan gum… làm chất kết đông thay thế.

- Vitamin

Ngoài các thành phần khoáng và nguồn cacbon thì vitamin đóng vai trò rất quan trọng trong môi trường nuôi cấy Mặc dù tất cả các loại mô và tế bào thực vật trong nuôi cấy đều có khả năng tự tổng hợp hầu hết các vitamin nhưng chỉ với một lượng nhỏ Do vậy, để đạt được sự sinh trưởng tối ưu của mô nuôi cấy thường phải bổ xung thêm một số vitamin như: vitamin B1, vitamin B2, vitamin

B3, vitamin B5, vitamin B6 trong đó vitamin B1 được coi là cần thiết đối với sự sinh trưởng của tế bào thực vật [7], [10]

- Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật

Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật có vai trò quan trọng đến sự sinh trưởng, phân chia của tế bào và kiểm soát sự biệt hóa cũng như phát sinh cũng

như hình thái của thực vật Trong nuôi cấy mô tế bào in vitro, các chất điều hòa

sinh trưởng là thành phần quan trọng nhất và việc sử dụng các chất điều hòa sinh trưởng hợp lý có ý nghĩa quyết định đến thành công của toàn bộ tiến trình nuôi cấy, có hai nhóm chất điều hòa sinh trưởng thường được sử dụng rộng rãi là auxin và cytokinin

+ Auxin

Auxin là hợp chất indol trong phân tử Trong nuôi cấy in vitro, auxin có

tác dụng kích thích sinh trưởng kéo dài tế bào, thúc đẩy sự sinh trưởng của mẫu thông qua hoạt hóa sự phân chia và làm giãn tế bào, kích thích quá trình tổng hợp và trao đổi chất, điều hòa sự phân chia rễ và chồi Nồng độ NAA thấp sẽ dẫn đến hình thành rễ phụ, nồng độ auxin cao sẽ dẫn tới hình thành mô sẹo Tuy nhiên nếu quá cao sẽ dẫn đến ức chế sự phát triển của rễ Các chất thuộc nhóm auxin thường dùng là IAA, IBA, NAA và 2,4- D Trong đó IAA là auxin tự

nhiên, kém bền với nhiệt, và trong thực tế thường được sử dụng ở dạng liên kết với các axit amin giúp bền hơn như indole-acetyl-L-glycin Hàm lượng IAA có thể sử dụng từ 1-50 mg/l Hàm lượng IAA và NAA thường được sử dụng từ 0,1-

10 mg/l Còn 2,4-D thường được bổ xung vào môi trường cho hiệu quả tạo mô sẹo ở nhiều loại thực vật [3], [15]

+ Cytokinin

Cytokinin được phát hiện vào năm 1953 (sau auxin) bởi Miller, Skoog và các công sự Hiệu quả sinh lý đặc trưng nhất của cytokinin đối với thực vật là các chất hoạt hóa sự phân chia tế bào, tác động lên sự phân hóa cơ quan đặc biệt

là sự phân hóa chồi [15] Các cytokinin thường gặp là BAP và kinetin, nồng độ cytokinin thường được sử dụng là 0,5-2 mg/l Nếu nồng độ thấp hơn thì hệu quả kích thích kém, khả năng tạo chồi giảm Ngược lại, cytokinin ở nồng độ cao sẽ hoạt hóa hình thành chồi bất định gây ra hiện tượng mọng nước và kìm hãm quá trình tạo rễ

d) Ảnh hưởng của các yếu tố vật lý

- Ánh sáng

Ánh sáng có tác động mạnh đến quá trình phát sinh hình thái của mô nuôi cấy Sự phát sinh hình thái mô nuôi cấy phụ thuộc vào chu kỳ, cường độ, thành phần quang phổ của ánh sáng [19] Cường độ ánh sáng thích hợp cho nhiều loại

mô trong giai đoạn tái sinh là 2000-3000 lux

- Nhiệt độ

Tùy thuộc vào loài thực vật mà nhiệt độ nuôi cấy khác nhau nhưng nhiệt

độ thích hợp là 25 ± 20C Nhiệt độ này ảnh hưởng tích cực tới quá trình sinh trưởng và phát triển của đa số các loài thực vật nuôi cấy Trong một số trường hợp, nhiệt độ lạnh lại có ảnh hưởng tốt hơn, chẳng hạn xử lý bao phấn lúa ở 4oC

thì hiệu suất tạo mô sẹo sẽ tăng [15] Nhiệt độ cao còn ảnh hưởng đến sinh trưởng của các mô nuôi cấy thông qua tác động lên cấu trúc hoạt động của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật như phân hủy IAA và GA [22]

