NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH MỘT SỐ HỢP CHẤT HỮU CƠ VÒNG BÉ BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLCMS VÀ NMR (luận văn thạc sĩ)

NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH MỘT SỐ HỢP CHẤT HỮU CƠ VÒNG BÉ BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLCMS VÀ NMR (luận văn thạc sĩ)NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH MỘT SỐ HỢP CHẤT HỮU CƠ VÒNG BÉ BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLCMS VÀ NMR (luận văn thạc sĩ)NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH MỘT SỐ HỢP CHẤT HỮU CƠ VÒNG BÉ BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLCMS VÀ NMR (luận văn thạc sĩ)NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH MỘT SỐ HỢP CHẤT HỮU CƠ VÒNG BÉ BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLCMS VÀ NMR (luận văn thạc sĩ)NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH MỘT SỐ HỢP CHẤT HỮU CƠ VÒNG BÉ BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLCMS VÀ NMR (luận văn thạc sĩ)NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH MỘT SỐ HỢP CHẤT HỮU CƠ VÒNG BÉ BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLCMS VÀ NMR (luận văn thạc sĩ)NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH MỘT SỐ HỢP CHẤT HỮU CƠ VÒNG BÉ BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLCMS VÀ NMR (luận văn thạc sĩ)NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH MỘT SỐ HỢP CHẤT HỮU CƠ VÒNG BÉ BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLCMS VÀ NMR (luận văn thạc sĩ)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

Lời cảm ơn!

Để hoàn thành ch-ơng trình cao học và viết luận văn này, tôi đã nhận đ-ợc

sự h-ớng dẫn, giúp đỡ và góp ý nhiệt tình của quý thầy cô tr-ờng Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà nội và Viện hóa học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt nam

Tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến Phó Giáo s- - Tiến sĩ Nguyễn Văn Tuyến

- Viện tr-ởng - Tr-ởng phòng Hóa d-ợc - Viện hóa học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt nam đã giành rất nhiều thời gian và tâm huyết h-ớng dẫn nghiên cứu và giúp tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp

Tôi xin chân thành cảm ơn các cô chú và anh chị tập thể phòng Hóa d-ợc, Phòng thí nghiệm Khối phổ - Viện hóa học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt nam đã tạo mọi điều kiện để tôi học tập và hoàn thành tốt luận văn này

Đồng thời tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Khoa Hóa học - Tr-ờng Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà nội, ng-ời thân và bạn

bè vì sự giúp đỡ quý báu, tận tình trong quá trình tôi học tập và nghiên cứu tại Khoa hóa học - Tr-ờng Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà nội

Tôi xin chân thành cảm ơn sự tài trợ của đề tài cơ bản thuộc ch-ơng trình hợp tác FWO-NAFOSTED (mã số: 01/2010) đã hỗ trợ kinh phí để hoàn thành luận văn này

Mặc dù tôi đã có nhiều cố gắng hoàn thiện luận văn bằng tất cả sự nhiệt tình

và năng lực của mình, tuy nhiên không thể tránh khỏi những thiếu sót, rất mong nhận đ-ợc những đóng góp quí báu của quí thầy cô và các bạn

Hà nội ngày 12 tháng 12 năm 2012 Học viên

Nguyễn Tiến Dũng

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC CÁC HÌNH 1

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ 2

MỞ ĐẦU 4

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 5

1.1 BETA LACTAM 5

1.2 TỔNG HỢP BETA LACTAM 6

1.2.1 Phản ứng Staudinger 6

1.2.2 Cơ chế phản ứng và điều khiển độ chọn lọc lập thể 7

1.3 PHÂN TÍCH CÁC ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG 10

1.3.1 Phương pháp tách các đồng phân đối quang bằng enzym 10

1.3 2 Tách các đồng phân đối quang nhờ tác nhân bất đối bổ trợ 11

1.3.3 Tách đồng phân đối quang bằng các phương pháp hóa lý hiện đại 11

1.3.4 Phân tích các đối quang nhờ phương pháp NMR 12

1.4 SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) 20

1.4.1 Khái niệm 20

1.4.2 Phân loại 20

1.4.3 Pha tĩnh trong sắc ký pha đảo 20

1.4.4 Pha động trong sắc ký pha đảo 21

1.4.5 DETECTOR DAD 22

1.4.6 DETECTOR MS 23

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM 25

2.1 Phương pháp nghiên cứu và trang thiết bị 25

2.1.1 Các phương pháp tổng hợp hữu cơ 25

2.1.2 Dụng cụ và hóa chất 25

2.1.3 Định tính phản ứng và kiểm tra độ tinh khiết của dẫn xuất bằng sắc kí lớp mỏng 26 2.1.4 Các phương pháp phân tích cấu trúc 26

2.2 Tổng hợp các hợp chất β-lactam 28

2.2.1 Tổng hợp dẫn xuất 2-phenoxy clorua axetic 28

2.2.2 Tổng hợp dẫn xuất imine 29

2.2.3 Tổng hợp các dẫn xuất β- lactam 30

2.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 H và 13C của các hợp chất 9a, 9b, 9c, 9d, 9e, 9f 31

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34

3.1 TỔNG HỢP CÁC HỢP CHẤT β-LACTAM 34

3.2 PHÂN TÍCH CẤU TRÚC HỢP CHẤTcis-β-LACTAM 35

3.2.1 Phân tích phổ 1H-NMR của hợp chất 9a 35

3.2.2 Phân tích phổ 1 H –NMR của hợp chất 9b 36

3.2.3 Phân tích phổ 1 H-NMR của hợp chất 9c 36

3.2.4 Phân tích phổ 1 H-NMR của hợp chất 9d 37

3.2.5 Phân tích phổ 1 H-NMR của hợp chất 9e 38

3.2.6 Phân tích phổ 1 H-NMR của hợp chất 9e 38

3.3 XÁC ĐỊNH TỈ LỆ CÁC ĐỒNG PHÂN LẬP THỂ BẰNG HPLC-MS 40

3.3.1 Khảo sát bước sóng hấp thụ đối với các chất nghiên cứu 40

3.3.2 Khảo sát phổ MS 43

3.3.3 Khảo sát chương trình dung môi cho quá trình sắc ký 44

3.4.4 Kết quả và thảo luận quá trình phân tích sắc ký 46

KẾT LUẬN 51

TÀI LIỆU THAM KHẢO 52

PHỤ LỤC 54

DANH MỤC CÁC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc cơ sở β-lactam 3

