Nghiên cứu ứng dụng chiếu xạ nhằm tạo ra các dòng cà chua đột biến cho năng suất cao từ nguồn vật liệu của Cuba (luận văn thạc sĩ)

Nghiên cứu ứng dụng chiếu xạ nhằm tạo ra các dòng cà chua đột biến cho năng suất cao từ nguồn vật liệu của Cuba (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu ứng dụng chiếu xạ nhằm tạo ra các dòng cà chua đột biến cho năng suất cao từ nguồn vật liệu của Cuba (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu ứng dụng chiếu xạ nhằm tạo ra các dòng cà chua đột biến cho năng suất cao từ nguồn vật liệu của Cuba (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu ứng dụng chiếu xạ nhằm tạo ra các dòng cà chua đột biến cho năng suất cao từ nguồn vật liệu của Cuba (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu ứng dụng chiếu xạ nhằm tạo ra các dòng cà chua đột biến cho năng suất cao từ nguồn vật liệu của Cuba (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu ứng dụng chiếu xạ nhằm tạo ra các dòng cà chua đột biến cho năng suất cao từ nguồn vật liệu của Cuba (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu ứng dụng chiếu xạ nhằm tạo ra các dòng cà chua đột biến cho năng suất cao từ nguồn vật liệu của Cuba (luận văn thạc sĩ)

I H QU GI H N I

Ƣ Ọ Ọ

-

PH M THỊ BÍCH THU

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CHIẾU X NHẰM T O RA CÁC

DÒ À U ỘT BIẾ Ă SUẤT CAO TỪ

NGUỒN VẬT LIỆU CỦA CUBA

UẬ Ă S Ọ

ăm 2016

MỤC LỤC

MỞ ẦU 5

1.Tính cấp thiết của đề tài 5

2 Mục đích nghiên cứu 6

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 6

hương1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 7

1.1 Nguồn gốc, phân loại, đặc điểm và giá trị của cây cà chua 7

1.1.1 Nguồn gốc 7

1.1.2 Phân loại thực vật 7

1.1.3 Đặc tính thực vật 79

1.1.4 Gía trị dinh dưỡng và ý nghĩa kinh tế 11

1.2 Tình hình sản xuất cà chua trên thế giới và ở Việt Nam 13

1.2.1 Tình hình sản xuất cà chua trên thế giới 13

1.2.2 Tình hình sản xuất cà chua ở Việt Nam 15

1.3 Khái quát về các nghiên cứu sử dụng đột biến trong chọn tạo giống cây trồng 17

1.3.1 Ý nghĩa của đột biến trong công tác chọn tạo giống cây trồng 17

1.3.2 Cơ sở di truyền của đột biến 18

1.3.3 Các tác nhân gây đột biến 20

1.4 Ứng dụng của phương pháp gây đột biến trong nghiên cứu chọn giống 22

1.4.1 Những nghiên cứu trên thế giới 22

1.4.2 Những nghiên cứu ở Việt Nam 24

1.5 Ứng dụng các chỉ thị phân tử trong chọn giống cây trồng 26

1.5.1 Khái quát về các loại chỉ thị phân tử trong chọn giống cây trồng 26 1.5.2 Các nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống

cà chua 36

hương 2 N I DUNG, VẬT LIỆU V PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN 37

2.1 Nội dung nghiên cứu 37

2.2 Vật liệu nghiên cứu 37

2.2.1 Vật liệu thực vật………36

2.2.2 Hoá chất 37

2.3 Phương pháp nghiên cứu 40

2.3.1 Phương pháp chiếu xạ gây đột biến 40

2.3.2 Phương pháp đánh giá ngoài đồng ruộng 40

2.3.3 Phương pháp tách chiết ADN tổng số 42

2.3.4 Phương pháp PCR 42

2.3.5 Điện di sản phẩm PCR 43

2.3.6 Phương pháp nhuộm Ethidium Bromide với gel polyacrylamide 44

2.3.7 Phương pháp phân tích số liệu 44

hương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 46

3.1 Xác định liều chiếu xạ thích hợp đối với hạt cà chua 46 3.2 ặc điểm nông sinh học và khả năng sinh trưởng, phát triển của các

3.6 ánh giá đa dạng di truyền của các dòng cà chua đột biến

ở thế hệ M3 Error! Bookmark not defined KẾT LUẬN Error! Bookmark not defined

MỞ ẦU 1.Tính cấp thiết của đề tài

Cà chua (Lycopersicon esculentum Mill ) là một loại rau ăn quả có giá

trị kinh tế và giá trị dinh dưỡng cao, là một trong những loại rau ưu tiên có chiều hướng phát triển mạnh cả về chất và lượng Chính vì vậy, sản lượng

cà chua trên thế giới luôn tăng mạnh Theo thống kê của FAO (2006) sản

lượng cà chua đứng thứ hai trên thế giới sau khoai tây

Cùng với sự phát triển của nền nông nghiệp thế giới, sản xuất nông nghiệp ở Việt Nam đang trên đà phát triển dựa trên những tiến bộ về khoa học kỹ thuật, đưa cây trồng có giá trị cao vào canh tác nhằm tăng thu nhập cho người dân, đặc biệt là loại cây trồng ngắn ngày nhanh cho thu hoạch phù hợp với phương thức sản xuất luân canh, có khả năng xuất khẩu và chế biến công nghiệp nên cây cà chua là đối tượng được quan tâm và đặt lên hàng đầu

Trong những năm qua, các cơ quan chuyên môn, nhiều nhà khoa học đã tập trung nghiên cứu cây cà chua theo nhiều hướng khác nhau, một trong các hướng đã được các nước ứng dụng rộng rãi là phương pháp chọn giống đột biến bằng phương pháp chiếu xạ, một ứng dụng của kỹ thuật hạt nhân trong nông nghiệp để cải tạo, nâng cao chất lượng của các giống cây trồng đồng thời cũng phát triển các giống mới với đặc điểm sinh học được cải tiến Bằng phương pháp chiếu xạ giúp rút ngắn thời gian chọn tạo giống so với các phương pháp chọn giống truyền thống đồng thời có thể tạo ra những tính trạng quý chưa có ở giống gốc Chọn giống đột biến đóng góp vai trò quan trọng trong việc cải tiến cây trồng nói chung và cà chua nói riêng

Trong những năm gần đây, sinh học phân tử đã phát triển mạnh mẽ Việc kết hợp sinh học phân tử và chọn giống đột biến đã chứng tỏ đó là phương pháp có hiệu quả Kỹ thuật phân tử được sử dụng để lập bản đồ và sàng lọc những chỉ thị phân tử liên kết với những gen đột biến để xác định bản chất đột biến xảy ra trong khi chúng rất khó biểu hiện ra kiểu hình ồng thời, điều đó cũng nhằm xây dựng chiến lược trong việc sử dụng những gen đột biến trong cải tiến giống Việc kết hợp giữa kỹ thuật sinh học phân tử với nghiên cứu gây tạo đột biến được thực hiện một cách chặt chẽ, có thể cung cấp những phương pháp nghiên cứu chính xác, hiệu quả, nhanh và kinh tế hơn trong công tác cải tiến cây trồng theo hướng chọn giống đột biến Việc xác định các giống cà chua có năng suất cao đáp ứng nhu cầu con người và giúp tăng thu nhập cho người nông dân là vấn đề cấp thiết được đặt ra Xuất phát từ thực tiễn trên chúng tôi tiến hành nghiên cứu

đề tài: “ ghiên cứu ứng dụng chiếu xạ nhằm tạo ra các dòng cà chua đột biến cho năng suất cao từ nguồn vật liệu của uba”

2 Mục đích nghiên cứu

Tạo ra các dòng cà chua đột biến có năng suất cao bằng phương pháp

chiếu xạ gây đột biến

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

- Từ kết quả nghiên cứu chúng tôi đưa ra một số dòng cà chua có triển vọng giúp tăng thu nhập cho người dân

- ề tài bổ sung thêm vào các tài liệu khoa học phục vụ cho công tác giảng dạy và nghiên cứu

hương1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nguồn gốc, phân loại, đặc điểm và giá trị của cây cà chua

1.1.1 Nguồn gốc

Cà chua có nguồn gốc ở Pêru, Bolivia và Equado Trước khi Crixtop Côlông phát hiện ra châu Mỹ thì ở Pêru và Mêhicô đã có trồng cà chua Những loài cà chua hoang dại gần gũi với cà chua trồng ngày nay vẫn tìm thấy ở dọc theo dãy núi Andes (Pêru), Bolivia và Equado Các nhà thực vật học De candolle (1884), Mulle (1940), Luckuwill (1943), Brezney (1955)… đều thống nhất cho rằng cây

cà chua có nguồn gốc ở bán đảo Galapagos bên bờ biển Nam Mỹ, Pêru, Equado

và hilê Người trồng trọt đã thuần dưỡng những giống cà chua quả nhỏ và dạng hoang dại, những giống và loài hoang dại được mang từ nơi xuất xứ đến Trung

