Các phương pháp phân tích lượng tồn dư clenbuterol trong sản phẩm thịt gia súc gia cầm.. Clenbuterol là chất có mặt trong danh mục các chất kháng sinh, hóa chất bị cấm sử dụng trong chăn
Trang 1III Các phương pháp phân tích lượng tồn dư clenbuterol trong sản phẩm thịt gia súc gia cầm.
1 Tổng quan về Clenbuterol
Clenbuterol (Spiropent, Ventipulmin) là một chất thuộc nhóm Beta-2-agonist Đầu tiên, Clenbuterol được dùng làm thuốc trị bệnh hen suyễn Liều dùng không được vượt quá 200 mcgs (1 mcg = 1/1000 mg) và trong khi điều trị phải giữ cho huyết
áp luôn dưới 140/90 Ngoài ra, khi dung các chất này cho heo ăn thì sẽ làm cho heo
nở mông, nở đùi, tăng trọng nhanh đặc biệt là tiêu biến mỡ và tăng tỉ lệ nạc
Công thức cấu tạo của Clenbuterol
Cách thức hoạt động của Clenbuterol giống với cách thức hoạt động của nhóm Beta- agonist Cụ thể là:
+ Khi Beta- agonist kết dính vào các thụ thể Beta-adrenergic trên tế bào mỡ, chúng
sẽ làm hoạt hóa một số emzyme, từ đó làm giảm sự tổng hợp và tích lũy mô mỡ
Trang 2trong tế bào Ngoài ra nó còn huy động mô mỡ trong tế bào để phân giải mô mỡ nhằm cung cấp năng lượng cho cơ thể và đưa đến kết quả là tỷ lệ mỡ tích lũy trong
cơ thể gia súc rất ít
+ Đối với mô cơ cũng có chưa thụ thể Beta-adrenergic ở trên bề mặt của nó Sự tương tác của Beta-agonist với thụ thể Beta-adrenergic sẽ làm gia tăng tổng hợp của axit ribonucleic (RNA), từ đó làm gia tăng tổng hợp protein trong tế bào và kết quả là làm gia tăng kích thước của tế bào cơ Sự tăng trưởng xảy ra bằng cách gia tăng chiều dài và độ lớn của sợi cơ một cách nhanh chóng (siêu nạc) chứ không gia tăng số lượng tế bào Tuy nhiên sự gia tăng này là có hạn theo thời gian và không thể sử dụng kéo dài được vì sẽ làm gia súc chết
Tác hại của Clenbuterol đó là việc ăn phải thịt lợn chứa chất Clenbuterol về lâu dài
có thể gây biến chứng ung thư, phù nề, co thắt phế quản, ngộ độc cấp tính, run cơ, đau tim, tim đập nhanh, tăng huyết áp, choáng váng… Clenbuterol sẽ gây tổn hại cho hệ thần kinh, hệ tuần hoàn, thậm chí gây chết người Đối với gia súc như lợn, con vật khi ăn phải chất này chỉ có thể tồn tại được quá nửa tháng là phải giết mổ Clenbuterol là chất có mặt trong danh mục các chất kháng sinh, hóa chất bị cấm sử dụng trong chăn nuôi
2 Tình hình sử dụng Clenbuterol trên thế giới và tại Việt Nam
a,Trên thế giới
Việc sử dụng các chất thuộc họ B- agonist, đặc biệt là Clenbuterol trong chăn nuôi
đã được khởi xướng từ Mỹ vào những năm 90, sau đó lan rộng khắp thế giới
Những vụ ngộ độc do ăn phải thịt heo bị nhiễm Clenbuterol
- Thập niên 80, Mỹ đã cấm sử dụng Clenbuterol vào thức ăn gia súc Vào năm
1990, Trung Quốc cũng cấm sử dụng Clenbuterol trong chăn nuôi gia súc Ở Tây
Trang 3Ban Nha, vào năm 1994, 140 người đã nhập viện sau khi ăn phải thịt heo bị nhiễm Clenbuterol Họ bị chóng mặt, tim đập nhanh, khó thở, run tay và nhức đầu
- Tháng 9/2006, 330 người ở Thượng Hải bị ngộ độc do ăn thịt heo siêu nạc Tháng 2/2009, trên 70 người ở Quảng Đông bị ngộ độc khi ăn lòng heo có dư lượng Clenbuterol
- Tại Thượng Hải (Trung Quốc), cơ quan chức năng đã phát hiện 18 vụ ngộ độc Clenbuterol liên quan đến thịt lợn, điển hình vào tháng 9/2006 có 330 người bị ngộ độc do ăn thịt lợn siêu nạc
- Tháng 3/2011, Bộ Nông nghiệp Trung Quốc mở đầu một chiến dịch kéo dài 1 năm để truy quét thức ăn chăn nuôi có chứa Clenbuterol, sau khi một công ty con của tập đoàn Shuanghui (sản xuất thịt lớn nhất TQ) bị phát hiện Clenbuterol trong thịt heo của công ty Tổng cộng có 72 người bị bắt và bị cảnh sát giam giữ vì bị cáo buộc sản xuất, bán hoặc sử dụng thịt heo có Clenbuterol
b,Tại Việt Nam
Việc sử dụng Clenbuterol tại Việt Nam cũng nằm trong tình trạng đáng báo động
Cụ thể:
- Cục chăn nuôi công bố: Năm 2006, khảo sát 114 công ty sản xuất thức ăn chăn nuôi cho lợn thì có 6 công ty sản phẩm chứa dư lượng Clenbuterol