Hình 1.2 Phổ 1H-NMR của hỗn hợp este Mosher (S)-1-phenylbutan-1-ol và (R)-1-phenylbutan-1-ol 10

Hình 1.3 Phổ 1H-NMR của este Mosher (R)-1-phenylbutan-1-ol và (S)-1-phenylbutan-1-ol 10

Hình 1.4 Phổ 1H-NMR của (-)-enriched và hỗn hợp (-)-enriched với CSA 12

Hình 1.5 Tín hiệu 1H-NMR của CH3 trong một số trường hợp 13

Hình 1.6 Cặp tín hiệu Fiedel 14

Hình 1.7 Sơ đồ tóm tắt quá trình phân tích cấu trúc bằng phương pháp X-Ray 14

Hình 1.8 Phổ CD của hợp chất A và B 16

Hình 1.9 Cấu trúc của cột ODS 18

Hình 1.10 Sơ đồ nguyên lý hệ điot quang 19

Hình 1.11 Các biện pháp cải tiến tăng độ nhạy của detector (cải tiến flowcell) 20

Hình 3.1 Phổ 1H của hợp chất 9a 32

Hình 3.2 Phổ 1H của hợp chất 9b 33

Hình 3.3 Phổ 1H của hợp chất 9c 33

Hình 3.4 Phổ 1H của hợp chất 9d 34

Hình 3.5 Phổ 1H của hợp chất 9e 35

Hình 3.6 Phổ 1H của hợp chất 9f 35

Hình 3.7 Phổ hấp thụ electron của hợp chất 9a 37

Hình 3.8 Phổ hấp thụ electron của hợp chất 9b 38

Hình 3.9 Phổ hấp thụ electron của hợp chất 9c 38

Hình 3.10 Phổ hấp thụ electron của hợp chất 9d 38

Hình 3.11 Phổ MS của hợp chất 9c khi để chế độ Positive 40

Hình 3.12 Phổ MS của hợp chất 9c khi để chế độ Negative 40

Hình 3.13 Sắc ký đồ của hợp chất 9c khi chạy với pha động Gradient 1 42

Hình 3.14 Sắc ký đồ của hợp chất 9c khi chạy với pha động Gradient 2 42

Hình 3.15 Sắc ký đồ của hợp chất 9c khi chạy với pha động Gradient 3 42

Hình 3.16 Sắc ký đồ của hợp chất 9a 43

Hình 3.17 Phổ MS của pic 1 (hợp chất 9a) 44

Hình 3.18 Phổ MS của pic 2 (hợp chất 9a) 44

Hình 3.19 Sắc ký đồ của hợp chất 9b 45

Hình 3.20 Sắc ký đồ của hợp chất 9c 46

Hình 3.21 Sắc ký đồ của hợp chất 9d 47

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 1.1 Phản ứng Staudinger 3

Sơ đồ 1.2 Cơ chế phản ứng Staudinger 4

Sơ đồ 1.3 Con đường hình thành β –lactam 5

Sơ đồ 1.4 Sử dụng muối (12) tổng hợp β-lactam 6

Sơ đồ 1.5 Sorbyl clorua (16) tổng hợp β-lactam 6

Sơ đồ 1.6 Tổng hợp β-lactam từ imine và vinylketene 7

Sơ đồ 2.1 Tổng hợp dẫn xuất 2-phenoxy clorua axetic 26

Sơ đồ 2.2 Tổng hợp dẫn xuất imin 26

Sơ đồ 2.3 Tổng hợp dẫn xuất cis-β-lactam 27

Sơ đồ 3.1 Tổng hợp dẫn xuất 2-phenoxy clorua axetic 31

Sơ đồ 3.2 Cơ chế hình thành chất 5a,b 32

những loại thuốc mới, có hiệu lực điều trị cao và chưa bị vi khuẩn kháng lại, thì

việc tổng hợp và bán tổng hợp β-lactam mới là một việc làm rất quan trọng

Mặt khác, như ta đã biết hoạt tính sinh học của các đồng phân quang học (đồng phân đối quang hoặc đồng phân lập thể không đối quang) là rất khác nhau

và việc tách các đồng phân đó thì rất tốn kém, tốn rất nhiều thời gian Vì vậy việc tổng hợp chọn lọc lập thể các đồng phân quang học là rất quang trọng, làm giảm chi phí cho thực hiện quá trình tách, tăng hiệu quả điều trị

Vì vậy trong luận văn này, chúng tôi tập trung vào việc phân tích cấu trúc

và xác định độ chọn lọc lập thể của các hợp chất β-lactams, thu được từ phản

ứng tổng hợp theo phương pháp Staudinger, bằng các phương pháp hiện đại như HPLC-MS và NMR

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 BETA LACTAM

β-lactam được phân loại dựa theo cấu trúc vòng cơ sở và được chia thành

4 nhóm:

 β-lactam kết hợp với vòng 5 cạnh bão hòa

o β-lactam có chứa vòng thiazolidine được gọi tên là penams (A)

o β-lactam có chứa vòng pyrrolidine được gọi tên là carbapenams (B)

o β-lactam hợp nhất để oxazolidine vòng được gọi tên là oxapenams

hoặc clavams (C)

 β-lactam kết hợp với vòng năm cạnh không bão hòa:

o β-lactam có chứa vòng thiazol 2,3-dihydro được gọi tên là penems

(D)

o β-lactam có chứa vòng 2,3-dihydro-1H-pyrrole được gọi tên là

carbapenems (E)