Mỹ , cuối cùng đến Mêhicô [6]

Theo các tài liệu của châu Âu thì chắc chắn cà chua được người Aztec và

người Toltec mang đến ầu tiên người Tây Ban Nha đem cà chua từ châu

Âu về, rồi sau đó đưa đến vùng ịa Trung Hải

ầu thế kỷ 18, cà chua đã trở lên phong phú, đa dạng nhiều vùng trồng

làm thực phẩm Thời kỳ này cà chua lại từ châu Âu quay lại Bắc Mỹ Cho

đến thế kỷ 19, cà chua trở thành loại thực phẩm không thể thiếu trong bữa

ăn thường nhật và được trồng rộng rãi

1.1.2 Phân loại thực vật

Cà chua thuộc họ Solanaceae, chi Lycopersicon Tên khoa học là

Lycopersicon esculencum Mill Theo tác giả Breznhev.D (1964)

Lycopersicon gồm 3 loài thuộc hai chi phụ

Subgenus 1- Eulycopersicon: các dạng cây một năm, quả không có lông,

màu đỏ hoặc vàng, hạt mỏng, rộng… chi này gồm một loài L Esculentum

Loài này chia làm 3 loài phụ

+ ssp Spontaneum Brezh: (cà chua dại): có hai biến chủng là var Racemigerum và var.Pimpinellifolium: hai biến chủng này thường quả nhỏ,

hàm lượng chất khô cao, chống bệnh tốt và có giá trị để sử dụng làm vật liệu khởi đầu cho chọn giống

+ ssp Subspontaneaum ( cà chua bán trồng): có 5 biến chủng là:

Var Pruniform: Dạng quả mận

Var purifomae: dạng quả lê

Var cerasifomae: dạng quả anh đào

Var Elongatum: dạng quả dài hay gọi là dạng quả nhót

Var Succenturiatum: dạng quả nhiều ngăn hạt

Năm biến chủng này thân mập, quả rất nhỏ, dùng làm vật liệu chọn giống

+ ssp Cultum (cà chua trồng): gồm 3 biến chủng

Var Vulgare: cà chua thường

Var Validum: dạng thân bụi

Var Grandiflium: dạng kiểu lá khoai tây

Subgenus 2- Eriopersicon: chi phụ này gồm các loài dại, cây dạng một

năm hoặc nhiều năm, gồm các dạng quả có lông, màu trắng, xanh lá cây hay vàng nhạt, có các vệt màu antoxian hay xanh thẫm Hạt dày không có lông màu nâu…chi phụ này gồm hai loài và các loài phụ

+ Loài L Peruvianum Mill: loài này có nhiều biến dạng trong đó

có Var Cheesmanii Riloey; var Chessmaniifminor.C.H.Mull; var.Dentatum Dum

+ Loài L Hirsutum Humb.et.Bonpl: loài này gồm hai loài phụ Var

glabratum C.H Mull và var glandulosum C.H.Mull có một vài tính trạng

có ý nghĩa trong chọn giống, các cơ quan sinh trưởng phủ một lớp lông tơ

1.1.3 Đặc tính thực vật

Cà chua là cây một năm Tuy nhiên trong điều kiện tối ưu nhất định cà chua có thể là cây nhiều năm

1.1.3.1 Hệ rễ

Cà chua có hệ rễ chùm, ăn sâu và phân nhánh mạnh, khả năng phát triển

rễ phụ rất lớn Trong điều kiện tối ưu những giống tăng trưởng mạnh có hệ

rễ ăn sâu 1- 1,5m và rộng 1,5-2,5m Vì vậy cà chua chịu hạn rất tốt Khi cây rễ chính bị đứt, bộ rễ phụ phát triển và phân bố rộng nên cây cũng chịu đựng được điều kiện khô hạn.Trong quá trình sinh trưởng, hệ rễ chịu ảnh hưởng lớn của điều kiện môi trường như nhiệt độ đất, độ ẩm…ở nhiệt độ đất thấp (14-160

C) sự phát triển rễ chậm lại 15-20 ngày Nhiệt độ đất cao (>350C) rễ cà chua phát triển bị trở ngại và có thể bị chết

1.1.3.2 Thân

Thân tròn thẳng đứng, mọng nước, phủ nhiều lông, khi cây lớn gốc thân dần dần hoá gỗ Thân mang lá và phát hoa Ở nách lá là chồi nách, chồi nách ở các vị trí khác nhau có tốc độ sinh trưởng và phát dục khác nhau, thường chồi nách ở ngay dưới chùm hoa thứ nhất có khả năng sinh trưởng mạnh và phát dục lớn so với các chồi nách gần gốc Tuỳ khả năng sinh trưởng và phân nhánh các giống cà chua được chia làm 4 dạng hình:

Dạng sinh trưởng hữu hạn: chiều cao từ 65-120cm

Dạng sinh trưởng vô hạn: Chiều cao cây từ 120->200cm, thân sinh trưởng mạnh

Dạng sinh trưởng bán hữu hạn: Chiều cao cây 65-95cm

Dạng lùn: cây thấp, chiều cao cây dưới 65cm, cây lùn mập, khoảng cách giữa các lóng ngắn

1.1.3.3 Lá

Lá cà chua là đặc trưng hình thái để phân biệt giống này với giống khác

Lá thuộc loại lá kép lông chim lẻ, mỗi lá có 3-4 đôi lá chét, ngọn lá có một

lá riêng gọi là lá đỉnh Rìa lá chét đều có răng cưa nông hay sâu tuỳ giống, phiến lá thường phủ lông tơ ặc tính lá của giống thường thể hiện đầy đủ sau khi cây có chùm hoa đầu tiên

Số lá là đặc điểm di truyền của giống, nhưng cũng bị ảnh hưởng của nhiệt độ trong quá trình hình thành Khi hình thành 10 lá đầu tiên cần nhiệt

độ trung bình hơn 130

C, hình thành 20 lá cần nhiệt độ trung bình ngày đêm

là 240C, nếu nhiệt độ thấp hơn 130C thì quá trình xuất hiện lá mới sẽ chậm lại

1.1.3.4 Hoa

Hoa mọc thành chùm, lưỡng tính, tự thụ phấn là chính Sự thụ phấn chéo

ở cà chua khó xảy ra vì hoa cà chua tiết nhiều tiết tố chứa alkaloid độc nên không hấp dẫn côn trùng và hạt phấn nặng không bay xa được Số lượng hoa trên chùm hoa thay đổi tuỳ giống và thời tiết, thường từ 5-20 hoa Màu sắc của cánh hoa thay đổi theo quá trình phát triển từ vàng xanh đến vàng tươi rồi vàng úa Hoa cà chua nhỏ, hoa đính vào chùm bằng một cuống ngắn Một lớp tế bào riêng rẽ hình thành ở cuống hoa, khi gặp điều kiện không thuận lợi sẽ thúc đẩy quá trình hình thành tầng rời, lớp tế bào sẽ khô héo và chết

Cà chua có 3 loại chùm hoa: ơn giản, trung gian và phức tạp

Cà chua là loại cây có khả năng ra hoa nhiều nhưng tỉ lệ đậu quả thấp, đặc biệt khi gieo trồng trong những điều kiện bất lợi Nguyên nhân rụng nụ, hoa rất phức tạp song chủ yếu do hình thành tầng rời, lớp tế bào bị chết làm cho hoa rụng khỏi chùm Số hoa trên cây là đặc điểm di truyền của giống

nhưng cũng chịu ảnh hưởng của điều kiện ngoại cảnh, chất lượng dinh dưỡng không đầy đủ, kỹ thuật chăm sóc…

1.1.3.5 Qủa

Qủa thuộc loại mọng nước gồm: vỏ, thịt quả, vách ngăn và giá noãn Qủa

cà chua được cấu tạo từ 2 đến nhiều ngăn Số lượng quả trên cây là đặc tính

di truyền của giống và cũng chịu ảnh hưởng của điều kiện ngoại cảnh, chất lượng dinh dưỡng không đầy đủ, kỹ thuật chăm sóc…