- PH môi trường

PH của môi trường cũng là yếu tố rất quan trọng, ảnh hưởng tới trạng thái

lý hóa của các chất trong môi trường, do đó ảnh hưởng đến khả năng điện ly của các muối, sự thủy phân hóa các chất, cấu trúc hoạt động của các chất điều hòa sinh trưởng… do đó ảnh hưởng mạnh đến sự sinh trưởng, phát sinh hình thái của mẫu mô Vì vậy, thông thường PH được điều chỉnh ở mức 5,5-5,8

1.3.4 Quy trình sản xuất cây giống in vitro

Nhân giống in vitro là lĩnh vực sử dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực

vật để nhân giống cây trồng trong ống nghiệm Với phương pháp này, hoàn toàn

có thể tạo một quần thể cây trồng đồng đều, giữ nguyên đặc tính của cây mẹ, có

hệ số nhân giống và hiệu quả kinh tế cao, không tốn diện tích nhân giống Hiện

nay có nhiều quy trình nhân giống in vitro của nhiều loài thực vật Nhìn chung quy trình nhân giống in vitro gồm các giai đoạn chung [7], [12].

- Giai đoạn 1: Chọn mẫu

Lựa chọn đối tượng (có thể là thân, lá, củ) thích hợp để làm mẫu Kết quả của quy trình phụ thuộc rất nhiều vào đặc tính của mẫu Quan trọng nhất là đỉnh sinh trưởng, chồi nách, sau đó là hoa, đoạn thân, mảnh lá, rễ… Mô chọn để nuôi cấy thường là những mô có khả năng tái sinh cao, sạch bệnh, giữ được các đặc tính sinh học quý của cây mẹ và ổn định Cây được chọn để lấy mẫu thường là cây ưu việt, khỏe, có giá trị kinh tế cao Tùy vào mục đích nuôi cấy và đặc tính của loài mà chọn mẫu phù hợp Nhưng chọn mẫu phải chú ý đến tuổi mẫu, thời gian lấy mẫu, mùa vụ

- Giai đoạn 2: Thiết lập hệ thống nuôi cấy vô trùng

Mẫu phải được khử trùng trước khi cấy vào môi trường Việc khử trùng mẫu trong điều kiện vô trùng sẽ làm giảm khả năng nhiễm bệnh của mẫu nuôi cấy Tùy theo sự tiếp xúc của mẫu với môi trường mà lựa chọn hóa chất, chế độ khử trùng cho phù hợp Sau khi khử trùng, mẫu vô trùng được cấy vào môi trường nhân tạo trong ống nghiệm hoặc trong bình nuôi.

- Giai đoạn 3: Nhân nhanh chồi

Thành phần và điều kiện nuôi cấy phải được tối ưu hóa nhằm đạt được mục đích nhân nhanh Quy trình cấy chuyển để nhân nhanh chồi khoảng 1-2 tháng tùy loài cây Nhìn chung giai đoạn 3 thường được thực hiện trong 10-36 tháng và không nên kéo dài quá lâu

- Giai đoạn 4: Hình thành rễ

Khi đạt đến một kích thước nhất định thì các chồi tái sinh được chuyển sang môi trường tạo rễ Trong giai đoạn này, người ta thường bổ xung vào môi trường nuôi cấy auxin có chức năng tạo rễ phụ từ mô nuôi cấy Giai đoạn này thường diễn ra 2-8 tuần