 β-lactam kết hợp với vòng 6 cạnh chưa bão hòa:

o β-lactam có chứa vòng 3,6-dihydro-2H-1,3-thiazine được gọi tên là

Hình 1.1 Cấu trúc cơ sở β-lactam

Hợp chất chứa vòng β-lactam được ứng dụng chủ yếu trong thực tế là làm

thuốc kháng sinh

1.2 TỔNG HỢP BETA LACTAM

Azetidin-2-ones(β-lactams) đại diện cho một nhóm các hợp chất rất quan

trọng do hoạt tính sinh học nổi tiếng của chúng [9] và là hợp chất trung gian

trong tổng hợp hữu cơ [13] Nhiều phương pháp tổng hợp β-lactam đã được phát

triển như: phản ứng cộng vòng [2+2], phản ứng tạo vòng, phản ứng gắn thêm carbene, và phản ứng sắp xếp lại các hợp chất dị vòng [14],[9]

1.2.1 Phản ứng Staudinger

Phản ứng Staudinger, phản ứng của ketene với các hợp chất chứa chức

imine, là phương pháp tổng hợp quan trọng nhất điều chế β–lactam Kể từ khi

được phát hiện ra bởi Staudinger [15], phản ứng này từ lâu đã được nghiên cứu thực nghiệm và lý thuyết để hiểu cơ chế của nó và là cơ sở cho việc chọn lọc lập

thể Nó được áp dụng để tổng hợp một loạt các cấu trúc β-lactam (Sơ đồ 1.1)

Hiện nay phản ứng này vẫn là một trong những phương pháp tốt nhất cho quá

trình tổng hợp β –lactam [14].

Sơ đồ 1.1 Phản ứng Staudinger

1.2.2 Cơ chế phản ứng và điều khiển độ chọn lọc lập thể

Cơ chế của phản ứng Staudinger được đưa ra bởi Hegedus là cơ chế mô tả tốt nhất [15] Imine, tác nhân nucleophile tấn công orbital nguyên tử trống (LUMO) của nhóm đồng phẳng carbonyl ketene tạo ketene thế Quá trình tấn công xảy ra ở bên phía ít cản trở (cách tiếp cận exo), với mặt phẳng của imine

vuông góc với ketene, tạo ra các trung gian zwitterion (5) (sơ đồ 1.2)

Sơ đồ 1.2 Cơ chế phản ứng Staudinger

Hợp chất trung gian này đã được phát hiện và đặc trưng bởi quang phổ IR [22] Chuyển động quay của các imine đi vào mặt phẳng của ketene xảy ra đồng

thời với việc đóng vòng conrotatory tạo ra sản phẩm β –lactam (6) trong đó

nhóm imine R1 và nhóm L của ketene là cis Khi nhóm thế trên carbon sp2 của imine (R1 trong sơ đồ) ổn định điện tích dương, hợp chất trung gian zwitterioncó

thể bị đồng phân hóa tạo thành dạng cis của liên kết iminium vàtạo ra sản phẩm

trans-β-lactam (9) Tỷ lệ tương đối của các quá trình sẽ xác định sản phẩm hóa

học lập thể của phản ứng ketene/imine

Tính toán ab initio xác định sự có mặt của hợp chất trung gian zwitterion

và đóng vòng conrotatory [25] Nghiên cứu tiếp theo [9] khẳng định bản chất hai bước của quá trình và chứng minh một số điểm tương đồng với mô hình đề xuất bởi Houk cho phản ứng conrotatory của cyclobutenes [18]

Gần đây, nghiên cứu mới của nhóm Xu [9] đề xuất một cơ sởđể giải thích kết quả lập thể của phản ứng, xem xét lại mô hình được mô tả bởi Hegedus và

chỉ ra nguồn gốc động học của tỷ lệ cis/trans của sản phẩm β –lactam Con

đường được đề xuất cho sự hình thành β –lactam được mô tả dưới đây (Sơ đồ

1.3)

Sơ đồ 1.3 Con đường hình thành β –lactam

Khi sử dụng ketene dẫn xuất một lần thế thường cho tấn công exo là ưu

thế Sản phẩm hóa học lập thể cuối cùng chịu ảnh hưởng bởi bản chất của các ketene và các hợp chất chức imine, vì nó là kết quả của sự cạnh tranh phản ứng đóng vòng (k1) và phản ứng đồng phân hóa imine (k2) Tỷ lệ k1/k2 xác định tỷ lệ

cis/trans của sản phẩm β –lactam Các tác giả đề xuất [9], bước đóng vòng có

thể xảy ra dễ dàng hơn khi thêm vào một tác nhân nucleophile của một enolate nhóm chức của imine hơn là quá trình electrocyclic Tăng mật độ điện tử cho ketene thế và giảm mật độ điện tử cho imine thế làm tăng phản ứng đóng vòng (tăng k1), dẫn đến hình thành chủ yếu cis- β –lactam Mặt khác, làm giảm mật độ

electron của ketene thế và làm tăng mật độ electron imine sẽ làm giảm giá trị k1

và có lợi cho phản ứng đồng phân hóa, dẫn đến hình thành chủ yếu trans- β –

lactam Các hiệu ứng điện tử của các nhóm thế trên đồng phân là một yếu tố nhỏ trong chọn lọc lập thể Cuối cùng, sau khi so sánh các phản ứng tương tự thực hiện trong các điều kiện khác nhau, các tác giả cũng thừa nhận rằng không có ảnh hưởng của sóng viba [15] hoặc ánh sáng trong độ chọn lọc lập thể của phản ứng Staudinge [21]

Độ chọn lọc lập thể cũng chịu ảnh hưởng bởi tính chất của dung môi, các

dung môi không phân cực có lợi cho sự hình thành cis- β –lactam, trong khi dung môi phân cực thuận lợi cho sự hình thành trans Ngoài ra, cách ketene

được hình thành và thứ tự của bổ sung các tác nhân, cũng ảnh hưởng đến độ chọn lọc lập thể của sản phẩm [27] Sự xuất hiện của các orbital liên hợp giữa ketene và tác nhân imine ảnh hưởng đến độ chọn lọc lập thể của sản phẩm tương

tự như nhiệt độ [19]

Một phương pháp rất hiệu quả để thu được trans- β -lactam được phát

triển bởi Lectka và đồng nghiệp bằng cách sử dụng muối (12) như một anion

xúc tác ái nhân (Sơ đồ 1.4) Trên thực tế, biện pháp này không hiệu quả với acyl clorua béo [28]

Sơ đồ 1.4 Sử dụng muối 12 tổng hợp β-lactam

Việc sử dụng sorbyl clorua (16) như một một tiền chất của

butadienylketene thu được một số kết quả thú vị liên quan đến đồng phân lập thể không đối quang Khi phản ứng Staudinger được thực hiện với N-aryl imine, thu

được chủ yếu là sản phẩm trans, trong khi sử dụng N-akyl imine thu được chủ yếu là cis- β –lactam (Sơ đồ 1.5)[24].