Số lượng quả thay đổi lớn từ 4-5 quả đến vài chục quả Khối lượng quả

có sự chênh lệch đáng kể giữa loài và trong loài từ 2-3g đến 200-300g Trên cùng một giống cà chua, số lượng quả và khối lượng quả có sự tương quan nghịch: số lượng quả nhiều thì khối lượng quả nhỏ và ngược lại Số lượng quả trên cây cũng tương quan rất chặt đến năng suất ây cũng là một trong những tính trạng quan tâm của các nhà chọn tạo giống

Hình dạng quả cà chua thay đổi từ tròn, bầu dục đến dài Vỏ quả có thể nhẵn hoặc có khía Màu sắc của quả thay đổi tuỳ giống và điều kiện thời tiết, thường màu sắc quả là màu phối hợp giữa màu vỏ quả và thịt quả Chất lượng quả cà chua được thể hiện qua các chỉ tiêu: cấu trúc quả, độ rắn, tỉ lệ thịt/quả, tỉ lệ đường/ axit và sắc tố quả Sự cân bằng về đường và axit thể hiện hương vị thích hợp

1.1.3.6 Hạt

Hạt cà chua nhỏ, nhiều lông, màu vàng sáng hoặc hơi tối Hạt nằm trong buồng chứa nhiều dịch bào kìm hãm sự nảy mầm của hạt Trung bình có 50-350 hạt trong quả, trọng lượng 1000 hạt là 2,5-3g

1.1.4 Gía trị dinh dưỡng và ý nghĩa kinh tế

Cà chua là loại rau quả quý được sử dụng rộng rãi trên thế giới hơn 150 năm qua Trong quả chín có nhiều chất dinh dưỡng như đường, vitaminA, vitamin C và các chất khoáng quan trọng như a, Fe, P, K, Mg…[6]

Theo ED War, D.C Tigche LAAR (1989) thành phần hoá học trong quả

cà chua chín như sau:

- Nước: 94 – 95%

- Chất khô: 5 – 6% trong đó: 55% đường; 21% chất khô hoà tan trong rượu, protein, xenlulozơ, pectin, polysaccarit; 7% chất vô cơ; 5% các chất khác

Theo PGS.TS Hồ Hữu An (2003-2006) cho thấy thành phần dinh dưỡng trong quả cà chua phụ thuộc rất nhiều yếu tố như thời vụ gieo trồng, giống

và các biện pháp kĩ thuật gieo trồng

à chua còn được sử dụng về mặt thẩm mỹ và y học: Cà chua có thể dùng để chống tiêu chảy, chữa bỏng nắng, giảm đau, làm lành vết thương

Cà chua còn làm thuốc tăng lực, bổ gan và chống xơ gan, sử dụng cà chua hàng ngày giúp chúng ta tiêu hoá khi ăn nhiều mỡ động vật, trứng, phomat…phòng được bệnh xơ cứng thành mạch Phụ nữ dùng quả cà chua đắp mặt hàng ngày làm cho da căng sáng, không nếp nhăn, chống lão hoá.Trong cà chua còn chứa các amino axit (trừ triptophan), giá trị dinh dưỡng của cà chua rất phong phú vì vậy hàng ngày mỗi người sử dụng từ

100 – 200g cà chua sẽ thoả mãn nhu cầu vitamin cần thiết và các chất khoáng chủ yếu Lycopen có trong cà chua là chất chống oxi hoá tự nhiên liên quan tới vitamin đã được chứng minh có khả năng ngăn ngừa bệnh ung thư tuyến tiền liệt, vì lycopen là chất có khả năng ngăn ngừa các gốc tự

do gây ung thư

à chua còn dùng để làm tăng hương vị của các món ăn và tạo cho món

ăn thêm hấp dẫn, cà chua có thể chế biến thành nhiều loại khác nhau như cà chua cô đặc, nước cà chua, cà chua nguyên quả đóng hộp, cà chua muối, dầm dấm, làm salat, mứt…[7]

Cà chua không chỉ là cây rau có giá trị kinh tế cao, nó còn là mặt hàng xuất khẩu của nhiều nước trên thế giới Tuỳ theo đặc điểm của từng vùng sinh thái, tuỳ mùa vụ, một sào bắc bộ có thể cho thu nhập từ 1-3 triệu đồng Theo trung tâm khuyến nông quốc gia (31/03/2006) cà chua trái vụ ở Thực

ạt (Hải Dương) thu được 3-5 triệu/sào (80 triệu đồng/ha) Có thể nói cà chua đã trở thành cây xoá đói, giảm nghèo cho người dân nơi đây

1.2 Tình hình sản xuất cà chua trên thế giới và ở Việt Nam

1.2.1 Tình hình sản xuất cà chua trên thế giới

à chua đã trở thành một trong những cây trồng thông dụng và được trồng phổ biến, rộng rãi trên khắp thế giới Nghiên cứu lịch sử trồng trọt cho biết đến tận thế kỉ thứ 19, cà chua vẫn chỉ được trồng như một cây cảnh nhờ màu sắc đẹp của quả Ngày nay, người ta đã biết ankaloid trong quả cà chua là tomatin, một chất ít độc kể cả khi nó có hàm lượng rất cao Bởi vậy, sản xuất và sử dụng cà chua trên thế giới không ngừng tăng lên Từ năm

1990 – 2001 diện tích trồng cà chua trên thế giới từ 2.868,443 ha tăng lên 3.745,299 ha và sản lượng từ 76.022,112 tấn tăng lên 100.259,346 tấn nhưng năng suất gần như không tăng Phải chăng do những ứng dụng tiến

bộ kỹ thuật mới vào trồng trọt, chăm sóc cà chua chưa nhiều

Trong những năm gần đây diện tích, năng suất và sản lượng cà chua tăng lên thể hiện qua bảng sau

Bảng 2.1 Tình hình sản xuất cà chua trên thế giới

(nghìn ha)

ăng suất (tấn/ha)

Sản lượng (nghìn tấn)

Nguồn:Theo thông kê của FAO (2000-2006)

Thống kê của FAO cho thấy, diện tích cà chua trên thế giới năm 2005 đạt 4.570,869 ha tăng gấp 1,4 lần so với năm 1995

Bảng 2.2: Sản lượng cà chua của thế giới và các nước dẫn đầu

Nguồn:Thống kê của FAO (200-2006)

Qua bảng tổng kết cho thấy: ến năm 2005 thì Trung Quốc vẫn luôn là nước đứng đầu trên thế giới về diện tích và sản lượng cà chua, tiếp theo là

Mỹ và Thổ Nhĩ Kỳ

Có thể thấy rằng cà chua đang là mặt hàng nông sản được sản xuất chủ lực

ở các nước ôn đới và á nhiệt đới

1.2.2 Tình hình sản xuất cà chua ở Việt Nam

Ở nước ta, cà chua được trồng trên 100 năm nay, diện tích trồng cà chua hàng năm biến động 12.000 -13.000 ha Theo thống kê sơ bộ năm 2005 thì diện tích trồng cà chua cả nước là 23.354 ha tăng 3,34 lần so với năm 2000 (6967 ha), với năng suất trung bình đạt 198 tạ/ha Sản lượng đạt 462,435 tấn Năng suất cà chua ở nước ta nói chung còn thấp, chỉ khoảng 60-65%

so với năng suất bình quân của thế giới Các vùng trồng cà chua lớn nhất ở nước ta là : Hải Dương, Nam ịnh, Bắc Giang, Lâm ồng… đây là những vùng trồng cà chua đạt năng suất cao nhất cả nước ( năng suất ≥ 200 tạ/ha)

Bảng 2.3 Diện tích, năng suất và sản lượng cà chua giai đoạn 2000-2005

Năm Diện tích

(1000 ha)

Năng Suất (tạ/ha)

Sản lượng (1000 tấn)

Nguồn: Trích số liệu của tổng cục thống kê 2006

Ở nước ta, cây cà chua sinh trưởng và phát triển tốt nhất vào vụ đông, mặc dù trong những năm gần đây có nhiều cố gắng trong công tác chọn giống và công nghệ nhưng vụ đông vẫn là vụ chính cho sản lượng và chất lượng cao nhất

Trong cả nước có khoảng 22 giống cà chua chủ lực trong đó có 10 giống được sử dụng nhiều nhất với tổng diện tích 6253 ha tương đương với 55% diện tích cả nước đứng đầu là giống M383 sau đó đến giống VL200, Tn002, Cà chua Mỹ, cà chua balan, Red crow, T42, VI2910 và giống Trang Nông