- Trung tâm nghiên cứu và tư vấn người tiêu dùng đã điều tra và công bố 9/10 mẫu thịt lợn có tồn dư chất tạo nạc (đầu năm 2011)
- Cục cảnh sát phòng chống tệ nạn về mội trường và chi cục thú y TP.HCM tìm thấy tại kho 1,4tấn sản phẩm chứa chất tạo nạc nhập từ Trung Quốc
3 Các phương pháp phân tích Clenbuterol
Trang 4Có 3 phương pháp phân tích Clenbuterol thường được sử dụng là:
Phương pháp ELISA
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC
Phương pháp sắc ký khí khối phổ GC/MS
a, Phương pháp ELISA
*Nguyên tắc: Phương pháp ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) có rất nhiều dạng mà đặc điểm chung là đều dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể được gắn với một enzyme Khi cho thêm
cơ chất thích hợp (thường là nitrophenol phosphate) vào phản ứng, enzyme sẽ thủy phân cơ chất thành một chất có màu Sự xuất hiện màu chứng tỏ đã xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể với kháng nguyên và thông qua cường độ màu mà biết được nồng độ kháng nguyên hay kháng thể cần phát hiện
* Ưu điểm và nhược điểm của phương pháp ELISA khi xác định Clenbuterol
Đơn giản, dễ thực hiện
Tính chọn lọc cao
Xác định bán định lượng
Có thể cho kết quả dương tính giả
b Kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC với detectơ UV
*Nguyên tắc: Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một kỹ thuật dùng để tách, nhận biết, định lượng từng thành phần trong hỗn hợp Kỹ thuật này dựa trên hệ thống bơm để đẩy dung môi lỏng dưới áp suất cao, trong dung môi có chứa hỗn hợp mẫu, qua
Trang 5một cột sắc ký Cột sắc ký được đổ bằng vật liệu hấp phụ rắn Mỗi thành phần trong mẫu tương tác tương đối khác nhau với vật liệu hấp phụ, nên tốc độ dòng của mỗi thành phần khác nhau là khác nhau, dẫn tới sự phân tách các thành phần khí
mà chúng chảy ra khỏi cột
* Ưu điểm và nhược điểm của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
Độ nhạy đạt 3,16 ppb
Khả năng định lượng tốt
Độ đặc hiệu không cao
Giới hạn phát hiện Clenbuterol còn lớn hơn so với phương pháp GC/MS
c Kỹ thuật GC/MS (sắc ký khí ghép khối phổ)
Sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS_Gas Chromatography Mass Spectometry) là một trong những phương pháp sắc ký hiện đại nhất hiện nay với độ nhạy và độ đặc hiệu cao và được sử dụng trong các nghiên cứu và phân tích kết hợp Thiết bị GC/
Trang 6MS được cấu tạo thành 2 phần: phần sắc ký khí (GC) dùng để phân tích hỗn hợp các chất và tìm ra chất cần phân tích, phần khối phổ (MS) mô tả các hợp phần riêng lẻ bằng cách mô tả số khối
Sử dụng thiết bị GC/MS/MS để đo khối phổ 1 lần (MS) hoặc đo khối phổ 2 lần (MS/MS)
Ưu điểm: Có giới hạn phát hiện Clenbuterol (LOD) dạng vết nên định tính và định lượng tồn dư Clenbuterol chính xác gần như tuyệt đối trong nguyên liệu thực phẩm thịt lợn
Do đó, tiến hành nghiên cứu định lượng Clenbuterol trong sản phẩm thịt lợn bằng phương pháp sắc ký khối phổ
IV Kiểm định Clenbuterol trong sản phẩm thịt gia súc bằng phương pháp GC-MS.
1 Mục đích
- Xác định thông số đặc trưng để xây dựng quy trình định lượng Clenbuterol trong thịt lợn bằng phương pháp sắc kí khối phổ nhiều lần
- Đánh giá dư lượng Clenbuterol trong một số mẫu thịt lợn trên thị trường
2.Vị trí lấy mẫu
Đối tượng: Lấy mẫu thịt lợn tươi tại các chợ và siêu thị ở Hà Nội
Địa điểm thực hiện: Tại Labo hóa - độc thực phẩm, khoa Thực phẩm và Vệ sinh an toàn thực phẩm, Viện Dinh Dưỡng, Bộ Y Tế
Trang 73.Kích thước mẫu
- Lấy 30 mẫu thịt lợn tại các chợ và siêu thị ở Hà Nội
- Mẫu thịt lợn tươi được thu mua từ 8h -10h sáng, mỗi mẫu lấy tối thiểu 300g, bảo quản lạnh đưa về PTN không quá 3h
- Tại PTN, các mẫu được xay nhuyễn bằng máy đến mịn và đồng nhất, sau đó cân lấy lượng mẫu phân tích hàng ngày, mẫu còn lại bảo quản trong tủ âm sâu -20 đến -25ºC