Sơ đồ 1.5 Sorbyl clorua (16)tổng hợp β-lactam

Việc chọn lọc trans cũng thu được trong phản ứng Staudinger giữa imine

và vinylketene chứa một γ – heteroatom Cấu hình Z của nhánh vinyl của đồng

đồng phân lập thể có tác dụng ổn định vinylketene và sản phẩm chính là trans-3- vinyl - β –lactam (Sơ đồ 1.6) [23].

Sơ đồ 1.6 Tổng hợp β-lactam từ imine và vinylketene

1.3 PHÂN TÍCH CÁC ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG

Phân tích các đồng phân đối quang là tách một hỗn hợp raxemic bằng các

phương pháp vật lý và hóa học Thông thường, sự tách được thực hiện sau khi

chuyển từ đồng phân đối quang sang đồng phân “dia”; do các đồng phân đối

quang có các tính chất vật lý và hóa học giống nhau nên chúng không thể tách

bằng cách trực tiếp Trong khi đó, các đồng phân “dia” có thể tách được bằng

các phương pháp kết tinh chọn lọc, phương pháp sắc ký hoặc phương pháp NMR

1.3.1 Phương pháp tách các đồng phân đối quang bằng enzym

Hầu hết các enzym có tính đặc hiệu với một loại cơ chất nhất định Dựa vào tính chất này, người ta đã sử dụng các enzym để chuyển hóa chọn lọc một

trong hai đối quang trong hỗn hợp Ví dụ phản ứng thủy phân hỗn hợp raxemic

của este bằng enzym pig liver estease Dưới tác dụng của enzym này, chỉ có

đồng phân S được thủy phân Nhờ đó mà người ta tách được hai đồng phân này

ra khỏi nhau

1.3 2 Tách các đồng phân đối quang nhờ tác nhân bất đối bổ trợ

Hỗn hợp raxemic hoặc hai đồng phân của các hợp chất đối quang có một

tâm bất đối thường không thể tách ra khỏi nhau Tuy nhiên, khi tham gia phản

ứng với các chất bổ trợ chiral có từ một hoặc nhiều tâm bất đối, tạo thành sản

phẩm có từ hai tâm bất đối trở lên, có thể tách được bằng các phương pháp hóa

lý khác nhau Dựa vào tính chất quan trong này năm 1953, Pasteur đã tách được

đôi đồng phân đối quang của axit tactaric nhờ sự tạo muối “dia” của hỗn hợp hai

đối quang với (+)-cinchotoxin, có độ tan khác nhau nên có thể tách ra khỏi nhau bằng phương pháp kết tinh Phương pháp này vẫn được sử dụng hiệu quả để tách hỗn hợp hai đồng phân đối quang ra khỏi nhau

Ngoài ra, có thể chuyển hóa các đối quang của các hợp chất có một tâm

bất đối thành các đồng phân “dia” nhờ phản ứng với tác nhân bất đối bổ trợ khác Các đồng phân “dia” nhận được có thể tách ra bằng các phương pháp hóa

lý khác nhau Cuối cùng các tác nhân bất đối bổ trợ được loại bỏ, thu được các đồng phân đối quang tinh khiết

1.3.3 Tách đồng phân đối quang bằng các phương pháp hóa lý hiện đại

Các đối quang có thể được tách nhờ các phương pháp sắc ký khí (GC),

sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) có sử dụng các cột chiral Bản chất của các

phương pháp này là các hỗn hợp đối quang tương tác với pha tĩnh (tâm bất đối

trên cột chiral), nghĩa là chỉ một trong các đối quang có tương tác mạnh hơn với

tâm bất đối của cột Đối quang có tương tác yếu sẽ được rửa giải nhanh nhờ pha động, kết quả là hai đối quang được tách ra khỏi nhau Phương pháp này thường được sử dụng để xác định độ chọn lọc đối quang trong của các phản ứng Nếu phản ứng nhận được hỗn hợp có hai đồng phân đối quang A và B

(ee=enantiomer excess, de=diasteroisomer excess), độ chọn lọc đối quang được

xác định theo công thức:

enantiom A enantiom B ee

di teroisomerA di teroisomerB







1.3.4 Phân tích các đối quang nhờ phương pháp NMR

Để xác định tỉ lệ các đồng phân lập thể có thể sử dụng nhiều phương pháp khác nhau, nhưng phổ NMR là một phương pháp hữu ích và phổ biến, vì nó không làm thay đổi tỉ lệ của các đồng phân trong hỗn hợp và chỉ cần lượng nhỏ hỗn hợp hai đồng phân đối quang Các đồng phân khác nhau được xác định nhờ