1.3 Khái quát về các nghiên cứu sử dụng đột biến trong chọn tạo giống cây trồng

1.3.1 Ý nghĩa của đột biến trong công tác chọn tạo giống cây trồng

Chọn tạo giống cây trồng là một ngành khoa học cải tiến di truyền của thực vật vì lợi ích của loài người [32] ể tạo ra nguồn biến dị mới với các tính trạng mong muốn các nhà chọn tạo giống phải áp dụng nhiều biện pháp khác nhau như chọn lọc, lai giống, tạo đột biến, gây đa bội thể và gần đây nhất là áp dụng công nghệ sinh học trong chọn giống Chọn lọc là phương pháp cơ bản của chọn giống Tuy nhiên, phương pháp chọn lọc chỉ đưa lại kết quả khi quần thể ban đầu đa dạng về kiểu gen Kết quả của các phương pháp chọn lọc chỉ là thừa hưởng những kho tàng biến dị có sẵn trong tự nhiên chứ không phải là tạo ra được những biến dị mới

Bằng các biện pháp lai tạo và gây đa bội thể thực nghiệm người ta đã làm phong phú thêm nguồn biến dị trong tự nhiên Một hiệu ứng đặc biệt nhận được trong lai giống là ưu thế lai biểu hiện ở thế hệ F1 Tuy nhiên ở cây trồng

do đặc điểm cấu trúc hoa và hệ thống sinh sản của chúng gây cản trở cho việc

áp dụng tạo giống ưu thế lai (bất hợp lai, F1 không có khả năng sống, F1 bất dục, sự suy nhược của con lai) Bằng các phương pháp này ta cũng chỉ mới sử dụng một số ít gen trong hệ thống gen của một cơ thể thực vật quá trình chọn lọc và lai tạo cũng phải trải qua một khoảng thời gian khá dài

ột biến là cơ sở của tiến hoá hình thành nên các giống cây trồng, vật nuôi mới ột biến là một con đường quan trọng dẫn đến việc làm tăng sự biến

dị trong cơ thể sinh vật, nó là sự biến đổi bất thường về vật chất di truyền dẫn đến sự biến đổi một hoặc nhiều tính trạng và có thể được di truyền cho thế

hệ sau ột biến gồm hai loại đột biến tự phát và đột biến nhân tạo

ột biến tự phát là dạng đột biến xảy ra một cách ngẫu nhiên trong tự nhiên do những biến đổi thời tiết, khí hậu do những thay đổi về yếu tố địa lý

v.v… Trong tự nhiên những biến đổi đột ngột do những biến động thời tiết khí hậu, địa lý làm cho sinh vật mới thích nghi hơn với điều kiện sống qua quá trình tiến hoá hàng trăm, thậm trí hàng nghìn năm những giống cây trồng, vật nuôi mới này hình thành những đặc tính khác biệt so với giống cũ ột biến tự phát xảy ra trong tự nhiện có tần số rất thấp thường 10-9 nghĩa là khoảng 10 triệu cá thể mới xuất hiện một cá thể bị đột biến và không phải đột biến nào cũng có ý nghĩa cho con người

ột biến nhân tạo: là đột biến xảy ra do các tác nhân (vật lý hoặc hoá học) gây đột biến được thực hiện bởi con người vì mục đích chọn giống Nhờ việc

sử dụng của các tác nhân gây đột biến người ta có thể tạo được các giống mới trong một khoảng thời gian ngắn và trong một phạm vi thí nghiệm hẹp Gây đột biến là một phương pháp để bổ sung nguồn gen trong chọn giống cây trồng Sau những năm 1995, cùng với sự bùng nổ thông tin của công nghệ thông tin đã có sự tăng cường trao đổi thông tin giữa các nhà khoa học về việc không chỉ gây đột biến để cải tiến giống cây trồng mà còn ứng dụng gây đột biến để khám phá gen kiểm soát những tính trạng quan trọng và tăng

sự hiểu biết chức năng và cơ chế hoạt động của chúng, mà còn giải mã bản chất sinh học của những biến đổi trong chuỗi ADN, sự tự sửa chữa các đột biến Những nghiên cứu về đột biến đã có những thay đổi về lượng và

cả về chất, nghiên cứu tìm hiểu tận gốc những thay đổi trong chuỗi ADN do những tác nhân đột biến gây nên Thậm trí người ta có thể nghĩ đến gây bất hoạt gen nhờ đột biến nhằm ức chế hoặc tạo ra một loại sản phẩm protein mới dẫn đến thay đổi chất lượng của cây trồng

1.3.2 Cơ sở di truyền của đột biến

ột biến có thể xảy ra ở bất kỳ lúc nào và ở bất kỳ tế bào nào Các tác động lên kiểu hình có thể là những biến đổi nhỏ nhất mà chỉ có thể phát hiện bằng các phương pháp phân tích phân tử đến những biến đổi lớn dẫn đến thay đổi

những quá trình cơ bản của tế bào dẫn đến có thể làm chết tế bào hoặc cả cơ thể

ột biến có thể phân chia theo nhiều cách khác nhau Ở các sinh vật đa bào, sự phân biệt quan trọng dựa trên các dạng tế bào đầu tiên xảy ra đột biến Những đột biến xuất hiện ở các tế bào hình thành giao tử được gọi là đột biến gen nhân (germ- line mutations) Những đột biến xảy ra ở tế bào sinh dưỡng được gọi là đột biến tế bào sinh dưỡng (somatic mutations) hay còn gọi là đột biến soma ột biến soma có thể tạo ra một sinh vật vừa có các mô tế bào đột biến vừa có các mô bình thường Hiện tượng này còn được gọi là đột biến khảm ột biến tế bào sinh dưỡng có thể không được di truyền cho thế

hệ sau ối với cây nhân giống vô tính thì tuỳ vào vị trí và phần trăm của

mô sinh dưỡng người ta có thể phân lập được hai hoặc ba loại đột biến khác nhau Ở các loài thực vật bậc cao các đột biến soma có thể được nhân giống

vô tính do đó vẫn có thể giữ lại được các đột biến này [34]

Dựa vào sự thay đổi cấu trúc di truyền đột biến được phân thành hai loại đó

là đột biến nhiễm sắc thể và đột biến gen ột biến nhiễm sắc thể (NST) là

sự biến đổi về cấu trúc hoặc số lượng nhiễm sắc thể ột biến có thể xảy ra ở một cặp NST nào đó hoặc ở toàn bộ các cặp NST Loại đột biến này phát sinh

có thể là do các tác nhân của ngoại cảnh (do chất phóng xạ, hoá chất, sự biến đổi đột ngột của nhiệt độ) hoặc những rối loạn của quá trình trao đổi chất của nội bào dẫn đến sự phân ly không bình thường của các cặp NST Trường hợp NST trong tế bào sinh dưỡng tăng lên thành bội số của n (nhiều hơn 2n) được gọi chung là thể đa bội Tế bào đa bội có lượng ADN tăng gấp bội, quá trình tổng hợp các chất hữu cơ diễn ra mạnh mẽ do đó kích thước tế bào lớn hơn Cơ thể đa bội thường có cơ quan sinh dưỡng to, phát triển khoẻ, chống chịu tốt Hiện tượng đa bội khá phổ biến ở thực vật và đã được ứng dụng hiệu quả trong chọn giống cây trồng ột biến NST có các dạng mất

đoạn, đảo đoạn, lặp đoạn, chuyển đoạn

ột biến gen là những biến đổi về số lượng, thành phần, trật tự các cặp

nucleotide xảy ra tại một điểm nào đó trên phân tử ADN Sự biến đổi về cấu

trúc phân tử của gen có thể dẫn tới biến đổi cấu trúc của một loại protein do

gen đó mã hoá và cuối cùng dẫn đến biến đổi ở kiểu hình Ngoài những đột

biến gen xảy ra trên ADN của NST còn xảy ra đột biến ADN của các bào

quan như ty thể, lạp thể có thể gây ra những biến dị di truyền theo dòng mẹ

1.3.3 Các tác nhân gây đột biến

Bằng chứng về các tác nhân ngoại cảnh có thể làm tăng tỉ lệ đột biến được

công bố vào năm 1927 bởi Hermann Muller, ông đã chứng minh tia X là

tác nhân gây đột biến ở ruồi giấm Kể từ đó một số lượng lớn các tác nhân

gây đột biến được khám phá và được phân thành hai loại đó là tác nhân

vật lý và tác nhân hoá học [35]

Ngay từ những năm 1940 Auerbach và Robson dã khẳng định một số

hoá chất có khả năng gây đột biến Trước những năm 60 của thế kỉ XX trên

thế giới người ta mới sử dụng các tác nhân gây đột biến hoá học Ngày nay có

đến hàng chục nhóm chất hoá học hoặc hàng ngàn dẫn xuất của chúng có khả

năng gây đột biến nhưng nếu xét về phương thức tác dụng chúng có thể được

chia thành năm nhóm như sau:

- Các chất kìm hãm sự tổng hợp của các bazơ nitơ, tham gia vào thành phần

axit nucleic dẫn đến việc hình thành các gốc không bình thường gây ra sự đột

biến Các chất này gồm có: coephin, ethyluretan, theobromin…

- Các chất đồng đẳng của bazơ nitơ như 5- bromuracil (đồng đẳng của

thymin), 2-aminopurin (đồng đẳng của adenin) tham gia vào thành phần DNA

cũng có thể gây đột biến

-Các hợp chất alkyl hoá như EI (ethyleneimin), EMS

(ethylmethanesulfonate) Các hợp chất này có khả năng alkyl hoá các nhóm phosphate trong phân tử ADN cũng như các bazơ purin hay pyrimidine dẫn đến sự đột biến

- Các chất ôxi hoá khử và các gốc tự do như peroxyt, HNO2, aldehyt…gây đột biến liên quan đến sự dezamin hoá các gốc purin và pyrimidine của ADN và ARN

- Các chất nhuộm màu thuộc nhóm acridin, các chất này khi phản ứng với ADN thì tạo thành một phức hệ làm rối loạn sự tái sinh bình thường của ADN Tác nhân gây đột biến vật lý là những dạng tia phóng xạ Muller và Xapeghin là những người đầu tiên đưa ra khả năng sử dụng tia phóng xạ để nâng cao tần số đột biến ở cây trồng Sau đó phương pháp chọn giống mới này đã thu hút được sự chú ý của nhiều người đặc biệt là các nhà

di truyền chọn giống của Liên Xô, ức, Nhật, Thuỵ iển… ó rất nhiều dạng tia phóng xạ và nguồn phóng xạ cho các nhà chọn gống lựa chọn Bên cạnh tia cực tím một số các tia phóng xạ ion hoá như tia X, tia gamma, hạt alpha, beta, hạt proton, neutron, ion beam có thể giải phóng nguồn năng lượng dưới dạng hạt hoặc sóng điện từ có thể gây ra tổn thương sinh học cho tế bào Những tổn thương sinh học do phóng xạ gây ra được hình thành qua hai con đường:

- Phóng xạ tác động trực tiếp xảy ra ở phân tử ADN và gây ra đột biến gen

- Phóng xạ tác động gián tiếp, nó được các các phân tử khác trong tế bào hấp thụ, sau đó các năng lượng này hoặc các sản phẩm của nó được truyền vào ADN dẫn đến biến đổi về cấu trúc ADN

Tia phóng xạ có tác dụng khác nhau đến thực vật tuỳ thuộc vào kiểu phóng

xạ, liều lượng phóng xạ, đặc tính di truyền của giống, trạng thái sinh lý sinh hoá của bộ phận được xử lý và một yếu tố của môi trường bên ngoài [35]

1.4 Ứng dụng của phương pháp gây đột biến trong nghiên cứu

chọn giống

1.4.1 Những nghiên cứu trên thế giới

Vào năm 1964 ở Roma, một hội nghị do FAO và IAEA tổ chức đã đưa

ra những đánh giá về kết quả và triển vọng của phương pháp chọn giống đột biến đối với cải tiến giống cây trồng và 5 năm sau người ta công bố đã

có 77 giống đột biến ra đời

Những năm 1970, ơ quan năng lượng nguyên tử quốc tế (IAEA) và

Tổ chức nông lương thế giới (F O) đã tài trợ mở rộng hướng nghiên cứu gây đột biến cải tạo cây nông nghiệp và cây công nghiệp nhiều nước trên thế giới nhằm tạo ra hàng loạt giống mới như: lúa, lúa mỳ, lúa mạch, táo, chanh, mía, chuối

Năm 1990, hội nghị do FAO/IAEA tổ chức thông báo có 1363 giống cây trồng được tạo ra từ phương pháp đột biến ở 48 quốc gia, trong đó có

559 giống hoà thảo và 415 giống cây trồng ến năm 1996 cũng theo F O/ IAEA công bố đã có tới gần 1800 giống cây trồng

Cho tới năm 2003 (F O/I E Mutant Varieties Database), 2317 giống cây trồng đã được tạo ra bằng gây đột biến thực nghiệm trên phạm vi 60 nước, trong số đó có 1585 giống cây trồng được trực tiếp sử dụng sau khi gây đột biến và 667 giống được sử dụng một cách gián tiếp như là vật liệu trong các phép lai Việc ứng dụng kỹ thuật hạt nhân để cải tiến cây trồng đã mang lại hiệu quả cực kỳ to lớn về mặt kinh tế, ước tính các nước đã thu được hàng tỷ đô la từ hàng triệu hecta gieo trồng những giống cây được tạo

ra từ đột biến.[33]

Hiện nay theo thống kê mới nhất của F O/I E đã có trên 3000 giống cây trồng được tạo ra bằng phương pháp đột biến, trong đó riêng lúa

có hơn 600 giống và Trung Quốc là nước dẫn đầu thế giới về trồng lúa đột biến có những tính trạng đặc sắc

Hơn 90% các giống đột biến nói trên đựơc tạo ra nhờ việc sử dụng tia x

và tia Gamma Phần lớn các giống được đưa vào sản xuất là những dạng có thay đổi về kiểu hình thời gian ra hoa, màu và dạng hoa, kích thước và màu quả, chống sâu bệnh Một số đột biến có giá trị khác như: thay đổi hàm lượng Protein, axit amin, chất lượng tinh bột ở nội nhũ hạt…

Năn 1967, Swaminathan (Ấn ộ) đã dùng tia gamma và tia tử ngoại chiếu lên hạt giống lúa mỳ Mehico Suorra 64 đã tạo ra giống đột biến Sảbati có hàm lượng protein cao hơn giống gốc 2,3%

Ở viện nghiên cứu Crasnoda của Nga năm 1976 đã xử lý tia Laze lên hạt lúa mỳ tạo được giống đột biến Ljubov có hàm lượng protein tăng và năng suất tăng 15% so với giống gốc

Kutefa ( Trung Quốc) năm 1989 xử lý tia Rơnghen liều 9,3 Krad lên hạt nảy mầm giống lúa Wuxian 20 và chọn tạo được giống mới tăng năng suất

so với giống gốc 30% ũng xử lý lên hạt nảy mầm giống Lungjing ở 2 liều 1 Kr và 2Kr tác giả thu được dạng đột biến thấp cây hơn giống gốc 30cm và năng suất vượt giống gốc 2,3 tấn/ha

Năm 1965, Tedoradze XG đã sử dụng tia gamma liều 17Kr xử lý hạt đậu tương, chọn lọc qua nhiều thế hệ và thu được giống đậu tương chín sớm, chống chịu bệnh và năng suất vượt giống gốc 6,7 tạ/ha

Ở Ấn ộ tác giả Kerketta V., Haque M.F bằng xử lý phóng xạ lên hạt giống đậu tương Birsa1 có vỏ hạt màu đen đã thu được những dòng đột biến có vỏ màu nâu, trắng hoặc vàng sẫm, cho năng suất cao hơn giống gốc [36]

Tạo được giống đậu chống bệnh cũng là một thành công của phương pháp chiếu xạ Tác gỉa Laseejan S xử lý tia gamma liều 15 – 30 Kr lên hạt

11 giống và chọn lọc qua nhiều thế hệ thu được 16 dòng cho sản lượng hạt cao và chống bệnh gỉ sắt

Sonnino A, khi xử lý phóng xạ lên chồi cây khoai tây đã thu nhận được các đột biến cây lùn, thay đổi màu sắc vỏ củ

Trên đối tượng hoa cây cảnh cũng thu được nhiều thành công từ chọn giống chiếu xạ Trong những năm từ 1987 – 1989, các nhà chọn giống Ấn

ộ đã tạo được 37 dạng đột biến ở hoa cúc, 14 dạng đột biến ở hoa hồng khác nhau về kích thước, màu sắc hoa

Năm 2000, các tác giả của Thái Lan đã tiến hành chiếu xạ cụm chồi hoa cúc bằng tia gamma ở các liều chiếu là 10, 30, 50, 70, 90,110 Gy Kết quả thu được cho thấy liều chiếu xạ 10Gy cho tỉ lệ sống cao nhất Sau chiếu xạ

đã tạo ra các cây cúc cho hoa có màu sắc kích thước và số lượng cánh hoa khác nhau trên cùng một bông hoa