- Giai đoạn 5: Chuyển cây ra đất trồng

Đây là bước cuối cùng của quy trình nuôi cấy in vitro Giai đoạn này cây

được chuyển từ điều kiện vô trùng của phòng thí nghiệm ra ngoài tự nhiên Nhìn chung các cây chuyển ra vườn ươm phải là cây hoàn chỉnh (có đủ thân, rễ, lá) sinh trưởng tốt Do vậy cây con vẫn còn hết sức non nớt, trạng thái sinh lý, sinh thái vốn thích hợp với điều kiện phòng thí nghiệm nên khi đưa ra ngoài tự nhiên rất dễ bị mất nước nhanh, nhiễm khuẩn và nấm bệnh, có thể bị cháy lá do nắng

Vì vậy, việc huấn luyện theo hướng làm quen dần với các điều kiện tự nhiên là rất quan trọng giúp đảm bảo tỷ lệ sống cao và sinh trưởng tốt của cây giống Điều này đòi hỏi việc thiết kế vườn ươm đảm bảo các thông số kỹ thuật về ánh sáng, nhiệt độ, lưu lượng gió, độ ẩm… cũng như khả năng kiểm soát các yếu tố

này trước những điều kiện bất lợi của thời tiết Giá thể trồng cây có thể là đất, mùn cưa và bọt biển…

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là cây hoắc hương (Pogostemon cablin (Blanco)

Benth.) được phòng thí nghiệm Sinh học- Khoa Khoa học Sự sống – Trường Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên cung cấp

Vật liệu nghiên cứu: vật liệu dùng cho nuôi cấy là lá và thân cây lấy trong

phòng thí nghiệm nên không cần có bước khử trùng mẫu trước khi cấy Trước khi tiến hành thí nghiệm, cây được cấy chuyển từ những bình thí nghiệm cũ sang bình thí nghiệm mới Mục đích của cấy chuyển là nhằm hoạt hóa khả năng sinh trưởng và phát triển của cây sau một thời gian sống trong điều kiện kìm hãm sự sinh trưởng và nhằm tăng thêm số lượng mẫu vật cần thiết để tiến hành thí nghiệm

Hình 2.1 Cây hoắc hương trong phòng thí nghiệm trường Đại học Khoa học

2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Các thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm sinh học – Khoa Khoa học sự sống – Trường Đại học Khoa học

Thời gian nghiên cứu: từ tháng 5/2011 đến tháng 4/2012

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Môi trường nuôi cấy

Hóa chất sử dụng trong các thí nghiệm được cung cấp bởi phòng thí nghiệm sinh học – Khoa Khoa học Sự sống – Trường Đại học Khoa học

Sử dụng môi trường cơ bản MS (Murashge và Skoog, 1962), có cải tiến, là môi trương MS bổ sung thêm 20 g/l đường sacarose, rồi thêm 10 g/l thạch (agar)

Môi trường được bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng với nồng độ khác nhau

Độ PH của các môi trường nuôi cấy được điều chỉnh trong khoảng 5,6-5,8 Môi trường được đổ vào bình tam giác 250 ml hoặc ống nghiệm

2.3.2 Khử trùng dụng cụ và thiết bị nuôi cấy

- Vệ sinh dụng cụ: tất cả các dụng cụ như bình nón, ống nghiệm, các dụng cụ xử

lý mẫu nuôi cấy như dao, kéo, panh… sử dụng xong đều được rửa bằng xà phòng, để ráo

- Khử trùng môi trường và các dụng cụ nuôi cấy: môi trường nuôi cấy sau khi được chuẩn bị, cùng với các dụng cụ nuôi cấy như: dao, kéo, panh… sẽ được đưa vào nồi khử trùng và tiến hành khử trùng ở 121oC, áp suất 103 kPa trong vòng 30 phút

- Chuẩn bị điều kiện trước khi cấy: trước tiên box cấy được khử trùng bằng cồn, sau đó đưa các dụng cụ nuôi cấy và môi trường vào trong box khử trùng bằng tia cực tím trong vòng 30 phút Sau đó, tất cả các dụng cụ dùng cho nuôi cấy như dao, kéo, panh… được khử trùng lại bằng cách thấm cồn và đốt dưới ngọn lửa đèn cồn

2.3.3 Điều kiện nuôi cấy

- Nhiệt độ phòng nuôi: 22 – 28oC

- Cường độ ánh sáng: 2000 lux

- Độ ẩm: 70 %