độ dịch chuyển hóa học và hằng số tương tác spin-spin của những nguyên tử

hydro trong từ trường

Trong phổ NMR, phần lớn hạt nhân của 1H và 13C của hai đồng phân

“dia” sẽ có tín hiệu chuyển dịch hóa học khác nhau Tỉ lệ của các đồng phân có

mặt trong hỗn hợp có thể tính toán được bằng sự phân tích các tín hiệu này Nếu

trong hỗn hợp có nhiều hơn hai đồng phân “dia” thì việc xác định tỉ lệ các đồng

phân bằng phổ NMR sẽ gặp khó khăn hơn, đặc biệt là các đồng phân chiếm tỉ lệ nhỏ

a) Phương pháp sử dụng tác nhân chuyển dịch (Shift reagent) Mosher

Đối với các hợp chất có một tâm bất đối thì hai cấu hình của chúng sẽ không phân biệt được bằng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân, do tín hiệu của chúng không được phân tách trong từ trường Để phân biệt được hai cấu hình của các hợp chất có một tâm bất đối, người ta phải chuyển hợp chất

nghiên cứu thành đồng phân dia Cơ sở của phương pháp Mosher là chuyển hợp chất có một tâm bất đối thành đồng phân dia bằng cách thực hiện phản ứng của hợp chất nghiên cứu với axit R-Mosher để tạo thành este hoặc thành amit… Sau

đó, nghiên cứu cấu hình của các hợp chất dia này sẽ đưa ra được cấu hình của

chất ban đầu Ví dụ, để xác định cấu hình tuyệt đối của hợp chất

1-phenylbutan-1-ol có một tâm bất đối, Mosher đã tổng hợp este của nó với axit R-Mosher để tạo ra hai đồng phân dia như mô tả trong sơ đồ dưới đây

Hai đồng phân dia này sẽ được phân biệt rõ trên phổ cộng hưởng từ hạt

nhân proton Tín hiệu của proton bậc ba tại trung tâm bất đối của dẫn xuất este

Mosher của (R)-1-phenylbutan-1-ol sẽ dịch chuyển về phía trường cao, trong khi tín hiệu proton bậc ba tại tâm bất đối của dẫn xuất (S)-1-phenylbutan-1-ol sẽ

dịch chuyển về phía trường thấp Như vậy, người ta có thể xác định được cấu hình tuyệt đối của hợp chất 1-phenylbutan-1-ol ban đầu

Hình 1.2 Phổ 1H-NMR của hỗn hợp este Mosher (S)-1-phenylbutan-1-ol và

(R)-1-phenylbutan-1-ol

Hình 1.3 Phổ 1H-NMR của este Mosher (R)-1-phenylbutan-1-ol và

(S)-1-phenylbutan-1-ol

Ngoài axit R-Mosher, hiện nay người ta đang nghiên cứu sử dụng một số

tác nhân bổ trợ khác để xác định cấu hình tuyệt đối của một số hợp chất ancol, amin và axit cacboxylic có một tâm bất đối, ví dụ như các tác nhân bổ trợ sau

b) Phương pháp sử dụng tác nhân chuyển dịch Chiral Pirkle ancol (CSA)

Chiral aryltrifluorometyl carbinol (chiralPirkle ancol) là những tác nhân

hữu dụng nhất, cho ph p xác định nhanh tỷ lệ của các đồng phân lập thể Khi có mặt của chất này, các đối quang của lacton, amin và ancol trong từ trường tạo ra phổ không tương đương Có thể là do cả hydroxyl và các hydro cacbinyl của chất CSA tạo ra các tương tác với các tâm bazơ Ưu điểm của của phương pháp này là không cần phải thực hiện các phản ứng chuyển hóa thành các dẫn xuất

với tác nhân bổ trợ nên hạn chế được quá trình raxemat hóa, đặc biệt là có thể sử

dụng để xác định cấu hình của các chất có hàm lượng nhỏ

Ví dụ, để nghiên cứu cấu hình của hai đối quang oxaziridin nhờ tác nhân

bổ trợ CSA, kết quả do tương tác cầu hydro của oxazirindin với CSA tạo thành

phức dia, dẫn đến một số tín hiệu của hai đối quang được tách biệt trong từ

trường Nghiên cứu của phổ 1

H-NMR của hỗn hợp hai đồng phân (-)-oxaziridin khi không có tác nhân chuyển dịch CSA thì các tín hiệu proton không phân biệt

được trong từ trường, nhưng khi cho kết hợp với (S)-(+)-CSA thì các tín hiệu

của metyl, metin được tách ra Dựa vào phổ này, người ta có thể xác định được

tỷ lệ hai đồng phân đối quang của oxaziridin

Hình 1.4 Phổ 1H-NMR của (-)-enriched và hỗn hợp (-)-enriched với CSA

Tác nhân Eu(hfc)3 là phức của kim loại thuận từ với ligand hữu cơ có tâm bất đối Khi tác nhân Eu(hfc)3 kết hợp với nhóm chức (NH2, OH, SH …) trong

phân tử có một trung tâm bất đối sẽ tạo thành đồng phân “dia” Phức dia tạo

thành có một số proton được tách ra trong từ trường và chuyển về trường thấp

Sự tách biệt và độ chuyển dịch về phía trường thấp của một số proton phụ thuộc vào nồng độ của tác nhân phức Eu(hfc)3

Ví dụ, nghiên cứu phổ 1H-NMR của hỗn hợp hai đối quang

(R,S)-1-axetyl-1-phenylbutan, các tín hiệu proton của hai đối quang không phân biệt được trong từ trường Tuy nhiên, khi được tạo phức với tác nhân chuyển dịch Eu(hfc)3 thì có sự tách tín hiệu Nhóm metyl (triplet) được tách thành hai triplet

có cường độ tương đương nhau Sự tách tín hiệu của proton trong từ trường phụ thuộc vào bản chất của chất nghiên cứu và nồng độ của tác nhân chuyển dịch

Qua ví dụ trên ta thấy, tín hiệu proton ở nhóm CH3 của hỗn hợp

(R,S)-1-axetyl-1-phenylbutan khi tạo phức với Eu(hfc)3 đều được tách ra và có độ

chuyển dịch hóa học chuyển về phía trường thấp Sự tách tín hiệu và độ chuyển dịch hóa học proton ở nhóm CH3 của hai đối quang có sự khác biệt rõ ràng Đối

với (R)-1-axetyl-1-phenylbutan, tín hiệu proton của nhóm CH3 được chuyển

dịch về phía trường cao so với (S)-1-axetyl-1-phenylbutan Như vậy, có thể phân biệt và xác định được tỷ lệ hai đồng phân (R)-1-axetyl-1-phenylbutan và (S)-1-

axetyl-1-phenylbutan nhờ 1H-NMR của chúng khi tạo phức với tác nhân chuyển dịch Eu(hfc)3 (xem hình 5)