Tác giả Xiao-Shan Shen, Jue-Zhen Wan, Wei- YiLuo và CS (2004) người Trung Quốc đã nghiên cứu ảnh hưởng của liều lượng chiếu xạ đến chồi đồng tiền trong các môi trường nuôi cấy M1,M2,M3 ( là các môi

trường tái sinh callus, môi trường tái sinh chồi, môi trường tạo rễ) trong in

vitro Vật liệu sử dụng để chiếu xạ là callus đồng tiền, kết quả tìm ra liều

chiếu xạ gây chết callus đồng tiền là từ 8 – 9Kr và liều có hiệu quả đột biến

là 5 – 6Kr

1.4.2 Những nghiên cứu ở Việt Nam

Ở Việt Nam, lĩnh vực này đã được cố giáo sư Lương ình ủa khởi xướng từ những năm 1960 Nhưng mãi đến năm 1980, hướng nghiên cứu này mới được phát triển một cách tương đối có hệ thống và định hướng do

cố tiến sĩ Phan Phải và cộng sự tiến hành Sau đó, một loạt nghiên cứu của các tác giả khác trên nhiều đối tượng cây trồng khác nhau như: lúa, ngô, đậu, lạc, táo, cà chua, hoa cúc đã tạo ra nhiều dòng đột biến có giá trị,

được chọn lọc và phát triển trực tiếp thành các giống quốc gia hoặc các dòng có triển vọng phục vụ cho công tác lai tạo giống mới

Từ năm 1989 – 2000 Viện di truyền Nông nghiệp đã công bố 6 giống lúa quốc gia, trong đó giống DT10 được tạo ra nhờ xử lý tia gamma liều 20Kr lên hạt khô của giống C4-63 ũng từ xử lý tia gamma liều 20Kr lên hạt khô của con lai F1 giữa giống TB1 và IR22, Viện kỹ thuật Nông nghiệp tỉnh Thái Bình đã chọn lọc được M174 có P1000 hạt là 40g [15]

Năm 1992, Phạm Văn Ro bằng phương pháp phóng xạ đối với một số giống lúa như Tài nguyên đục, Tép hành đã chọn tạo được các giống có thời giam sinh trưởng ngắn hơn rất nhiều so với giống gốc

Năm 1994, Nguyễn Minh ông và ào Xuân Tân tạo được 2 dòng đột biến từ nếp Quýt Bắc Ninh có hàm lượng protein cao hơn hẳn giống gốc bằng xử lý tia gamma lên hạt nảy mầm.[18]

Nghiên cứu mới đây của Hoàng Quang Minh, Nguyễn Như Toản” Hiệu ứng chiếu xạ tia gamma ( nguồn Co60

) lên hạt lúa và những biến đổi di truyền trong M1 và M2” đã rút ra kết luận: Xử lý chiếu xạ tia gamma lên hạt lúa ướt ( ngâm sau 20h) với 3 liều lượng 15K, 20K, 25K đã tạo ra hiệu ứng đột biến cao Từ đó tạo nguồn vật liệu khởi đầu rất đa dạng và phong phú cho công tác chọn tạo giống lúa [10]

Chiếu xạ tia gamma liều 18Kr lên hạt giống đậu tương K-04 có hạt màu xanh, tác giả Mai Quang Vinh, Trần Văn Lài và S đã chọn được dòng DT95 có khả năng sinh trưởng khỏe và cho năng suất cao, có trường hợp tới 200% so với giống đối chứng.[9]

Trên cây lạc, tác giả Lê Song Dự khi chiếu liều 5Kr lên giống Bạch sa

đã tạo ra giống mới B5000 có năng suất cao hơn giống gốc 20 – 30%, hàm lượng protein đạt 21,48%, dầu 52,5% [11]

Năm 2003, ỗ Quang Minh, Nguyễn Xuân Linh đã bước đầu tạo ra nguồn vật liệu khởi đầu cho chọn tạo giống cúc bằng việc gây đột biến thực nghiệm từ việc chiếu xạ tia gamma (nguồn Co60) trên chồi in vitro

Năm 2005, ào Thanh Bằng và cộng sự thuộc Viện Di Truyền Nông nghiệp đã chiếu xạ vào mô sẹo cây hoa cúc bằng tia gamma ở các liều 1, 3,

5, 7 và 15Kr nhằm tăng phổ đột biến màu sắc hoa từ màu trắng ban đầu Kết quả thu được cho thấy liều gây chết 50% về khả năng tái sinh chồi là 5Kr và thu được 3 thể đột biến về màu sắc: hoa màu hồng, hoa vàng và hoa

có chóp cánh màu xanh.[40]

Năm 2007, Viện Di Truyền Nông nghiệp đã nghiên cứu ảnh hưởng của liều chiếu xạ lên callus đồng tiền, kết quả tìm ra liều gây chết là 12Kr và liều chiếu xạ có hiệu quả cho tỉ lệ sống và tỷ lệ đột biến cao là 16Kr

1.5 Ứng dụng các chỉ thị phân tử trong chọn giống cây trồng

1.5.1 Khái quát về các loại chỉ thị phân tử trong chọn giống cây trồng

Chỉ thị phân tử được coi là những đoạn ADN đã được tìm thấy ở các vùng đặc hiệu trên bộ gen và được di truyền theo các quy luật từ thế hệ này sang thế hệ khác Sự phát triển và sử dụng các loại chỉ thị phân tử để phát hiện và khám phá sự đa hình của ADN, lập bản đồ di truyền và nghiên cứu sự liên kết của các tính trạng là một trong những tiến bộ nhất trong lĩnh vực di truyền phân tử Sự hiện diện của rất nhiều loại chỉ thị phân tử khác nhau và sự khác nhau về nguyên lý, phương pháp và sự ứng dụng của chúng đòi hỏi sự cân nhắc trong việc lựa chọn một hoặc nhiều phương pháp Chưa có một loại chỉ thị phân tử nào đáp ứng được tất cả các nhu cầu của các nhà nghiên cứu Tuỳ theo các dạng nghiên cứu sẽ được đảm nhận có thể chọn một trong số các kỹ thuật sinh học phân tử khác nhau, mỗi kỹ thuật đó kết hợp ít nhất một vài đặc tính được mong đợi Cho đến nay đã có rất nhiều loại chỉ thị phân tử được

phát triển và ứng dụng trong lĩnh vực chọn giống cây trồng ở mức độ phân

tử người ta gọi là chọn giống nhờ chỉ thị phân tử (Marker Assisted Selection-MAS) Các loại chỉ thị này được phân thành các nhóm khác nhau dựa trên:

a) Phương thức di truyền (di truyền nhân từ bố mẹ, di truyền nhân

từ mẹ, di truyền cơ quan từ mẹ, di truyền cơ quan từ bố và mẹ.)

b) Phương thức hoạt động của gen (chỉ thị trội hay đồng trội)

c) Phương pháp phân tích (chỉ thị lai hoá hay chỉ thị PCR) [26]

Chỉ thị phân tử dựa trên sự lai hoá

RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) là chỉ thị phân tử dựa

trên lai hoá được sử dụng phổ biến nhất Kỹ thuật này dựa trên sự nhận biết của các enzyme giới hạn ở các vị trí khác nhau giữa các đoạn ADN ở các sinh vật riêng biệt Nguyên lý và phương pháp của chỉ thị RFLP như sau:

- Phân cắt ADN với một hoặc nhiều enzyme

- Phân đoạn các đoạn cắt giới hạn bằng agarose gel

- Chuyển các đoạn cắt riêng biệt từ agarose gel sang màng lọc bằng

Southern blotting

- Phát hiện các băng cá biệt bằng sự lai hoá axít nucleic với các mẫu dò

- Ưu điểm chủ yếu của chỉ thị RFLP là có khả năng tái bản cao, ưu thế trội,

có khả năng chuyển giao tốt giữa các phòng thí nghiệm, cung cấp các chỉ thị locus đặc hiệu mà cho phép nghiên cứu (bảo tồn các gen giữa các sinh vật

có họ hàng), không đòi hỏi thông tin về trình tự, và tương đối dễ chấm điểm

do kích thước khác nhau giữa các đoạn ADN Tuy nhiên, phương pháp RFLP

vẫn còn có một vài hạn chế như sau:

- òi hỏi mẫu ADN đem phân tích phải có số lượng và chất lượng tốt

- Nó phụ thuộc váo sự phát triển của thư viện các mẫu dò đặc hiệu đối với từng loài

- Kỹ thuật này rất khó tự động hóa

- Mức độ đa hình thấp và chỉ có một vài locus được nhận biết sau mỗi lần thử

- Tốn thời gian, thiết bị và đắt tiền

- Yêu cầu phải có mẫu dò đánh dấu phóng xạ

Các chỉ thị dựa trên PCR

PCR là một kỹ thuật sinh học phân tử, nó là sự sao mã các đoạn ADN nhờ enzyme mà không cần đến cơ thể sống Chỉ cần một lượng nhỏ ADN có thể nhân bản một số lượng lớn các gen cần thiết nhờ một thiết bị biến đổi nhiệt và enzyme ADN polymerase Những ưu điểm chính của kỹ thuật PCR so với phương pháp phân tích dựa trên sự lai hoá đó là chỉ cần một lượng nhỏ ADN

và có thể không cần đến mẫu dò gắn phóng xạ, có khả năng khuếch đại trình

tự ADN từ các mô đã được bảo quản, có thể ứng dụng cho nhiều loại chỉ thị di truyền, có khả năng chọn lọc nhiều gen trong cùng một thời điểm và trong thời gian ngắn và đây là một phương pháp có thể áp dụng được ở tất cả các phòng thí nghiệm quy mô nhỏ và có thể tiết kiệm về chi phí Ngày nay dựa trên kỹ thuật PCR nhiều loại chỉ thị phân tử đã được phát triển và cho kết quả rất triển vọng Các loại chỉ thị phân tử khác nhau dựa trên PCR được chia thành hai dạng dựa vào các mồi sử dụng để khuếch đại như sau:

- Chỉ thị phân tử mồi ngẫu nhiên hoặc bán ngẫu nhiên không phát

triển trên các đoạn ADN không cần biết trước trình tự (như AP-

PCR, RADP, DAF, AFLP, ISSR)

- Chỉ thị phân tử có chủ đích được phát triển từ các trình tự ADN

đã biết (như ETS, PS, SSR, S R, STS…)

SSR (Simple Sequence Repeat, Microsatellites)

SSR hay còn gọi là vi vệ tinh, là những đoạn trình tự ADN đơn giản lặp lại nối tiếp và chỉ gồm 1- 6bp có trong hệ gen của các loài sinh vật bậc cao (Litt and Luty, 1989; Jacob et al, 1991) Phản ứng PCR đối với chỉ thị SSR được thực hiện nhờ sự có mặt của mồi xuôi, mồi ngược và kéo dài mạch từ đầu 5’ đến 3’ của ADN mạch khuôn Các đoạn sản phẩm PCR thường được phân tích bằng cách điện di trên băng polyacrylamide kết hợp với nhuộm AgNO3 hoặc Ethylrium bromua (EtBt) Gel agarose (thường 3%) với EtBr cũng được sử dụng khi sự khác biệt về kích thước của các allen giữa các mẫu lớn hơn 10 bp Tuy nhiên, tuỳ từng loài mà số lượng các nucleotid trong mỗi đơn vị lặp lại có thể thay đổi từ một đến hàng chục và số lượng đơn vị lặp lại có thể biến động từ hai đến hàng chục lần hoặc nhiều hơn Thông thường có các kiểu lặp lại:

- Lặp lại hoàn toàn: các đơn vị lặp lại sắp xếp nối tiếp nhau

- Lặp lại không hoàn toàn: xen kẽ vào các đơn vị lặp lại là một hoặc một

số nucleotid khác

- Lặp lại phức tạp: xen kẽ giữa các đơn vị lặp lại khác nhau

Thông thường, các SSR có mặt chủ yếu ở các vùng dị nhiễm sắc của nhiễm sắc thể như vùng tâm động hoặc các đầu mút, chúng giữ vai trò quan trọng trong việc điều hoà phiên mã đối với các gen hoạt động ở vùng nguyên nhiễm sắc, góp phần làm tăng tính ổn định cơ học của nhiễm sắc thể trong các quá trình phân bào và có thể chứa đựng những thông tin di

truyền liên quan đến sự xác định giới tính ở cả động vật và thực vật

Bản chất đa hình của SSR có thể được sinh ra do sự nhân bội từ ADN tổng số của hệ gen nhờ sử dụng 2 đoạn mồi bổ trợ với trình tự gần kề hai đầu của vùng lặp lại Sự khác nhau về độ dài ở locut SSR được phát hiện bởi sự nhân đoạn ADN nhờ phản ứng P R Kích thước của sản phẩm P R được xác định một cách chính xác bằng điện di trên gel agarose hoặc gel polyacrylamide với sự khác nhau về độ dài có thể rất nhỏ (2bp) Chỉ thị SSR dùng để đánh giá đa dạng di truyền, xác lập quan hệ di truyền của cây trồng, chọn lọc tính kháng bệnh, một số tính trạng có quan hệ chặt chẽ với năng suất ở cây lúa, lập bản đồ, nghiên cứu locut tính trạng số lượng (QTL)

Ưu điểm và hạn chế của chỉ thị SSR

Thuận lợi to lớn của sự phân tích SSR là phương pháp này biểu hiện số lượng lớn sự đa hình Hơn nữa, khả năng phân biệt các cá thể khi có sự kết hợp các locus được kiểm tra làm cho phương pháp này rất hữu dụng trong các thí nghiệm dòng chảy gene, xác định cây trồng và phân tích mối quan hệ di truyền [35]

SSR là chỉ thị đồng trội, do đó dị hợp tử có thể dễ dàng được xác định trong quá trình thực nghiệm Tính đồng trội của SSR sẽ gia tăng sự hiệu quả và độ chính xác của những phép tính toán di truyền quần thể dựa trên những chỉ thị này so với những chỉ thị khác, như FLP và R PD Hơn nữa, việc xác định dị hợp tử ở thế hệ F1 sẽ làm cho những phân tích phả

hệ, sự lai giống, dòng chảy gen trở nên dễ dàng hơn (Schlotterer và Pemberton, 1994) SSR là công cụ hữu hiệu để chọn lọc giống, đa dạng hoá về các vật liệu di truyền và dùng trong thiết lập bản đồ di truyền Chẳng hạn, Parasnis phát hiện đoạn lặp lại G T kích thước 5 kb chỉ có

ở cây đu đủ đực không có ở cây đu đủ cái bằng chỉ thị SSR

Khi các mồi SSR đã được xác định, việc sàng lọc các vật liệu sử dụng kỹ thuật này hoàn toàn không đắt tiền Hơn nữa, sự khuếch đại SSR giữa các loài nghĩa là sự xác định những mồi SSR thích hợp không cần thiết trong những loài có quan hệ gần [24] Các chỉ thị SSR ngày nay là chỉ thị được lựa chọn ở hầu hết các lĩnh vực di truyền phân tử vì chúng có độ

đa hình cao thậm chí ở các dòng có quan hệ gần gũi, nó không đòi hỏi chất lượng và số lượng DNA cao, có thể trao đổi thông tin giữa các phòng thí nghiệm [23]

Hạn chế của chỉ thị này là quá trình thiết kế mồi quá đắt, mỗi loại mồi chỉ đặc trưng cho một loài và không thể áp dụng phân tích trên một hệ thống lớn bao gồm nhiều loài có quan hệ di truyền xa nhau

RAPD (Random amplified polymorphic DNA)

RADP hay còn gọi là đa hình khuếch đại ngẫu nhiên ADN là kỹ thuật sử

dụng các đoạn mồi có trình tự nucleotide ngẫu nhiên để nhân bản các đoạn ADN mạch khuôn trong bộ gen mà không cần biết trước trình tự của nó [32] Kỹ thuật RADP thường sử dụng các mồi ngẫu nhiên có khoảng 10bp

có nhiệt độ bắt cặp mồi thấp (thường từ 34-37oC)

Ưu điểm của kỹ thuật này là không cần biết trình tự nucleotide của đoạn ADN khuôn, quy trình tiến hành tương đối nhanh, dễ thực hiện ở quy mô phòng thí nghiệm nhỏ, cần một lượng mẫu ADN nhỏ Tuy nhiên, chỉ thị RADP có một số hạn chế đó là các phản ứng PCR phụ thuộc vào nồng độ và chất lượng của ADN khuôn, nồng độ của MgCl2, tỉ lệ giữa mồi và mạch khuôn, nhiệt độ bắt cặp, nguồn enzyme taq polymerase Tuy nhiên những hạn chế này có thể được khắc phục bởi việc lựa chọn phương pháp tách chiết ADN thích hợp và tối ưu hoá các thông số đã nêu trên Một hạn chế khác của chỉ thị RAPD đó là RADP có tính trội do đó những gen nào điều khiển tính trạng

lặn sẽ khó tìm thấy sự đa hình trong quá trình điện di

Chỉ thị DAF (DNA amplification fingeprinting) khác biệt với RAPD chủ yếu là sử dụng các mồi ngắn (ít nhất 5 bp), nồng độ mồi cao hơn, hai chu kỳ nhiệt thay cho ba chu kỳ nhiệt và nhận biết sản phẩm khuếch đại băng gel polyacrylamide nhuộm AgNO3 ặc tính chủ yếu của AP- PCR khi so sánh với RAPD và DAF là:

AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)

Chỉ thị AFLP là sự kết hợp của RFLP với khả năng linh hoạt của kỹ thuật

PCR bằng cách gắn các mồi đã biết trình tự với các đoạn DNA được phân

cắt bởi enzyme giới hạn [32 ]

Ưu điểm của AFLP là:

1) Độ tin cậy cao và có khả năng tái bản

2) Không yêu cầu bất cứ thông tin về trình tự DNA của các sinh vật cần nghiên cứu

3) Cung cấp nhiều thông tin nhờ khả năng phân tích đồng thời một số lượng lớn các locus đa dạng (tỉ lệ đa phần hiệu quả) với sự kết hợp của các mồi riêng rẽ trên một bản gel riêng rẽ khi so sánh với RADPs, RFLP và microsatellites

4) Các sản phẩm khuếch đại AFLP cùng di chuyển hầu hết là tương đồng và

ở locus đặc trưng ngoại trừ các loài đa bội

So sánh với phương pháp RAPD hạn chế của AFLP là:

a) Phương pháp này yêu cầu thực hiện nhiều bước để thu được kết quả

b) Phương pháp này yêu cầu các mẫu ADN sạch các thành phần ức chế

có thể ảnh hưởng đến enzyme giới hạn

c) Kỹ thuật này yêu cầu sử dụng gel polyacrylamide kết hợp với nhuộm AgNO3, hoặc phương pháp đánh dấu phóng xạ hoặc đánh dấu huỳnh

quang để xác định, nó sẽ đắt hơn và khó khăn hơn so với gel agarose

d) Phương pháp này đòi hỏi bổ sung chi phí để mua các emzyme giới hạn

và các enzyme nối mạch cũng như các adapter

Giống như RAPD, phần lớn các locus AFLP là trội nó không phân biệt được sự đồng trội từ các thể dị hợp iều này làm giảm độ chính xác của chỉ thị AFLP trong phân tích di truyền quần thể, lập bản đồ di truyền

ISSR (inter- simple sequence repeat)

ISSR là sự khuếch đại của các đoạn ADN tồn tại ở một khoảng có thể

khuếch đại được giữa hai vùng lặp vi vệ tinh giống hệt nhau định hướng theo chiều đối diện Kỹ thuật này sử dụng các vùng vi vệ tinh như các mồi trong một phản ứng PCR hướng tới nhiều locus của hệ gen để khuếch đại chủ yếu các đoạn lặp trình tự đơn giản của các đoạn có kích thước khác nhau

Ưu điểm của kỹ thuật này:

Kỹ thuật này đơn giản, nhanh và không cần phải sử dụng các chất đánh dấu phóng xạ

Nhược điểm của ISSR là chỉ phân tích được các gen trội, không phát hiện được sự đa hình của gen lặn trong các cơ thể dị hợp và ISSR cũng không có khả năng phân tích các đoạn cùng dịch chuyển trên gel bắt nguồn từ các vùng không tương đồng [26]

EST (Expressed sequence tags)

EST là chỉ thị phân tử bắt nguồn từ cDNA (complementary DNA)

được tổng hợp của một phân tử mRNA Mỗi cDNA là điển hình cho một gen được phân lập do đó các nhà khoa hoc có thể giải trình tự một vài trăm nucleotide từ đầu 5’ hoặc 3’ để tạo ra các đoạn đánh dấu trình tự biểu hiện 5’ (5’EST) hoặc 3’EST [25] Việc tạo ra các chỉ thị EST được bắt đầu từ việc thiết lập các thư viện về cDNA Chỉ thị EST đầu tiên được sử dụng để nhận dạng các bản sao của gen nhưng sau này nó là một công cụ để khám phá gen,

thu thập số liệu về sự biểu hiện và điều hoà của gen và xác định trình tự gen để phát triển các trình tự có giá trị cao như RFLP, SSR, CAPS dựa trên chỉ thị EST EST cũng đã được sử dụng để thiết kế các mẫu dò cho ADN microarray

CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence)

CAPS là sự kết hợp của PCR và RFLP và đầu tiên nó được gọi là PCRRFLP [34] Do sự đa hình giữa các cá thể sinh vật được xác định dựa vào kết quả so sánh kích thước các băng ADN của chúng, vì vậy mà sản phẩm PCR gồm các băng ADN của các mẫu sinh vật có thể không khác nhau

về kích thước nhưng lại có thể khác nhau về trình tự sắp xếp các nucleotide

Từ lý giải nói trên, các nhà khoa học đã sử dụng các enzym giới hạn để cắt sản phẩm RAPD, STS, SSR nếu trình tự nucleotide của các sản phẩm

đó chứa vị trí nhận biết của enzym nào đó thì nó sẽ bị cắt tại đó Sự đa hình

sẽ được phát hiện khi sản phẩm cắt được tiếp tục được điện di trong gel

SCAR (Sequence characterized amplified region)

Chỉ thị SCAR là một đoạn ADN của hệ gen được xác định bằng sự khuếch đại bởi PCR sử dụng một cặp mồi oligonucleotide đặc hiệu [32] Các chỉ thị SCAR được thu nhận bằng cách nhân dòng và giải trình tự hai đầu mút của chỉ thị RAPD mà xuất hiện ở dạng đặc trưng cho các mục đích riêng biệt (ví dụ như băng RADP biểu hiện trong các dòng kháng bệnh nhưng không có ở trong các dòng dễ mắc bệnh) Chỉ thị SCAR có ưu điểm hơn chỉ thị RAPD vì chúng chỉ xác định một locus riêng biệt, sự khuếch đại của các chỉ thị này ít nhạy cảm với các điều kiện phản ứng và chúng có khả năng

biến đổi trong các chỉ thị đồng trội

STS (sequence tagged site)

Chỉ thị STS là một đoạn duy nhất, ngắn có trình tự xác định, mỗi chỉ

thị STS được ghi nhận trên bản đồ tại một vị trí chuyên biệt nào đó trong hệ gen Ở thực vật các chỉ thị STS là một cặp mồi được thiết kế bằng cách giải trình tự một mẫu dò RFLP mà có số bản sao ít nhất khi phân tích [22] hoặc là các đoạn AFLP Các mồi được thiết kế dựa trên chỉ thị RAPD đôi khi cũng được coi như chỉ thị STS Chỉ thị STS là tiền đề cho phép chuyển đổi bản đồ di truyền thành bản dồ vật lý Các chỉ thị STS là chỉ thị đồng trội, nó thích hợp với việc phân tích mẫu với số lượng nhiều và khả năng tự động hoá cao

SNP (single nucleotide polymorphism)

Trong một số những công bố về trình tự hệ gen của một vài sinh vật

đã có những nghiên cứu sự khác nhau về trình tự giữa các cá thể, giữa các giống hoặc dưới loài Những nghiên cứu này đã khám phá ra sự đa hình của các nucleotide đơn (SNP) và cho thấy các gen bị thêm hoặc mất nucleotide rất nhiều và phân bố trong toàn bộ gen của các loài khác nhau kể

cả thực vật úng như tên của nó, một chỉ thị SNP là một base thay đổi trong một đoạn DNA với sự chuyển đổi thường xảy ra của hai nu bổ sung

ở vị trí nhất định Do đó SNP ngược lại với tất cả các phương pháp đã nói ở trên, việc xác định các allele không thể dựa trên sự khác biệt về kích thước khi điện di trên gel Trong nhiều năm qua một số lượng lớn các phương pháp xác định kiểu gen SNP khác nhau và các hoá chất đã được phát triển dựa trên nhiều phương pháp khác nhau của việc đánh giá các allele và phát hiện các lý thuyết nền tảng Tất cả các phương pháp của việc xác định kiểu gen SNP đều kết hợp hai yếu tố: đầu tiên là sự tạo ra của một sản phẩm của allele đặc hiệu và thứ hai là phân tích các sản phẩm đó

Ưu điểm của SNP đó là nó có tính ổn định rất cao về mặt di truyền, có thể ước đoán được tần suất allele dễ dàng trong bất cứ một quần thể nào thông qua một loạt các kỹ thuật xét nghiệm Tuy nhiên nhược điểm của