Hình 1.5 Tín hiệu 1H-NMR của CH3 trong một số trường hợp

1.3.5 X-ray tinh thể

a Giới thiệu chung

Phương pháp X-ray phân tử là phương pháp hiện đại nhất để xác định cấu trúc phân tử của một hợp chất hữu cơ Từ phương trình Bragg, người ta tính toán

độ dài của các cạnh tế bào cơ sở (a,b,c), chỉ số Miler (h,k,l), góc giữa các trục

tinh thể (α,β,γ), thể tích tế bào tinh thể cơ sở (V) và số lượng phân tử (n) xây

dựng nên tế bào cơ sở

Phương trình Bragg: 2d.sin(θ) = nλ

Thể tích tế bào cơ sở: V = abc(1-cos2α-cos2β-cos2γ+2cosαcosβcosγ)1/2

Số lượng phân tử trong một tế bào cơ sở n = V.d.6,023.1023 (d: tỷ trọng g/cm3)

Mặt khác, khi chiếu bức xạ tia X vào phân tử, ở mỗi trung tâm liên kết sẽ phát ra một cặp tín hiệu Friedel phản xạ theo hai hướng (h,k,l) và hướng ngược lại (-h,-k,-l) Cường độ của tín hiệu Friedel (Fhkl, F-h,-k-l) được tính toán nhờ cường độ của tín hiệu nhiễu xạ (Ihkl) (|Fhkl| = (Ihkl)1/2)

Hình 1.6 Cặp tín hiệu Fiedel

Mật độ electron tại một điểm trong tế bào cơ bản sẽ được tính toán bằng công thức:

ρ(x,y,z) = [ Σhkl Fhkl exp{-2p(hx + ky + lz)}] / V Bằng cách đo cường độ của tất cả các tín hiệu nhiễu xạ Ihkl theo mặt h,k,l khi đã biết được các thông số cơ bản của tế bào cơ sở theo phương trình Bragg ở trên, người ta sẽ tính toán được mật độ electron tại mọi điểm trong không gian của tế bào cơ sở, từ đó có thể xây dựng được bản đồ mật độ điện tích của phân tử.Từ dữ liệu bản đồ mật độ electron, chương trình máy tính sẽ dựng được cấu trúc không gian ba chiều của phân tử Quá trình xác định cấu trúc của hợp chất hữu cơ bằng phương pháp X-ray phân tử có thể được tóm tắt như sau:

Hình 1.7 Sơ đồ tóm tắt quá trình phân tích cấu trúc bằng phương pháp X-Ray

b Xác định cấu hình tuyệt đối

Phương pháp X-ray tinh thể có khả năng xác định chính xác cấu hình tuyệt đối của một phân tử, nếu trong phân tử có nguyên tử có tán xạ tia X bất thường Để xác định cấu hình tuyệt đối của phân tử bằng phương pháp X-ray tinh thể người ta sử dụng phương pháp của Bijvoet và phương pháp so sánh chỉ

số R

H,K,L

-H,-K,-L

Phương pháp Bijvoet: Do mỗi trung tâm bất đối khi được chiếu bức xạ tia

X sẽ phát ra một cặp tín hiệu bất thường Friedel, lợi dụng nguyên tắc này Bijvoet đã so sánh tín hiệu tán xạ của một nguyên tử đánh dấu với tín hiệu của cặp bức xạ Friedel ở trung tâm bất đối phản xạ theo hướng (h,k,l) và hướng ngược lại (-h,-k,-l), để xác định cấu hình tuyệt đối

Phương pháp so sánh chỉ số R: Chỉ số R được xây dựng trên cơ sở hàm thống kê Hamilton từ toàn bộ dữ liệu của các cặp đồng phân đối quang và được

so sánh với các tính toán Bijvoet để xác định kiểu đồng phân đối quang Nếu giá trị của chỉ số R có sự sai khác, dù rất nhỏ (±0,1%) thì phải đánh giá lại các giá trị này bằng phương pháp thống kê

Như vậy, cả hai phương pháp này chỉ dựa vào tia phản xạ đặc biệt có cường độ cao do ảnh hưởng của cấu trúc ở những trung tâm bất đối của phân tử

mà chưa so sánh được những tia tán xạ yếu Những yếu tố tán xạ yếu chỉ được

sử dụng khi dữ liệu X-ray có số lượng lớn Phương pháp X-ray tinh có thể sử dụng hữu hiệu nhất đối với các hợp chất không chứa nguyên tử nặng hơn oxi

Với những chất quang hoạt không tồn tại ở dạng đơn tinh thể, người ta có thể xác định cấu hình tuyệt đối của chúng bằng cách cho chúng phản ứng với một chất khác có chứa một hay nhiều trung tâm bất đối đã biết cấu hình tuyệt đối Các hợp chất có cấu hình tuyệt đối đã biết được chọn để nghiên cứu trong phương pháp này là những chất có khả năng dễ kết tinh để nhận được dạng đơn tinh thể Việc xác định cấu hình tuyệt đối của các hợp chất quang hoạt bằng phân tích X-ray được thực hiện dựa vào phần cấu hình tuyệt đối của chất gắn kết với chất nghiên cứu Ngoài ra, việc đưa nhóm nguyên tử nặng như halogen (Cl,

Br, I) vào phân tử hợp chất quang hoạt cũng cho ph p xác định cấu hình tuyệt đối của chất đó nhờ phương pháp Bijvoet ở trên

Ví dụ hidroxy lacton chưa biết cấu hình tuyệt đối được chuyển thành este

với axit Mosher để tạo thành đồng phân dia Trong trường hợp chất tạo thành

thu được dưới dạng đơn tinh thể, cấu hình tuyệt đối của hydroxy lacton được

xác định thông qua cấu hình tuyệt đối đã biết của phần tác nhân Mosher thông qua phân tích phổ X-ray

1.3.6 Phổ CD

Phương pháp phổ CD cũng dựa trên nguyên tắc cơ bản của hiệu ứng Cotton, cơ sở của phương pháp này là nghiên cứu bước chuyển ở trung tâm bất đối (circular dichroism) hay còn gọi là phổ nhị sắc tròn Việc xác định phổ CD rất phức tạp, vì nó phụ thuộc vào bản chất của hợp chất nghiên cứu, chỉ có những hợp chất có bước chuyển n >π* và π >π* (có nhóm mang màu) mới

đo được hiệu ứng Cotton Trong trường hợp chất cần nghiên cứu không có bước chuyển n >π* và π >π* cần phải gắn thêm một nhóm mang màu vào phân

tử Xác định cấu hình tuyệt đối của một hợp chất hữu cơ được thực hiện nhờ so sánh hiệu ứng Cotton của nó với hiệu ứng Cotton của chất có cấu trúc tương tự

đã biết về cấu hình tuyệt đối Như vậy, cần phải có nhiều hợp chất có cấu trúc tương đồng đã biết để so sánh và xác định cấu hình tuyệt đối của chất cần nghiên cứu

Ví dụ, khi muốn xác định cấu hình của flavan mới, người ta phải so sánh hiệu ứng Cotton của hợp chất cần nghiên cứu với hiệu ứng Cotton flavan đã biết trước cấu hình tuyệt đối Hợp chất flavan B đã biết cấu hình tuyệt đối, hợp chất flavan A chưa biết cấu hình tuyệt đối, hiệu ứng Cotton của A và B trên phổ CD

là tương tự nhau nhưng có chiều ngược nhau, nên cấu hình tuyệt đối của A là ngược so với B

Hình 1.8 Phổ CD của hợp chất A và B

Ngoài ra, với các phân tử hữu cơ quang hoạt có chứa các phần mang màu

đã biết việc phân tích phổ CD cho ph p xác định được cấu hình tuyệt đối của cacbon bất đối trong phần mang màu này

1.4 SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

1.4.1 Khái niệm

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ra đời năm 1967-1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển HPLC là một phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột

là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ Phương pháp này ngày càng được sử dụng rộng rãi và phổ biến vì nhiều lý do: có độ nhạy cao, khả năng định lượng tốt, thích hợp tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ phân hủy nhiệt

Phạm vi ứng dụng của phương pháp HPLC rất rộng, như phân tích các hợp chất thuốc trừ sâu, thuốc kháng sinh, các chất phụ gia thực phẩm trong lĩnh

vực thực phẩm, dược phẩm, môi trường…

1.4.2 Phân loại

Dựa vào sự khác nhau về cơ chế tách chiết sử dụng trong HPLC, người ta chia HPLC thành 4 loại:

 Sắc ký hấp phụ hay sắc ký lỏng rắn (adsorption/liquid chromatography)

 Sắc ký phân bố (partition chromatography)

 Sắc ký ion (ion chromatography)

 Sắc ký rây phân tử (size exclusion/gel permeation chromatography)

Riêng SKPB được chia thành hai loại dựa trên độ phân cực tương đối giữa pha tĩnh và pha động: sắc ký pha thường – SKPT (normal phase chromatography) và sắc ký pha đảo – SKPĐ (reversed phase chromatography)

Trong đó, sắc ký pha đảođược sử dụng nhiều hơn cả

1.4.3 Pha tĩnh trong sắc ký pha đảo

Trong sắc ký phân bố nói chung, pha tĩnh là những hợp chất hữu cơ được gắn lên chất mang rắn silica hoặc cấu thành từ silica theo hai kiểu:

 Pha tĩnh được giữ lại trên chất mang rắn bằng cơ chế hấp phụ vật lý → sắc ký lỏng-lỏng (liquid-liquid chromatography)

 Pha tĩnh liên kết hóa học với chất nền → sắc ký pha liên kết (bonded phase chromatography)

Trong quá trình sử dụng, người ta nhận thấy sắc ký pha liên kết có nhiều

ưu điểm hơn sắc ký pha lỏng-lỏng vì một số nguyên nhân sau:

o Pha tĩnh trong hệ sắc ký lỏng-lỏng dễ bị hòa tan bởi pha động nên

dễ bị mất mát pha tĩnh trong thời gian sử dụng và gây nhiễm đối với hợp chất phân tích

o Do pha tĩnh của sắc ký lỏng-lỏng dễ tan trong pha động nên người

ta không thể ứng dụng phương pháp rửa giải gradient dung môi

Vì vậy, người ta thường chỉ quan tâm đến loại sắc ký phân bố pha liên kết

và phần lớn các loại cột sử dụng hiện nay trong sắc ký phân bố đều có cấu trúc dạng này

Trong SKPĐ, nhóm thế R trong hợp chất siloxan hầu như không phân cực hoặc ít phân cực Đó là các ankyl mạch dài như C8 (n-octyl), C18 (n-octadecyl) còn gọi là ODS (octadecylsilan) hoặc các nhóm alkyl ngắn hơn như C2; ngoài ra còn có cyclohexyl, phenyl trong đó nhóm phenyl có độ phân cực cao hơn nhóm alkyl Người ta nhận thấy các alkyl mạch dài cho kết quả tách ổn định hơn các loại khác nên đây là loại được sử dụng nhiều nhất

Hình 1.9 Cấu trúc của cột ODS

1.4.4 Pha động trong sắc ký pha đảo

Pha động trong sắc ký lỏng nói chung phải đạt những yêu cầu sau:

 Hòa tan mẫu phân tích

 Phù hợp với đầu dò

 Không hòa tan hay làm mòn pha tĩnh

 Có độ nhớt thấp để tránh áp suất dội lại cao

 Tinh khiết dùng cho sắc ký

Trong sắc ký pha đảo, dung môi pha động có độ phân cực cao Trên lý thuyết chúng ta có thể sử dụng khá nhiều dung môi nhưng kinh nghiệm thực tế cho thấy nước, methanol, acetonitrile, tetrahydrofuran là đạt yêu cầu nhất Trong

đó nước là một dung môi được cho vào các dung môi hữu cơ để giảm khả năng rửa giải

Trong quá trình tách của SKPĐ, sự tương tác giữa hợp chất cần phân tích

và pha động phụ thuộc rất nhiều vào moment lưỡng cực, tính acid hoặc tính base của dung môi Do đó độ phân cực và độ rửa giải của dung môi có tác động lớn lên khả năng phân tách của sắc ký

Thông thường pha động trong SKPĐ bao gồm một hỗn hợp nước hoặc dung dịch đệm với một hoặc nhiều dung môi hữu cơ phân cực tan được trong nước

Thành phần pha động có thể cố định trong suốt quá trình chạy sắc ký (chế

độ isocratic) hoặc được thay đổi theo một chương trình đã định sẵn (chương trình gradien dung môi) để có hiệu quả tách tốt hơn

1.4.5 DETECTOR DAD

Trung tâm của thiết bị là một dãy diot hàng trăm chiếc (những máy hiện nay có thể lắp 1024 diot) được sắp xếp cạnh nhau liên tục thành dãy trên tấm silicon tinh khiết, kích thước 1-6 cm, độ rộng của mỗi diot riêng là 0,0015 – 0,050 mm

Hình 1.10 Sơ đồ nguyên lý hệ điot quang

Trên mỗi tấm silicon còn có một tụ điện, một công tắc cho mỗi diot Hệ thống được điều khiển bằng computer luôn ngắt mỗi công tắc làm cho tụ điện được tích – 5V Khi bức xạ chiếu vào mặt diot làm đóng mạch điện và tụ điện phóng điện Sự nạp điện lại được tiếp tục ở chu kỳ tiếp theo Kết quả là dòng điện tỷ lệ với lượng bức xạ chiếu vào, khuếch đại, số hóa và ghi lại vào bộ nhớ

a) đường quang chữ Z, b) đường quang bong bóng,

c) đường quang phản xạ nhiều lần

Hình 1.11 Các biện pháp cải tiến tăng độ nhạy của detector (cải tiến flowcell)

1.4.6 DETECTOR MS

Phương pháp khối phổ (Mass Spectrometry-MS) là phương pháp nghiên cứu các chất bằng cách đo, phân tích chính xác khối lượng phân tử của chất đó dựa trên sự chuyển động của các ion nguyên tử hay ion phân tử trong điện trường hoặc từ trường nhất định Tỉ số giữa khối lượng và điện tích (m/z) có ảnh hưởng rất lớn đối với chuyển động này của ion Nếu biết được điện tích của ion thì ta dễ dàng xác định được khối lượng của ion đó

Do quá trình phân tích với đầu dò MS đòi hỏi mức độ chân không cao, nhiệt độ cao, các chất khảo sát phải ở trạng thái khí, vận tốc dòng chảy nhỏ; trong khi hệ thống LC lại hoạt động ở áp suất cao với một lượng dung môi tương đối lớn, nhiệt độ tương đối thấp, các chất phân tích ở thể lỏng Điều này gây rất nhiều khó khăn trong việc tìm cách giải quyết được sự tương thích giữa

hệ thống sắc ký lỏng và đầu dò khối phổ

Để khắc phục những khó khăn trên, cần phải có một k thuật trung gian gọi là giao diện Rất nhiều k thuật giao diện (interface technology) như ch m tia hạt (FB), bắn phá nguyên tử nhanh dòng liên tục (CF-FAB),… đã được nghiên cứu và ứng dụng, nhưng mãi cho đến cuối thập nhiên 80, mới có sự đột phá thật sự với k thuật ion hóa tại áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure Ionization – API)

Ưu điểm nổi bật của API là khả năng hình thành ion tại áp suất khí quyển ngay trong buồng ion hóa Điều này khác biệt với các kiểu ion hóa sử dụng trước đó cho LC/MS như bắn phá nguyên tử nhanh với dòng liên tục (continuous flow- fast atom bombardment CF-FAB) hay như tia nhiệt (thermospray – TS) đều đòi hỏi áp suất thấp Một thuận lợi nữa của API là sự ion hóa mềm (soft ionization), không phá vỡ cấu trúc của hợp chất cần phân tích

nhờ đó thu được khối phổ của ion phân tử Ngoài ra, với k thuật này, người ta

có thể điều khiển được quá trình phá vỡ ion phân tử để tạo ra những ion con t y theo yêu cầu phân tích

Có ba kiểu hình thành ion ứng dụng cho nguồn API trong LC/MS:

* Phun m điện tử (ESI)

* Ion hóa hóa học tại áp suất khí quyển (APCI)

* Ion hóa bằng photon tại áp suất khí quyển (APPI)

Trong đó, hai k thuật APCI và ESI, đặc biệt là ESI được sử dụng nhiều hơn cả

c Các loại đầu d khối phổ

Có các loại tổng quát sau:

* Sự uấn cong nhờ từ trường (Magnetic field deflection)

- Máy khối phổ đơn giản sử dụng từ trường (a single focussing magnetic sector mass spectrometer): máy có độ phân giải thấp

- Máy khối phổ nhị tiêu (double focussing mass spectrometer): sự uốn cong nhờ từ trường và điện trường, máy có độ phân giải cao

* Máy khối phổ tứ cực (quadrupole mass spectrometer)

- Máy khối phổ tứ cực (quadrupole mass filter)

- Bẫy ion (quadrupole ion storage; ion trap)

* Máy khối phổ sử dụng k thuật thời gian bay (time of flight mass spectrometry)

* Máy khối phổ cộng hưởng cyclotron-ion, sử dụng phép biến đổi Fourier (Fourier transform-ion cyclotron resonance mass spectrometry: FTMS)

Trong đó, Máy khối phổ tứ cực; máy khối phổ sử dụng k thuật thời gian bay; máy khối phổ cộng hưởng cyclotron-ion, sử dụng phép biến đổi Fourierđược sử dụng nhiều hơn cả